CN105296600A

CN105296600A - Med23基因的用途及其相关药物

Info

Publication number: CN105296600A
Application number: CN201410225081.5A
Authority: CN
Inventors: 王纲; 初雅婧
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation of molecular cell science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-05-26
Also published as: CN105296600B

Abstract

本发明公开了Med23基因的用途及其相关药物。本发明公开了Med23基因在制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物，或者在筛选2型糖尿病诱发药物中的用途。本发明还进一步构建了Med23基因小分子干扰RNA、Med23基因干扰核酸构建体、Med23基因腺病毒并公开了它们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、腺病毒能够特异性敲除或抑制Med23基因的表达，尤其是腺病毒，能够高效侵染肝细胞，高效率地抑制肝细胞中Med23的表达，在预防/治疗2型糖尿病中具有重要意义。

Description

Med23基因的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及Med23基因的用途及其相关药物。

背景技术

作为当前分子生物学研究的一个热点课题，Mediator被认为是信息中转整合的“路由器”并且普遍参与到受PolII调控基因的转录过程(MalikandRoeder,2010)。Mediator复合物的发现人之一RogerKornberg教授由于其在真核转录系统中做出的杰出贡献，获得了2006年度的诺贝尔化学奖。瑞典皇家科学院在获奖公告中指出，“真核生物的复杂性源于特异转录因子，DNA增强子和Mediator三者的相互作用，Mediator的发现是揭示转录过程的一个里程碑”。转录信号从增强子传递到启动子，从转录因子到PolII(RNAPolymeraseII，PolII)，Mediator作为信息传递的桥梁一头连接转录因子，一头连接基础转录因子和PolII，参与基因的转录调控过程(Carlstenetal.,2013)。Mediator在真核生物中普遍存在，被认为是PolII转录装置中的一个必需组分，与PolII和通用转录因子(GTFs)有同等重要的作用。

尽管Mediator作为一个复合物普遍参与转录过程，但是在功能上又有其特异性(MalikandRoeder,2010；YinandWang,2014)。不同的转录因子受到特定的环境或发育信号的刺激时，会与Mediator复合物中的某个特定的亚基发生特异的相互作用，继而促进Mediator在增强子区域的富集并发生在结构上的改变，招募通用转录因子和PolII到启动子区域聚集并形成转录起始前复合物(Pre-initiationcomplex，PIC),进而参与基因表达的水平的调控并最终导致特定的生物学现象的发生(MyersandKornberg,2000；Ryuetal.,1999；Takahashietal.,2011)。目前的研究结果揭明了一些Mediator组分蛋白在特定生物过程如发育、癌症和代谢等方面的功能(Blazeketal.,2005；Wangetal.,2009)。比如在发育过程中，MED1(Geetal.,2002)、MED14(Grontvedetal.,2010)和MED23(Wangetal.,2009)通过不同的机制参与脂肪细胞分化的不同阶段，从而影响脂肪细胞的成熟；MED23(Yinetal.,2012)和MED28(Beyeretal.,2007)参与平滑肌细胞的分化。在癌症方面，MED15影响TGFβ信号通路活性并在乳腺癌组织中高表达(Zhaoetal.,2013)；MED23作为RAS-MAPK下游的关键节点影响肺癌的发生(Yangetal.,2012)。在代谢方面，MED15可以通过与SREBP1a相互作用参与调节脂质代谢平衡(Yangetal.,2006)；MED25通过影响HNF4α的靶基因调节异生物质和脂质代谢(Ranaetal.,2011)等等。

MED23又叫Sur2(suppressorofras2)，位于Mediator复合物尾部，最早是在线虫中被鉴定出来的一个蛋白，是Ras/MAP-kinasepathway下游的一个靶标(SinghandHan,1995)。目前已知腺病毒因子E1A和MAPK激酶激发的转录因子Elk1可以与之相互作用从而影响下游特定基因的表达。我们实验室的研究工作证明了MED23作为Ras/MAP-kinasepathway的下游参与Ras-active肺癌的发生发展，同时建立了MED23在肺癌细胞株和肺癌临床样本中与ras-active肺癌发生发展的相关型。另外，本实验室进一步的研究表明，MED23既是脂肪细胞分化过程中胰岛素信号转导途径和脂肪细胞分化基因转录网络的一个重要节点，又是肌肉细胞的分化调控的一个关键因子(Wangetal.,2009；Yinetal.,2012)。脂肪、肌肉和肝脏是能量代谢主要器官，而参与脂肪和肌肉分化调控的一些关键基因在能量代谢调控中也起着重要的作用，如调控脂肪细胞分化的转录因子PPARγ2对于肝细胞中脂生成(lipogenesis)和脂质的积累(lipidaccumulation)具有调节作用(Schadingeretal.,2005)，但是MED23在糖脂代谢方面以及对2型糖尿病、癌症的发生发展起到的作用，未曾有研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，公开与Med23基因相关的治疗方法及药物，以基因敲除或RNAi为手段研究Med23基因在糖脂代谢方面以及对2型糖尿病发生发展所起到的作用。

本发明的第一方面，以RNA干扰为手段，研究了Med23基因在2型糖尿病发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肝组织中Med23表达的方法，该方法包括：向动物施用一种能够特异性抑制Med23基因的转录或翻译，或能够特异性抑制Med23蛋白表达或活性的分子，以此来抵抗2型糖尿病。

所述抑制或降低肝组织中Med23表达的方法中，所述分子的施用量为足够降低Med23基因的转录或翻译，或者足够降低Med23蛋白表达或活性的剂量。进一步的，所述Med23基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或干扰腺病毒。

所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。

所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有Med23基因的启动子序列或Med23基因的信息序列。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与Med23基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人Med23基因的表达。

进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与Med23基因中的靶序列基本相同。较优的，所述Med23基因中的靶序列含有SEQID：5-6中之任一序列。

所述Med23基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默Med23基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的Med23基因中的片段。

