CN104721838A - Yap抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，属于医药技术领域。YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是对于胶质细胞及胶质细胞肿瘤的应用。所述YAP抑制剂为降低YAP核酸或蛋白表达的化合物；主要为YAP-i-1或YAP-i-2所示的siRNA和shRNA核酸序列；所述YAP-i-1siRNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述YAP-i-2siRNA序列如SEQ ID NO：4所示。本发明发现降低YAP表达的物质干扰胶质瘤细胞的增殖和迁移，从而起到抑癌的作用，有助于进行干预肿瘤发生和转移的治疗，并提供了YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，为新的肿瘤药物研发提供了基础。

Description

YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

胶质细胞瘤是人类难治性肿瘤之一，也是中枢神经系统在肿瘤中的常见肿瘤，有33.3～58.6％的原发性脑肿瘤起源于胶质细胞，即胶质瘤。其中原发性恶性脑肿瘤中约有77％为恶性胶质瘤。目前公认的恶性胶质瘤标准治疗方案为手术切除肿瘤，替莫唑胺化疗以及放疗，但事实上由于恶性胶质瘤的特殊的病理特点和生长方式，这些临床治疗方法效果有限，一直不甚理想，恶性胶质瘤患者的中位生存期仅为确诊后的12～18个月，5年生存率不足10％。对于恶性胶质瘤来说，单纯手术切除后复发率高，因此必须经过放化疗，然而目前对于胶质细胞瘤属猴放化疗的具体方案意见并不统一，且效果不理想，患者预后不容乐观。这主要是因为血脑屏障对阻碍化疗药物充分进入肿瘤组织以及恶性胶质刘对细胞毒性药物固有的和诱导产生的耐药性。因此通过基因治疗的方法将外源性基因转染至患者肿瘤细胞来干扰肿瘤细胞的增殖或者迁移能力是一种有效的方法。其关键是找到肿瘤特异性的靶点蛋白，作为治疗的靶点，通过研制该靶点蛋白的抑制剂来达到干预胶质细胞肿瘤的目标。

由于肿瘤的发生发展是一个多基因互相调控的过程，胶质瘤的分子病理学机制研究也已从过往的单基因的研究逐渐转移到多基因的信号通路调控及其信号网络调控的研究中。YAP(Yes-associatied protein)为Yes相关蛋白，是Hippo通路的转录共激活因子，定位于人类染色体11q22，通过增强转录因子的活性促进基因表达。外界信号激活MST1/2，与调节蛋白SAV1结合后磷酸化LATS1/2、MOB，继而直接磷酸化YAP/TAZ，磷酸化后的YAP/TAZ停滞在细胞质内，转录抑制。当此信号通路被阻断或失活，未磷酸化的YAP/TAZ由细胞质转入细胞核，与TEADs、Smad、Runx1/2、p63/p73、ErbB4等转录因子结合促进基因转录。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的YAP抑制剂为降低YAP核酸或蛋白表达的化合物；

优选的，所述的YAP抑制剂为YAP-i-1或YAP-i-2所示的核酸序列。

所述的YAP-i-1为针对YAP核酸序列第1062个碱基开始的YAP-i-1 siRNA序列或YAP-i-1shRNA序列；

所述的YAP-i-1 siRNA序列如下：CCGGGATGACTCAGGAATT；

所述的YAP-i-1 shRNA序列如下：

YAP-i-1 shRNA正链：

5’-GATCCCCCCGGGATGACTCAGGAATTTTCAAGAGAAATTCCTGAGTCATCCCGGTTTTTA-3’；

YAP-i-1 shRNA反链：

5’-AGCTTAAAAACCGGGATGACTCAGGAATTTCTCTTGAAAATTCCTGAGTCATCCCGGGGG-3’；

所述的YAP-i-2为针对YAP核酸序列第930个碱基开始的YAP-i-2 siRNA序列或YAP-i-2 shRNA序列；

所述的YAP-i-2 siRNA序列如下：GGCAATACGGAATATCAAT；

所述的YAP-i-2 shRNA序列如下：

YAP-i-2 shRNA正链：

5’-GATCCCCGGCAATACGGAATATCAATTTCAAGAGAATTGATATTCCGTATTGCC TTTTTA-3’；

YAP-i-2shRNA反链：

5’-AGCTTAAAAACCGGGATGACTCAGGAATTTCTCTTGAAAATTCCTGAGTCATCCCGGGGG-3’；

所述的肿瘤为胶质细胞肿瘤。

由于核苷酸序列的特殊性，任何含有YAP-i-1和YAP-i-2所示的核酸序列或其变体，只要其片段与前述核酸序列同源性在90％以上，或针对YAP起始位点第930或第1062个碱基的siRNA序列，且具有相同功能，均属于本发明保护范围之列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

