CN114457040A - 一种rspo1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用。本申请的RSPO1检测稳转细胞株为人胚胎肾细胞De‑RSPO‑CS，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C202224。本申请的RSPO1活性检测稳转细胞株，De‑RSPO‑CS为RSPO1蛋白功能测试及相关分子机制研究提供了一种新的研究工具。

Description

一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
R-脊椎蛋白(R-Spondin，RSPO)蛋白家族是含有血小板反应蛋白质1型重复序列(thrombospondin type1 repeat,TSR-1)的超家族。其家族有4个成员，分别为R-spondin1～4(RSPO 1～4)；它们的氨基酸序列同源性为40％～60％，且均含有1个羧基尾巴和2个富含半胱氨酸的弗林蛋白质酶域(furin-like cysteine-rich domains,FLD)。RSPOl被认为是一种崭新的内皮细胞分裂素，能够刺激黏膜的生长。实验显示，由DSS、TNBS等药物在小鼠肠道引发的急性或慢性炎症，可以通过注射RSPOl蛋白来改善，RSPOl通过调节Wnt/β-catemin信号通路刺激隐窝上皮细胞生长和黏膜再生以保持黏膜完整性，令肠道结构得到修复，从而使炎症带来的小鼠体重减轻、腹泻、直肠出血等症状得到减轻。与此相似的是，肿瘤小鼠在接受化学治疗或放射治疗时，RSPO同样可以通过刺激内皮细胞增殖使化疗药物和放射物对黏膜造成的损伤得到修复，从而保护正常组织免受毒副作用的影响，提示RSPO具有作为抗癌辅助药物的潜力。以上发现暗示RSPO在某些肿瘤的治疗中具有相当的潜力，有望成为新型的抗肿瘤基因治疗药物。
另有研究报道，RSPOl及其同源蛋白可作为配体特异性激活孤儿受体LGR5，并激活Wnt信号通路。而Wnt/β-catenin信号通路在细胞极性产生和细胞命运决定中发挥重要作用，包括通过干细胞群体进行的自我更新，进而影响生物体的组织分化，器官形成以及疾病发生。近年来，随着干细胞培养技术，特别类器官培养技术的兴起，RSPO-1作为培养基中的主要组成部分，也愈发凸显其重要性。
RSPO1的蛋白表达和纯化是满足其在干细胞培养和组织修复应用的必要途径。但纯化后的蛋白活性的定性和定量检测仍存在诸多问题：1)缺少特异性响应RSPO1的靶向序列；2)瞬时转染的细胞批次不稳定，影响RSPO1的定量检测。本发明构建了一株能够检测RSPO1稳定表达的细胞株，可以稳定的测试RSPO1蛋白的活性，为RSPO1的应用提供了技术保障。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用，解决了上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种RSPO1检测稳转细胞株，命名为人胚胎肾细胞De-RSPO-CS，于2022年1月20日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202224，地址为中国武汉，武汉大学。
本发明提供的人胚胎肾细胞De-RSPO-CS是通过以下方法进行构建：
S1.慢病毒载体pHS-AVC进行线性化处理后与测试RSPO1活性的元件序列进行连接形成终载体；
S2.终载体进行病毒包装，形成过表达慢病毒包装产物；
S3.过表达慢病毒包装产物感染293FT细胞，筛选，即得到RSPO1检测稳转细胞株。
本发明还提供了人胚胎肾细胞De-RSPO-CS的子代细胞。
本发明还提供了人胚胎肾细胞De-RSPO-CS及其子代细胞的用途，包含以下一项或多项：
a.用于RSPO1蛋白功能测试；
b.用于研究Wnt信号通路相关分子机制；
c.用于开发或测试Wnt相关拮抗剂/激动剂的药物。
本发明技术效果如下：
1.本发明成功建立了稳定检测RSPO1蛋白活性的稳转细胞株，为RSPO1蛋白功能机制研究提供了一种新的研究工具。
2.本发明构建RSPO1检测稳转细胞株所用的质粒，以慢病毒质粒pHS-AVC为骨架，在其多克隆位点插入TCF/LEF结合位点序列,微小启动子序列(Minimal TA promoter)，以及荧光检测蛋白Luciferase CDS序列，可以灵敏的检测Wnt信号通路中β-catenin介导的TCF/LEF转录活性水平。
3.本发明构建RSPO1检测稳转细胞株相比瞬时转染方式所获的细胞在蛋白测试方面具有更加稳定性的优势，解决了测试批次间的差异。
4.本发明构建RSPO1检测稳转细胞株细胞形态更加饱满，呈现长纤维状。分裂旺盛，可连续传代，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿，构建的细胞系稳定性好。
附图说明
图1 RSPO1检测稳转细胞株构建过程图
图2 RSPO1检测稳转细胞株构建的骨架载体图谱
图3终载体酶切验证结果图
图4慢病毒包装流程图
图5稳转细胞株筛选图
图6稳转细胞株测试商品化的RSPO1蛋白定性结果
