CN111548998A - 一种分泌pd-1抗体的长寿浆细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌PD‑1抗体的长寿浆细胞及其制备方法与应用。具体是将PD‑1抗体基因定点整合到B细胞中，得基因工程B细胞；将所述基因工程B细胞诱导成分泌PD‑1抗体的长寿浆细胞。本发明制备得到的分泌PD‑1抗体的长寿浆细胞不仅具有长寿浆细胞典型的表型和转录特点，并且能够持续的分泌大量PD‑1抗体，其有望替代PD‑1抗体药物介导的肿瘤免疫治疗，同时本发明为肿瘤过继细胞免疫治疗提供一种新思路。并且，本发明将抗体基因导入B细胞进而诱导为能持续大量分泌抗体的长寿浆细胞，将此长寿浆细胞回输患者进行治疗的新思路疗法，不仅可用于治疗各种肿瘤，在各种感染性疾病比如艾滋病和慢性乙型病毒性肝炎，以及蛋白缺陷型疾病如血友病中也具有广阔的应用前景。

Description

一种分泌PD-1抗体的长寿浆细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种分泌PD-1抗体的长寿浆细胞及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤因其发病机理不明确，患病致死率高，治疗极其困难。目前传统治疗方法有手术切除、放射治疗、化学药物治疗三大模式，传统治疗方法均存在毒副作用大、药物作用靶点不清晰、肿瘤易复发等缺陷。免疫检查点阻断疗法具有显著的抗肿瘤效果，其中，针对PD-1的免疫检查点阻断疗法在肿瘤免疫治疗领域取得了重大突破，例如PD-1阻断性抗体纳武单抗和派姆单抗。这些抗体通过阻断PD-1和其配体PD-L1结合，抑制T细胞耗竭，进而发挥抗肿瘤疗效。但是使用该方法需要长期多次给予单克隆抗体药物，给病患者造成极严重的经济压力和心理生理压力。

肿瘤过继性细胞治疗是基于肿瘤患者自身免疫细胞开发的一种新型治疗手段，从患者自身免疫细胞着手，通过一系列技术手段使免疫细胞具备杀瘤效应，随后回输病人体内，激活病人抗肿瘤免疫应答。相对传统治疗方案，肿瘤过继性细胞治疗具备疗效好，毒副作用低，靶向强且具备记忆性免疫等优点，成为继传统的手术疗法、化疗和放疗后最具有前景的研究方向之一。肿瘤过继细胞免疫疗法在抗肿瘤、抗病毒等领域都带来前所未有的临床成果。T淋巴细胞和NK细胞一直是肿瘤过继细胞免疫疗法的研究热点。与此同时，随着B细胞和浆细胞研究的深入，对其进行基因编辑并应用于蛋白缺陷型疾病、糖尿病、自身免疫性疾病的细胞过继疗法正在兴起，而且受到了广泛的关注。B淋巴细胞受到抗原激活可向下游分化为效应性细胞、浆母细胞及浆细胞，分泌抗体保护机体免受病原体的侵害。浆母细胞归巢到骨髓，并最终分化成为长寿浆细胞(long-lived plasma cell，LLPC)，长寿浆细胞可以存活数十年之久，并持续不断的分泌大量的抗体。因此，将长寿浆细胞应用到细胞治疗领域将具有广阔的前景，但是目前对长寿浆细胞的免疫疗法研究较少。

因此我们想，理论上通过基因工程技术获得持续分泌PD-1抗体的长寿浆细胞，有望替代PD-1抗体药物介导的肿瘤免疫治疗。然而基因工程技术中效率和安全性是焦点问题，现有的基因编辑手段对人原代B细胞的基因编辑效率，尤其是大片段外源基因的敲入效率一直很低。目前尚未见有任何相关的研究和报道。

发明内容

针对上述现有技术中的不足与缺陷，本发明通过基因工程技术获得持续分泌PD-1抗体的长寿浆细胞，具体是利用整合酶缺陷的慢病毒传递CRISPR/Cas9基因编辑系统，将PD-1抗体基因定点敲入到人原代B细胞，并诱导成分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。所得能分泌PD-1抗体的长寿浆细胞有望替代PD-1抗体药物介导的肿瘤免疫治疗。