较佳的，所述Med23基因来源于人。

本发明的第一方面还公开了一种Med23基因在制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物，或者在筛选2型糖尿病药物诱发中的用途。

所述将Med23基因用于制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物包括两方面的内容：其一，将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用靶标应用于制备2型糖尿病预防/治疗药物或制剂；其二，将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用靶标应用于筛选2型糖尿病预防/治疗药物或制剂。

所述将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用靶标应用于制备2型糖尿病预防/治疗药物或制剂具体是指：将Med23基因作为基因敲除或者RNA干扰作用的靶标，来研制针对2型糖尿病的药物或制剂，从而敲除或降低肝脏组织内Med基因的表达水平。

将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用靶标应用于筛选2型糖尿病预防/治疗药物或制剂，具体是指：将Med23基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以敲除或抑制Med23基因表达的药物作为2型糖尿病预防/治疗药物或制剂。如本发明所述的Med23基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以Med23基因为作用对象筛选获得的。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将Med23基因及其蛋白作为作用对象。

所述2型糖尿病预防/治疗药物或制剂为能够特异性敲除Med23基因、抑制Med23基因的转录或翻译，或能够特异性抑制Med23蛋白的表达或活性的分子，从而敲除Med23基因或降低肝组织中Med23基因的表达水平，达到预防或治疗2型糖尿病的目的。

所述通过Med23基因制备或筛选获得的预防或治疗2型糖尿病的药物或制剂包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或干扰腺病毒。

所述预防或治疗2型糖尿病的药物或制剂的施用量为能够敲除Med23基因、足够降低Med23基因的转录或翻译，或者足够降低Med23蛋白的表达或活性的剂量。以使Med23基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

所述将Med23基因用于筛选2型糖尿病诱发药物，是指首先构建一种抵抗2型糖尿病小鼠模型，然后将诱发2型糖尿病备选药物施用于前述抵抗2型糖尿病小鼠，通过比较用药前后小鼠的血糖、胰岛素、胆固醇和甘油三酯水平变化；胰岛素敏感、葡糖糖耐受和丙酮酸耐受情况以及对肥胖的抵抗情况，筛选出使小鼠出现2型糖尿病症状的药物作为2型糖尿病诱发药物。

所述构建抵抗2型糖尿病小鼠模型的方法，采用的是条件性基因打靶技术，将Med23基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠与在肝脏特异性启动子Albumin的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得抵抗2型糖尿病小鼠模型。

以Cre/LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因打靶(conditionalgenetargeting)策略主要是运用DNA重组方法来构建打靶基因置于同向LoxP之内的打靶载体,经在ES细胞(胚胎干细胞)上同源重组及筛选,将携带该载体的小鼠与受控于组织特异性启动子的Cre基因的转基因小鼠交配,经Cre介导重组,即可获得靶基因在某一组织器官上缺失的基因敲除小鼠。

进一步的，所述抵抗2型糖尿病小鼠模型的构建步骤如下：

1)构建标记小鼠：通过同源重组的方法构建Med23基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠；

2)构建Cre小鼠：构建在肝脏特异性启动子Albumin的作用下表达Cre重组酶的Cre小鼠；

3)将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选，获得剔除Med23基因的纯合子小鼠即为抵抗2型糖尿病小鼠模型。

本发明所述剔除Med23基因的纯合子小鼠并不是在小鼠所有细胞基因组上都存在基因的缺失，而只是在受Albumin启动子调控的肝脏组织中缺失，是Med23基因被条件性敲除的纯合子小鼠。

较优的，所述2型糖尿病小鼠模型的构建步骤具体为：

1)构建标记小鼠：将含有Lox-Med23-Lox基因片段的载体转化胚胎干细胞，使其与胚胎干细胞的Med23基因组发生同源重组；然后将同源重组后的阳性胚胎干细胞植入胚胎，产生Med23基因两侧带有loxP位点的后代即为标记小鼠；

2)构建Cre小鼠：通过转基因技术将表达Cre重组酶的基因引入基因组中，并位于组织特异性基因启动子Albumin的控制下，获得在肝脏特异性启动子Albumin的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠；

3)将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选剔除了Med23基因的纯合子小鼠，即为抵抗2型糖尿病的小鼠模型。

所述标记小鼠可以为Med23^Flox/Flox小鼠；所述Cre小鼠可以为Albumin-Cre转基因小鼠。

所述启动子Albumin的GeneID为11657。

Cre(CyclizationRecombinationEnzyme,即环化重组酶)是来源于P1噬菌体cre基因所编码的一个大小为38kDa的蛋白,属于Intergrase家族。它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为LoxP的特异靶位点,并根据LoxP的方向性,可在各种底物上介导三种不同的重组事件：a.同向位点之间序列的缺失；b.插入序列；c.两个反向位点之间序列颠倒。

靶基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠的构建，以及组织特异性启动子控制下的Cre小鼠的构建均属于现有技术。本发明所针对的靶基因为Med23基因，Cre重组酶受启动子Albumin的控制特异性表达，条件性剔除小鼠体内肝脏部位的Med23基因。本发明实施例中，标记小鼠采用的是Med23^Flox/Flox转基因小鼠，Cre小鼠为Albumin-Cre小鼠，均为现有的已构建小鼠。

本发明其次公开了一种抵抗2型糖尿病小鼠模型，由前述方法制备获得。

本发明的抵抗2型糖尿病小鼠模型，其体内受Albumin启动子控制的Med23基因的表达被选择性的抑制。所述小鼠在常规饲料喂养的条件下，空腹血糖值有下降的倾向，血液胰岛素、胆固醇和甘油三酯水平正常，并且表现为轻微的胰岛素敏感、葡糖糖耐受和丙酮酸耐受；当采用高脂饲喂诱导小鼠发生肥胖时，所述小鼠表现为对肥胖的抵抗；所述小鼠在饥饿14h时血糖呈现显著下降、胰岛素相对敏感和葡萄糖输出能力降低。

