CN103656641A - 转录中介体Med23亚基作为靶点用于预防或治疗癌症 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转录中介体Med23亚基作为靶点用于预防或治疗癌症。具体地，转录中介体Med23的缺失能影响Ras被激活的(ras-active)肺癌细胞株生长和成瘤能力，并明显降低oncogene ras转化MEF细胞的效率。同时Med23表达量在转化过程中明显上调；芯片分析结果显示Med23缺失影响了ras特征基因的表达，同时Med23通过与Elk1作用共同调控细胞周期/细胞增殖相关基因。Med23在Ras被激活的肺癌细胞株以及肺癌临床样本中都有显著的高表达，且表达量高低与预后有着显著的相关性；Med23的缺失还能降低癌细胞对化疗药的耐受程度。因此Med23是潜在的癌症治疗靶点。

Description

转录中介体Med23亚基作为靶点用于预防或治疗癌症

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体地，本发明涉及转录中介体Med23亚基作为靶点用于预防或治疗癌症。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是由有分裂潜能的细胞受致癌因素作用后，发生恶性转化和克隆增生所形成的新生物。肿瘤的发生往往是机体遗传和环境致癌因素以先后或协同的方式，引起遗传物质DNA的损伤、突变，同时伴随有多个癌基因激活和肿瘤抑制基因的失活，使正常细胞不断增生，转化最终癌变。

目前在世界范围内，肺癌已经成为发病率和病死率最高的肿瘤之一。2005年估计中国肺癌的新发病例大约有50万例(男性33万例，女性l7万例)。2006年美国肺癌的新发病例估计有l7.5万例(男性9.3万例，女性8.2万例)，死亡16.2万例(男性9.0万例，女性7.2万例)。肺癌是一种独特的疾病类型，80%以上患者就诊时已处于晚期，失去手术机会，化疗有效率低，毒副反应大，5年生存率不足15%。

在癌症细胞中,随着致癌基因的不断激活,抑癌基因被抑制，细胞内正常的信号通路变得异常活化，比如像肺癌中异常的Ras-MAPK信号通路，乳腺癌中异常的TGFβ信号通路，前列腺癌中异常的androgen receptor信号通路，结肠癌中异常的Wnt信号通路等，这些被活化的重要通路是推动癌症发生发展以及维持的主要动力。

作为这些动力之一的促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP kinase)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由于不同的细胞外刺激或介导细胞表面至细胞核的信号转导而被激活，结合其它信号途径，它们能够改变转录因子的磷酸化状态,从而调控多种生物体内基础的过程：如生长、增殖、分化、迁移、凋亡等等,但当其活力失控时往往导致肿瘤的发生。

Oncogene ras作为MAP kinase信号通路通路的重要成员，在整个信号网络的传递过程中起到了非常重要的作用，是信号从胞外转向胞内的枢纽；正是由于其位置的重要性，ras基因的突变便成为了强有力的致癌因素，在三分之一的人类的癌症中都存在着激活性Ras突变(activating Ras mutation)。从1982年Weinberg和Barbacid首先从人膀胱癌细胞中克隆出活化的癌基因C-Ha-ras以来，由于它与人类恶性肿瘤的相关性，人们对其基因、蛋白及其参与的信号转导通路进行了广泛深入的研究。针对Ras蛋白及其下游MAP kinase信号途径的肿瘤靶向治疗目前也成为肿瘤治疗学的研究热点。

目前本领域还没有一种成熟的针对Ras蛋白及其下游MAP kinase信号途径的肿瘤靶向治疗方法，因此迫切需要开发特异性的靶点，用于癌症的预防或治疗。

发明内容

本发明的目的就是提供针对Ras蛋白及其下游MAP kinase信号途径的靶向治疗方法以及将转录中介体Med23亚基作为靶点进行癌症预防或治疗。

在本发明的第一方面，提供了一种转录中介体(Mediator)Med23亚基的抑制剂、或Med23基因的抑制剂的用途，被用于(a)制备预防或治疗肿瘤的药物；和/或(b)制备降低肿瘤或肿瘤细胞对化疗药的耐受程度的药物。

在另一优选例中，所述的Med23亚基选自下组：

(A)氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示的多肽；

(B)将SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Med23亚基衍生物，或其活性片段；

(C)序列与SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地≥98%，最佳地≥99%的Med23亚基衍生物，或其活性片段。

在另一优选例中，所述的Med23基因选自下组：

(A1)编码如SEQ ID NO.:2所示Med23亚基的多核苷酸序列；

(B1)如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(C1)将SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列；