本发明的目的是提供一种分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的制备方法。

本发明另一目的是提供上述制备方法所得的分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。

本发明另一目的是提供上述分泌PD-1抗体的长寿浆细胞在制备防治肿瘤、药物中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的制备方法，具体为将PD-1抗体基因定点整合到B细胞中，得基因工程B细胞；将所述基因工程B细胞诱导成分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。

PD-1抗体具有显著的抗肿瘤效果，被广泛运用于临床，但是直接使用PD-1抗体需要长期多次给予单克隆抗体药物，现有研究表明长寿浆细胞可以存活数十年之久，并持续不断的分泌大量的抗体。本发明通过制备分泌PD-1抗体的长寿浆细胞，其不仅具有长寿浆细胞典型的表型和转录特征，而且能持续分泌大量PD-1抗体，避免了长期多次给药的困扰，提高患者的依从性以及治疗效率，同时，本发明为肿瘤过继细胞免疫治疗提供了一种新思路。

优选地，本发明制备分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的方法中，是将所述PD-1抗体基因定点整合到B细胞的看家基因GAPDH位点。研究结果显示，本发明选取看家基因GAPDH作为定点整合位点，能够高效地启动外源整合基因的表达。

优选地，所述B细胞为人原代B细胞。

更优选地，是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统将PD-1抗体基因定点整合到B细胞中。

进一步，优选地，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统含有SEQ ID NO:1所示的sgRNA核苷酸序列，所述核苷酸序列为：AGCCCCAGCAAGAGCACAAG。

本发明为了确定合适的sgRNA序列，设计了大量的sgRNA序列构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，最终结果显示含有如SEQ ID NO:1所示的sgRNA核苷酸序列的切割率最高，因此被选作最终的打靶序列。

优选地，本发明通过整合酶缺陷的慢病毒传递CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括Cas9/sgRNA和同源重组模板，将PD-1抗体基因定点整合到B细胞中。

基因工程技术中效率和安全性是关注的焦点，现有技术中CRISPR/Cas9系统对B细胞的基因编辑效率，尤其是大片段外源基因的敲入效率一直很低。因此，为解决将PD-1抗体基因(大片段外源基因)高效地敲入B细胞中，本发明研究发现整合酶缺陷的慢病毒(integrase-defective lentiviral vector，IDLV)具有感染能力强，包装容量相对较大的优点，利用IDLV传递CRISPR/Cas9基因编辑系统能极大提高外源基因敲入比例。同时，IDLV细胞毒性和免疫原性低，避免了慢病毒随机整合可能致癌的潜在风险。

进一步，优选地，所述整合酶缺陷的慢病毒是狒狒逆转录病毒包膜包装的整合酶缺陷的慢病毒。

本发明使用狒狒逆转录病毒包膜由Els Verhoeyen赠送者(参考文献Levy,C.,etal.(2016)."Baboon envelope pseudotyped lentiviral vectors efficientlytransduce human B cells and allow active factor IX B cell secretion in vivoin NOD/SCIDgammac(-/-)mice."J Thromb Haemost 14(12):2478-2492.)包装整合酶缺陷的慢病毒，而不是水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)包膜。研究结果显示，相对于水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)包膜包装的IDLV，经过狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLV对B细胞具有更高的感染率且不会发生随机整合。

另外优选地，本发明制备分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的方法中，通过细胞因子诱导和293T-APRIL饲养细胞共培养将基因工程B细胞诱导成分泌PD-1抗体的长寿浆细胞，其中293T-APRIL饲养细胞是由构建含有APRIL基因的慢病毒感染HEK293T细胞，并用X射线辐照细胞所得。

优选地，所述诱导的方法为：通过多步骤细胞因子诱导和293T-APRIL饲养细胞共培养，将基因工程B细胞逐步分化成前浆母细胞、浆母细胞、浆细胞，最终分化成长寿浆细胞。

更优选地，具体诱导方法步骤为：

(1)制备293T-APRIL饲养细胞：构建含有APRIL基因的慢病毒感染HEK293T细胞，并用X射线辐照细胞使得细胞停止生长，即得到293T-APRIL饲养细胞；