本发明的发明原理：受YAP在胶质细胞瘤发生和发展中起关键作用的启示，发明人研究了其对这些过程的影响。根据临床胶质瘤标本的检测结果显示YAP特异性地表达在胶质细胞瘤中，而在癌旁组织中表达量很低，且其表达量随肿瘤的病理分级息息相关，IV型的表达量高于III型，高于II型和I型。且YAP对于胶质瘤细胞的增殖和迁移起必要作用。通过siRNA或shRNA干扰YAP的表达能够显著抑制胶质瘤细胞系U251的增殖能力和迁移能力。在肿瘤细胞U251中以特异性siRNA或shRNA以基因干扰的方式敲低YAP的表达，对U251细胞的增殖和迁移能力有显著的抑制作用。这些结果显示YAP的表达对肿瘤生成和生长有关键的调节作用，也提供了新型的抑癌靶点和药物形式。YAP表达在临床胶质细胞瘤标本中的显著升高也提供了以检测YAP的表达水平进行临床肿瘤诊断和预后判断的可行性。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明发现YAP蛋白表达水平在病人胶质瘤中明显升高，发现YAP蛋白的表达可以反映胶质瘤的恶性程度，并研制降低YAP表达的物质对干扰胶质瘤细胞的增殖和迁移，从而起到抑癌的作用，有助于进行干预肿瘤发生和转移的治疗，并提供了YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，为新的肿瘤药物研发提供了基础。

附图说明

图1是YAP蛋白在人胶质细胞瘤组织的免疫组化结果；

图2是YAP蛋白在人胶质细胞瘤组织表达量显著高于癌旁组织(正常组织)统计图；

图3是YAP-i-1和YAP-i-2对YAP蛋白的表达的影响结果；其中：A为YAP-i-1和YAP-i-2对YAP蛋白的印迹结果图，B为YAP-i-1和YAP-i-2降低YAP蛋白表达的统计图；

图4是YAP抑制剂抑制人胶质瘤细胞U251的细胞增殖的结果图；

图5是YAP抑制剂抑制胶质细胞肿瘤细胞系的迁移的结果图；其中，Con：对照组；YAP-i-1：干扰YAP表达的siRNA-1；YAP-i-2：干扰YAP表达的siRNA-2；

图6是YAP抑制剂抑制胶质细胞肿瘤细胞系的迁移统计图；其中，Con：对照组；YAP-i-1：干扰YAP表达的siRNA-1；YAP-i-2：干扰YAP表达的siRNA-2。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

临床胶质瘤标本的检测分析证实YAP在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且YAP的表达水平与肿瘤的病理分级密切相关，证实YAP的表达是临床胶质瘤诊断的新型标记物。

为了探求YAP在临床应用中的可能性和重要性，利用高特异性的YAP抗体，以免疫组化法检测了72例人胶质瘤标本中的YAP表达水平。代表性的YAP在临床胶质瘤标本切片中的免疫组化染色结果如图1所示，YAP的免疫染色在癌组织中很明显，而在癌旁正常组织中几乎检测不到。更值得关注的是，YAP的免疫染色强度随着肿瘤的病例分级相关，肿瘤分级越高，YAP的免疫染色强度越深，也代表YAP在癌组织中的蛋白水平或称为表达量越高(图1)。

YAP的免疫组化结果由Image-Pro Plus软件，由三个不同的工作人员在不知道病人和病理信息的情况下测量染色强度的分值。染色强度的统计结果得出YAP的高表达在癌组织中高度分布与癌旁组织有显著性差异，n＝72例标本，P＜0.05，Kruskal-Wallis检测，且与肿瘤病理分级高度相关，数据统计经单向ANOVA检测(图2)。

实施例2

以细胞模型证实YAP对人胶质瘤细胞系U251的生成和发展及其重要，提供以特异性YAP抑制物能抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力。

