CN108265080A - PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法 - Google Patents

PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学研究领域，具体地说涉及一种PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法。该细胞株的建立是利用慢病毒载体将PlexinB2基因转染入肺癌细胞，并经药物抗性筛选获得PlexinB2基因沉默的稳定细胞株。应用细胞荧光显微成像、Real‑time PCR和Western blot技术检测细胞株PlexinB2的表达，证明细胞株构建成功。本细胞株的建立为研究PlexinB2在肺癌发生、发展及转移中的作用及相关分子机制提供了新的实验材料。

Description

PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌的病因至今尚不完全明确，复发和转移是许多患者治疗失败和死亡的主要原因，因而揭示肺癌转移的机制，进而预测肺癌的转移潜能，对判断预后和选择合理而有效的治疗方案、延长患者的生存期和提高生活质量等具有重要的意义。
神经丛素(Plexins)是一个广泛分布的跨膜受体家族，是信号素(Semaphorins)的受体，介导Semaphorins在细胞内信号传导，分为4个亚家族：Plexin-A(1-4)、Plexin-B(1-3)、Plexin-C1和Plexin-D1。研究表明，Plexins在多种肿瘤细胞中广泛表达，有些Plexins高表达与肿瘤转移有关。其中，Plexin-B2位于第22号染色体，包含37个编码外显子，有1838个氨基酸组成，为Sema4C的高亲和力受体，可受肝细胞生长因子HGF的介导的细胞内信号调控而促进细胞迁移。最近的研究显示，在神经元细胞中Plexin-B2与Rnd3表达可能是负相关的关系，Plexin-B2可通过激活RhoGEFs蛋白，在进一步活化RhoA蛋白，从而促进神经元迁移，而Rnd3通过抑制RhoGAP激活，从而抑制RhoA蛋白活化，最终降低神经元的迁移，同时Rnd3可能还受Plexin-B2负调控。在细胞骨架研究方面，Plexins通过与LARG和PDZ-RhoGEF结合可使Rho活化，在Plexins家族中只有Plexin B亚家族成员含有PDZ域结合位点，一些Semaphorins作用于Plexin B可以调控Rho，从而在轴突导向和细胞迁移时调节细胞骨架肌动蛋白、整合素功能、细胞粘附等，这提示Plexin-B2可能在肺癌中也能起到微丝骨架调控作用。PAK1可能在多种信号通路中处于关键位置，是多种信号分子的下游靶蛋白，同时也是多种信号分子的上游调控蛋白，研究证实，PAK1可被多种生长因子如HGF、IGF、PDGF、EGF等通过多种路径激活。已有多项报道PAK1是Rho家族Cdc42和Rac1下游的重要靶蛋白，参与了细胞骨架的调节、细胞凋亡、细胞转分化等生物学行为，提示它在信号网络中可能起到关键的调控作用。此外，大量研究结果表明，激活的PAK1可通过下游效应物的作用LIMK1/2、Cofilin促进细胞骨架重构和肿瘤细胞迁移，而失活的PAK1则引起相反的效应。关于Plexin-B2在肿瘤中的研究尚少，其在肺癌中的作用尚不明确。我们以往的研究及其他文献报道，PAK1/LIMK-1/微丝骨架蛋白在肺癌增殖、转移过程中发挥重大作用。然而，Plexin-B2是否调控PAK1/LIMK-1/Cofilin通路并影响肺癌的增殖和转移，目前尚不清楚。我们前期的预实验表明Plexin-B2在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，提示Plexin-B2可能参与肺癌发生及转移的调控。
目前，文献报道Plexin-B2功能研究主要采用表达质粒瞬时转染方法，其缺点是Plexin-B2的表达不稳定、不持久。然而，慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、稳定促进目的基因表达的优点。现有技术中尚无持续、稳定沉默Plexin-B2基因的人肺癌细胞株。本发明通过慢病毒转染得到的稳定细胞株，为研究肺癌Plexin-B2/PAK1/LIMK-1/Cofilin信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法，为研究肺癌PAK1/LIMK-1/Cofilin信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
本发明通过以下技术方案实现：该细胞株利用基因重组技术将人PlexinB2基因克隆入慢病毒表达载体，通过293T细胞包装得到病毒载体，然后将获得的病毒感染目的细胞，Puromycin进行药物筛选，RT-PCR鉴定阳性细胞簇、扩大培养，收获蛋白再用Western Blot进行鉴定，最终获得稳定细胞株，将其冻于液氮中保藏。与现有技术相比，本发明通过慢病毒转染得到的稳定细胞株，具有转染效率高，用量少，能特异、持续干扰PlexinB2表达的优点。本发明为研究肺癌PAK1/LIMK-1信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
附图说明
图1是本发明的载体图谱
图2是本发明的重组质粒的测序鉴定
图3是本发明通过稳定沉默PlexinB2基因表达的肺癌A549及PC-9稳定细胞株在激光共聚焦显微镜(200×)的细胞荧光鉴定图
图4是本发明通过稳定沉默PlexinB2基因表达的肺癌A549及PC-9稳定细胞株RT-PCR鉴定图
图5是本发明通过稳定沉默PlexinB2基因表达的肺癌A549及PC-9稳定细胞株WesternBlot鉴定图
具体实施方式
1材料与方法
1.1材料 人肺癌A549细胞、PC-9细胞、人肾上皮细胞293T购自中国科学院上海细胞所，慢病毒包装试剂盒购自上海吉凯基因，胎牛血清和RPMI 1640培养基购自Gibco公司，Xho I、Hpa I内切酶和T4DNA连接酶购自NEB公司，质粒提取试剂盒试剂盒购自OMEGA公司，转染试剂Lipofectamine 2000和总RNA提取试剂TRIzoi购自Invitrogen公司，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)和荧光定量PCR试剂盒SYBR PremixEx Taq II(Tli RNaseH Plus)购自TAKARA公司，GAPDH、PlexinB2抗体购自美国CellSignaling公司，化学发光试剂购自Bio-Rad公司，倒置荧光显微镜Leica，凝胶成像系统，iMARK型全自动酶标仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2方法
1.2.1干扰序列设计
在GenBank检索出入Plexin B2基因核苷酸序列(基因号NM_012401)，设计针对人PlexinB2的2个干扰RNA序列(Tab 1)。正义与反义siRNA之间由6个碱基(CTCGAG)的loop环连接，同时设计1条无关序列作为阴性对照，作用序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，通过BLAST验证该序列对任何基因无干扰效应。
Tab 1：PlexinB2干扰RNA序列
1.2.2慢病毒表达载体的构建及鉴定
空载体GV248含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)序列，用限制性内切酶Age I\EcoR I双酶切空载体，并回收酶切片段。上下游OligoDNA经退火形成双链DNA，然后与线性化后的空载体GV248在T4DNA连接酶作用下16℃过夜连接，连接产物转化感受态细胞Stb13。37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，PCR引物为载体多克隆位点两端的引物，序列为F：5′-TACGTCAAGTCTTACGGCAAGAATA-3′，R：5′-GAGCTTATCGATACCGTCGAC-3′，空载体质粒会扩增出239bp的片段，插入shRNA序列的质粒会扩增出305bp的片段。PCR鉴定阳性的菌落接种LB液体培养基中培养过夜，提取质粒送测序。经测序鉴定正确的重组质粒分别命名为PLXNB2-RNAi(42950-1)、PLXNB2-RNAi(42951-2)。
1.2.3慢病毒包装