图7稳转细胞株测试RSPO1蛋白的标准曲线及未知浓度的定量计算结果
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
主要仪器及生产商
仪器名称 生产厂家
Sorvall Legend Mircro 17台式离心机 美国ThermoFisher公司
Sorvall ST 16R冷冻离心机 美国ThermoFisher公司
微量移液器 德国Eppendorf公司
生物安全柜 新加坡ESCO公司
EVOS荧光显微成像系统 美国ThermoFisher公司
恒温二氧化碳细胞培养箱 德国Binder公司
实验室耗材I(移液枪头、1.5/2.0mL离心管) 美国Axygen公司
实验室耗材II(细胞培养皿、移液管等) 美国Corning公司
超低温冷冻冰箱 美国ThermoFisher公司
凝胶成像分析系统 北京赛智创业科技有限公司
凝胶电泳系统 美国BioRad公司
主要试剂及生产商
仪器名称 生产厂家
质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型) 北京艾德莱生物科技有限公司
限制性内切酶类 美国NEB公司/美国ThermoFisher公司
DNA Ligase 北京合生基因科技有限公司
慢病毒包装试剂盒 北京合生基因科技有限公司
EpFect Transfection Reagent 北京合生基因科技有限公司
EvaGreen 2×Master Mix 北京合生基因科技有限公司
DMEM高糖培养基 美国Gibco公司
胎牛血清 美国Gibco公司
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请所述的RSPO1检测稳转细胞株构建过程如图1所示。
病毒感染初期，荧光显微镜下并未观察到细胞发出荧光。随着感染天数的增加，细胞在感染一天后陆续发出荧光，到第三天时荧光表达量开始达到稳定。由于在病毒感染细胞的过程中，病毒基因组在细胞中的释放及其后整合至宿主基因组需要一段时间，因此细胞在病毒感染初期并未能启动由病毒携带的外源基因表达。随着病毒基因组在宿主基因组中的定点整合，细胞启动了对外源基因的表达。而由于腺相关病毒的整合特性，使外源基因能够在宿主细胞中得到长期稳定地表达。细胞荧光的检测确定了腺相关病毒对宿主细胞的有效感染，并介导了外源基因在宿主细胞里的顺利表达。
实施例1载体构建和病毒包装
1.基因过表达慢病毒载体构建
目的基因序列如下列所示(SEQ ID NO：1)
AGATCAAAGGGGGTAAGATCAAAGGGGGTAAGATCAAAGGGGGCCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTGAGCTCACGCGTAGATCTGCAGAAGCTTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA
其中，TCF bingding cite序列(SEQ ID NO：2)为：
AGATCAAAGGGGGTAAGATCAAAGGGGGTAAGATCAAAGGGGGCCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCTTACCCCCTTTGATCT
pTA序列(SEQ ID NO：3)为：
TAGAGGGTATATAATGGAAGCTC
从第205位开始为Luciferase CDS序列
目的基因按常规方法扩增得到目的基因的PCR回收产物。
(2)载体信息(如表2所示)
表2载体信息
载体编号 载体元件 原核抗性
pHS-AVC 5’-LTR；3’-LTR；Puro；WPRE等 Amp
载体图谱如图2所示。
(3)载体构建
①载体酶切
酶切骨架载体，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带：
酶切体系:
Figure BDA0003545842160000071
②连接
得到骨架载体回收产物后，选用T4连接酶进行连接，其反应体系如下所示：
反应体系：
Figure BDA0003545842160000072
反应条件：16℃恒温金属浴反应0.5-1h，之后取出进行转化。
③转化涂板及菌斑鉴定
无缝拼接后产物5-10μL转化至100μL感受态，42℃金属浴，热激1min,冰上迅速预冷2min，在超净工作台中，加入600μL无抗培养基，37℃摇床振荡培养1h，取适量菌液涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。菌落PCR后鉴定阳性克隆。
④阳性克隆摇菌及质粒提取
挑选3-4个单菌落摇菌，加入相应抗性培养基摇菌过夜(8mL LB液体培养基)，然后参照质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。
⑤质粒质控(酶切鉴定和目的基因测序)
完成过表达慢病毒质粒构建后，分别使用限制性内切酶对质粒进行了酶切鉴定以及目的基因的测序比对鉴定，以获得构建正确的质粒。载体酶切结果如图3所示。
测序引物序列如表3所示：
表3测序引物序列