(2)基因工程B细胞分化成前浆母细胞：将基因工程B细胞重悬于培养基中培养，得前浆母细胞；

(3)前浆母细胞分化成浆母细胞：收集步骤(2)所述的前浆母细胞，洗涤，悬于培养基中培养，得浆母细胞；

(4)浆母细胞分化成浆细胞：将步骤(3)所述的浆母细胞，重悬于培养基中培养，得浆细胞；

(5)浆细胞分化成长寿浆细胞：收集步骤(4)所述的浆细胞，铺在步骤(1)所述的293T-APRIL饲养细胞上，培养，得长寿浆细胞。

更优选地，具体293T-APRIL饲养细胞的制备方法的步骤为：

(1)调取人APRIL基因，将APRIL基因克隆到慢病毒载体中，构建质粒，并包装成慢病毒，取慢病毒感染HEK293T细胞；

(2)然后用X射线辐照步骤(1)所得细胞使细胞停止生长，即得到所述293T-APRIL饲养细胞。

本发明通过大量研究发现，所制备的293T-APRIL饲养细胞可以支持浆细胞长期存活，最终分化成长寿浆细胞。并且，相较于目前的细胞因子诱导方法，使用饲养细胞一方面可以节约细胞因子，从而节约成本，另一方面可以更好的促进长寿浆细胞的分化。

因此，本发明上述构建的293T-APRIL饲养细胞以及其在诱导长寿浆细胞方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

另外，由本发明上述方法所制得的分泌PD-1抗体的长寿浆细胞，也应在本发明的保护范围之内。

上述分泌PD-1抗体的长寿浆细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

基于本发明的结果，可开发一种治疗肿瘤的药物，包括能分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种能分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的制备方法，所得分泌PD-1抗体的长寿浆细胞不仅具有长寿浆细胞典型的表型和转录特点，并且能够持续地分泌大量PD-1抗体，其有望替代PD-1抗体药物介导的肿瘤免疫治疗。

并且，本发明也为肿瘤过继细胞免疫治疗提供一种新思路，将抗体基因导入B细胞进而诱导为能持续大量分泌抗体的长寿浆细胞，将此长寿浆细胞回输患者进行治疗的新思路疗法，不仅可用于治疗各种肿瘤，在各种感染性疾病比如艾滋病和慢性乙型病毒性肝炎，以及蛋白缺陷型疾病如血友病中也具有广阔的应用前景。

此外，本发明使用整合酶缺陷的慢病毒(IDLV)作为CRISPR/Cas9基因编辑系统的传递工具，解决了CRISPR/Cas9基因编辑技术对大片段外源基因的敲入效率低的技术问题；同时使用狒狒逆转录病毒包膜包装IDLV，极大的提高了对人原代B细胞的感染率，且这种IDLV感染在B细胞中没有随机整合。本发明提供了一种新的针对人原代B细胞的基因编辑方式，能够有效的将PD-1抗体基因等大片段外源基因敲入到人原代B细胞中。

并且，本发明选取的看家基因GAPDH作为定点整合位点，能够高效地启动外源整合基因的表达。

本发明还提供了一种用293T-APRIL饲养细胞诱导分化长寿浆细胞的策略，能够有效的将基因工程B细胞诱导分化成长寿浆细胞，同时可以节约细胞因子，最大程度地节约了成本。

附图说明

图1为构建α-PD-1定点整合到GAPDH基因座所需的Cas9/sgRNA表达质粒和同源模板质粒，以及定点整合示意图；

图2为狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLV对人原代B细胞的感染图；其中，图A为IDLV感染B细胞后，不同的时间荧光蛋白表达图；图B为IDLV感染B细胞后检测基因组中整合的前病毒图；

图3为IDLV传递CRISPR/Cas9在人原代B细胞中的定点敲入；其中，图A为IDLV介导的人原代B细胞定点敲入流程图；图B为IDLV介导的人原代B细胞敲入率图；图C为敲入率的统计总结图；

图4为基因工程B细胞在体外分化成长寿浆细胞流程图；

图5为基因工程B细胞的体外分化；其中，图A为在基因工程B细胞分化成前浆母细胞、浆母细胞、浆细胞和长寿浆细胞流式图；图B为在不同的分化时间，浆母细胞(CD20－CD38+CD138－)和浆细胞/长寿浆细胞(CD20－CD38+CD138+)所占比例的统计总结图；