收集对数生长期的293T细胞，接种5×107个于15cm的培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。按照Lipofectamine 2000说明书用脂质体进行共转染：在灭菌EP管中加入配制好的各DNA溶液，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；在另一灭菌EP管中取Lipo2000试剂与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5min；把稀释后的DNA与稀释后的Lipo2000进行混合，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipo2000稀释液的转染复合物；将转染复合物转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。转染48h后收集293T细胞的上清，用0.45μm滤器进行过滤，滤液经超速离心后浓缩，分装，保存于-80℃。PLXNB2-RNAi(42950-1)和PLXNB2-RNAi(42951-2)经包装后获得的慢病毒分别命名为PlexinB2-shRNA-1和PlexinB2-shRNA-2。
1.2.4病毒滴度测定
滴度测定采用逐孔稀释法，测定前1d将5×104/ml 293T细胞按每孔100μL接种于96孔板中，常规培养24h。准备10个无菌的EP管，每个管中加入90μL培养基，取病毒原液10μL加入到第1个管中，混匀后，取10μL加入到第2个管中，如此依次做10∶1倍比稀释。选取96孔板中所需的细胞孔，吸去90μL培养基，加入稀释好的病毒溶液，37℃培养48h后，加入新鲜培养基100μL继续培养。96h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况，计数孔中荧光细胞数，结合稀释倍数计算病毒滴度：滴度(TU/ml)＝荧光细胞数×有效稀释倍数。
1.2.5稳定干扰细胞株的建立
取对数生长期状态良好的A549细胞按每孔5×105个接种于6孔板。24h细胞贴壁后，加入上述包装好的病毒。培养8h后，更换为新鲜RPMI 1640完全培养基2mL继续培养，72h后荧光显微镜下观察感染效率。转染96h后，加入终浓度2mg/ml的Puromycin进行药物筛选；每3天更换一次含2mg/ml Puromycin的RPM1-1640培养基，筛选4周。然后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。在荧光显微镜下观察单克隆形成的情况，对荧光强度较高的阳性克隆孔，扩大培养，为下一步检测作准备。得到的2株稳定干扰细胞分别命名为A549/shPlexinB2-1和A549/shPlexinB2-2，阴性对照细胞命名为照细胞命名为A549/shControl。
取对数生长期状态良好的PC-9细胞按每孔3×105个接种于6孔板。24h细胞贴壁后，加入上述包装好的病毒。培养8h后，更换为新鲜RPMI 1640完全培养基2mL继续培养，72h后荧光显微镜下观察感染效率。转染96h后，加入终浓度0.5mg/ml的Puromycin进行加药筛选；每3天更换一次含0.5mg/ml Puromycin的RPM1-1640培养基，筛选4周。然后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。在荧光显微镜下观察单克隆形成的情况，对荧光强度较高的阳性克隆孔，扩大培养，为下一步检测作准备。得到的2株稳定干扰细胞分别命名为PC-9/shPlexinB2-1和PC-9/shPlexinB2-2，阴性对照细胞命名为照细胞命名为PC-9/shControl。
1.2.6RT-PCR检测细胞PlexinB2mRNA干扰效率
收集A549/shPlexinB2-1、A549/shPlexinB2-2、A549/shControl、PC-9/shPlexinB2-1、PC-9/shPlexinB2-2和PC-9/shControl细胞，按TRIzol试剂和反转录试剂盒说明书提供的方法提取细胞总RNA，并将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，应用荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，PlexinB2和GAPDH基因引物由上海生工合成。PlexinB2：5′-GAGCATTTCAGTTCCGCTGTG-3′(上游)，5′-AGTCAGCAGTGATGCAAAGT-3′(下游)；GAPDH：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′(上游)，5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′(下游)。PCR反应条件：95℃ 60s；95℃ 15s、60℃ 1min，共40个循环。以2-ΔΔCt值表示PlexinB2基因mRNA的相对表达水平。
1.2.7Western blot检测细胞PlexinB2蛋白干扰效率
收集A549/shPlexinB2-1、A549/shPlexinB2-2、A549/shControl、PC-9/shPlexinB2-1、PC-9/shPlexinB2-2和PC-9/shControl细胞，加入细胞裂解液冰上裂解30min，冰上进行操作。收集到EP管，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度定量。取10～15μg蛋白质进行10％SDS-PAGE电泳，分离后的蛋白质电转移至PVDF膜上，用含5％BSA的PBST封闭1h，分别加入对应一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入对应二抗室温摇床孵育2h，TBST洗膜3次，ECL发光试剂盒发光显影，定影后进行分析。
1.3统计学方法
数据以均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件分析，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
2实验结果
2.1荧光显微镜下观察PlexinB2-shRNA稳转后细胞的形态
用PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2两种慢病毒分别感染A549细胞和PC-9细胞后，都可观察到绿色荧光，感染率达到100％，如图2。
2.2RT-PCR检测稳转后细胞内PlexinB2mRNA的表达
应用实时荧光定量PCR检测结果显示，PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2稳定干扰A549细胞后PlexinB2mRNA的相对表达水平都明显低于PlexinB2/shControl细胞。PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2mRNA干扰率分别是(74.23±2.28)％和(61.46±2.39)，差异有统计学意义(P＜0.01)，如图3。PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2稳定干扰PC-9细胞后PlexinB2mRNA的相对表达水平也都明显低于PlexinB2/shControl细胞。PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2mRNA干扰率分别是(87.43±3.34)％和(78.45±2.29)，差异有统计学意义(P＜0.01)，如图3。
2.3Western blot检测稳转后细胞内PlexinB2蛋白的表达
应用Western blot检测结果显示：PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2稳转A549细胞后PlexinB2蛋白水平表达都较空白载体组显著降低，PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2蛋白表达水平分别为对照组0.34和0.53倍(P＜0.01)，如图4。PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2稳转PC-9细胞后PlexinB2蛋白水平表达都较空白载体组显著降低，PlexinB2-shRNA1和PlexinB2-shRNA2蛋白表达水平分别为对照组0.11和0.19倍(P＜0.01)，如图4。

