CN104994883A - miR-494通过BIM下调来调节TRAIL诱导的细胞凋亡的用途 - Google Patents

miR-494通过BIM下调来调节TRAIL诱导的细胞凋亡的用途 Download PDF

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Abstract

描述了用于在体外和体内抑制有此需要的受试者中的致瘤性的方法和组合物，其包括施用足以靶向一种或多种肿瘤抑制基因(TSG)的有效量的抗-miR-494核酸构建体。ERK1/2途径的活化是多种细胞过程和癌症发展的主要决定因素，并且负责几种重要miRNA的转录。本文中描述了ERK1/2途径与BIM表达之间通过miR-494的联系。该ERK1/2途径通过miR-494和负责TRAIL抗性的机制调控细胞凋亡和细胞增殖。描述了与癌症的研究和治疗相关的材料和方法。

Description

miR-494通过BIM下调来调节TRAIL诱导的细胞凋亡的用途
发明人:Carlo M.Croce,Giulia Romano
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年9月23日提交的美国临时申请号61/704,542的权益，其完整公开内容出于所有目的明确地通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含已通过EFS-网站提交并在此通过引用以其整体并入的序列表。将于2013年9月19日创建的ASCII副本命名为604_54418_SEQ_LIST_13072.txt，并且其大小为3,838字节。
背景
MicroRNA(miRNA或miR)在不同类型的癌症中的化学敏感性或化学抗性的发生中具有重要的作用。ERK1/2途径的激活是多种细胞过程和癌症发展的主要决定因素，并且负责几种重要miRNA的转录。MiRNA是有吸引力的药物靶标，因为它们调控许多细胞蛋白质的表达并且常常在恶性细胞中相对于正常细胞差异表达。
TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是细胞凋亡诱导性细胞因子。TRAIL是有前景的基于细胞凋亡的抗肿瘤剂。然而，许多人癌细胞仍然对TRAIL诱导的细胞凋亡具有抗性。
虽然已经提出许多治疗方法来治疗癌症，但仍然存在对另外的有效的抗癌剂和载体的需要。需要用于有效和安全的体内抗癌治疗的方法和材料。需要涉及药物抗性的生化途径和发现药物的方法的增进的理解。此外，仍然存在对于开发基因治疗载体(其对于治疗肿瘤性病症具有增强的治疗活性，最小化的毒性和广泛目标范围)的未满足的医疗需求。
发明概述
在第一广泛的方面，本文中描述了抗-miR-494作为治疗剂诱导细胞凋亡的用途。在另一广泛的方面，本文中描述了抗-miR-494作为治疗剂增强药物敏感性的用途。
在另一广泛的方面，本文中描述了抗-miR-494和TRAIL作为化学治疗剂的共施用(即，抗-miR-494将减小TRAIL抗性)。
在另一广泛的方面，本文中描述了抗-miR-494调控BIM的表达以促进肿瘤细胞(诸如，但不限于肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃肠道肿瘤和黑色素瘤)的细胞凋亡的用途。
在另一广泛的方面，本文中描述了miR-494靶向BIM 3’UTR的用途。
在另一广泛的方面，本文中描述了在有此需要的受试者中恢复ERK1/2活性的所需模式的方法，包括施用足以靶向一个或ERK1/2的有效量的至少一种抗-miR-494。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于在有此需要的受试者中诱导肿瘤抑制基因(TSG)的再表达的方法，包括施用足以诱导TSG表达的有效量的抗-miR-494。
在某些实施方案中，所述TSG包括BIM和TRAIL的一种或多种。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于在有此需要的受试者中体外和体内抑制致瘤性的方法，其包括施用足以靶向一种或多种肿瘤抑制基因(TSG)的有效量的抗-miR-494核酸构建体。在某些实施方案中，所述受试者为癌症患者。在某些实施方案中，所述抑制方法包括非小细胞肺癌(NSCLC)的表观遗传学调控。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于增加肿瘤抑制基因(TSG)的表达的方法，所述方法包括：用抗-mir-494核酸构建体转染细胞。在某些实施方案中，所述TSG包括BIM和TRAIL的一种或多种。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于上调细胞中BIM和/或TRAIL的表达水平的方法，包括用抗-miR-494核酸构建体转染细胞。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于在体外和体内抑制致瘤性的方法，包括抑制miR-494在癌细胞中的表达。
在另一广泛的方面，本文中描述了通过使用单独的或与其它治疗组合的合成的抗-miR-494以在癌细胞中再活化肿瘤抑制因子和使BIM和/或TRAIL表达的异常模式正常化来开发表观遗传学疗法的方法。在某些实施方案中，所述细胞是癌细胞，诸如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤和黑色素瘤。
在另一广泛的方面，本文中描述了在受试者中抑制肿瘤发生的方法，所述受试者患有或怀疑患有其中至少miR-494在受试者的癌细胞中相对于对照细胞被上调的癌症相关疾病，所述方法包括：当miR-494在癌细胞中被上调时，对受试者施用有效量的至少一种用于抑制miR-494表达的化合物，以便在受试者中肿瘤发生被抑制。
在某些实施方案中，所述化合物包括抗-miR-494核酸构建体，或其分离的变体或生物活性片段或功能等同物，或与其结合的抗体。
在某些实施方案中，治疗癌细胞或抑制BIM下调的方法包括在施用TRAIL和抗-miR-494之前测量癌细胞中的miR-494表达水平；如果miR-494水平是对照水平的2-12倍，则将所述癌细胞归类为过表达miR-494；和以足以减少miR-494水平的量施用miR-494的抑制剂。在某些实施方案中，miR-494水平在施用miR-494抑制剂后减少至少25％。在某些实施方案中，miR-494水平减少25％-50％。在某些实施方案中，施用治疗后的miR-494水平少于对照水平的5倍。在某些实施方案中，施用治疗后的miR-494水平少于对照水平的2倍。在某些实施方案中，在施用治疗之后，被治疗的细胞中的miR-494水平在非癌性对照水平的25％之内。
在另一广泛的方面，本文中描述了鉴定肿瘤发生的抑制剂的方法，包括：给细胞提供测试试剂，和测量与癌症相关疾病中改变的表达水平相关的至少miR-494的水平，其中所述细胞中miR-494的水平相对于适当的对照细胞的升高或降低表示所述测试试剂为肿瘤发生的抑制剂。在某些实施方案中，癌症为肺癌。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于治疗癌症相关疾病的药物组合物，其包含：至少抗-miR-494核酸构建体和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，癌症相关疾病为肺癌。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于诱导癌细胞的细胞凋亡的方法，所述方法包括将癌细胞与抑制癌细胞的ERK1/2信号传导途径的试剂接触。在某些实施方案中，所述细胞存在于受试者中。在某些实施方案中，所述细胞不过表达miR-494。
在某些实施方案中，所述试剂为特异性抑制ERK1/2信号传导途径和引起miR-494的下调的有机化合物。
在某些实施方案中，所述化合物包括：含死亡效应子结构域的蛋白，诸如糖尿病中富集的磷蛋白(PED)或星形细胞中富集的磷蛋白(PEA-15)。
在某些实施方案中，所述试剂为特异性拮抗ERK1/1信号传导途径的核酸试剂。
在某些实施方案中，所述试剂选自短的干扰RNA(siRNA)、短的发夹RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、反义核酸和互补DNA(cDNA)。
在某些实施方案中，miRNA试剂包括抗-miR-494核酸构建体。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于治疗或改善受试者的癌症的方法，所述方法包括对受试者施用包含有效量的试剂的药物组合物，所述试剂下调ERK1/2信号传导途径和下调miR-494的表达。
在某些实施方案中，所述试剂是特异性抑制ERK1/2信号传导途径的有机化合物。在某些实施方案中，所述化合物包括：含死亡效应子结构域的蛋白，诸如糖尿病中富集的磷蛋白(PED)或星形细胞中富集的磷蛋白(PEA-15)。
在另一广泛的方面，本文中描述了治疗或抑制有此需要的受试者中的细胞增殖的方法，包括对受试者施用miR-494的抑制剂。在某些实施方案中，miR-494的抑制剂为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与成熟miR-494序列、pri-miR-494和/或pre-miR-494至少部分互补的序列。在某些实施方案中，miR-494的抑制剂为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有为miR-494转录启动子序列诸如(S1)和/或(S2)或与其至少部分互补的序列。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含至少一个糖和/或主链修饰。
在某些实施方案中，通过静脉内或皮下施用途径对受试者施用所述抑制剂。
在某些实施方案中，在施用抑制剂后相较于未治疗的受试者增加了受试者的癌细胞的细胞凋亡。
在某些实施方案中，在施用抑制剂后相较于未治疗的受试者，BIM的表达在受试者中增加。在某些实施方案中，所述受试者是人。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含抗-miR-494核酸和细胞凋亡的至少一种诱导剂的构建体。