Figure BDA0003545842160000081
2.慢病毒包装(具体包装流程见图4)
(1)HEK 293FT细胞准备
将3～5×106个HEK 293FT细胞传代接种至100mm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2的培养箱中，培养16h～24h。传代过程中需要将细胞充分消化为单细胞悬液，以获得较好的包装效果。
(2)慢病毒包装系统转染
①将慢病毒包装试剂盒中的包装质粒混合物(Package Plasmid Mix)及慢病毒表达质粒使用ddH2O稀释为终浓度1.0μg/μL的质粒溶液；
②取1支1.5mL离心管(标记为A管)，分别加入300μLOpti-MEM培养基及40μLEpFectTM Transfection Reagent，混匀后室温静置5min；
③取1支1.5mL离心管(标记为B管)，加入2.5μL终浓度为1.0μg/μL的慢病毒表达质粒质粒溶液及7.5μL Package Plasmid Mix，充分混匀；
④将A管中溶液加入B管中，充分混匀，室温静置15～30min；
⑤将B管中的混合溶液逐滴均匀加入接种HEK 293FT细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀，将培养皿置于37℃，5％CO2培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基；
(3)慢病毒收集及浓缩
①转染48h后，收集含有慢病毒的上清液，向培养皿中补充10～15mL新鲜的完全培养基；继续培养24h，进行第二次病毒上清液收集；
②将两次收集的病毒上清液混合，0.45μm滤器过滤，过滤后的病毒液可以进行浓缩或直接感染目的细胞；
③按照病毒上清液：浓缩试剂＝5:1比例进行混合，4℃放置2h或过夜；
④将混合液按照4℃，4000g离心30min，可见管底有米白色沉淀；小心移去上清，切勿碰触沉淀物，加入适量体积无血清培养基或PBS溶液，用微量移液器轻轻吹打重悬沉淀物；
⑤将病毒浓缩液分装，保存于-80℃，即取即用，切忌反复冻融。
(4)病毒质量检测
慢病毒的质量控制要点包括物理状态检测、无菌检测及病毒滴度检测。
①物理指标检测
颜色判定：通过肉眼判定，慢病毒保存液呈澄清液体状。
粘稠度判定：用20-200μL规格移液器缓慢吸取50μL慢病毒保存液体，无明显粘稠感或吸液滞后现象；
②无菌检测
将病毒加入293T细胞验证，正常培养24h后镜检，无任何细菌及真菌污染情况，同时参照空细胞组，细胞间隙无明显颗粒存在，培养基澄清透明。
③病毒滴度测定
采用的慢病毒滴定方法是qPCR法，具体流程为：
细胞接种：将生长状态良好的HEK 293H细胞消化计数后，按照105细胞/孔接种至12孔培养板中，每种病毒接种3个孔，置于37℃，5％CO2培养16～24h；
病毒感染：取20μL浓缩后的慢病毒液，稀释10倍后，分别取100/50/25μL，加入接种有HEK 293H细胞的12孔板中，并添加终浓度为8μg/mL的促感染试剂Polybrene，将培养液混匀后，置于37℃，5％CO2培养48～72h；
滴度测定：提取上述感染慢病毒的HEK 293H细胞的基因组DNA，稀释已知拷贝数的DNA标准品(104～109copies/μL)，与上述基因组同时进行qRT-PCR检测，qRT-PCR实验的扩增/检测对象为慢病毒载体上的WPRE序列(WPRE序列可以随目的基因整合入细胞基因组)，根据qRT-PCR的实验数据进行整理换算，即可获得慢病毒液的滴度。病毒滴度测定结果如表4所示：
表4病毒滴度测定结果
载体编号 载体类型 滴度
pHS-AVC-1513 过表达慢病毒 2.4e+08TU/mL
实施例2细胞株构建
1.慢病毒的稀释
从-80℃条件下取出慢病毒后，4℃冰箱中暂存。如果需要稀释病毒，可加用PBS或培养基，适当稀释后使用。
2.慢病毒感染293FT细胞
(1)第一天:铺板
准备细胞将状态良好的293FT细胞接种10cm培养皿中加入约1x106个细胞。加入10mL培养基。保证第二天感染病毒时融合率达到30-40％。
(2)第二天：感染。
取100μL浓缩后的慢病毒液，加入接种有293FT细胞的10cm培养皿中，并添加终浓度为8μg/mL的促感染试剂Polybrene，将培养液混匀后，置于37℃，5％CO2培养。
(3)第三天：换液
病毒感染12-24小时后，观察细胞状态。如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。加终浓度为2μg/ml Puromycin对细胞进行筛选。筛选结果如图5所示，筛选过的细胞株细胞形态更加饱满，呈现长纤维状。分裂旺盛，可连续传代，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿，构建的细胞系稳定性好。
(4)第五天：第二代
当10cm培养皿中细胞融合率达到90-100％时，进行细胞传代，培养基中加入终浓度为2-5μg/ml Puromycin对细胞进行筛选。
(5)第七天：第三代
当10cm培养皿中细胞融合率达到90-100％时，进行细胞传代，培养基中加入终浓度为2-5μg/ml Puromycin对细胞进行筛选。得到De-RSPO-CS稳转细胞株。