图6为不同分化阶段的基因工程细胞分泌PD-1抗体含量图；

图7为体外诱导分化的长寿浆细胞特征性的表型检测图；

图8为体外诱导分化的长寿浆细胞的转录特征检测图；

图9为T7E1酶切检测三条sgRNA的打靶效率；

图10为AAV介导CRISPR/Cas9在人原代B细胞中的定点敲入；

图11为用狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLV与VSVG包装的IDLV对人原代B细胞感染对比图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本文所述PD-1抗体基因序列：Addgene，来自质粒pLN539(FuGW-G8p-antiPD1(HC)-P2A-antiPD1(LC)-1Pe)(Plasmid#105200)。

实施例1分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的制备

1、质粒的构建与B淋巴细胞培养

(1)Cas9/sgRNA表达慢病毒质粒的构建

用张锋实验室sgRNA设计工具((https://zlab.bio/guide-design-resources)设计sgRNA，合成寡核苷酸引物，经退火反应形成寡核苷酸引物对，克隆至BsmBI酶切的lentiCRISPR v2(Addgene)质粒中。

退火反应体系：

Oligo 1(100μM)	1μl
		Oligo 2(100μM)	1μl
10×NEB buffer 2	5μl
		ddH<sub>2</sub>O	定容至50μl

退火反应程序：95℃加热5分钟，72℃加热10分钟，自然冷却至室温。

(2)同源重组模板慢病毒质粒的构建

分离人外周血淋巴细胞(PBMCs)，用Omega公司的Tissue gDNA Extraction Kit提取基因组DNA，以此为模板，调取sgRNA引导的切割位点左右各800bp分别作为左右同源臂(LHR/RHR)，将左右同源臂通过PCR搭桥，再克隆连接到pCPPT-IRES-eGFP(本实验室自主构建保存)慢病毒载体中，构建质粒pCPPT-LHR-RHR。以质粒pLN539(Addgene)为模板，调取PD-1抗体基因α-PD-1。收取人间充质干细胞，用Trizol提取细胞RNA，并反转成cDNA，以此为模板，调取人CD90基因。合成P2A和T2A序列，将α-PD-1和CD90用PCR搭桥，得到片段P2A-α-PD-1-T2A-CD90。将片段P2A-α-PD-1-T2A-CD90克隆连入到质粒pCPPT-LHR-RHR中，得到质粒pCPPT-LHR-P2A-α-PD-1-T2A-CD90-RHR。

(3)B淋巴细胞培养

用淋巴细胞分离液从健康人全血中分离得到人外周血淋巴细胞，再用EasySepTMHuman B Cell Isolation Kit(Stemcell)从中分离出B淋巴细胞。用含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和1％ITS补充剂的IMDM完全培养基重悬，置37℃5％CO₂培养箱中培养。

2、IDLV的包装和浓缩

第一天，将生长状态良好的HEK293T细胞以2×10⁶的密度种在10cm的细胞培养皿中；

第二天，当细胞密度达到60％-80％时，配置磷酸钙-DNA混合液，配置体系如下：

psPAX2-D64V	8.6μg
		狒狒逆转录病毒包膜	7μg
Cas9/sgRNA表达慢病毒质粒或者同源重组模板慢病毒质粒	8.6μg
		CaCl<sub>2</sub>溶液(2M)	55μl
ddH<sub>2</sub>O	定容至450μl

将混合物加入到450μl的HBS溶液中，混匀后迅速滴在HEK293T细胞上；

第三天早上，即转染后12-16小时，用Opti-MEM培养基给细胞换液；

第四天，收集HEK293T细胞上清，用0.45μm滤器过滤掉细胞碎片，置50ml离心管中，4℃离心3000×g，16小时；

第五天，离心完成后，用滴管小心吸走上清，加入适量体积的Opti-MEM培养基重悬病毒，即得到病毒浓缩液，分装冻-80℃冰箱保存。

3、人原代B细胞的定点敲入

将人原代B细胞以1×106/ml的密度，均匀铺在12孔细胞培养板中。用10μg/mlCpG2006/2219、50ng/ml MegaCD40L、20U/ml hIL-2、50ng/ml hIL-10和10ng/ml hIL-15刺激细胞48小时激活细胞。提前12个小时用20μg/ml的Retronectin包被48孔板。弃去Retronectin，用PBS洗一遍后，加入激活的B细胞悬液，同时加入传递Cas9/sgRNA和同源重组模板的IDLV混合液，37℃离心500×g，90分钟。离心完成后，放回培养箱中培养12-16小时，更换新鲜培养基。