(D1)序列与SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地≥98%，最佳地≥99%的多核苷酸序列；

(E1)与(A1)-(D1)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的Med23亚基或基因来源于哺乳动物(包括人)。

在另一优选例中，所述的Med23基因编码Med23亚基。

在另一优选例中，所述Med23亚基的抑制剂选自下组：Med23亚基的抗体、Med23亚基的结合蛋白。

在另一优选例中，所述Med23基因的抑制剂为：Med23基因特异性的RNAi、Med23基因特异性的microRNA、抑制Med23基因启动子的抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述Med23基因的抑制剂为Med23基因特异性的RNAi。

在另一优选例中，所述的肿瘤或肿瘤细胞选自下组：肺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌。

在另一优选例中，所述的肿瘤为肺癌；所述的肿瘤细胞是肺癌细胞(如A549)。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为Med23亚基的抑制剂或Med23基因的抑制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防或治疗肿瘤；和/或用于降低肿瘤或肿瘤细胞对化疗药的耐受程度。

在另一优选例中，所述的Med23亚基的抑制剂为Med23亚基的抗体或Med23亚基的结合蛋白。

在另一优选例中，所述的Med23基因的抑制剂为Med23基因特异性的RNAi、Med23基因特异性的microRNA、抑制Med23基因启动子的抑制剂、或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：在Med23亚基抑制剂或Med23基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的Med23亚基抑制剂抑制所述肿瘤细胞中Med23亚基的活性；或Med23基因抑制剂抑制所述肿瘤细胞中Med23基因的表达。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌；较佳地为肺癌。

在另一优选例中，所述的抑制肿瘤细胞为抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞成瘤。

在另一优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中Med23亚基的活性降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有Med23亚基的活性。

在另一优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中Med23基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有Med23基因的表达。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示Med23的缺失明显影响了A549细胞的生长和成瘤能力；图1A：逆转录病毒介导的RNAi敲低A549细胞中Med23的表达，western blot检测Med23的表达情况，A、B、C为三条不同的针对Med23的RNAi oligo；图1B：对WT、control、RNAiMed23的五株A549细胞株进行细胞生长记数，细胞种于12孔板，起始数量为每孔20000个细胞，每天记数；图1C：对control和RNAiMed23的A549细胞进行软琼脂克隆形成实验，细胞种于6孔板中，每孔10000个细胞，上层胶浓度为0.3%，2周后染色拍照；图1D：裸鼠皮下成瘤实验，将400万Ctrl和RNAi Med23的A549细胞分别注射在四周的裸鼠皮下，五周后观察肿瘤形成情况。

图2显示Med23的缺失降低了oncogene ras转化MEF的效率；图2A：利用逆转录病毒在WT、Med23-/-的MEF细胞中过表达Ha-RasV12，western blot检测RAS的表达情况；图2B，图2C：软琼脂克隆形成实验检测转化后细胞的悬浮克隆形成能力，起始细胞量为6孔板每孔10000个细胞，上层胶浓度为0.25%，两周后染色拍照；图2D：裸鼠皮下成瘤实验，将100万转化后的细胞注射在四周的裸鼠皮下，五周后观察肿瘤形成情况，取出瘤块称重。

图3显示Med23的缺失对oncogene c-myc的转化效率影响不大；图3A：利用逆转录病毒在WT、Med23-/-的MEF细胞中过表达c-myc，western blot检测C-MYC的表达情况；图3B：real-time PCR检测c-myc的mRNA水平；图3C、图3D：软琼脂克隆形成实验检测转化后细胞的悬浮克隆形成能力，起始细胞量为6孔板每孔10000个细胞，上层胶浓度为0.25%，两周后染色拍照。

图4显示Med23的表达量在ras-transformation过程中明显上调；图4A：利用逆转录病毒在原代MEF细胞中过表达E1A、si-p53以及ras，c-myc，t-antigen进行transformation实验，western blot检测转化前后Med23的表达情况；图4B：real-time PCR检测转化前后Med23的mRNA水平。

图5显示了Western blot检测si-Ctrl,si-Med23,si-Elk1 A549细胞中激酶ERK，Akt的磷酸化水平，结果显示Med23的缺失没有影响到ERK和Akt的磷酸化水平。