(6)第九天：铺板、传代
将稳转细胞株消化并制成细胞悬液，以每孔约1x104个细胞接种96孔板，同时以同样的方式处理未转染的293FT细胞做为对照。
(7)第十天：加入商品化的RSPO1蛋白用培养液作为稀释液，按照1ug/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL和0mg/mL浓度梯度进行稀释；将表达纯化的未知浓度的RSPO1蛋白按1:1000倍和1:500倍稀释；将上述标准品和待测样本分别加入到96孔板各测试孔中，每个测试重复四个孔，细胞继续培养48小时。
Figure BDA0003545842160000121
(8)第十二天：检测
用
Figure BDA0003545842160000122
Reporter Assay System(货号E1910)试剂盒进行检测。数据通过具有化学发光功能的多功能酶标仪读取。所有荧光值通过对0mg/mL相应的平均值进行归一化处理并进行统计学分析和制图。如图6所示：与对照293FT细胞相比，利用构建的De-RSPO1-CS细胞株检测标准的RSPO1蛋白具有非常好的特异性，证明构建的稳转细胞株可用于RSPO1蛋白的定性检测。如图7所示，De-RSPO1-CS细胞株检测标准的RSPO1蛋白的荧光结果与剂量呈良好线性关系，并通过对待测样本的检测结果计算获得其蛋白浓度为0.75mg/mL，证明了本发明构建的De-RSPO1-CS细胞株可用于RSPO1的定量分析。
综上，本发明成功建立了稳定检测RSPO1蛋白活性的稳转细胞株，为RSPO1蛋白功能机制研究提供了一种新的研究工具。本发明构建RSPO1检测稳转细胞株所用的质粒，以慢病毒质粒pHS-AVC为骨架，在其多克隆位点插入TCF/LEF结合位点序列,微小启动子序列(Minimal TA promoter)，以及荧光检测蛋白Luciferase CDS序列，可以灵敏的检测Wnt信号通路中β-catenin介导的TCF/LEF转录活性水平。构建的RSPO1检测稳转细胞株相比瞬时转染方式所获的细胞在蛋白测试方面具有更加稳定性的优势，解决了测试批次间的差异。同时，细胞株细胞形态更加饱满，呈现长纤维状。分裂旺盛，可连续传代，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿，构建的细胞系稳定性好。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 深圳明澳生物科技有限公司
<120> 一种RSPO1活性检测稳转细胞株及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1837
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggccccctt tgatcttacc 60
ccctttgatc ttaccccctt tgatctgagc tcacgcgtag atctgcagaa gcttagacac 120
tagagggtat ataatggaag ctcgacttcc agcttggcaa tccggtactg ttggtaaagc 180
caccatggaa gatgccaaaa acattaagaa gggcccagcg ccattctacc cactcgaaga 240
cgggaccgcc ggcgagcagc tgcacaaagc catgaagcgc tacgccctgg tgcccggcac 300
catcgccttt accgacgcac atatcgaggt ggacattacc tacgccgagt acttcgagat 360
gagcgttcgg ctggcagaag ctatgaagcg ctatgggctg aatacaaacc atcggatcgt 420
ggtgtgcagc gagaatagct tgcagttctt catgcccgtg ttgggtgccc tgttcatcgg 480
tgtggctgtg gccccagcta acgacatcta caacgagcgc gagctgctga acagcatggg 540
catcagccag cccaccgtcg tattcgtgag caagaaaggg ctgcaaaaga tcctcaacgt 600
gcaaaagaag ctaccgatca tacaaaagat catcatcatg gatagcaaga ccgactacca 660
gggcttccaa agcatgtaca ccttcgtgac ttcccatttg ccacccggct tcaacgagta 720
cgacttcgtg cccgagagct tcgaccggga caaaaccatc gccctgatca tgaacagtag 780
tggcagtacc ggattgccca agggcgtagc cctaccgcac cgcaccgctt gtgtccgatt 840