图2结果表明，狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLV对人原代B细胞不会发生随机整合，同时避免了慢病毒随机整合可能致癌的潜在风险。

IDLV介导的人原代B细胞敲入率如图3所示，人原代B细胞的敲入效率约为20％，表明IDLV可以介导CRISPR/Cas9系统在人原代B细胞中定点敲入外源基因。

4、293T-APRIL饲养细胞的制备

分离人PBMCs，用Trizol提取细胞RNA，并反转成cDNA，以此为模板，调取人APRIL基因。将APRIL基因克隆到pCPPT-IRES-eGFP(本实验室自主构建保存)慢病毒载体中，构建质粒pCPPT-APRIL-IRES-eGFP，与VSVG包膜质粒、psPAX2骨架质粒一起包装成慢病毒，包装方法与IDLV包装方法一样。取慢病毒感染HEK293T细胞，用极限稀释法获得GFP表达的单克隆。

293T-APRIL饲养细胞实验前准备：将生长状态良好的293T-APRIL饲养细胞以2×10⁵/孔的密度铺在12孔板中，待细胞完全贴壁后，用120 Gy剂量的X射线辐照细胞，随后观察8-12小时确定细胞停止生长，得293T-APRIL饲养细胞。

5、长寿浆细胞的诱导分化及抗体分泌检测

如图4、图5所示设计多步骤细胞因子诱导和293T-APRIL饲养细胞共培养的方法将基因工程B细胞分化成长寿浆细胞：

第一步B细胞分化成前浆母细胞：将基因工程B细胞以5×10⁵/ml的细胞浓度，重悬于IMDM完全培养基，加入10μg/ml CpG2006/2219、50ng/ml MegaCD40L、20U/ml hIL-2、50ng/ml hIL-10和10ng/ml hIL-15，继续培养3天；

第二步前浆母细胞分化成浆母细胞：收集前浆母细胞，用PBS洗涤1遍，重悬在IMDM完全培养基中，加入20U/ml hIL-2、50ng/mL IL-6、50ng/ml hIL-10和10ng/ml hIL-15，培养3天；

第三步浆母细胞分化成浆细胞：在IMDM完全培养基中，加入50ng/mL IL-6、10ng/ml hIL-15和500U/ml IFN-α-2b，继续培养细胞3天；

第四步浆细胞分化成长寿浆细胞：收集浆细胞，均匀铺在辐照过的293T-APRIL饲养细胞上，加入10ng/mL hIL-6。持续培养，每周更换2次饲养细胞和细胞因子。

在分化的各个阶段收集细胞培养上清，用ELISA检测PD-1抗体的含量。如图6所示，实验结果表明用IDLV传递CRISPR/Cas9基因编辑过的B淋巴细胞仍然保持体外分化成长寿浆细胞的能力，并且，随着浆细胞的分化成熟，其分泌PD-1抗体的能力增强。

6、长寿浆细胞表型和转录特征

收集细胞，用流式抗体标记CD20、CD38、CD138表面分子，定义长寿浆细胞，并进一步

用BD Cytofix/Cytoperm^TM Fixation/Permeabilization Kit标记长寿浆细胞表面和胞质的其他分子标记物，包括CD27、Ki67、细胞表面IgG、细胞质IgG。如图7所示，结果表明相较于激活的B淋巴细胞，体外分化第30天的细胞群高表达CD27，不表达Ki67，丢失细胞表面IgG，胞内却富含IgG，这些都是长寿浆细胞的特征，证明他们长期存活，不再增殖，但是具有生产大量免疫球蛋白的能力。

此外，用流式分选出长寿浆细胞，提取细胞RNA，并反转成cDNA，用qPCR检测转录因子的表达，如图8所示，相较于激活的B淋巴细胞，这群体外分化的长寿浆细胞高表达浆细胞谱系转录因子PRDM1和IRF4，低表达PAX5、MYC、SPIB和ID3；增殖相关因子BCL6表达很低但是抗凋亡因子BCL2表达上抬；蛋白折叠调节因子XBP1高表达；生发中心相关基因AID表达下调。这些特异性的转录变化进一步验证了体外诱导分化第30天的细胞群是长寿浆细胞。