在某些实施方案中，细胞凋亡的诱导剂选自BIM和TRAIL。
在某些实施方案中，抗-miR-494核酸是天然miR-494、pri-miR-494和/或pre-miR-494的变体或其同源物、类似物和/或片段。
在某些实施方案中，抗-miR-494核酸大体上是对应于或互补于选自如下miR-494形式的核酸序列：miR-494的初级转录物(pri-miR-494)、miR-494的前体(pre-miR-494)、miR-494的RNA双链体以及成熟miR-494。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含如本文中描述的核酸构建体的载体。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含如本文中描述的载体的分离的宿主细胞。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含构建体(作为活性成分)和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于治疗人受试者的癌症的方法，包括对有此需要的人受试者施用治疗有效量的构建体，从而治疗人受试者的癌症。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于抑制人受试者的肿瘤进展的方法，包括对有此需要的人受试者施用治疗有效量的构建体，从而抑制人受试者的肿瘤进展。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于在人受试者中减轻或缓解与肿瘤性病症相关的症状的方法，包括对有此需要的人受试者施用治疗有效量的构建体，从而在人受试者中减轻或缓解与肿瘤性病症相关的症状。
在某些实施方案中，所述受试者患有特征在于miR-494在肿瘤的至少一部分细胞中内源性表达的肿瘤。在某些实施方案中，所述受试者患有选自肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃肠道肿瘤和黑色素瘤的癌症。
在某些实施方案中，通过选自注射、输注和至肿瘤内的直接注射的途径进行施用。
在某些实施方案中，在对受试者施用化学治疗剂之外进行所述方法。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含i)一个或多个剂量单位的构建体；和ii)用于对有此需要的受试者施用构建体的说明书的试剂盒。
在另一广泛的方面，本文中描述了通过抑制细胞的增殖和/或诱导细胞的细胞凋亡来影响细胞的方法，所述方法包括将有效量的至少miR-494的miR特异性抑制剂引入细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是癌细胞。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂选自抗-miR和靶模拟物。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂包含与miR-494互补的至少6个连续核苷酸的核苷酸序列，并且与miR-494序列的其余部分具有至少50％互补性，并且其中miR-494的miR-特异性抑制剂诱导BIM和TRAIL的至少一种在细胞中表达。
在某些实施方案中，miR-494的miR-特异性抑制剂上调BIM和TRAIL的一种或多种。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂与抗-miR-494具有至少60％互补性。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂与抗-miR-494具有至少70％互补性。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂与抗-miR-494具有至少80％互补性。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂与抗-miR-494具有至少90％互补性。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂在至少一个核苷酸上被化学修饰。
在另一广泛的方面，本文中描述了上调哺乳动物细胞的BIM和/或TRAIL的方法，其包括将有效量的至少miR-494的miR-特异性抑制剂引入哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞是癌细胞。在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂选自抗-miR和靶模拟物。
在某些实施方案中，所述miR-特异性抑制剂包含与miR-494互补的至少6个连续核苷酸的核苷酸序列，并且与miR-494序列的其余部分具有至少50％互补性，并且其中miR-494的miR-特异性抑制剂诱导BIM和TRAIL的至少一种在细胞中表达。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于测定获自受试者的细胞样品的细胞周期进程表型的方法，所述方法包括：a)测量细胞样品中至少miR-494的水平；和b)将至少miR-494的水平与细胞周期进程参考值相比较，其中高于细胞周期进程参考值的水平表明细胞样品中加速的细胞周期进程。
在某些实施方案中，所述细胞周期进程表型是增殖。在某些实施方案中，所述细胞周期进程表型是细胞凋亡。
在另一广泛的方面，本文中描述了测量赘生物中的增殖的方法，包括测定赘生物中miR-494的水平。
在另一广泛的方面，本文中描述了测量赘生物中细胞亚群的增殖的方法，包括测定细胞亚群中miR-494的水平。
在另一广泛的方面，本文中描述了诊断赘生物是否抗标准化学疗法的方法，所述方法包括：测定赘生物中miR-494和TRAIL的至少一种的水平，以及如果miR-494的水平在赘生物中比在正常对照中更高和/或TRAIL的水平在赘生物中比在正常对照中更低，则将赘生物鉴定为抗化学疗法的。
在另一广泛的方面，本文中描述了确定赘生物是否包含抗标准化学疗法的细胞亚群的方法，所述方法包括：分离细胞的亚群，测定miR-494和TRAIL的至少一种在细胞亚群中的水平，以及如果miR-494的水平在亚群中比在正常对照中更高和/或TRAIL的水平在亚群中比在正常对照中更低，则将细胞的亚群鉴定为抗化学疗法的。在某些实施方案中，细胞的亚群为干细胞样细胞。在某些实施方案中，正常对照为大批赘生性细胞(bulk neoplastic cells)。
本发明的实施方案包括基于本文中描述的诊断和预后方法的结果确定用于疾病治疗的健康保险补偿和/或支付的范围或拒绝的方法。例如，从保险范围排除治疗的方法，所述方法包括：鉴定具有健康保险的患者；接受对患者的诊断过程的结果，其中所述诊断过程包括确定赘生物是否抗标准化学疗法；以及如果miR-494的水平相较于对照较高，则拒绝化学疗法治疗的健康保险范围。在一些实施方案中，化学疗法是术前和/或术后辅助疗法。在一些实施方案中，化学疗法是禁忌的。在一些情况下，禁忌的化学治疗剂是抑制EGFR酪氨酸激酶的小分子诸如吉非替尼、埃罗替尼或拉帕替尼或抑制MAP激酶途径的小分子诸如索拉非尼。
在另一广泛的方面，本文中描述了减少细胞的增殖的方法，包括将细胞与以有效地减少细胞的增殖的量存在的与miR-494互补的抑制性核酸接触。
在另一广泛的方面，本文中描述了增强细胞对化学治疗剂的敏感性的方法，其包括将细胞与以有效地使细胞对化学治疗剂敏感的量存在的与miR-494互补的抑制性核酸接触。
在某些实施方案中，将所述抑制性核酸转染至细胞中。
在某些实施方案中，所述化学治疗剂是细胞凋亡调节剂诸如，但不限于BIM和TRAIL。
在某些实施方案中，所述细胞是癌干细胞。
在某些实施方案中，所述细胞是赘生性细胞。
在另一广泛的方面，本文中描述了治疗受试者中的赘生物的方法，包括对受试者施用有效量的抑制miR-494的抑制性核酸。
在某些实施方案中，所述方法还包括施用第二疗法，其中所述抑制性核酸的施用使赘生物对第二疗法敏感。在某些实施方案中，所述第二疗法包括施用化学治疗剂。
在某些实施方案中，所述癌症选自肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃肠道肿瘤和黑色素瘤。
在另一广泛的方面，本文中描述了用于病理样品的分析的试剂盒，所述试剂盒在适当的容器中包含用于测定miR-494的水平、BIM和TRAIL的一种或多种的水平的RNA杂交或扩增试剂，以及使用说明书。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含大体上纯的抗-miR-494和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一广泛的方面，本文中描述了包含大体上纯的抗-miR-494和TRAIL以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一广泛的方面，本文中描述了方法，所述方法还包括测量测试样品中至少一种另外的miR基因产物的水平，其中所述miR选自图1D中显示的组。
在另一个方面，本文中描述了用于通过施用治疗有效量的核酸构建体从而治疗人受试者的癌症来治疗人受试者的癌症的方法。
在另一个方面，本文中描述了用于抑制人受试者中的肿瘤进展的方法，所述方法包括对有此需要的人受试者施用治疗有效量的核酸构建体，从而抑制人受试者中的肿瘤进展。
在另一个方面，本文中描述了用于抑制人受试者中的肿瘤转移的方法，所述方法包括对有此需要的人受试者施用治疗有效量的核酸构建体，从而抑制人受试者中的肿瘤转移。
在另一个方面，本文中描述了用于减轻或缓解人受试者的与肿瘤性病症相关的症状的方法，所述方法包括对有此需要的人受试者施用治疗有效量的核酸构建体，从而减轻或缓解人受试者的与肿瘤性病症相关的症状。
在另一个方面，在一个实施方案中，所述受试者患有癌症、肿瘤或肿瘤性病症，其特征在于miR-494在其至少一部分细胞中内源地表达。
在具体实施方案中，通过选自注射、输注和至肿瘤内的直接注射的途径进行施用。
在具体实施方案中，施用包括施用单个剂量或多个剂量的核酸构建体。
在具体实施方案中，方法还包括测定来自受试者的生物样品例如细胞或组织中的miR-494活性的水平的步骤。