本发明还公开了前述构建抵抗2型糖尿病小鼠模型的方法，以及前述抵抗2型糖尿病小鼠模型在筛选诱发2型糖尿病模型药物中的应用。可以简便、快速和高效地实现对导致2型糖尿病的潜在药物进行的定性和/或定量的评价。

由上所述，本发明的抵抗2型糖尿病小鼠模型是首次发明，构建方法简便、经济，而且本发明中小鼠可以自发地抵抗肥胖和2型糖尿病的形成，不需要特别的处理，因此极具市场价值和医药用途的前景。

本发明第二方面公开了一种降低肝组织中Med23基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

1)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与Med23基因杂交的核苷酸序列；或者

2)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与Med23基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与Med23基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与Med23基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与Med23基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。

更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与Med23基因中的靶序列基本相同。

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO：20所示，具体为5’-GAGAUAAGUAAGUUACAUG-3’；

或者如SEQIDNO：21所示，具体为5’-UGAAGCCCAGGUUUGUUAU-3’。

所述的siRNA为以SEQIDNO:5和6所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对Med23基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肝组织中内源Med23基因表达的作用。

进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与Med23基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默细胞中内源Med23基因表达的作用。

更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与Med23基因中的靶序列基本相同。

较佳的，所述正义链片段与Med23基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与Med23基因中19、20或21个连续的核苷酸序列基本相同。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。优选的，所述茎环结构为UUCAAGAGA。

更进一步的，所述shRNA的序列如SEQIDNO:22所示，

具体为：

5’-GAGAUAAGUAAGUUACAUGUUCAAGAGACAUGUAACUUACUUAUCUC-3’；

或者，所述shRNA的序列如SEQIDNO:23所示，

具体为：

5’-UGAAGCCCAGGUUUGUUAUUUCAAGAGAAUAACAAACCUGGGCUUCA-3’。

shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肝组织中内源性Med23基因表达的作用。

编码本发明所述shRNA的基因片段的腺病毒病毒载体含有SEQID5或6的序列及其互补序列。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与Med23基因中的靶序列基本相同，所述Med23基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默Med23基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的Med23基因的片段。

较佳的，所述Med23基因中的靶序列含有SEQIDNO:5或6的序列。

进一步的，所述Med23基因来源于人。

本发明第三方面，公开了一种Med23基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述的Med23基因干扰核酸构建体可以是将编码前述Med23基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述Med23基因干扰核酸构建体为Med23基因干扰腺病毒载体。

本发明的Med23基因干扰腺病毒载体是将编码前述Med23基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为腺病毒载体，所述Med23基因干扰腺病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肝组织细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默Med23基因的表达。

本发明实施例具体列举了以RNAi-ReadypSIREN-RetroQ为载体构建的Med23基因腺病毒载体。

本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物。

本发明的Med23基因siRNA可用于抵抗2型糖尿病，进一步地可以用作预防或治疗2型糖尿病的药物或制剂。Med23干扰腺病毒载体则可用于制备所述Med23基因siRNA。当用作预防或治疗2型糖尿病的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第四方面，公开了一种Med23基因干扰腺病毒，由前述Med23基因干扰腺病毒载体在腺病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该腺病毒可感染肝组织细胞并产生针对Med23基因的小分子干扰RNA，从而抵抗2型糖尿病。该Med23基因干扰腺病毒可用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物。

本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗2型糖尿病的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，Med23基因干扰核酸构建体或Med23基因干扰腺病毒中的一种或多种的组合。

进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％所述双链RNA、shRNA、Med23基因干扰核酸构建体或Med23基因干扰腺病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明还公开了所述药物组合物在制备预防或治疗2型糖尿病预防/治疗药物中的应用。

该药物组合物的应用为2型糖尿病的预防/治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内2型糖尿病的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内2型糖尿病时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述2型糖尿病被抵抗。

所述方法的对象可以为人。

本发明第六方面，公开了一种用于降低肝组织细胞中的Med23基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，Med23基因干扰核酸构建体，和/或所述的Med23基因干扰腺病毒。

综上所述，本发明设计了针对Med23基因的RNAi靶点序列，构建相应的Med23RNAi载体，其中编码序列SEQIDNO：5或6的RNAi载体能够显著下调Med23基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用腺病毒作为基因操作工具携带RNAi载体能够靶向地将针对Med23基因的RNAi序列高效导入肝组织中，降低Med23基因的表达水平，显著抵抗2型糖尿病。因此腺病毒介导的Med23基因沉默是2型糖尿病潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、腺病毒能够特异性抑制Med23基因的表达，尤其是腺病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中Med23基因的表达，进而减轻2型糖尿病症状，在2型糖尿病的预防或治疗中具有重要意义。

附图说明

图1A：抵抗2型糖尿病小鼠模型构建图解

图1B：小鼠基因型的PCR基因定结果

图1C：Westernblot检测Med23基因在不同组织中的表达情况

图1D：HE染色检测模型小鼠肝脏组织形态变化

图2：在正常饲喂条件下肝脏MED23特异性敲除小鼠的表现为胰岛素敏感

其中，

图2A：小鼠在饥饿(fasted)状态下的体重和肝重

图2B：小鼠在进食(refed)状态下的体重和肝重

图2C：小鼠在饥饿过夜后的胰岛素水平

图2D：小鼠在进食和饥饿6h、12h、24h状态时的血糖水平

图2E：小鼠GTT实验过程中的血糖水平

图2F：小鼠ITT实验过程中的血糖水平

图2G：小鼠PTT实验过程中的血糖水平

图3：肝脏Med23特异性敲除小鼠可以抵抗高脂食物诱导的肥胖

其中，

图3A：小鼠在饲喂高脂食物(60％fat)过程中的体重变化

图3B：小鼠在饥饿状态下的肝重

图3C：小鼠在饥饿14h时的血浆胰岛素水平

图3D：小鼠的血糖水平

图3E：小鼠GTT实验过程中的血糖水平

图3F：小鼠ITT实验过程中的血糖水平

图3G：小鼠PTT实验过程中的血糖水平

图4A：小鼠在饲喂高脂食物(60％fat)过程中的体重变化:

图4B：小鼠在饥饿状态下的肝重

图4C：小鼠在饥饿14h时的血浆胰岛素水平

图4D：小鼠的血糖水平

图4E：小鼠GTT实验过程中的血糖水平

图4F：小鼠ITT实验过程中的血糖水平

图4G：小鼠PTT实验过程中的血糖水平

图4H：小鼠PTT实验过程中的血糖水平

图5A：RealtimePCR鉴定Med23的mRNA水平(normalizedto18s)

图5B：腺病毒注射后的体重变化(以天数为单位)

图5C：小鼠在饥饿状态下(18h)的肝重与体重比

图5D：小鼠在自由进食或饥饿状态下的血糖水平(腺病毒注射后10天)

图5E：小鼠在饥饿状态时的血浆胰岛素水平

图5F：小鼠在GTT实验过程中的血糖水平(腺病毒注射后7天)

图5G：小鼠在PTT实验过程中的血糖水平(腺病毒注射后14天)

图5H：小鼠在PTT实验过程中的血糖水平(腺病毒注射后14天)

每组小鼠数量为5-8只；结果表示方式为Mean±SEM；*P<0.05,**P<0.01，与对照相比。

图6：RNAi-ReadypSIREN-RetroQ载体质粒图谱

图7：Ad-siCtrl，Ad-si23-B，Ad-si23-D对Med23基因的敲低效率

具体实施方式

本发明基于转录中介体亚基MED23能够与MAPK信号通路激活的转录因子Elk1发生特异性的相互作用从而调控Krox20的表达，进而参与到胰岛素信号转导途径以及脂肪细胞分化，推测Med23可能参与了糖脂代谢。

本发明涉及了针对Med23基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰腺病毒。选取Med23mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的腺病毒。动物实验证明，上述siRNA序列能够特异性敲除或沉默2型糖尿病模型小鼠db/db体内Med23基因的表达，并表现出抵抗2型糖尿病症状。

本发明又对Med23^flox/flox小鼠尾静脉注射能够表达Cre重组酶的腺病毒(Ad-Cre)以敲除肝组织中的Med23基因，实验结果表明，在敲除Med23基因后，小鼠表现出抵抗2型糖尿病症状。

本发明还采用条件性基因打靶技术，将Med23基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠与在肝脏特异性启动子Albumin的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得的敲除了肝组织中Med23基因的小鼠，同样表现出抵抗2型糖尿病的症状。

本发明的发明人经过上述广泛而深入的研究发现，采用RNAi方法下调肝组织中Med23基因的表、尾静脉注射能够表达Cre重组酶的腺病毒(Ad-Cre)或条件性基因打靶敲除肝组织中Med23基因，均能够使得小鼠表现出抵抗2型糖尿病症状。这一研究结果表明，Med23基因，可作为预防或治疗2型糖尿病的靶点。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1肝脏内Med23组成性特异性敲除的小鼠的构建

1.实验材料

Albumin-Cre转基因小鼠，购自南京大学模式动物研究所-国家遗传工程小鼠资源库，品系号为J003574；该品系小鼠的Cre酶表达序列位于组织特异性启动子Albumin的控制之下。

Med23^Flox/Flox小鼠，购自南京大学模式动物研究所-国家遗传工程小鼠资源库，品系号为T000026，为基因工程小鼠；该品系小鼠在Med23基因中插入了Cre酶识别序列，当存在Cre酶时，细胞的Med23基因部分片段就会被敲除，从而使Med23基因彻底失活。

2.实验方法及分析

1)实验小鼠的构建：

通过Med23^Flox/Flox与Albumin-Cre配对来生产实验用小鼠，如图1A所示，通过2代的杂交，我们得到了肝脏内组成性特异性剔除Med23的Albumin-CreMed23^Flox/Flox小鼠(以下简称为LMKO小鼠)，并同时得到可作为对照的同窝Med23^Flox/Flox小鼠。

2)小鼠的基因型检测

通过标准的PCR基因定型方法，可以鉴定小鼠的基因型，将小鼠加以区分。实验对象为前一步骤制备的1只野生型小鼠(+/+)、1只仅带Cre标记的小鼠(+/+,cre)，1只仅带一个LoxP的小鼠(f/+)，1只在肝脏中剔除了一半Med23的杂合子小鼠(f/+,cre)，1只带两个LoxP标记的小鼠(f/f)，1只在肝脏中剔除了Med23的纯合子小鼠(f/f,cre)。小鼠基因组DNA通过标准程序测得：收集出生2周龄小鼠尾尖组织，并且抽提DNA分离，作为PCR扩增的模板。PCR扩增试剂为莱枫公司所提供的2*Mixture普通PCR试剂盒，并按照该试剂盒提供的方法进行扩增。在鉴定LoxP的扩增反应中，分别加入编号1和编号2的引物；在鉴定Albumin-Cre的扩增反应中，分别加入编号3和编号4的引物对用于扩增Cre，通过上述方法，可以扩增所有的基因型。所用引物序列如表1。

表1引物序列

实验结果见图1B，可以清楚地看到LoxP和Albumin-Cre都可以被很好地PCR区分，不同基因型的小鼠可以被加以分离。结果显示，野生型小鼠仅含有野生型Med23基因，而杂合子体内则含有Flox插入标记的Med23基因和敲除Med23基因后的基因。

3)模型小鼠的基因水平验证

通过标准的PCR基因定型方法(同上一方法)，检测Med23基因在不同组织中敲除的情况。实验对照为野生型小鼠的不同组织，例如骨骼肌、肝脏以及脂肪等；PCR扩增试剂为莱枫公司所提供的2*Mixture普通PCR试剂盒，并按照该试剂盒提供的方法进行扩增。在每个扩增反应中，在鉴定LoxP的扩增反应中，分别加入编号1和编号2的引物；在鉴定Albumin-Cre的扩增反应中，分别加入编号3和编号4的引物对用于扩增Cre，通过上述方法，可以扩增所有的基因型。