图6显示了Western blot检测tet on细胞株中Med23的表达量随DOX的变化情况。

图7显示了Med23的缺失影响了Elk1下游基因的表达：用DOX处理细胞6天后开始进行血清刺激，先用0.5%的DMEM饥饿24小时，然后分别用15%的DMEM刺激0，30，90(min)，收RNA进行检测。

图8显示Med23对于Ras/MAPK信号通路的影响；图8A：Med23或Elk1缺失对于全基因组的影响：深色为正调控基因，浅色为负调控基因，纵坐标以Med23影响的基因排序；图8B：microarray聚类分析：将在si-Med23和si-Elk1A549细胞中共同变化(log FC>0.5)的基因挑出进行基因表达聚类，每种细胞各三个重复，si-Med23(1，2，3)为三条不同的RNAi oligo；图8C：Med23和Elk1共同影响基因的示意图，图上数目为受影响的基因的数目，Positive overlap为共同下调基因，Negative overlap为共同上调基因；图8D：GoMiner聚类结果总结：所聚功能均为biological process level3，以功能内改变基因的数目多少排序。

图9显示了细胞周期、细胞增殖相关基因的real-time PCR验证结果。

图10显示了Med23对于Ras特征(signature)基因表达的影响；A：已报道的ras signature基因set，共768个基因，其中部分基因的排序情况；图10B：将这些signature基因从microarray结果中挑出进行表达谱聚类分析，观察Med23的缺失对于这些基因表达的影响。每种细胞各三个重复。

图11显示Elk1的缺失减慢A549细胞的生长速度，降低Oncogene Ras转化永生化MEF的效率；图11A：western blot检测A549细胞中Elk1的RNAi效果，A，B为两条不同的RNAi oligo；图11B：生长计数实验，细胞铺于12孔板，起始量为每孔20000个细胞，每种细胞三个重复，六天后消化计数；图11C：利用逆转录病毒在si-Ctrl、si-Elk1的MEF细胞中过表达Ha-RasV12，western blot检测RAS的表达情况。(D)软琼脂克隆形成实验检测转化后细胞悬浮克隆形成能力，起始细胞量为6孔板每孔10000个细胞，上层胶浓度为0.25%，两周后染色拍照。

图12显示Western Blot检测各个细胞株中Med23以及其他subunit的表达情况。

图13显示Western Blot检测各个细胞株中Ras/MAPK信号通路的活跃情况。

图14显示Med23在不同Ras突变背景的细胞株中对于细胞生长速度的影响，生长计数实验，细胞铺于12孔板，起始量为每孔20000个细胞，每种细胞三个重复，六天后消化计数，图14A：HTB-177,CRL-5807,H1299，PANC-1为ras突变细胞；图14B：H522,HTB-182，CRL-5889，DU145为ras正常细胞。

图15显示免疫组化检测临床肺癌组织和癌旁组织中Med23的表达量，免疫组化检测临床样本中Med23的表达情况，共检测80例临床病例样本，其中肺鳞癌40例，肺腺癌40例。

图16显示临床肺癌样本中Med23的表达情况和Ras/MAPK信号通路的活跃情况相关；图16A：利用相同的肺癌组织芯片免疫组化检测临床样本中Med23、p-ERK、p-Elk1的表达情况，共检测80例临床病例样本；图16B：对组化结果进行统计，将样本按p-ERK染色强度高低、p-Elk染色强度高低分别分成两组，比较其对应的Med23的染色强度(p<0.05)。

图17显示临床肺癌样本中Med23的表达情况和Ras/MAPK信号通路的活跃情况相关；图17A：根据ras signature基因将425个临床肺癌样本分为三群，其中ras signature+143例，ras signature-116例；图17B：分别在ras signature+和rassignature-的病人样本中以Med23表达量高低作为标准观察病人的存活率，深色线为Med23低表达病人群体，浅色线为Med23高表达病人群体。