Claims (3)

1.一种PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法，其特征在于，利用基因重组技术将人PlexinB2基因克隆入慢病毒表达载体，通过293T细胞包装得到病毒载体，然后将获得的病毒感染肺癌细胞，经Puromycin药物筛选，RT-PCR鉴定阳性细胞簇、扩大培养，收获蛋白再用Western Blot进行鉴定，最终获得稳定细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株，其特征在于稳定细胞株的构建方法，具体步骤如下：
(1)利用基因重组技术将人PlexinB2基因克隆入慢病毒表达载体GV248中，构建成GV248-PlexinB2，重组质粒经测序鉴定；
(2)接种293T细胞5×107个于15cm的培养皿中培养，24h后按照Lipofectamine2000说明书进行共转染：在灭菌EP管中加入配制好的各DNA溶液，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；在另一灭菌EP管中取Lipo2000试剂与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5min；把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；将转染复合物转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。转染48h后收集293T细胞的上清，用0.45μm滤器进行过滤，滤液经超速离心后浓缩，分装，保存于-80℃。
(3)接种A549细胞于6孔板，24h后，加入包装好的病毒感染。培养8h后，更换为新鲜培养基继续培养，72h后荧光显微镜下观察感染效率。转染96h后，加入终浓度2mg/ml的Puromycin进行药筛选，筛选4周后在显微镜下挑取阳性细胞簇，进行单细胞克隆，获得稳定细胞株。对于PC-9细胞加入终浓度0.5mg/ml的Puromycin进行药筛。
3.根据权利要求1所述的一种PlexinB2基因沉默的人肺癌稳定细胞株，其特征在于获得的稳定肺癌细胞株可为研究肺癌Plexin-B2/PAK1/LIMK-1/Cofilin信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
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