实验结果见图1C所示，Med23在肝脏内被特异敲除，而在骨骼肌和脂肪组织中正常表达。

4)模型小鼠肝脏组织H&E染色分析

组织处理及H&E染色：对出生后2周和12周的模型小鼠经麻醉后，肝脏组织被小心取下来，并用4％中性甲醛在4℃固定14小时。标本经石蜡包埋处理后，用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。经60℃烘片2-8小时，室温保存待用。切片处理：二甲苯Ⅰ，10分钟；二甲苯Ⅱ，10分钟；无水乙醇Ⅰ，5分钟；无水乙醇Ⅱ，5分钟；95％乙醇，5分钟；95％乙醇，5分钟；85％乙醇，5分钟；75％乙醇，5分钟；自来水，2分钟。染色：苏木精染色，5分钟；自来水，30分钟；伊红染色，2分钟；自来水，速洗。脱水、透明、封固：80％乙醇，1分钟；90％乙醇，1分钟；95％乙醇Ⅰ，1分钟；95％乙醇Ⅱ，1分钟；无水乙醇Ⅰ，1分钟；无水乙醇Ⅱ；1分钟；二甲苯Ⅰ，3分钟；二甲苯Ⅱ，3分钟；二甲苯Ⅲ，3分钟；中性树胶封固。

具体的，

(1)4％多聚甲醛(PFA)配制：80gPFA，2份10XPBS粉末，溶解于1800mlddH₂O，加入1ml1NNaOH，70℃水浴加热。待完全溶解后，冷却至室温，此时PH值约为7.4，如与PH7.4差别较大，则对PH值进行调节。分装50ml管，包锡箔纸，冻于-20℃。

(2)石蜡包埋用的组织固定：采集新鲜肝脏后，将肝脏修整成约4mm²大小，于10倍于组织体积的4％PFA中固定过夜(4℃)，用1×PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30％、50％乙醇中各10min至1小时(可省略)，4℃保存于70％乙醇中(过夜或长期保存)。

(3)组织的石蜡包埋：保存于4℃70％乙醇中的组织样品，经80％乙醇、95％乙醇100％乙醇各15min脱水，经1/2乙醇1/2二甲苯处理15min，然后经过二甲苯透明5-10min(棕色脂肪和白色脂肪只需3-5min透明，经1/2二甲苯1/2石蜡浸蜡30min，最后在液化的石蜡中作用1.5h，再换到新的石蜡中作用1.5-2.5h，即可进行包埋。

(4)石蜡组织的切片、展片及保存：包埋好的蜡块进行修整，使用石蜡切片机切片，厚度在2μm到5μm，37℃水浴展片、贴片，37℃烤片过夜，于室温或4℃保存。

(5)石蜡组织切片脱蜡、复水：连续经过三个二甲苯各10min的作用，置1/2二甲苯1/2乙醇15min，最后经梯度乙醇：100％、95％、80％、70％、50％、30％各5min，最后于ddH₂O中作用5min，完成复水。

(6)伊红美兰染色：石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，苏木精染色2min，水迅速冲洗30min，梯度乙醇脱水：30％、50％、70％、80％和95％乙醇各1min后，置于伊红A液中作用1min，伊红B液1-30s，分别脱水封片：无水乙醇依此处理1min、5min和5min，最后经1/2乙醇1/2二甲苯15min，二甲苯三次5min，中性树胶封片，室温干燥保存。

实验分析：如图1DHE染色结果表明不论是在出生后2周还是12周，在没有外界刺激的情况下，MED23缺失没有影响肝脏的正常结构，其中，肝小叶结构清晰，肝细胞大小相近。表明本发明中所用的基因改造对小鼠发育没有致命的影响，小鼠肝组织正常。

实施例2Med23基因选择性敲除的小鼠胰岛素敏感增强

为了检测MED23在肝脏糖脂代谢中发挥的作用，我们比较了6-8只8-12周龄雄性f/f基因型的对照小鼠和6-8只8-12周龄雄性Med23基因敲除小鼠在饥饿24小时状态(fasted)和饥饿再进食24小时状态(refed)的体重和肝重，结果如图2A-B所示。

饥饿14小时后，MED23基因敲除小鼠的用Mecodia公司商业化ELISA试剂盒测定的血浆胰岛素水平明显下降(图2C)。

鉴于肝脏在调节全身性葡萄糖平衡方面的重要贡献，我们还分别检测了进食状态下以及饥饿6小时、12小时和24小时后对照小鼠和基因敲除小鼠的血糖水平，发现在进食状态下，MED23基因敲除小鼠的经血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定的血糖下降(图2D)。

葡萄糖耐受实验(glucosetolerancetest，GTT)和胰岛素耐受实验(insulintolerancetest，ITT)是检测小鼠全身性胰岛素敏感程度的两个经典实验。葡萄糖耐受实验表明MED23基因敲除小鼠表现为葡萄糖耐受性增强，胰岛素耐受实验表明MED23基因敲除小鼠表现为胰岛素敏感增强，这两个实验结果一致表明了肝脏MED23基因敲除小鼠的全身性胰岛素敏感度有所增强(图2E和2F)。

同时丙酮酸耐受实验(pyruvatetolerancetest,PTT)表明肝脏MED23基因敲除小鼠的糖异生能力下降(图2G)。

具体的，

葡萄糖耐受实验：正常饲料饲喂的小鼠禁食16h，腹腔注射20％D-葡萄糖(2g葡萄糖每kg体重)；在特定时间点尾尖取血，用血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定血糖水平。

胰岛素耐受实验：正常饲料饲喂的小鼠禁食6h，腹腔注射0.075U/ml胰岛素(0.75U胰岛素每kg体重)；在特定时间点尾尖取血，用血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定血糖水平。

丙酮酸耐受实验：正常饲料饲喂的小鼠禁食18h，腹腔注射20％丙酮酸钠(2g丙酮酸钠每kg体重)；在特定时间点尾尖取血，血糖水平由血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定。