图18显示Med23的缺失降低了A549细胞对于化疗药物的耐受程度；图18A、图18B：用30μg/ml的cisplatin处理control和RNAi细胞24小时，收样进行FACS周期检测，统计sub-G1期细胞比例；图18C：western blot检测给药前后caspase3的表达；图18D：皮下注射约3周后对小鼠进行随机分组，cisplatin每四天给药一次，剂量为5mg/kg，共给药5次。DOX配制于0.5%的蔗糖溶液中，浓度为0.2mg/ml，避光使用，每四天更换一次，活体成相使用xenogene系统拍摄，拍摄前腹腔注射荧光底物，十分钟后进行麻醉上机拍摄。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，转录中介体(Mediator)Med23的缺失能影响Ras被激活的(ras-active)肺癌细胞株生长、成瘤能力，Med23的缺失明显降低了oncogene ras转化MEF细胞的效率，同时Med23的表达量在转化过程中明显上调；microarray芯片分析结果显示Med23的缺失影响了ras signature基因的表达，同时发现Med23通过与Elk1作用，从而共同调控细胞周期、细胞增殖相关基因；此外Med23在Ras被激活的肺癌细胞株以及肺癌临床样本中都有显著的高表达，并且Med23表达量的高低与Ras被激活的肺癌病人的预后有着显著的相关性；Med23的缺失还能降低了肺癌细胞对于化疗药物的耐受程度。因此Med23在Ras被激活的肺癌中起到非常重要的作用，是一个潜在的癌症治疗靶点。在此基础上完成了本发明。

术语

中介体复合物(Mediator Complex)

真核生物的复杂性源于特异转录因子、DNA增强子和Mediator复合物三者的相互作用。转录信号从增强子传递到启动子，Mediator复合物在此中连接了转录因子和RNA聚合酶II(RNA Polymerase II，Pol II)，作为信息传递的桥梁起到非常重要的调控作用。Mediator复合物在真核生物中普遍存在，被认为是基因表达中最为重要的一个辅因子。Mediator复合物被认为是Pol II转录装置中的一个必须组分，与Pol II和通用转录因子(GTFs)有同等重要的作用。

从酵母到哺乳动物，mediator的蛋白在进化上有极高的保守性。酵母Mediator由25个亚基组成，而已分离到的哺乳动物Mediator中有大约30种不同的亚基，其中有些是在酵母中未曾发现的。对酵母和多种哺乳动物Mediator进行的序列比对显示，几乎所有的酵母Mediator亚基都和哺乳动物Mediator亚基间存在广泛的同源性。研究表明，哺乳动物Mediator复合物头部模块包含：MED6，MED8，MED11，MED17，MED18，MED19，MED20，MED22，MED28，MED29，MED30等；中间模块包含：MED1，MED4，MED5，MED7,MED9,MED10,MED21等；尾部模块包含：MED2，MED3，MED14，MED15，MED16，MED23等。Mediator复合物仍有一些组分的归属尚有争论。

Mediator的功能

不同的转录因子受到环境及发育信号的影响时，就会与Mediator复合物中的某个特定的蛋白质组分发生相互作用，招募Pol II及General Transcription Factors(GTFs)在基因起始序列上的聚集并形成转录起始前复合物(Pre-initiation complex，PIC),进而调高基因表达的水平，控制特定的生物学反应。

目前的研究结果已经阐明了一些Mediator组分蛋白在不同信号转导通路中的功能。如，MED1与核受体(如：TR、ER、GR、PPARγ和VDR)；MED12与β-catenin、Wnt信号通路；MED14与γ-干扰素；MED15通过其KIX结构域与TGF-β信号通路控制的SMAD2/SMAD3的相互作用；MED 17与P53和VP 16；MED23与RAS/MAPK信号通路上控制的Elk1，CCAAT增强子绑定蛋白(C/EBPβ)；以及MED25与VP16相互作用等等。

Med23

Med23是Mediator复合物中位于尾部模块(tail module)上的一个重要分子，Med23又叫Sur2(suppressor of ras 2)，目前研究已经发现它能够与腺病毒的E1A和MAPK激酶激发的Elk1两个转录因子发生特异的相互作用从而影响特定下游基因的表达变化。在本发明中，发现在Ras被激活的的肺癌里，Ras/MAPK信号通路异常活跃，导致通路下游的效应因子Med23的高表达，近而为癌症的发生发展过程提供动力。当Med23缺失后，Ras/MAPK信号通路的传递受阻，下游控制生长增殖的基因表达紊乱，从而导致肿瘤细胞生长、成瘤能力受到影响，而且使得肿瘤细胞对于化疗药物变的更加敏感。因此Med23在Ras被激活的的肺癌中起到了非常关键的作用，是一个潜在的癌症治疗靶点。

如本文所用，术语“Med23基因”、“Med23编码基因”、“Med23的编码序列”可以互换使用，都是指编码Med23中介体的多核苷酸序列。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得Med23基因的序列，如从NCBI获取。

本发明的可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的Med23亚基可以是天然纯化的产物或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的Med23亚基可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的Med23亚基还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括具有Med23亚基或Med23亚基活性的Med23亚基多肽片段和类似物。