为了研究YAP对胶质瘤细胞增殖的影响，选择了人胶质瘤细胞系U251。同时构建特异性识别YAP的siRNA，YAP-i-1和YAP-i-2(序列见序列表)和对照scramble siRNA，序列为5’-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3’，此为一段打乱的无针对全基因组核酸序列的核苷酸序列，经过大规模数据分析和实验验证，不靶向任何已知的人、小鼠、大鼠基因。将上述的两种特异性YAP的siRNA和对照scramble siRNA单链目的基因片段分别退火连接形成双链DNA。将pSUPER质粒载体线性化：BglII和HindIII双酶切pSUPER质粒载体，使其线性化，1％琼脂糖凝胶回收大片段。将线性化pSUPER质粒载体与退火片段在T4连接酶作用，4℃连接过夜，并连接产物42℃热激转化至DH5α感受态细菌，涂卡那抗生素平板，37℃培养过夜。挑选单克隆菌落，小量抽提质粒，酶切、测序鉴定正式后，用EndoFree Plasmid Maxi Kit试剂盒大量抽提并纯化质粒，检测OD260/280值，合格后将质粒稀释至3mg/ml浓度备用。

当人胶质瘤细胞系U251细胞长满时，将上述YAP-i-1和YAP-i-2及对照siRNA使用脂质体转染方法，具体为3g的siRNA质粒和31脂质体(lipofectamin2000，Invitrogen公司)混合后加入60mm的细胞盘中，4小时后更换新鲜培养液。由于本例采用的pSUPER载体上带有绿色荧光蛋白(GFP)，因而在荧光显微镜下通过观察GFP表达细胞比例来评价转染效率。选取转染成功且转染效率为80％左右的细胞进行后续检测。

蛋白印迹结果显示，与scramble siRNA相对照，YAP-i-1和YAP-i-2可以将U251细胞系中的YAP蛋白的水平降低60％-70％(图3)。

YAP-i-1和YAP-i-2或者scramble siRNA转染后的细胞以相同的接种密度在相同的条件下生长，并分别于0、1、2、3天接受细胞增殖的CCK8检测(结果见图4)。这个细胞模型证明YAP特异性的促进人胶质瘤细胞系的增殖，而降低YAP的蛋白水平可以有效地抑制人胶质瘤细胞系的增殖。

YAP-i-1和YAP-i-2或者scramble siRNA转染后的细胞以相同的接种密度在相同的条件下生长，于种植2天后更换为无血清培养基以排除细胞增殖影响，同时行划痕实验，继而在0小时、12小时、24小时和48小时在显微镜下观察细胞迁移情况。此细胞迁移模型证明降低YAP的蛋白水平可以有效地抑制人胶质瘤细胞系的迁移。

结论：YAP蛋白在正常已分化的组织中几乎不表达，而在临床胶质瘤肿瘤标本中高度表达，起到致癌和促癌的效应。因此针对YAP蛋白的表达情况可作为临床肿瘤诊断，尤其是胶质瘤诊断的一个重要常规指标，YAP的表达水平与其他分子指标的结合考虑，是一个重要判断病人存活率和用药的标准。通过降低YAP的表达可以抑制YAP的致癌促癌效应，抑制人胶质瘤细胞的增殖和迁移，从而起到抑制肿瘤的发生发展和转移。

由于目前已有的胶质瘤化疗药物疗效不佳且往往引起抗药性，因此使用基因调节的方法在转录水平抑制YAP的表达，结合其他治疗手段联合使用，以达到更好的抗癌效果。

本发明也可应用于其他系统肿瘤的诊断和药物开发靶点。凡针对以检测YAP的表达来诊断，以及以降低或抑制YAP的表达来进行肿瘤的治疗，均在本发明的保护范围。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的YAP抑制剂为降低YAP核酸或蛋白表达的化合物。

3.根据权利要求1所述的YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的YAP抑制剂为YAP-i-1或YAP-i-2所示的核酸序列；

所述的YAP-i-1为针对YAP核酸序列第1062个碱基开始的YAP-i-1 siRNA序列或YAP-i-1 shRNA序列；

所述的YAP-i-2为针对YAP核酸序列第930个碱基开始的YAP-i-2 siRNA序列或YAP-i-2 shRNA序列。

4.根据权利要求3所述的YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的YAP-i-1 siRNA序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的YAP-i-1 shRNA序列如下：

YAP-i-1 shRNA正链如SEQ ID NO：2所示；

YAP-i-1 shRNA反链如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求3所述的YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的YAP-i-2 siRNA序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的YAP-i-2 shRNA序列如下：

YAP-i-2 shRNA正链如SEQ ID NO：5所示；

YAP-i-2 shRNA反链如SEQ ID NO：6所示。

6.根据权利要求1所述的YAP抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为胶质细胞肿瘤。