实施例3Med23基因选择性敲除的小鼠可以抵抗高脂食物诱导的肥胖

为了证实Med23在肥胖和2型糖尿病发生发展过程中的作用，我们采用了高脂饲料(脂肪60％kcal，蛋白质20％kcal，碳水化合物20％kcal，货号D12492,购自ResearchDiet公司)，于4周龄时开始饲喂6-8对雄性小鼠(指f/f基因型的对照小鼠和Med23基因敲除小鼠各6-8只)至16至20周。在小鼠4周龄时，对照组和肝脏Med23基因敲除小鼠体重一致；随着饲喂高脂食物的时间达到16至20周，它们的体重逐渐出现显著差异(图3A)。

我们还比较了6-8只8-12周龄雄性f/f基因型的对照小鼠和6-8只8-12周龄雄性Med23基因敲除小鼠在饥饿14小时状态下的体重和肝重，发现两者均存在差异，虽然肝重在该状态下的差异并不显著(图3B)。

我们同时比较了6-8只8-12周龄雄性f/f基因型的对照小鼠和6-8只8-12周龄雄性基因敲除小鼠的血糖和血浆胰岛素，结果表明Med23基因敲除小鼠在饥饿14h时血糖呈现显著下降(图3D)，血浆胰岛素水平也出现下降，但由于个体差异较大，所以差异并不显著(图3C)。下降的血糖水平意味着小鼠可能处于全身胰岛素敏感状态，与此一致的是，葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验均表明Med23基因敲除小鼠较对照小鼠保持了胰岛素相对敏感(图3E和3F)；同时，丙酮酸耐受实验证明Med23基因敲除小鼠的葡萄糖输出能力也有所减弱(图3G)。

具体的，葡萄糖耐受实验：高脂饲料饲喂的小鼠或db/db小鼠禁食16h，腹腔注射40％D-葡萄糖(1g葡萄糖每kg体重)；在特定时间点尾尖取血，用血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定血糖水平。

胰岛素耐受实验：高脂饲料饲喂的小鼠禁食6h，腹腔注射0.075U/ml胰岛素(0.75U胰岛素每kg体重)；在特定时间点尾尖取血，用血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定血糖水平。

丙酮酸耐受实验：高脂饲料饲喂的小鼠禁食18h，腹腔注射20％丙酮酸钠(2g丙酮酸钠每kg体重)；在特定时间点尾尖取血，血糖水平由血糖仪(ACCU-CHEK，Roche)测定。以上实验结果说明，在同样的高脂食物诱导条件下，Med23基因选择性敲除的小鼠的体重明显明显低于对照小鼠，而且表现为胰岛素敏感，因此Med23基因选择性敲除的小鼠的体重明显对可以抵抗高脂食物诱导的肥胖。

通过上述方法所构建的抵抗2型糖尿病小鼠模型，可以用于诱发2型糖尿病药物的筛选，具体方法为为将诱发2型糖尿病备选药物施用于前述抵抗2型糖尿病小鼠，通过比较用药前后小鼠的血糖、胰岛素、胆固醇和甘油三酯水平变化；胰岛素敏感、葡糖糖耐受和丙酮酸耐受情况以及对肥胖的抵抗情况，筛选出使小鼠出现2型糖尿病症状的药物作为诱发2型糖尿病药物。

上述筛选诱发2型糖尿病药物的方法，可以简便、快速和高效地实现对导致2型糖尿病的潜在药物进行的定性和/或定量的评价，筛选得到的“诱发2型糖尿病的药物”可以用来建立2型糖尿病动物模型，用于科学研究。

实施例4腺病毒介导的Med23敲除可以提高肥胖小鼠的糖脂代谢水平

我们构建了腺病毒介导的Med23基因敲除小鼠模型，并研究其对高脂诱导肥胖的抵御能力。

首先，将4周大的Med23^flox/flox小鼠饲喂高脂食物6周后，对其尾静脉注射7×10⁸PFU(每只小鼠)表达Cre重组酶的腺病毒(以下简称Ad-Cre)，由于腺病毒有嗜肝性，经血液循环后，腺病毒会聚集到达肝脏，实现Med23基因的敲除。

其中，所述表达Cre重组酶的腺病毒可以从VectorBiolabs公司购买，也可以从VectorBiolabs公司购买表达Cre重组酶的腺病毒的种子之后，自己扩增纯化后使用。具体的，腺病毒的扩增纯化方法如下：

1)将293A细胞铺于30-40个10cmdish，待细胞长满，向每块板中加入合适滴度的病毒(约10⁷-10⁸pfu/ml)10μl，待细胞完全病变后(4－7天)，向每块板中加入约500μl10％的NP-40以裂解细胞，冻存于-80℃。

2)提前1天将病毒从-80℃冰箱中拿出，室温(或4℃)融解。收集整个细胞裂解物，12000rpm离心10min，弃细胞碎片，收集上清。每100ml上清加入50mlPEG8000(20％PEG8000，2.5MNaCl)，冰上放置1小时沉淀病毒。12000rpm离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20mMTris-HCl，pH8.0)；4℃，7000rpm离心5min，取上清。

3)CsCl梯度的制备方法如下：加入2.0ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液(溶剂同上)，然后加入3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒悬浮液。20000rpm，室温离心2h。

4)收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA－Na₂煮沸10min)。在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml1MTris-HCl，pH8.0，2ml1MMgCl₂定容至1L)中，4℃透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，使用经典的TissueCultureInfectiousDose50(TCID50)方法或商业试剂盒(StratageneAdEasyviralTiterKit#972500)测定病毒滴度，符合使用要求。

3种浓度的CsCl溶液的配制

密度(g/ml)(20℃)	浓度(mg/ml)	CsCl的量(g)	终体积(ml)
				1.40	548.3	5.483	10
1.30	402.4	4.024	10
				1.10	143.8	1.438	10