如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持天然Med23亚基相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还包括与本发明的Med23亚基具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括Med23亚基类似物与天然Med23亚基的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

在本发明的一个优选例中，Med23亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明还提供了编码Med23亚基的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

在本发明优选例中，编码Med23亚基的DNA序列如SEQ ID NO.:1所示，其编码SEQ ID NO.:2所示的Med23亚基。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

Med23亚基的抑制剂

如本文所用，术语“Med23亚基的抑制剂”是指抑制Med23亚基活性的物质。Med23亚基的抑制剂选自下组：Med23亚基的抗体、Med23亚基的结合蛋白等。

Med23基因的抑制剂

如本文所用，术语“Med23基因的抑制剂”是指抑制Med23亚基基因复制或转录的物质，或减少Med23亚基基因表达(表达产物如mRNA等)的物质，Med23基因的抑制剂包括(但不限于)：RNAi、microRNA、抑制Med23基因的抑制剂、或其组合。Med23基因的抑制剂优选RNAi。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：Med23亚基的抑制剂或Med23基因的抑制剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

应用

本发明提供了一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：在Med23亚基抑制剂或Med23基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。所述的肿瘤选自下组：肺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌；较佳地为肺癌。

在本发明的一个优选例中，所述的Med23亚基抑制剂抑制所述肿瘤细胞中Med23亚基的活性；或Med23基因抑制剂抑制所述肿瘤细胞中Med23基因的表达。

在本发明的一个优选例中所述的抑制肿瘤细胞为抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿成瘤。

优选地，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中Med23亚基的活性降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有Med23亚基的活性。

或优选地，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中Med23基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有Med23基因的表达。

本发明的主要优点在于：

(1)Med23的缺失减慢了Ras被激活的肺癌细胞的生长速度，减弱了成瘤能力；

(2)Med23的缺失降低了oncogene ras转化MEF细胞的效率；

(3)Med23的缺失影响了Ras/MAPK信号通路下游基因的表达；

(4)Med23在Ras被激活的的肺癌细胞以及肺癌临床样本中明显高表达；

(5)Med23表达量的高低能够指针Ras被激活的肺癌病人的预后情况；

(6)Med23的缺失降低了A549细胞对于化疗药物的耐受程度。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。

实施例1

Med23的缺失减慢A549细胞的生长速度，减弱A549细胞在体内体外的成瘤能力

实验方法：利用retrovirus-based RNAi knockdown A549细胞(一种非小细胞肺癌细胞株,其中含有activing K-ras mutation)中的Med23的表达，对RNAi和controlA549细胞进行细胞计数。结果发现：knockdown Med23后，A549细胞的生长速度明显变慢，说明Med23参与到了调控A549细胞生长的过程中(图1B)。

同时对RNAi和control A549细胞进行Soft Agar Colony Formation Assay,发现RNAi Med23的A549细胞的成瘤能力明显减弱，对两者所形成的colony的数目以及直径进行了统计，发现Knockdown细胞所形成的colony较少，而且很小很疏松(图1C)。

另外裸鼠皮下成瘤实验的结果表明，缺失Med23的A549细胞形成肿瘤的体积、重量都明显小于Ctrl细胞(图1D)，说明Med23的缺失明显减弱了A549细胞在体内、体外的成瘤能力。

因此，本实施例的实验结果表明：Med23的缺失减慢A549细胞的生长速度，减弱A549细胞在体内体外的成瘤能力。

实施例2

Med23的缺失明显降低了Oncogene Ras转化永生化MEF的效率

已知Oncogene ras在体外能够转化永生化的MEF，转化后的MEF将会失去接触抑制并且能够在软琼脂内悬浮生长形成克隆，最终能在裸鼠皮下成瘤。本实施例试图检测Med23是否通过影响ras造成了上述的现象。

结果发现：Ras转化Med23-/-的MEF细胞的效率相比野生型来说被大大的降低，在形成克隆数目和大小(图2B、图2C)，以及裸鼠皮下成瘤能力上都明显不如WT MEF细胞(图2D)，说明Med23的缺失影响了Oncogene ras转化(transformation)的过程。

实施例3

Med23的缺失对于Oncogene c-myc转化永生化MEF的效率没有明显影响

与ras transformation不同，发明人发现c-myc转化Med23-/-的MEF细胞的效率相比野生型来说没有明显差异，形成的克隆大小以及数目都和WT MEF相近(图3C、图3D)，表明Med23的缺失对于Oncogene c-myc的影响不大，从而近一步说明了Med23与Ras/MAPK信号通路的相关性。