实施例2 sgRNA序列筛选

为了确定合适的sgRNA序列，在GAPDH 3’-UTR临近编码区终止子附近设计了3条sgRNA如表1所示，分别克隆到lentiCRISPR v2载体中，构建方法为实施例1中Cas9/sgRNA表达慢病毒质粒的构建。然后转染HEK293T细胞，经嘌呤霉素筛选后，提取基因组DNA。

表1 sgRNAs序列

利用T7E1酶切法检测突变体：

a.收集细胞提取基因组DNA，以此为模板，用PCR扩增出带有突变点(sgRNA靶序列)DNA片段；

b.配置如下反应体系：

PCR产物	300ng
		10×NEB buffer 2	2μl
ddH<sub>2</sub>O	定容至20μl

95℃加热5分钟，自然冷却至室温，进行退火反应；

c.加入1μl T7E1酶进行酶切，37℃孵育30分钟；

d.加入1μl 0.25M EDTA终止反应，立即用1％琼脂糖凝胶电泳。

结果如图9所示，第三条(sg-3)sgRNA切割率最高，为48.3％，而sg-1、sg-2的打靶效率远低于sg-3，分别为4.1％、7.5％，因此本发明将sg-3选作最终的打靶序列。

对比例1腺相关病毒介导CRISPR/Cas9在人原代B细胞中的定点敲入实验

在人原代细胞进行外源基因的定点敲入中，常用腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)传递同源重组模板。在本发明中，为了与IDLV作对比，将实施例1中的同源重组供体模板序列克隆到AAV载体质粒上，再与6型血清型的包膜质粒以及辅助质粒一起包装成AAV，用作B淋巴细胞外源基因同源重组模板传递工具。

结果如图10所示，在AAV MOI高达10⁶时，外源基因敲入比例依然非常低。因此，AAV不适用于人原代B淋巴细胞大片段外源基因的CRISPR/Cas9定点敲入。

对比例2狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLV与VSVG包装的IDLV对人原代B细胞感染对比

使用水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)包膜包装的IDLV的方法同实施例1中狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLVI包装和浓缩过程，不同之处在于，将狒狒逆转录病毒包膜替换成VSVG包膜。然后用狒狒逆转录病毒包膜包装的IDLV与VSVG包装的IDLV分别对人原代B细胞感染。

结果如图11所示，使用狒狒逆转录病毒包膜(BaEVTR)包装的IDLV对人原代B细胞感染率为60.3％，远高于水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)包膜包装的IDLV对人原代B细胞感染(8.0％)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分泌PD-1抗体的长寿浆细胞的制备方法，其特征在于，将PD-1抗体基因整合到B细胞中，得基因工程B细胞；将所述基因工程B细胞诱导成分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述PD-1抗体基因定点整合到B细胞的看家基因GAPDH位点。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统将PD-1抗体基因整合到B细胞中；优选地，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统含有SEQ ID NO:1所示的sgRNA核苷酸序列；所述sgRNA核苷酸序列为：AGCCCCAGCAAGAGCACAAG。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过整合酶缺陷的慢病毒传递所述CRISPR/Cas9基因编辑系统，将PD-1抗体基因定点整合到B细胞中；优选地，所述整合酶缺陷的慢病毒是狒狒逆转录病毒包膜包装的整合酶缺陷的慢病毒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导的方法为：通过细胞因子诱导和293T-APRIL饲养细胞共培养将基因工程B细胞诱导成分泌PD-1抗体的长寿浆细胞；所述293T-APRIL饲养细胞是由含有APRIL基因的慢病毒感染HEK293T细胞后并用X射线辐照细胞所得。

6.权利要求1至5任一所述的方法所制得的分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。

7.权利要求6所述的分泌PD-1抗体的长寿浆细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

8.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求6所述的分泌PD-1抗体的长寿浆细胞。

9.一种293T-APRIL饲养细胞，其特征在于，由如下方法构建得到：由含有APRIL基因的慢病毒感染HEK293T细胞后并用X射线辐照细胞所得。

10.权利要求9所述293T-APRIL饲养细胞在诱导长寿浆细胞方面的应用。

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