采用Real-timePCR检测Med23基因敲除小鼠肝脏内Med23mRNA表达水平，检测结果显示如图4A所示，Ad-Cre可以敲除肝脏中80％的Med23基因，使肝脏中Med23mRNA的水平降低一半。具体方法为：

Realtime-PCR采用20μl体系。cDNA模版使用Takara公司的HSTaq酶与缓冲液。每一体系含1UHSTaq，终浓度0.5×SYBRgreen，终浓度1.5mMMgCl₂，终浓度62.5μMdNTP(each)，终浓度0.2μM引物，5μl的cDNA(逆转录产物稀释8倍)。

1)将水、缓冲液、dNTP、镁离子、引物、cDNA模板与酶加入反应体系，混匀。

2)按以下的反应条件进行反应：a.94℃预变性3分钟，b.94℃变性15秒，c.60℃退火20秒，d.72℃延伸20秒，e.b-d循环45次，f.72℃延伸5分钟。

3)根据软件读数计算结果。所有cDNA的检测都以18S为内参。所有ChIPDNA的检测都以InputDNA为内参。

ChIPDNA模板使用商业化试剂盒2×SyBRMix(TaKaRaDRR041A)。

1)反应体系：10μl2×SyBRMix，0.2μl10μM引物，5μlDNA模板，用ddH₂O补齐体积到20μl。

然后，以6-8只8-12周龄雄性Med23^Flox/Flox小鼠作为对照，与6-8只8-12周龄雄性Med23基因敲除小鼠一起，用高脂饲料喂养6周诱导其发生肥胖。结果如图4B和4C所示，与对照组相比，Med23基因敲除小鼠的体重和肝重体重比没有显著差异。

我们还比较了对照小鼠和Med23基因敲除小鼠的血糖和血浆胰岛素水平，发现Med23的敲除会导致血糖在进食和饥饿18h时呈现显著下降(图4D)，血浆胰岛素水平没有明显变化(图4E)。与对照组相比，Med基因敲除组小鼠的血浆胆固醇水平显著偏低，而甘油三酯水平基本不变(wako商业化试剂盒测定)(图4F)。葡萄糖耐受实验表明敲除小鼠比对照小鼠对葡萄糖的耐受力更强，而丙酮酸耐受实验表明敲除小鼠的肝糖输出水平下降(图4G和4H)。

以上实验结果说明，表达Cre重组酶的腺病毒(Ad-Cre)敲除Med23基因的小鼠虽然在体重上跟对照小鼠没有显著性差别，但是小鼠的血脂水平下降，胰岛素敏感性提高，所以表达Cre重组酶的腺病毒(Ad-Cre)敲除Med23基因小鼠可以提高肥胖小鼠的代谢水平，抵抗2型糖尿病。

实施例5腺病毒介导的Med23敲除可以提高2型糖尿病模型小鼠db/db糖耐受能力

我们制备了针对Med23基因的RNAi腺病毒，利用所述腺病毒实现了对2型糖尿病模型小鼠db/db的Med23基因敲除，并研究Med23基因敲除对高脂诱导肥胖的抵御能力。

1.针对Med23基因的RNAi腺病毒及对照RNAi腺病毒的制备

(1)设计并合成针对Med23的有效的siRNA靶点

从Genebank调取Med23(GeneID:70208)基因信息，设计针对Med23的可能的有效siRNA靶点，如表5-1所示：

表5-1靶向于Med23基因的siRNA靶点序列

SEQ ID NO	TargetSeq	命名
			5	TGAAGCCCAGGTTTGTTAT	Si23-B
6	GAGATAAGTAAGTTACATG	Si23-D

其中，不针对Med23的靶点的作为对照的siRNA靶点序列为：

SEQ ID NO	TargetSeq	命名
			7	GTGCGCTGCTGGTGCCAACTTCAAGAGA	SiCtrl

(2)腺病毒载体的制备

1)针对siRNA靶点(SEQIDNO：5、6)合成含粘性末端的双链DNAOligo序列(表5-2)。

表5-2含粘性末端的双链DNAOligo

上述DNAOligo可交给上海生工合成，合成之后引物溶解成100ul。

2)将shRNA连入RNAi-ReadypSIREN-RetroQ载体

各4.5ul上述DNAOligo加上1ulannealingbuffer退火(用PCR仪95度5分钟之后缓慢降温)。退火后的产物经过1：1000稀释后，取7ul加入到1ul经过BamHI和EcoRI酶切好的RNAi-ReadypSIREN-RetroQ载体质粒(购自Clontech公司，见图6)进行连接，连接产物转化amp板，随机挑出几个克隆，用Nhe1酶且鉴定会有1.5kb条带，送测序公司使用U6测序引物测序，选择测序正确的质粒保存，分别命名为pSIREN-RetroQ-si23-B；pSIREN-RetroQ-si23-D；pSIREN-RetroQ-siCtrl。

3)获得U6启动子和其下游的shRNA片段

针对RNAi-ReadypSIREN-RetroQ设计PCR引物：将U6启动子连同后面的shRNA一同扩增出来。

PCR引物如下，扩增得到的产物命名为U6-si23-B，U6-si23-D，U6-siCtrl：

pSIREN-RetroQ-si23-B

正义链：5'GGGGTACCGAAGAGGGCCTATTTCCCAT3'SEQIDNO14

反义链：5'GAAGATCTGCTAGCAAAAAATGAAGCC3'SEQIDNO15

pSIREN-RetroQ-si23-D；

正义链：5'GGGGTACCGAAGAGGGCCTATTTCCCAT3'SEQIDNO16

反义链：5'GAAGATCTGCTAGCAAAAAAGAGATAAG3'SEQIDNO17

pSIREN-RetroQ-siCtrl；

正义链：5'GGGGTACCGAAGAGGGCCTATTTCCCAT3'SEQIDNO18

反义链：5'GAAGATCTGCTAGCAAAAAATCTCTTG3'SEQIDNO19

4)将U6启动子及其下游shRNA连入pShuttle质粒，以便于与腺病毒的骨架质粒进行重组。

将扩增得到的U6-si23-B，U6-si23-D，U6-siCtrl连同pShuttle质粒进行KpnI和BglII双酶切以及DNA琼脂糖凝胶回收、连接。转化，挑克隆，送公司测序鉴定，将鉴定成功的质粒利用Qiagen质粒大抽试剂盒进行大抽，得到pShuttle-U6-si23-B，pShuttle-U6-si23-D，pShuttle-U6-siCtrl质粒。