实施例4

Med23的表达量在ras-transformation过程中明显上调

发明人在本实施例试图检测Med23自身的表达量在transformation过程中会发生什么样的变化。由于前面使用的是永生化MEF系统，为了避免体外长期传代对Med23表达量的影响，本实施例利用原代MEF细胞进行转化实验来观察Med23表达量的变化。由于ras直接转化原代MEF会导致细胞的衰老，因此利用E1A这个永生化基因一起对原代MEF进行转化实验，同时还有c-myc，T-antigen两个oncogene的对照。

结果发现：相对于未转化的细胞，Med23的表达量在ras-transformation过程中明显的上调(图4A、图4B)。同时，尽管c-myc，T-antigen转化的细胞Med23表达量也有所上升，但是都明显的低于ras转化的细胞，因此可以进一步看出Med23和ras的相关性。

实施例5

Med23的缺失没有影响到Ras/MAPK信号通路上游信号的传递

已有的研究发现Med23对于Ras/MAPK信号通路的传递起着非常重要的作用，发明人在本实施例中试图检测Med23是否参与对信号通路的调控过程以及所发挥的作用。

首先发明人检测Med23对于通路的影响是位于上游还是下游，通过对RNAi和control A549细胞内Ras/MAPK信号通路上的两个重要的激酶ERK，Akt的激活情况进行检测，发现不管是Med23还是和它相互作用的转录因子Elk1的缺失都没有影响到ERK，Akt的磷酸化水平(图5)，说明Med23的缺失对于Ras/MAPK信号通路上游信号的传递并没有明显影响。

实施例6

构建可诱导RNAi-Med23的A549细胞株

由于Med23的缺失并没有影响到Ras/MAPK信号通路上游信号的传递，因此Med23对于信号通路的影响可能还是通过与转录因子Elk1相互作用从而调控下游基因的表达。为了更好的检测Med23对于下游基因的影响，排除RNAi稳定细胞系筛选过程中造成的非特异性差异，发明人利用慢病毒系统构建了可诱导RNAi-Med23的A549细胞株。

建立tet on RNAi-Med23的A549细胞株，当细胞处于含有DOX的培养基中两天后Med23能被很好的敲低，当撤药6天后Med23的表达量又会自动回复，图6为Western blot检测tet on细胞株中Med23的表达量随DOX的变化情况。

实施例7

Med23的缺失影响了Ras/MAP-kinase pathway下游基因的表达

发明人在tet on RNAi-Med23的A549细胞中检测了Elk1的几个靶基因Egr1、Egr2、Ier2、c-fos的表达，由于这几个基因都属于早期响应基因，所以对细胞作了血清刺激。

结果显示，在没有Med23的情况下，不管有没有生长因子的刺激，这些基因的表达量都明显下降(图7)。说明在A549细胞中Med23的缺失也同样能够影响Ras/MAP-kinase pathway信号的传递，从而影响下游基因的表达。

实施例8

Med23的缺失在全基因组水平上对于Elk1的影响

为了更好更全面的研究Med23对于转录因子Elk1的影响，确定Med23对于Ras/MAP-kinase pathway的影响程度，寻找可能的机制解释，发明人接下来在A549细胞中分别敲低了Med23以及Elk1的表达，同时对这些细胞株进行了表达谱芯片的分析。

芯片结果显示：在全基因组水平上，Med23和Elk1对于下游基因的调控存在着相似的影响(图8A)。Med23的缺失以及Elk1的缺失共同影响了一大批基因的表达，而且相对于野生型细胞这些基因有着相同的表达趋势(图8B)。同时对这些基因的数目进行统计，结果发现有接近57%的受Elk1调控的基因都和Med23影响的基因相重叠(图8C)，说明Med23的缺失影响了大部分Elk1的功能。最后将敲低Med23以及Elk1后共同下调的230个基因拿出来作了GO功能聚类，发现排名前三的功能分别为细胞周期调控，细胞增殖和细胞分裂(图8D)，这表明，Med23是通过影响了一系列受Elk1调控的生长相关的基因的表达从而影响了A549细胞的生长和成瘤能力。

实施例9

microarray数据的real-time PCR验证

为了对microarray数据进行验证，发明人挑选了细胞周期调控，细胞增殖和细胞分裂对应功能中差异表达排名靠前的基因，其中包括大家熟悉的CDK6，FGF2，EREG等。real-time PCR结果显示当Med23或Elk1缺失后，这些基因的表达确实会明显下调，和microarray数据基本一致(图9)。