cagtcatgcc cgcgacccca tcttcggcaa ccagatcatc cccgacaccg ctatcctcag 900
cgtggtgcca tttcaccacg gcttcggcat gttcaccacg ctgggctact tgatctgcgg 960
ctttcgggtc gtgctcatgt accgcttcga ggaggagcta ttcttgcgca gcttgcaaga 1020
ctataagatt caatctgccc tgctggtgcc cacactattt agcttcttcg ctaagagcac 1080
tctcatcgac aagtacgacc taagcaactt gcacgagatc gccagcggcg gggcgccgct 1140
cagcaaggag gtaggtgagg ccgtggccaa acgcttccac ctaccaggca tccgccaggg 1200
ctacggcctg acagaaacaa ccagcgccat tctgatcacc cccgaagggg acgacaagcc 1260
tggcgcagta ggcaaggtgg tgcccttctt cgaggctaag gtggtggact tggacaccgg 1320
taagacactg ggtgtgaacc agcgcggcga gctgtgcgtc cgtggcccca tgatcatgag 1380
cggctacgtt aacaaccccg aggctacaaa cgctctcatc gacaaggacg gctggctgca 1440
cagcggcgac atcgcctact gggacgagga cgagcacttc ttcatcgtgg accggctgaa 1500
gagcctgatc aaatacaagg gctaccaggt agccccagcc gaactggaga gcatcctgct 1560
gcaacacccc aacatcttcg acgccggggt cgccggcctg cccgacgacg atgccggcga 1620
gctgcccgcc gcagtcgtcg tgctggaaca cggtaaaacc atgaccgaga aggagatcgt 1680
ggactatgtg gccagccagg ttacaaccgc caagaagctg cgcggtggtg ttgtgttcgt 1740
ggacgaggtg cctaaaggac tgaccggcaa gttggacgcc cgcaagatcc gcgagattct 1800
cattaaggcc aagaagggcg gcaagatcgc cgtgtaa 1837
<210> 2
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatcaaagg gggtaagatc aaagggggta agatcaaagg gggccccctt tgatcttacc 60
ccctttgatc ttaccccctt tgatct 86
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagagggtat ataatggaag ctc 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catagttaag aataccagtc aatc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaccagcag ggcagattga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggccgcgc agcaacagat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgatgaaca gggcacccaa 20

Claims (4)

1.一种RSPO1检测稳转细胞株，其特征在于，所述RSPO1检测稳转细胞株为人胚胎肾细胞De-RSPO-CS，于2022年1月20日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202224。
2.如权利要求1所述的人胚胎肾细胞De-RSPO-CS细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
S1.慢病毒载体pHS-AVC进行线性化处理后与测试RSPO1元件序列进行连接形成终载体；
S2.所述终载体进行病毒包装，形成过表达慢病毒包装产物；
S3.所述过表达慢病毒包装产物感染293FT细胞，筛选，即得到RSPO1检测稳转细胞株。
3.如权利要求1所述的人胚胎肾细胞De-RSPO-CS的子代细胞。
4.如权利要求1-2任一项所述的人胚胎肾细胞De-RSPO-CS的用途，选自以下任一项或多项：
a.用于RSPO1蛋白功能测试；
b.用于研究Wnt信号通路相关分子机制；
c.用于开发或测试Wnt相关拮抗剂/激动剂的药物。
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