5)腺病毒的构建遵照Stratagene公司的标准步骤，下述实验所用材料均可以在Strategene买到：

①线性化pShuttle-U6-si23-B，pShuttle-U6-si23-D，pShuttle-U6-siCtrl质粒：利用PmeI质粒对pShuttle-U6-si23-B，pShuttle-U6-si23-D，pShuttle-U6-siCtrl质粒进行酶切，TiangenDNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。

②将1ugpShuttle-U6-si23-B，pShuttle-U6-si23-D，pShuttle-U6-siCtrl质粒分别与1ugpAdEasy-1质粒共同转化到BJ5183大肠杆菌细胞中，涂Kanamycin抗性的平板。挑选长的瘦小的克隆进行摇菌。

③鉴定发生重组的pAdEasy-U6-siB，pAdEasy-U6-si23-D，pAdEasy-U6-siCtrl质粒:抽提上一步得到的质粒，并利用PacI进行酶切，跑胶鉴定：跑胶产生的条带产生两条条带，一条是30kb左右，另一条要么是3kb，要么是4.5kb，就是我们需要的发生重组的质粒。

④扩增pAdEasy-U6-siB，pAdEasy-U6-si23-D，pAdEasy-U6-siCtrl质粒并线性化：将pAdEasy-U6-siB，pAdEasy-U6-si23-D，pAdEasy-U6-siCtrl质粒转化DH5α进行扩增，利用Qiagen质粒大抽试剂盒进行大抽得到质粒。利用PacI酶切上述质粒，TiangenDNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化的质粒。

⑤将线性化的质粒4ug利用lipofectamine2000试剂(购自invitrogen公司)转染至6cmdish的293A细胞。第二天在细胞上面铺一层低熔点胶。待6-8天后，挑取8-10个腺病毒克隆，感染24孔板的293A细胞，得到腺病毒的种子。

⑥将上述种子腺病毒进行扩增纯化：具体方法如同实例4中的腺病毒扩增方法；纯化的腺病毒利用商业试剂盒(StratageneAdEasyviralTiterKit#972500)测定病毒滴度，符合使用要求；得到腺病毒Ad-siCtrl，Ad-si23-B，Ad-si23-D。

⑦检测腺病毒对MED23的敲低效率：将Ad-siCtrl，Ad-si23-B，Ad-si23-D同样的滴度MOI＝7感染细胞，并利用western检测效率，如下图7。发现si23-B和Ad-si23-D均能敲低Med23基因，且si23-D对Med23的敲低效率更高。后续实验采用si23-D进行，简写为Ad-si23。3.对2型糖尿病模型小鼠db/db的Med23基因进行敲除

对5只6-8周2型糖尿病模型小鼠db/db小鼠尾静脉注射Ad-si23腺病毒，(每只小鼠注射5×10⁹PFU，由于腺病毒有嗜肝性，经血液循环后，腺病毒会聚集到达肝脏，实现Med23基因的敲除。并对5只6-8周2型糖尿病模型小鼠db/db小鼠尾静脉注射Ad-sictrl，每只小鼠注射5×10⁹PFU，作为对照小鼠。

Westernblot的结果显示Ad-si23可以特异降低肝脏中Med23的蛋白水平，而没有影响其在白色脂肪中的蛋白水平(图5A)。腺病毒敲除Med23基因的小鼠的体重以及肝体比与注射了同样剂量不针对任何基因的腺病毒Ad-ctrl的雄性对照组相比，没有显著差异(图5B和5C)。Med23的敲除并没有影响小鼠在饥饿6h和18h时的血糖水平(图5D)。另外，与对照组相比，Med23敲除小鼠的wako商业化试剂盒测定的血浆胆固醇水平显著下降，而甘油三酯水平基本不变(图5E)。

葡萄糖耐受实验表明敲除小鼠比对照小鼠对葡萄糖的耐受力更强，而丙酮酸耐受实验表明敲除小鼠的肝糖输出水平下降(图5G和5H)。

该试验结果证明，敲除或沉默2型糖尿病模型小鼠db/db体内Med23基因的表达，能够使其表现出抵抗2型糖尿病症状，说明Med23基因可作为预防或治疗2型糖尿病的靶点。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种Med23基因在制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物，或者在筛选诱发2型糖尿病药物中的用途。

2.一种抵抗2型糖尿病小鼠模型的构建方法，其特征在于，利用条件性基因打靶技术，将Med23基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠与在肝脏特异性启动子Albumin的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得抵抗2型糖尿病小鼠模型。

3.一种降低肝组织中Med23基因表达的分离的核酸分子，所述分子包括：

4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与Med23基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与Med23基因中的靶序列基本相同。

5.根据权利要求4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述Med23基因的靶序列含有SEQIDNO:5-6中任一序列。

6.根据权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，该小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO：20-21任一序列所示。

7.根据权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO：22-23任一序列所示。

8.一种Med23基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

9.根据权利要求8所述Med23基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述Med23基因干扰核酸构建体为干扰腺病毒载体。

10.根据权利要求9所述的Med23基因干扰核苷酸构建体，其特征在于，所述干扰腺病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入腺病毒后获得。

11.一种Med23基因干扰腺病毒，由权利要求8-10任一权利要求所述干扰腺病毒载体在腺病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

12.一种用于预防或治疗2型糖尿病的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述Med23基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的Med23基因干扰腺病毒以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

13.权利要求12所述药物组合物在制备预防/治疗2型糖尿病药物中的应用。