实施例10

Med23的缺失影响了ras signature基因的表达

从之前的结果可以看出Med23确实可以通过和Elk1相互作用从而参与到Ras/MAPK信号通路的调控过程。近期有多篇关于ras signature基因的报道，即这群ras signature基因的上调或者下调就能够代表ras的活跃状态，代表整个Ras/MAPK信号通路的激活情况(图10A)。因此发明人想脱离Elk1，从整个通路的角度上看看Med23对于Ras功能的影响。

利用之前A549细胞株中microarray的结果，观察Med23的缺失对于ras signature基因表达的影响。结果显示，Med23的缺失确实影响到部分ras signature基因的表达，原本在ras活跃状态下高表达的基因缺失Med23后表达下调，而在ras活跃状态下低表达的基因缺失Med23后表达上调(图10B)，从整个signature基因的角度也可以看到Med23对于activated ras的影响。说明Med23在很大程度上调控着Ras下游基因的表达，影响着ras的功能。

实施例11

Elk1的缺失减慢A549细胞的生长速度，降低Oncogene Ras转化永生化MEF的效率

和Med23的结果一致，当缺失Elk1后A549细胞的生长速度也受到了明显的影响，同时transformation assay发现Oncogene Ras转化永生化MEF的效率也随着Elk1的缺失而降低(图11)，这表明Med23确实是通过影响Elk1从而影响Ras/MAP-kinasepathway的信号传递，Med23和Elk1相互作用的打破是造成上述现象的原因。

实施例12

Med23在肺癌细胞株中明显高表达

对正常肺成纤维细胞(WI-38,MRC-5)、正常肺上皮细胞(CRL-2741,CRL-2078)以及肺癌细胞株(A549、H1299、CRL-5807、HTB-177、HTB-57、H2122,HTB-182、H522)中Med23的表达量进行检测，发现和正常肺细胞相比肺癌细胞株中Med23有着显著的高表达。同时在这些肺癌细胞株中有ras mutation的细胞也有没有rasmutation的细胞，相比之下Med23的表达量在ras mutation的肺癌细胞中明显更高，进一步反应出Med23与癌症以及与RAS的相关性(图12)。作为对照，还检测了Mediator其他subunit在这一系列细胞株中的表达量，发现他们和Med23呈献出不一样的表达模式，从而进一步证明Med23在肺癌中的特异性。

实施例13

存在ras mutation的肺癌细胞株中Ras/MAPK信号通路被异常活化

发明人在实施例12的细胞株中还检测了Ras/MAPK信号通路的活化情况，包括ERK，Akt，Elk1的磷酸化水平，以及下游基因Egr1的表达(图13)。

结果发现：和Med23的表达pattern相似，在含有mutated RAS的肺癌细胞株中这些蛋白都有显著的高表达，而在正常肺细胞或不含有mutated RAS的肺癌细胞株中它们的表达量都很低。表明当细胞中存在ras mutation时，整条Ras/MAPK信号通路都会被异常激活，同时也包括Med23。

实施例14

Med23对于肿瘤细胞生长的调控是ras依赖性的

为了更准确的了解Med23对于肺癌细胞的重要性，发明人在上述其他肺癌细胞株中敲低了Med23的表达看是否有类似的表型。

通过细胞生长计数，发现只有在含有ras mutation的肺癌细胞株中Med23的缺失能够对细胞生长产生影响(14A)，而在不含ras mutation的肺癌细胞株中细胞的生长则不会对Med23的缺失产生反应(图14B)。另外，为了证明在其他癌症类型中Med23是否存在着同样的调控模式，发明人选取其他两株癌症细胞，PNAC-1(胰腺癌细胞株，存在K-ras的突变)、DU145(前列腺癌细胞株，不存在ras的突变)，通过生长计数，发现在PANC-1中Med23的缺失能够明显的影响细胞的生长，而DU145则不响应Med23的缺失。

上述结果说明：Med23对于肿瘤细胞生长的调控是需要特定遗传背景的，是ras依赖性的。

实施例15

Med23在肺癌临床样本中有着明显高表达

利用组织芯片分析了80例肺癌的临床标本，每个样本都包括对应的肺癌组织和癌旁组织。免疫组化结果显示有86%的癌旁组织中Med23的染色结果为阴性，而癌症组织中只有12.5%为阴性，同时18.7%的癌症组织中Med23的染色结果很深而且阳性率很高。