在另一个方面，本文中描述了核酸构建体用于制备用于治疗人受试者的癌症的药剂的用途。
在另一个方面，本文中描述了本发明的核酸构建体用于制备用于抑制人受试者中的肿瘤进展的药剂的用途。
在另一个方面，本文中描述了核酸构建体用于制备用于抑制人受试者中的肿瘤转移的药剂的用途。
在另一个方面，本文中描述了本发明的核酸构建体用于制备用于减轻或缓解与肿瘤性病症相关的症状的药剂的用途。
在另一个方面，本文中描述了试剂盒，其含有i)足够用于表达miR-494的癌症、肿瘤或赘生物的一个或多个治疗过程的一个或多个剂量单位的核酸构建体；和ii)用于对有此需要的受试者施用核酸构建体的说明书。所述组合物、方法和试剂盒可用于治疗多种与miR-494的表达相关的癌症和肿瘤性病症。在具体实施方案中，所述癌症选自肉瘤、癌、腺癌、淋巴瘤和白血病。在具体的实施方案中，所述癌症是肺癌。
当根据附图阅读时，根据以下优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图概述
专利或申请文件可包含一个或多个彩色执行的附图和/或一张或多张照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开的副本在应要求和支付必要的费用后将由美国专利和商标局提供。
图1A-1D。ERK1/2对miRNA的调控：
图1A：显示PEDWT和PEDS104G细胞的表达的Western印迹；
图1B：显示在空载体、PEDWT和PEDS104G转染后293A细胞中ERK1/2的不同亚细胞定位的Western印迹；
图1C：基于293A细胞中PEDWT对PEDS104G的miRNA表达谱的无监督层次聚类，P值<0.05；和，
图1D：显示在PEDWT对PEDS104G转染后失调的microRNA的倍数变化(P≤0.05)。
图2A-2G.miR494启动子的鉴定：
图2A：显示在PEDWT和PEDS104G转染后293A细胞中的pri–miR-494下调的qRT-PCR；
图2B：显示在PEDWT和PEDS104G转染后293A细胞中的premiR-494下调的qRT-PCR；
图2C：进行萤光素酶测定以鉴定miR-494启动子；
图2D：ERK对miR-494表达的调控；
图2E：AP-1调控miR-494启动子的推定序列(S1和S2)。
图2F：对S1和S2片段的染色质免疫沉淀分析。利用c-Jun抗体免疫沉淀染色质；和
图2G：跨越pri–miR-494的30-kb基因组区域：示意图代表位于pri–miR-494上游27.8kb和18.6kb的两个推定的AP1结合序列(绿色矩形)。数据表示为±SD。
图3A-3D。BIM为miR-494的靶：
图3A：BIM 3’UTR含有一个预测的miR494结合位点；显示了miR-494[SEQ ID NO:16]的种子区域与BIM 3’UTR[SEQ ID NO:7]的比对；靶诱变的位点以红色标示；
图3B：利用含有野生型(直方图的左侧)或突变型(直方图的右侧)的pGL3-BIM荧光素酶构建体进行萤光素酶测定；将萤火虫萤光素酶表达的相对抑制针对转染对照进行标准化；进行3次报告基因测定，结果基本上相同；
图3C：miR-494下调升高293A细胞中BIM蛋白的内源水平；和，
图3D：293A细胞中的显示miR-494下调后BIM表达的增加的qRT-PCR。数据表示为±SD。
图4A-4E。PED通过ERK1/2调控BIM表达：
图4A：显示PEDwt和PEDS104G转染后BIM的表达的Western印迹；
图4B：显示在无规miR或miR-494转染48小时和ERK1/2抑制剂(ERK抑制剂II FR180204)的时间过程后BIM、ERK1/2、p-ERK1/2和p-Elk1的表达的Western印迹；
图4C：与图4B相关的miR-494表达的qRT-PCR；
图4D：293A细胞中的显示在ERK1/2信号传导的干扰后miR-494下调的qRT-PCR；和，
图4E：293A细胞中的显示在AP1的干扰后的BIM增加的qRT-PCR。数据表示为±SD。
图5A-5G。miRNA-494通过BIM下调抑制NSCLC中的细胞凋亡：
图5A：显示在H460细胞的miR494转染后BIM的表达的Western印迹；
图5B：显示在A549细胞的抗-miR-494转染后BIM的表达的Western印迹；
图5C：显示在ERK1/2沉默和miR-494–强制表达后BIM和ERK1/2的表达的Western印迹；
图5D：显示在A549细胞的ERK1/2、c-Jun和c-Fos siRNA的转染后BIM、ERK1/2、c-Jun和c-Fos的表达的Western印迹；
图5E：在miR-494或BIM siRNA和TRAIL处理(200ng/mL)后对H460细胞进行的百分比细胞增殖测定。相对于未处理的H460细胞的P<0.05的显著性值；
图5F：在miR-494或BIM siRNA和TRAIL处理(200ng/mL)后的对H460细胞进行的半胱天冬酶3/7活性测定。相对于未处理的H460细胞的P<0.05的显著性值；和
图5G：显示在用(200ng/mL)TRAIL处理40分钟的H460细胞中在miR-无规、miR-494、siRNA对照(Ctr)和siBIM后PARP和被切割的PARP的表达的Western印迹。数据表示为±SD。
图6A-6D。miR-494在体内对致瘤性的作用：
图6A和图6B：对用对照(空)或miR-494慢病毒(miR-494)感染的H460细胞进行的克隆生成测定。进行克隆生成测定3次。显示了代表性板。柱表示来源于涂板的500个细胞的克隆的数目；
图6C：用利用空载体或miR-494稳定感染的H460细胞注射的裸鼠中的肿瘤植入物尺寸的比较；和，
图6D：系统的摘要图：阻断ERK1/2细胞核途径的PED104下调miR-494，增强对细胞凋亡刺激的敏感性。数据表示为±SD。
图7A：显示在ERK1/2、c-Fos和c-JUN siRNA转染后蛋白质表达的Western印迹。
图7B：对Meg01和293A细胞进行的显示miR-494内源水平的qRT-PCR。
图7C：在miR-494的强制表达后对Meg01细胞进行的qRT-PCR。
图7D：作为图3D的对照的在miR-494下调后对293A细胞进行的qRT-PCR。
图8A和图8B：显示这些细胞系的BIM和miR-494表达的NSCLC细胞的qRT-PCR。miR-494在不同NSCLC中与BIM mRNA表达反相关。
图8C：显示NSCLC细胞中的BIM与miR-494之间的反相关的XY散布图。
图8D：A549细胞中的显示在miR-494过表达存在或不存在的情况下在ERK1/2siRNA后的miR-494下调的qRT-PCR。
图8E：A549细胞中的显示在miR-494过表达存在或不存在的情况下在ERK1/2siRNA后的BIM表达的增加的qRT-PCR。
图8F：A549细胞中的显示在ERK1/2siRNA后的miR-494下调的的qRT-PCR。
图8G和图8H：在miR-494转染和TRAIL处理后的对A549细胞进行的增殖和半胱天冬酶3–7测定。相对于未处理的A549细胞的P<0.05的显著性值。
图8I：对用无规miR、miR-494转染的并用(400ng/mL)TRAIL处理40分钟的A459细胞进行的Western印迹。数据表示为±SD。
图9A：显示在抗-mir-494转染后A549细胞的PTEN表达的Western印迹。
图9B：显示用空载体或miR-494稳定感染的H460细胞的miR-494表达的qRT-PCR。
图9C：对利用对照或miR-494慢病毒感染的H460细胞进行的生长曲线分析。
图9D：用利用空载体或miR-494稳定感染的H460细胞注射的裸鼠的植入肿瘤的生长曲线。
图9E：对来源于用对照或或miR-494慢病毒感染的H460细胞的植入肿瘤样品进行免疫组织化学。相对于来源于空载体(左上)的团块，过表达miR-494(左下)的细胞形成大得多的团块。基于有活力的异种移植物(V)与坏死区域(N)之间的界面上的细胞增殖(左柱，原始放大倍数＝10×)或细胞凋亡(中和右柱，原始放大倍数＝200×)的程度不能分离对照和表达miR-494的样本。免疫组织化学染色：增殖＝抗-Ki67，细胞凋亡＝抗-半胱天冬酶-3，两者使用二氨基联苯胺作为色原体来在淡兰色(苏木精)背景上产生棕色产物。
图10A：显示用空载体(ZIP)或α-miR-494稳定感染的A549细胞的miR-494的表达的qRT-PCR。
图10B和图10C：对用对照(ZIP)或α-miR-494慢病毒感染的A549细胞进行的克隆生成测定。进行克隆生成测定3次。显示了代表性板。柱表示来源于涂板的500个细胞的克隆的数目。
图10D：对利用空载体(ZIP)或α-miR-494慢病毒稳定感染的A549细胞进行的生长曲线分析。
图10E：用利用ZIP载体或α-miR-494稳定感染的A549细胞注射的裸鼠的肿瘤植入物尺寸的比较。
图10F：用利用空载体(ZIP)或α-miR-494慢病毒稳定感染的A549细胞注射的裸鼠的植入肿瘤的生长曲线。
优选实施方案的详述
在整个本公开内容中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过标识引用进行引用。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容在此处通过引用并入本公开内容以更全面地描述本发明所属领域的当前状态。
定义
应当理解的是，前述一般描述和以下的详细描述都只是示例性和解释性的，并且无意限制本教导的范围。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。
当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，单词"一个/一种(a)"或"一个/一种(an)"的使用可表示"一个/一种"，但其还与"一个/一种或多个/多种"、"至少一个/一种"和"一个/一种或超过一个/一种"的含义一致。
此外，"包含"、"含有"和"包括"或这些根词的修饰体例如但不限于"包含(comprises)"、"含有(contained)"和"包括(including)"的使用无意是限定性的。术语"和/或"意指可一起或分开地获取之前和之后的项。为了举例说明，但非作为限制，"X和/或Y"可意指"X"或"Y"或者"X和Y"。