比较每一个样本的肺癌组织和癌旁组织，发现接近85%(67of 80)的样本中Med23都是在肺癌组织中有明显高表达(P<0.0001,pair t test)(图15)。从而进一步说明Med23与肺癌的发生发展过程存在着相关性。

实施例16

Med23在肺癌临床样本中的表达高低和样本中Ras/MAPK信号通路的活跃程度相关

本实施例试图检测临床样本中，Med23的表达量是否和整个通路也存在着一定的相关性。发明人利用相同的肺癌组织芯片(连续切片)，同时进行了p-ERK，p-Elk1的免疫组化染色，用这两个蛋白的磷酸化情况来指针整个通路的活跃情况。

结果发现，Med23的表达量高低和通路的活跃情况成明显的正相关(图16A)，p-ERK，p-Elk1染色强度高的组织，Med23的染色强度也高；p-ERK，p-Elk1染色强度低的组织，Med23的染色强度也低(图16B)；说明不论是细胞株水平还是临床样本中Med23的高表达都与ras/MAPK通路的活跃情况相关，这也和前面transformation实验的结果相一致。

实施例17

Med23表达量的高低与Ras被激活的肺癌病人的预后有着显著的相关性

本实施例试图检测Med23对于Ras被激活的肺癌病人的存活以及预后的影响。分别在ras signature+(即存在着激活的Ras通路)和ras signature-(即正常的Ras通路)的两群病人中观察Med23的表达量的高低同病人预后的相关性(图17A)。

结果发现，在ras signature+的病人中，Med23的低表达对应着更好的预后，病人的存活率也明显较长。而在ras signature-的病人中，Med23表达量的高低则无法很好对预后产生影响(图17B)。说明Med23的表达量的高低在临床上可以当做Ras被激活的肺癌病人预测预后结果的指标。

实施例18

Med23的缺失降低了A549细胞对于化疗药物的耐受程度

用肺癌治疗中经常使用的化疗药物cisplatin处理Ctrl和RNAi Med23的A549细胞，发现在相同处理浓度和相同处理时间的情况下，细胞周期sub-G0期检测结果显示RNAi细胞发生凋亡的数目明显多于Ctrl细胞(图18A，图18B)，说明Med23的缺失使得A549细胞对化疗药物变得更加敏感了。同时western结果也显示当Med23缺失后细胞内激活形式的caspase3的量也明显增加，也表明RNAi细胞在药物处理后发生了更多的凋亡(图18C)。

同样本发明人在小鼠模型中也发现了类似的现象，将之前构建的tet onRNAi-Med23的A549细胞用luciferase进行标记以便后续的活体荧光拍摄，然后将细胞注射到裸鼠皮下建立肿瘤模型。当肿瘤长至100mm³左右时将小鼠进行随机分组，然后给小鼠进行cisplatin腹腔注射，或给小鼠的饮水中加入DOX以诱导Med23的RNAi，或两者同时进行。结果发现当只给小鼠喂含有DOX的水时，肿瘤的生长相对于不给水的对照组明显变慢，荧光信号明显减弱，这和前面稳定细胞株观察到的现象相一致。而在给cisplatin处理的情况下，如果同时给小鼠喂含有DOX的水的话，结果发现：相对于单独给cisplatin的对照组肿瘤不光生长明显变慢，而且到了后期会有消退的现象出现(图18D)，这说明Med23的缺失确实使得小鼠体内的肿瘤对于cisplatin变得更加敏感，增强了化疗药物的疗效。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种Med23亚基的抑制剂、或Med23基因的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肿瘤的药物；和/或制备降低肿瘤或肿瘤细胞对化疗药的耐受程度的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Med23亚基的抑制剂选自下组：Med23亚基的抗体、Med23亚基的结合蛋白。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Med23基因的抑制剂为：Med23基因特异性的RNAi、Med23基因特异性的microRNA、抑制Med23基因启动子的抑制剂、或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：肺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌。

5.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为Med23亚基的抑制剂或Med23基因的抑制剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Med23亚基的抑制剂为Med23亚基的抗体或Med23亚基的结合蛋白。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的Med23基因的抑制剂为Med23基因特异性的RNAi、Med23基因特异性的microRNA、抑制Med23基因启动子的抑制剂、或其组合。

8.一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括步骤：在Med23亚基抑制剂或Med23基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中Med23亚基的活性降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有Med23亚基的活性。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中Med23基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有Med23基因的表达。

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