如本文中所用，术语"其组合"是指术语之前所列的项的所有排列和组合。例如，"A、B、C或其组合"意欲包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一项，并且如果在特定上下文中顺序是重要的话，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，术语"基因"为方便起见用于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括miRNA的牵涉其表达的基因组序列，诸如启动子或其它调控序列。
术语"miR"、"mir"和"miRNA"通常是指microRNA，一类能够调节RNA翻译的小RNA分子(参见，Zeng和Cullen,RNA,9(1):112-123,2003；Kidner和Martienssen Trends Genet,19(1):13-6,2003；Dennis C,Nature,420(6917):732,2002；Couzin J,Science298(5602):2296-7,2002，其每一个通过引用并入本文)。
应理解，miRNA来源于基因组序列或基因。在这方面，术语"基因"为方便起见用于指编码给定的miRNA的前体miRNA的基因组序列。然而，本发明的实施方案可包括miRNA的牵涉其表达的基因组序列诸如启动子或其它调控序列。
术语"miRNA"通常是指单链分子，但在特定的实施方案中，本发明中应用的分子还将包括区域或另外的链，所述区域或另外的链与相同单链分子的另一个区域或与另一个核酸部分地(在链的长度上10和50％之间的互补)、大体上(在链的长度上大于50％但小于100％的互补)或完全互补。因此，核酸可包括包含一个或多个互补或自身互补链的分子或包含分子的特定序列的"互补物"。例如，前体miRNA可具有达到100％互补的自身互补区域，本发明的miRNA探针可与它们的靶互补或与其至少60,65,70,75,80,85,90,95或100％互补。
除非另外指出，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,由OxfordUniversity Press出版的,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell ScienceLtd.出版的,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,由VCH Publishers,Inc.出版的,1995(ISBN1-56081-569-8)。
为了有利于本公开内容的各种实施方案的综述，提供特定术语的下列解释：
辅助疗法：与主要治疗组合使用以改善主要治疗的效应的治疗。
临床结果：是指在疾病或病症的治疗后或在治疗不存在的情况下患者的健康状态。临床结果包括但不限于直至死亡的时间长度的增加、直至死亡的时间长度的减少、存活机会的增加、死亡风险的增加、存活率、无疾病生存率、慢性疾病、转移、晚期或侵袭性疾病、疾病复发、死亡以及对疗法的有利的或不良反应。
细胞因子：由多种造血和非造血细胞产生的影响其它细胞的行为的蛋白质。细胞因子对于先天和适应性免疫反应都是非常重要的。
存活率的降低：如本文中所用，“存活率的降低”是指患者死亡前的时间长度的减短，或患者的死亡风险的增加。
检测表达的水平：例如，“检测miR或miRNA表达的水平”是指定量存在于样品中的miR或miRNA的量。检测特定miR或任何microRNA的表达可使用本领域中已知的或本文中描述的任何方法例如通过qRT-PCR来实现。检测miR的表达包括检测miRNA的成熟形式或与miRNA表达相关的前体形式的表达。通常地，miRNA检测法包括序列特异性检测，例如通过RT-PCR。miR-特异性引物和探针可使用前体和成熟miR核酸序列来设计。
MicroRNA(miRNA)：调控基因表达的单链RNA分子。MicroRNA在长度上通常为21-23个核苷酸。MicroRNA从称为pri-miRNA的初级转录物被加工成称为前体(pre)-miRNA的短茎-环结构，并最终被加工成功能性的成熟microRNA。成熟microRNA分子与一种或多种信使RNA分子部分互补，并且它们的主要功能是下调基因表达。MicroRNA通过RNAi途径调控基因表达。
miR表达：如本文中所用，“低miR表达”和“高miR表达”是指在样品中发现的miRNA的水平的相对术语。在一些实施方案中，通过比较一组对照样品与测试样品的miRNA水平来测定低和高miR表达。随后可基于样品中miRNA的表达是高于(高)还是低于(低)平均或中位miR表达水平来将低和高表达赋予每一个样品。对于单个样品，高或低miR表达可通过将样品与已知具有高或低表达的对照或参照样品相比较，或通过与标准值相比较来测定。低和高miR表达可包括miRNA的前体或成熟形式或两者的表达。
受试者：如本文中所用，术语“受试者”包括人和非人动物。进行治疗的优选患者是人。“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
药学上可接受的媒介物：用于本公开内容的药学上可接受的载体(媒介物)是常规性的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)，描述了适合用于一种或多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。
预防、治疗或缓解疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。术语“预防”、“防止”和“防治”通常是指疾病或病症在受试者中发生的减少。预防可以是完全的，例如疾病或病症在受试者中完全不存在。预防还可以是部分的，以便疾病或病症在受试者中的发生少于在本发明不存在的情况下会出现的发生。“预防”疾病通常是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在其开始发展后缓解疾病或病理病况的体征或症状的治疗性干预。“缓解”是指疾病的体征或症状的数量或严重度的减少。
筛选：如本文中所用，“筛选”是指用于评价和鉴定影响这样的疾病的候选试剂的过程。microRNA的表达可使用本领域已知的和本文中描述的许多技术的任一种，例如通过微阵列分析或通过qRT-PCR来定量。
小分子：通常具有小于约1000道尔顿或在一些实施方案中小于约500道尔顿的分子量的分子，其中所述分子能够在一定的可测量的程度上调节靶分子的活性。
治疗：包括诊断和治疗的总称。
治疗剂：当对受试者正确施用时能够诱导所需治疗或预防作用的化学化合物、小分子或其它组合物诸如反义化合物、抗体、蛋白酶抑制剂、激素、趋化因子或细胞因子。
如本文中所用，“候选试剂”是被选择用于筛选以确定其是否可用作治疗剂的化合物。“温育”包括用于试剂与细胞或组织相互作用的充足量的时间。“接触”包括将以固体或液体形式存在的试剂与细胞或组织一起温育。用试剂“治疗”细胞或组织包括将所述试剂与细胞或组织接触或一起温育。
治疗有效量：足以在用试剂进行治疗的受试者或细胞中实现所需作用的指定的药物或治疗剂的量。试剂的有效量取决于几个因素，包括但不限于进行治疗的受试者或细胞以及治疗性组合物的施用方式。
术语“药学上可接受的媒介物”通常是指如可通常使用的这样的药学上可接受的载体(媒介物)。Remington’s Pharmaceutical Sciences,byE.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第20版，描述了适合用于一种或多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。一般地，载体的性质将取决于所使用的具体施用模式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射液，所述可注射液包括药学上和生理上可接受的液体诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水葡萄糖、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如制药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体以外，待施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
术语“药学上可接受的盐”通常是指在靶动物(例如，哺乳动物)中被生理耐受的本发明的化合物的任何盐(例如，通过与酸或碱反应所获得的)。本发明的化合物的盐可从无机或有机酸和碱衍生而来。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸，诸如草酸，尽管本身不是药学上可接受的，但可用于制备在获得本发明的化合物以及它们的药学上可接受的酸加成盐中用作中间体的盐。碱的实例包括但不限于碱金属(例如，钠)氢氧化物、碱土金属(例如，镁)氢氧化物、氨等。盐的实例包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、flucoheptanoate、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟乙基磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、palmoate、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。盐的其它实例包括与合适的阳离子如Na+、NH4+和NW4+(其中W是C1-4烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。对于治疗性用途，本发明化合物的盐预期是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可用于例如在药学上可接受的化合物的制备或纯化中。
在本方法的一些实施方案中，对照的使用是需要的。在这一点上，对照可以是从相同患者获得的非癌性细胞/组织样品，或从健康受试者诸如健康组织供者获得的细胞/组织样品。在另一个实例中，对照是从历史值计算的标准。肿瘤样品和非癌性细胞/组织样品可按照任何方法获得。例如，肿瘤和非癌性样品可获自已经历切除术的癌症患者，或它们可通过使用皮下针头抽取，通过显微解剖或通过激光捕获来获得。对照(非癌性)样品可以获自例如尸体器官供者或健康供者。
在一些实施方案中，相对于某些丰富且稳定地表达(从而使其成为良好的内源对照候选物)的小的非编码RNA(ncRNA)测量miR表达。
在一些实施方案中，筛选包括将候选试剂与细胞接触。细胞可以是获自患者的原代细胞，或细胞可以是永生化或转化的细胞。
候选试剂可以是任何类型的试剂诸如蛋白质、肽、小分子、抗体或核酸。在一些实施方案中，候选试剂是细胞因子。在一些实施方案中，候选试剂是小分子。筛选包括高通量筛选和筛选单个或小组的候选试剂。
MicroRNA检测
在本文中的一些方法中，需要鉴定存在于样品中的miRNA。
前体microRNA(pre-miRNA)和成熟miRNA的序列是可公共获得的，例如通过miRBase数据库，可通过Sanger研究所在线获得(参见Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids Res.36:D154-D158,2008；Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids Res.34:D140-D144,2006；和Griffiths-Jones,Nucleic Acids Res.32:D109-D111,2004)。本文中提供了目前公开的优选家族成员的前体和成熟形式的序列。
RNA表达的检测和定量可通过本领域公知的多种方法的任一种来实现(参见，例如，美国专利申请公开No.2006/0211000和美国专利No.7,955,848，通过引用并入本文)。适当时，通过使用RNA家族成员的已知序列，可设计特定的探针和引物用于下文中描述的检测方法。
在一些情况下，RNA检测法需要从样品例如细胞或组织样品分离核酸。可使用任何适当的技术分离核酸，包括RNA，特别是miRNA。例如，基于酚的提取是用于RNA分离的常用方法。基于酚的试剂含有用于细胞和组织破碎以及随后从污染物分离RNA的变性剂和RNA酶抑制剂的组合。基于酚的分离法可回收在10-200个核苷酸的范围内的RNA种类(例如，前体和成熟miRNA，5S和5.8S核糖体RNA(rRNA)，以及U1核内小RNA(snRNA))。此外，提取法诸如使用TRIZOLTM或TRI REAGENTTM的那些提取法可纯化所有RNA(大的和小的)，并且是用于从含有miRNA和小干扰RNA(siRNA)的生物样品分离总RNA的高效方法。
在一些实施方案中，需要使用微阵列。微阵列是核酸、蛋白质、小分子、细胞或其它物质的微观有顺序阵列，其使得能够平行分析复杂的生化样品。DNA微阵列由化学地附接至固体衬底的不同的核酸探针(称为捕获探针)组成，所述固体衬底可以是微心片、载玻片或微球尺寸的珠粒。微阵列可被用于例如同时测量大量信使RNA(mRNA)和/或miRNA的表达水平。
可使用多种技术，包括利用细尖的针打印至载玻片上，使用预制掩模进行光刻，使用动态微镜装置进行光刻，喷墨打印或在微电极阵列上的电化学来制造微阵列。
miRNA的微阵列分析可例如(尽管这些方法可以以改进的形式用于任何RNA分析)按照本领域中已知的任何方法来实现(参见，例如，PCT公开No.WO 2008/054828；Ye等人，Nat.Med.9(4):416-423,2003；Calin等人，N.Engl.J.Med.353(17):1793-1801,2005，其每一个通过引用并入本文)。在一个实例中，从细胞或组织样品提取RNA，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA按尺寸选择小的RNA(18-26个核苷酸的RNA)。将寡核苷酸接头附接至小RNA的5'和3'末端，将所得的连接产物用作RT-PCR反应(进行10个扩增循环)的模板。有义链PCR引物具有附接至其5'末端的荧光基团，从而荧光标记PCR产物的有义链。将PCR产物变性，随后将其与微阵列杂交。被称作为靶核酸的与阵列上的对应miRNA捕获探针序列互补的PCR产物将通过碱基配对与捕获探针附着于其上的点杂交。当使用微阵列激光扫描仪激发时，所述点将因此而发荧光。随后使用许多阳性和阴性对照以及阵列数据标准化法，在特定miRNA的拷贝数方面评估每一个点的荧光强度，这将导致特定miRNA的表达水平的评估。
在可选择的方法中，直接使用从细胞或组织样品提取的含有小的RNA级分(包括miRNA)的总RNA，而无需对小的RNA进行尺寸选择，并使用T4RNA连接酶和任一荧光标记的短的RNA接头标记3'末端。通过在30℃温育2小时，随后在80℃灭活T4RNA连接酶5分钟来标记RNA样品。与阵列上的对应miRNA捕获探针序列互补的荧光基团标记的miRNA将通过碱基配对与捕获探针附着于其上的点杂交。随后进行微阵列扫描和数据处理。
存在几个类型的可使用的微阵列，包括点样的寡核苷酸微阵列、预制的寡核苷酸微阵列和点样的长寡核苷酸阵列。在点样的寡核苷酸微阵列中，捕获探针是与miRNA序列互补的寡核苷酸。该类型的阵列可与来自待比较的两个样品(诸如非癌性组织和癌性或样品组织)的经尺寸选择的小的RNA的扩增PCR产物杂交，所述扩增产物标记有两种不同的荧光基团。或者，可从两个样品提取含有小的RNA级分(包括miRNA)的总RNA，并将其直接使用，而无需尺寸选择小的RNA，并使用T4RNA连接酶和标记有两种不同荧光基团的短RNA接头标记3'末端。可将样品混合并与单一微阵列杂交，随后扫描所述微阵列，从而允许在一个测定中可视化上调和下调的miRNA基因。
在预制的寡核苷酸微阵列或单通道微阵列中，所述探针被设计来匹配已知或预测的miRNA的序列。存在商购可得的覆盖完整基因组的设计(例如，来自Affymetrix或Agilent)。这些微阵列给出了基因表达的绝对值的评估，从而两个条件的比较需要使用两个单独的微阵列。
在一些实施方案中，需要使用定量RT-PCR。定量RT-PCR(qRT-PCR)是用于快速测量聚合酶链式反应的产物的量的改进的聚合酶链式反应。qRT-PCR通常用于确定遗传序列诸如miR是否存在于样品中并且如果其存在，测定样品中的拷贝数的目的。可测定核酸分子包括miRNA的表达的PCR的任何方法落在本公开内容的范围之内。存在本领域已知的qRT-PCR法的几个变型，其中3个在下文中进行描述。
用于定量聚合酶链式反应的方法包括但不限于通过琼脂糖凝胶电泳，SYBR Green(双链DNA染料)的使用，以及使用荧光报告探针的使用。后两者可以进行实时分析。
多种筛选候选试剂的方法可用于鉴定用于疾病治疗的治疗剂。检测RNA和蛋白质的表达水平的方法是但不限于微阵列分析、RT-PCR(包括qRT-PCR)、原位杂交、原位PCR和Northern印迹分析。在一个实施方案中，筛选包括高通量筛选。在另一个实施方案中，单独地筛选候选试剂。
候选试剂可以是任何类型的分子，诸如但不限于核酸分子、蛋白质、肽、抗体、脂质、小分子、化学物质、细胞因子、趋化因子、激素或任何其它类型的可直接或间接改变癌症疾病状态的分子。
将理解，在本文中描述的方法中，可通过对细胞或生物体施用一旦在细胞内就用作对应的miRNA的核酸分子来给细胞或其它生物物质诸如生物体(包括患者)提供对应于特定miRNA的miRNA或miRNA分子。提供给细胞的分子的形式可能不是一旦在细胞内就起miRNA作用的形式。因此，可预期，在一些实施方案中，给生物物质提供合成miRNA或非合成miRNA，例如一旦其可进入细胞的miRNA加工机器就被加工为成熟的活性miRNA的miRNA。在某些实施方案中，特别地预期，提供给生物物质的miRNA分子不是成熟miRNA分子，而是一旦其可进入miRNA加工机器就可被加工为成熟miRN的核酸分子。在miRNA的上下文中，术语“非合成的”意指miRNA不是如本文所定义的“合成的”。此外，可预期，在涉及合成miRNA的使用的实施方案中，还考虑对应的非合成miRNA的使用，反之亦然。应理解，术语“提供”试剂用于包括对患者“施用”药剂。
在某些实施方案中，方法还包括在细胞或生物体中将miRNA靶向调节。术语“将miRNA靶向调节”意指将利用核酸以调节选择的miRNA。在一些实施方案中，调节利用对应于被靶向的miRNA的合成或非合成miRNA来实现，这有效地为细胞或生物体提供了被靶向的miRNA(正调节)。在其它实施方案中，调节利用miRNA抑制剂来实现，这有效地抑制细胞或生物体中的被靶向的miRNA(负调节)。
在一些实施方案中，被靶向以进行调节的miRNA是影响疾病、病况或途径的miRNA。在某些实施方案中，miRNA被靶向是因为可通过被靶向的miRNA的负调节来提供治疗。在其它实施方案中，miRNA被靶向是因为可通过被靶向的miRNA的正调节来提供治疗。
在某些方法，存在对需要与被靶向的miRNA的调节相关的治疗或需要本文中论述的生理学或生物学结果(诸如关于特定细胞途径或结果如细胞活力的降低)的细胞、组织、器官或生物体(统称“生物物质”)施用选择的miRNA调节剂的其它步骤。因此，在一些方法中，存在鉴定需要可通过miRNA调节剂提供的治疗的患者的步骤。预期在一些实施方案中可施用有效量的miRNA调节剂。在具体实施方案中，存在赋予生物物质的治疗益处，其中“治疗益处”是指一个或多个病况或与疾病或病况相关的症状的改善，或关于疾病的预后、持续时间或状态的改善。预期，治疗益处包括但不限于疼痛的减轻、发病率的下降、症状的减轻。例如，对于癌症，预期治疗益处可以是肿瘤生长的抑制、转移的阻止、转移灶数量的减少、癌细胞增殖的抑制、癌细胞增殖的抑制、癌细胞的细胞死亡的诱导、癌细胞附近的血管生成的抑制、癌细胞的细胞凋亡的诱导、疼痛的减轻、复发风险的减小、癌细胞的化学或放射敏感性的诱导、生命的延长和/或与癌症直接或间接相关的死亡的延迟。
此外，预期可将miRNA组合物作为疗法的部分结合常规疗法或预防剂来提供给患者。此外，预期在疗法的上下文中论述的任何方法可被预防性地应用，特别是用于经鉴定潜在地需要疗法或处于对于其需要疗法的病况或疾病的风险中的患者。
此外，某些方法涉及使用一种或多种对应于miRNA的核酸和治疗性药物。所述核酸可增强药物的作用或功效，减小任何副作用或毒性，改变其生物利用度，和/或减少需要的剂量或频率。在某些实施方案中，所述治疗性药物是癌症治疗剂。因此，在一些实施方案中，存在治疗患者的癌症的方法，包括对患者施用癌症治疗剂和有效量的至少一种提高癌症治疗剂的功效或保护非癌细胞的miRNA分子。癌症疗法还包括多种与基于化学和放射的治疗的组合疗法。
可给予miRNA的抑制剂以实现相较于当给予对应于成熟miRNA的核酸分子时的相反作用。类似地，可给予对应于成熟miRNA的核酸分子以实现相较于当给予miRNA的抑制剂时相反的作用。例如，可向细胞提供增加细胞增殖的miRNA分子以增加增殖，或可向细胞提供这样的分子的抑制剂以减少细胞增殖。例如，可在利用本文中公开的不同miRNA分子和miRNA抑制剂所观察到的不同生理效应的背景中预期这些实施方案。这些包括但不限于下列生理效应：增加和减少细胞增殖、增加或减少细胞凋亡、增加转化、增强或减弱细胞活力、减少或增加活细胞数目以及增加或减少处于细胞周期的特定阶段的细胞的数目。还预期方法包括提供或引入对应于一种或多种不同miRNA分子的一种或多种不同的核酸分子。预期，可提供或引入下列、至少下列或至多下列数目的不同核酸分子：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100种或可在其中导出的任意范围。这也适用于可被提供或引入细胞的不同miRNA分子的数目。
一般描述
应当理解，前述一般描述和以下详细描述都只是示例性和解释性的，并且无意限制本教导的范围。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。为了便于综述本公开内容的各种实施方案，提供了具体术语的下列解释。
“miRNA核酸"通常指编码上文中定义的miR，或与编码miR的核酸序列互补，或在适当的严格条件下与这样的RNA或DNA杂交并保持稳定地结合于其的RNA或DNA。具体地包括的是基因组DNA、cDNA、mRNA、miRNA和反义分子、pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA和miRNA种子序列。还包括的是基于替代主链或包括替代碱基的核酸。MiRNA核酸可来自于天然来源或可被合成。
应理解，miRNA或pre-miRNA长度可为18-100个核苷酸，更优选长度为18-80个核苷酸。例如，成熟miRNA可具有19-30个核苷酸，优选21-25个核苷酸，具体地21,22,23,24或25个核苷酸的长度。MicroRNA前体通常具有约70-100个核苷酸的长度并且具有发夹构象。因此，在已知miRNA或pre-miRNA的序列后，可按照沃尔森和克里克碱基配对法则设计与所述miRNA或pre-miRNA的部分充分互补的miRNA拮抗剂。如本文中所用，术语"充分互补"通常意指两个序列充分互补以便可在生理条件下在其之间形成双链体。与miRNA或pre-miRNA目标序列充分互补的miRNA拮抗剂序列可与所述miRNA或pre-miRNA序列具有70％、80％、90％或更高的同一性。在一个实施方案中，miRNA拮抗剂包含不超过1、2或3个不与所述miRNA或pre-miRNA目标序列互补的核苷酸。在另一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂与miRNA或pre-miRNA目标序列100％互补。miRNA的序列可通过miRBase注册表(Griffiths-Jones，等人，NucleicAcids Res.,36(Database Issue):D154-D158(2008)；Griffiths-Jones,等人，Nucleic Acids Res.,36(Database Issue):D140-D144(2008)；Griffiths-Jones,等人，Nucleic Acids Res.,36(DatabaseIssue):D109-D111(2008))公共获得。
"MicroRNA种子序列"、"miRNA种子序列"、"种子区域"和"种子部分"通常是指成熟miRNA序列的核苷酸2-7或2-8。miRNA种子序列通常位于miRNA的5'末端。
“miR-特异性抑制剂”可以是抗-miRNA(antagomir或抗-miR)寡核苷酸。抗-miRNA可以是单链分子。抗-miR可包含RNA或DNA或具有非核苷酸组分。抗-miR通过广泛的序列互补性与成熟microRNA退火并阻断其。在一些实施方案中，抗-miR可包含为完整miRNA的完全互补物的核苷酸序列。在一些实施方案中，抗-miR包含与位置2-8上的microRNA分子的种子区域互补的至少6个连续核苷酸的核苷酸序列并且与miRNA的其余部分具有至少50％,60％,70％,80％或90％的互补性。在其它实施方案中，抗-miR可包含与相邻初级(pri-miRNA)序列互补的额外的侧翼序列。可使用化学修饰诸如2'-O-甲基；锁核酸(LNA)；和2'-O-甲基、硫代磷酸酯、胆固醇(antagomir)；2'-O-甲氧乙基。化学修饰的抗-miR可从多个来源，包括但不限于Sigma-Proligo、Ambion、Exiqon和Dharmacon商购获得。
miRNA拮抗剂可以是RNA或DNA的寡聚物或多聚物，并且可包含对它们的核碱基、糖基团、磷酸基团或共价核苷间连接的修饰。在某一实施方案中，修饰包括增强miRNA拮抗剂的稳定性或增强miRNA拮抗剂的细胞吸收的那些修饰。在一个实施方案中，所述miRNA拮抗剂可以是antagomir，其具有糖的2'-O-甲基化、硫代磷酸酯主链和末端胆固醇部分。
在一些实施方案中，miR-特异性抑制剂具有至少一个microRNA结合位点，模拟microRNA靶(靶模拟物)。这些靶模拟物可具有至少一个包含与所述miRNA种子区域的位置2-8互补的6个连续核苷酸的核苷酸序列。或者，这些靶模拟物可包含具有与整个miRNA的互补性的核苷酸序列。这些靶模拟物可以是载体编码的。载体编码的靶模拟物可在报告基因的5'或3'UTR中具有一个或多个microRNA结合位点。靶模拟物可具有用于超过一个microRNA家族的microRNA结合位点。靶模拟物的microRNA结合位点可被设计成错配microRNA的位置9-12以防止miRNA-引导的靶模拟物的切割。
在替代实施方案中，miR-特异性抑制剂可与靶转录物中的miRNA结合位点相作用，从而阻止其与miRNA相互作用。
术语“miRNA特异性抑制剂”和"miRNA拮抗剂"通常是指减少或抑制miRNA的表达、稳定性或活性的试剂。miRNA拮抗剂可以例如通过阻断miRNA的活性(例如，阻断miRNA用作一个或多个miRNA靶的转录抑制因子和/或激活物的能力)或通过介导miRNA降解来起作用。示例性miRNA拮抗剂包括靶向miRNA的核酸例如反义锁核酸分子(LNA)、antagomirs或2'O-甲基反义RNA。
短语"抑制靶基因的表达"通常是指RNAi试剂诸如siRNA沉默、减少或抑制靶基因的表达的能力。“抑制”、“下调”或“减少”的另一个方式，其意指使基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的RNA分子或等同的RNA分子的水平，或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性被降至低于在所述RNAi试剂不存在时所观察到的表达、水平或活性。
例如，在一个实施方案中，抑制、下调或减少涉及抑制靶mRNA至低于在例如具有无规序列或具有错配的siRNA分子存在的情况下所观察到的水平。
为了检查基因沉默的程度，将测试样品(例如，来自表达靶基因的目标生物体的生物样品或表达靶基因的培养物中的细胞的样品)与沉默、减少或抑制靶基因表达的siRNA接触。将测试样品的靶基因的表达与未与所述siRNA接触的对照样品(例如，来自表达靶基因的目标生物的生物样品或表达靶基因的培养物中的细胞的样品)的靶基因的表达相比较。对照样品(即，表达靶基因的样品)被赋予100％的值。当测试样品相对于对照样品的值为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、10％或0％时，靶基因的表达的沉默、抑制或减少得以实现。合适的测定包括例如使用本领域普通技术人员已知的技术诸如斑点印迹、northern印迹、原位杂交、ELISA、微阵列杂交、免疫沉淀、酶功能以及对于本领域普通技术人员来说是已知的表型测定进行的蛋白质或mRNA水平的检查。
miR-特异性抑制剂的"有效量"或"治疗有效量"是足以产生所需作用(例如目标序列的表达相较于在miR-特异性抑制剂不存在的情况下检测的正常表达水平的抑制)的量。当靶基因mRNA或蛋白质的表达水平相对于对照样品的靶基因mRNA或蛋白质的表达水平为约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，miR-特异性抑制剂对靶基因或靶序列的表达的抑制得以实现。miR-特异性抑制剂的所需作用还可通过检测由被miR特异性抑制剂靶向的miRNA下调的基因的表达的增加来测量。
"调节"意指基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的RNA分子或等同的RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性被上调或下调，以便表达、水平或活性高于或低于在所述调节剂不存在的情况下观察到的所述表达、水平或活性。例如，术语"调节"可意指"抑制"，但单词“调节”的使用不限于该定义。
miRNA的合适的序列变体的非限定性实例可包括：置换、插入或缺失变体。插入包括5'和/或3'末端融合以及单个或多个残基的序列内插入。还可在成熟序列内部引入插入。然而，这些插入可以是比5'或3'末端上的那些插入更小的插入，大约1至4个残基、2个残基和/或1个残基。
miRNA的插入序列变体是其中一个或多个残基被引入靶miRNA中的预定位点的那些变体。最常见的插入变体是miRNA的5'或3'末端上的核酸的融合物。
缺失变体的特征在于一个或多个残基从miRNA序列的去除。这些变体通常通过定点诱变编码miRNA的DNA中的核苷酸，从而产生编码所述变体的DNA，并随后在重组细胞培养物中表达所述DNA来制备。然而，变体miRNA片段可方便地通过体外合成来制备。变体通常表现与天然存在的类似物相同的定性生物活性，尽管变体也被选择来修饰miRNA的特征。
置换变体是其中至少一个残基序列已被去除并且在其位置插入不同的残基的那些变体。虽然用于引入序列变异的位点被预先确定，但突变本身不需要被预先确定。例如，为了最优化给定位点上的突变的性能，可在靶区域进行随机诱变，并就所需活性的最佳组合筛选表达的miRNA变体。可使用用于在具有已知序列的DNA中的预定位点上产生置换突变的各种合适的技术。
核苷酸置换通常是单个残基的置换；插入通常是大致约1至10个残基；并且缺失通常在约从1至30个残基的范围内。优选以邻近的配对产生缺失或插入；即2个残基的缺失或2个残基的插入。可组合置换、缺失、插入或其任意组合以获得终构建体。
可产生变化来降低miRNA的活性，并且包括所有这样的对编码这样的miRNA的核苷酸序列的修饰。
“分离的核酸或DNA”通常被理解为表示化学合成的DNA、cDNA或具有或不具有3'和/或5'侧翼区的基因组DNA。可通过例如如下步骤从其它来源获得编码miRNA的DNA：a)从含有mRNA的细胞获得cDNA文库；b)利用编码miRNA或其片段的标记DNA进行杂交分析，以检测cDNA文库中含有同源序列的克隆；和c)通过限制性内切酶分析和核酸测序来分析所述克隆以鉴定全长克隆。
如本文中所用，当核酸和/或核酸序列天然地或人工地来源于共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。通常从两个或更多个核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断出同源性。用于建立同源性的序列之间的同一性的精确百分比随待讨论的核酸和蛋白质而变化，但低至25％的序列同一性被常规地用于建立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高也可用于建立同源性。用于测定序列相似性百分比的方法(例如，使用缺省参数的BLASTN)通常是可获得的。用于进行BLAST分析的软件是可通过美国国立生物技术信息中心公共地获得的。
术语“检测miR表达的水平”通常是指定量存在于样品中的这样miR的量。检测miR或任何microRNA的表达可使用任何方法，例如通过qRT-PCR来实现。检测miR的表达包括检测miR的成熟形式或与miR表达相关的前体形式的表达。例如，miRNA检测法包括序列特异性检测，例如通过RT-PCR进行的检测。可使用前体和成熟miR核酸序列设计miR-特异性引物和探针，所述引物和探针可包括不改变序列的功能的修饰。
术语“低miR-表达”和“高miR-表达”是指在样品中发现的miR的水平的相对术语。在一些实施方案中，低miR-和高miR-表达通过一组测试样品与对照样品中的miR水平的比较来测定。随后可基于样品中miR的表达是高于(高)还是低于(低)平均或中位miR表达水平来将低和高表达赋予每一个样品。对于单个样品，高或低miR表达可通过将样品与已知具有高或低表达的对照或参照样品相比较，或通过与标准值相比较来测定。低和高miR表达可包括miRNA的前体或成熟形式或两者的表达。
在一些情况下，可使用疾病参照标准或样品。参照标准可包含指示已知癌症的miR水平。参照标准可以是来源于癌症组织的样品的混合物。测试结果与疾病参照和/或对照的比较可用于诊断法。在一些实施方案中，与一种或多种疾病参照样品和一种或多种正常的无疾病对照样品同时地处理测试样品。
术语"表达载体"通常是指可被重组或合成地生成的核酸构建体。表达载体通常包括一系列特定的使得能够在宿主细胞中转录特定基因的核酸元件。通常地，将基因表达置于某些调控元件诸如组成型或诱导型启动子的控制之下。
术语"有效连接的"用于描述调控元件与基因或其编码区之间的连接。即，基因表达通常被置于某些调控元件例如但不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子的控制之下。基因或编码区“有效地连接于”或“可操作地连接于”调控元件或与调控元件“有效地连接”，意指基因或编码区受调控元件控制或影响。
术语“试剂”和“药物”通常指用于治疗特定疾病或病症的任何治疗剂(例如，化学治疗化合物和/或分子治疗化合物)、反义疗法、放射疗法或手术干预。
术语“对照”通常是指用于与实验样品诸如从受试者获得的样品比较的样品或标准。在一些实施方案中，对照是获自健康受试者的样品。在一些实施方案中，对照是获自相同受试者的细胞/组织样品。在一些实施方案中，对照是历史对照或标准值(即，先前测试的对照样品或样品的组，其代表基线或正常值，如对照样品中的水平)。在其它实施方案中，对照是获自健康受试者诸如供者的样品。测试样品和对照样品可按照本领域已知的任何方法来获得。
miR-494特异性抑制剂和miR-494拮抗剂
除非另有所指，否则术语“miRNA-494”和“miR-494”可互换使用，其是指microRNA-494，包括miR-494、pri-miR-494、pre-miR-494、成熟miR-494、miRNA-494种子序列、包含miRNA-494种子序列的序列及其变体。
在一些实施方案中，使用能够阻断miRNA的活性的核酸(抗-miRNA或抗-miR)。这类核酸包括例如反义miR-494。例如，“miR-494拮抗剂"意指被设计来干扰或抑制miRNA-494的活性的试剂。
在某些实施方案中，miR-494拮抗剂可包含被靶向至miRNA的反义化合物。例如，miR-494拮抗剂可包含干扰或抑制miRNA的活性的小分子等。
在某些实施方案中，miR-494拮抗剂可包含具有与miRNA或其前体的核碱基序列互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，抗-miR是包含总共约5至约100个或更多个，更优选约10至约60个核苷酸的反义miR-494核酸，并且具有优选与miR-494的至少种子区域互补的序列。在一个实施方案中，抗-miRNA可包含总共至少约5至约26个核苷酸。在一些实施方案中，抗-miRNA的序列可包含与miR-494的5'区域大体上互补的至少5个核苷酸，与miR-494的3'区域大体上互补的至少5个核苷酸，与miR-494种子序列大体上互补的至少4-7个核苷酸，或与miR-494种子序列的侧翼区域大体上互补的至少5-12个核苷酸。
在一些实施方案中，抗-miR-494包含miR-494的序列的互补序列。在其它实施方案中，抗-miR-494包含种子序列的互补序列或能够在严格条件下与种子序列杂交。在某些实施方案中，优选分子是能够在严格条件下与编码成熟miR-494的cDNA的互补序列杂交的那些分子。
应理解，本文中描述的方法不受miR-494或抗-miR-494的来源限制。miR-494可来自人或非人哺乳动物，来源于任何重组来源，可体外合成或通过化学合成来合成。核苷酸可以是DNA或RNA，并且可以以双链、单链或部分双链形式存在，这取决于特定背景。
miR-494和抗-miR-494核酸可通过通常用于大量制备核酸的任何常规方法来制备。例如，核酸可通过本领域中公知的方法，使用商购可得的试剂和合成仪和/或使用自动化合成法来化学合成。
还应理解，本文中描述的方法不限制于天然存在的miR-494序列；相反地，miR-494序列的突变体和变体也在涉及的范围之内。例如，编码miR-494的突变体(其为具有一个或多个置换、添加和/或缺失的miR-494)和miR-494的片段以及miR-494的截短形式的核苷酸序列也可用于本文中描述的方法。
还应理解，在某些实施方案中，为了增强有义或反义寡核苷酸的稳定性和/或最优化其的递送，可使用修饰的核苷酸或主链修饰。在一些实施方案中，可修饰miR-494或抗-miR-494寡核苷酸以增强至靶细胞的递送。编码miR-494和抗-miR-494的核酸分子可在一些实施方案中用于调节免疫细胞的功能、活性和/或增殖。
在某些实施方案中，miR-494拮抗剂可以是单链、双链、部分双链或发夹结构的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括充分互补以与选择的miR-494或pre-miR-494目标序列杂交的核苷酸序列。如本文中所用，术语"部分双链的"通常是指含有比互补链少的核苷酸的双链结构。一般地，部分双链寡核苷酸将具有低于75％的双链结构，优选低于50％，更优选低于25％、20％或15％的双链结构。
在某些实施方案中，miRNA拮抗剂与人miR-494的miRNA或pre-miRNA序列的部分充分互补。miRNA拮抗剂可具有与人miRNA的miRNA或pre-miRNA序列的部分至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的区域。
有用的miRNA拮抗剂包括具有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的寡核苷酸，所述连续核苷酸与在测试受式者中过表达(相较于对照受试者)的内源miRNA或pre-miRNA大体上互补。公开的miRNA拮抗剂优选包括充分互补以与约12至25个核苷酸，在一些实施方案中约15至23个核苷酸的miRNA目标序列杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，在互补区域中将存在核苷酸错配。在某些实施方案中，互补区域将具有不超过1、2、3、4或5个错配。
在一些实施方案中，miRNA拮抗剂与hsa-miR-494“精确互补”。因此，在一个实施方案中，miRNA拮抗剂可对miRNA退火以在精确互补的区域中形成完全由沃尔森-克里克碱基对组成的杂交体。因此，在一些实施方案中，miRNA拮抗剂特异性区分单核苷酸差异。在这样的情况下，如果在单核苷酸差异的区域中发现精确互补性，miRNA拮抗剂才抑制miRNA活性。此外，在某些实施方案中，miRNA拮抗剂是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其修饰物的寡聚体或多聚体。miRNA拮抗剂包括含有天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)连接的寡核苷酸。
寡核苷酸和表达载体至靶细胞或组织的递送
含有抗-miR-494编码序列的表达载体可用于将抗-miR494递送至靶细胞。在某些实施方案中，表达载体可含有任选地与在靶细胞中指导编码序列表达的调控元件结合的抗-miR-494序列。应理解，特定载体和/或与编码序列有效连接的表达控制序列的选择通常取决于(如由本领域普通技术人员所理解的)所需的特定功能性质；例如，待转化的宿主细胞。
还应理解，用于本文中描述的方法的载体优选能够在适当的宿主中指导复制以及能够在靶细胞、组织或器官中表达抗-miR-494。
还应理解，有用的载体可包括其表达赋予可检测的标记诸如药物抗性的选择基因。选择基因的非限定性实例包括编码赋予对抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性、补充营养缺陷或提供从培养基撤除的至关重要的营养物的蛋白质的那些载体。还应理解，可检测标记可任选地存在于单独的质粒上并通过共转染引入。
还应理解，表达控制元件可用于调控有效连接的编码序列的表达。非限定性实例包括：诱导型启动子、组成型启动子、增强子和其它调控元件。在一些实施方案中，使用容易被控制例如响应靶细胞的培养基中的营养物的诱导型启动子。还应理解，适合用于适应于miR-494特异性抑制剂在靶细胞中的表达的其它方法、载体和靶细胞可容易地被改造来适合特殊情况。
在某些实施方案中，将抗-miR-494寡核苷酸递送至靶细胞。在其它实施方案中，将编码抗-miR-494的表达载体递送至其中表达抗-miR-494的靶细胞。应理解，可使用不同的将寡核苷酸和表达载体递送至靶细胞的方法。
在某些实施方案中，所述靶细胞可存在于宿主中，诸如哺乳动物中，或可存在于宿主外的培养物中。因此，miR-494或抗-miR-494至靶细胞的体内、离体和体外递送可以以适当的方式来完成。在某些实施方案中，将miR-494或抗-miR-494寡核苷酸递送至靶器官或组织。
在某些实施方案中，可通过将抗-miR-494寡核苷酸施用至细胞来调节(例如，抑制)细胞的突变。可通过对癌细胞或对癌前细胞施用抗-miR-494寡核苷酸来调节细胞的数目和/或活性。在某些实施方案中，可通过将抗-miR-494递送至细胞来调节细胞的免疫功能和/或发育。
应理解，寡核苷酸和/或表达载体至靶细胞的递送可使用不同的方法来实现。在某些实施方案中，可使用转染剂。一般地，转染剂(例如，转染试剂和/或递送媒介物)可以是结合于寡核苷酸和多核苷酸或与其复合并促进它们进入细胞的化合物。有用的转染试剂的非限定性实例包括：阳离子脂质体和脂质、多胺、磷酸钙沉淀、聚阳离子、组蛋白、聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸和聚两性电解质复合物。
另一种递送方法可包括通过将miRNA电穿孔至细胞中而不诱导显著的细胞死亡。此外，可以以不同的浓度转染miRNA。
用于递送miRNA、抗-miRNA和表达载体的有用试剂的非限定性实例包括：蛋白质和聚合物复合物(聚合复合物)、脂质和脂质体(脂质复合物)、聚合物与脂质的组合(脂质多聚复合物)以及多层和再充电的颗粒。转染剂还可以凝聚核酸。转染剂还可用于将官能团与多核苷酸缔合。官能团可包括细胞靶向部分、细胞受体配体、核定位信号、增加内容物从内体或其它细胞内囊泡释放的化合物(如膜活性化合物)，和改变与它们连接的化合物或复合物的行为或相互作用的其它化合物(相互作用改性剂)。
在某些实施方案中，可以例如通过注射来全身性递送抗-miR-494核酸和转染试剂。在其它实施方案中，可将它们注射进包含靶细胞的特定区域，诸如特定器官，例如实体癌组织。本领域普通技术人员能够选择和使用适当的系统来将抗-miRNA-494或表达载体体内、离体和/或体外递送至靶细胞而无需过度实验。
microRNA的调控和调节
MicroRNA(miRNA)在不同类型的癌症中的化学敏感性或化学抗性的发展中具有重要作用。ERK1/2途径的活化是各种细胞过程和癌症发展的主要决定因素，并且负责几种重要miRNA的转录。本文中描述了ERK1/2途径与BIM表达之间通过miR-494的联系。BIM(也称为BCL2-样11)是最重要的细胞凋亡调节因子之一。BIM牵涉非小细胞肺癌(NSCLC)的药物抗性。BIM表达水平还受miRNA调控，从而导致NSCLC的化学抗性。此外，MEK-ERK信号传导负调控BIM表达。
本文中描述了293A PEDS104G过表达细胞相较于PEDWT 293A细胞的microRNA表达谱的分析。该突变的PED不能在Ser104上被磷酸化，因此PEDS104G结合ERK1/2并将其保持在胞质溶胶中，从而抑制其转录作用。
导致ERK在细胞质中积累的阻断赋予受累细胞特定的microRNA标签，其中miR-494是下调最多的miRNA之一。此外，BIM是miR-494的真正的靶；并且，miR-494对BIM的下调诱导NSCLC细胞的TNF-相关细胞凋亡-诱导配体(TRAIL)抗性。
ERK1/2的核活性通过ERK1/2天然相互作用因子蛋白PED/PEA-15的过表达而被阻断。进行了microRNA表达谱。miR-494是在ERK1/2失活后下调最多的microRNA。此外，miR-494通过下调BIM诱导非小细胞肺癌(NSCLC)的TRAIL抗性。该通过miR-494调控NSCLC的细胞凋亡和细胞增殖的ERK1/2途径的阐明表明了负责TRAIL抗性的机制，并且提供了另外的抗癌治疗法。
ERK1/2途径控制几个细胞功能，诸如增殖、存活和迁移。当失调时，该级联在各种病理病况，特别是癌症中起着主要作用。ERK1/2部分地受其亚细胞定位的调控。ERK在细胞内的定位可受糖尿病中富集的磷蛋白(PED，也称为PEA-15[星形细胞中富集的糖蛋白])的控制，所述磷蛋白是一种小的含死亡效应子结构域的蛋白。PEA-15在细胞内具有至少2个不同的功能：其通过将ERK隔离在细胞质中来调控ERK1/2定位，以及其通过干扰死亡诱导信号传导复合物的装配来阻断细胞凋亡。PED功能受两个不同丝氨酸残基(Ser104，被蛋白激酶C磷酸化；和Ser116，被AKT/蛋白激酶B和CamKII(钙-钙调蛋白激酶II)磷酸化)上的磷酸化的调控。蛋白激酶C对PED的磷酸化显著减少ERK结合，然而由CamKII产生的磷酸化对ERK结合没有作用。PED通过从细胞核排出ERK来修饰ERK信号传导。Raf/MAPK/ERK级联现被认为在microRNA表达中具有调控作用。
实施例
本发明的某些实施方案在本文中的实施例中进行了定义。应理解，虽然表示了本发明的优选的实施方案，但这些实施例仅以举例说明的方式给出。根据上面的讨论和这些实施例，本领域普通技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和变动，以使其适应于各种用途和条件。
PED通过ERK1/2调控miR-494。
为了阻断ERK1/2的转录活性，将myc-PEDS104G cDNA在显示低的内源PED水平的293A细胞中过表达。作为对照，使用PEDwt cDNA-过表达细胞(图1A)。
在PEDS104G突变体中，将位置104上的Ser改变成Gly(PEDS104G)，这样PEDS104G不能在Ser104上被磷酸化，并且其结合ERK1/2并将ERK1/2保持在胞质溶胶中。随后进行细胞核/胞质溶胶分离。
如图1B中显示的，PEDS104G相较于PEDWT降低细胞核ERK水平。利用TaqMan Array Cards检查总体的miRNA表达谱(图1C)。显示了具有<-3.00的倍数变化的microRNA(图1D)。miR-494是PEDS104G细胞中下调最多的microRNA。
miR-494启动子分析。
为了分析ERK1/2对miR-494表达的作用，通过定量(q)RT-PCR分析来评价PEDwt-和PEDS104G-转染的293A细胞中的初级(pri)-miR-494和premiR-494的表达水平。
如图2A和2B中显示的，PEDS104G过表达诱导pri-miRNA-494和pre-miR-494水平的强烈下调。
为了确认ERK1/2对miR-494表达水平的直接参与，利用Promoter.2预测服务器分析miR-494的上游序列。可能是转录启动子的两个区域位于pri-miR-494的5’末端上游的～27.8kb和18.61kb之处(图2G)。
为了确认该上游区域是miR-494转录启动子，通过将约400bp的片段(S1＝422bp,S2＝425bp)插入无启动子载体pGL3basic来构建报告质粒。萤光素酶测定显示两个序列都相较于空载体增强萤光素酶活性(图2C)，从而显示两个区域都可启动miR-494。
为了确认S1和S2启动子序列受ERK1/2调控，测定ERK1/2的干扰是否可在S1和S2过表达后降低萤光素酶活性。如图2D中显示的，ERK1/2的沉默诱导pGL3b-S1和pGL3b-S2的萤光素酶活性的下调。发现AP1转录因子预测结合miR-494基因上游的序列S1和S2，并且激活miR-494表达。
ERK1/2磷酸化c-Jun和c-Fos原癌蛋白并且激活所述蛋白，所述蛋白以同二聚体或异二聚体形式参与AP1转录因子的形成。c-Fos和c-Jun沉默能够在S1和S2过表达后降低萤光素酶活性，从而证明S1和S2序列受AP1调控(图2E)。
通过Western印迹显示的siRNA对ERK1/2、c-Jun和c-Fos的下调(图7A)。为了验证c-Jun在miR-494启动子上的直接结合，进行外染色质免疫沉淀(out chromatin immunoprecipitation)(ChIP)测定。分析了3个染色质区域：两个区域跨越AP-1结合位点S1和S2，一个区域作为阴性对照，其是premiR-4945'末端上游～31kb的区域，其中未发现AP-1的预测的结合位点。c-Jun的ChIP测定显示靠近启动子的ChIP分析区域S1和S2上的显著的AP-1结合(图2F)。在阴性对照中未观察到由c-Jun ChIP产生的染色质富集，从而验证了ChIP测定的特异性。这些结果确认了S1和S2是受ERK1/2通过AP1调控的启动序列。
miR-494直接靶向BIM 3’UTR。
对miR-494的推定的mRNA靶进行生物信息学搜索(Targetscan,Pictar,RNhybrid)。在候选靶当中，选择人BIM的3'UTR(核苷酸2829–2835，NM_001204106)，其含有匹配hsa-miR-494的种子序列的区域(图3A)。为了验证BIM是否是miR-494的直接靶，将含miR-494结合位点的BIM 3'UTR克隆进pGL3对照载体中萤光素酶ORF的下游。该报告构建体被用于转染Meg01细胞，所述细胞相较于293A细胞表达极低水平的miR-494(图7B)，并且是高度可转染的。通过qRT-PCR确认转染后该miRNA的增加的表达(图7C)。在用具有BIMmRNA的3'UTR的质粒和miR494共转染的样品中发现萤光素酶活性相较于用相同长度的无规miR转染的细胞的显著下降(图3B，左)。
相反地，当使用具有BIM mRNA的3'UTR的质粒进行萤光素酶测定时，其中通过定点诱变删除miR-494的结合位点，观察到miR-494对BIM 3'UTR的抑制作用的一致降低(图3B，右)。
为了确认miR-494可影响细胞系的BIM表达，通过抗-miR-494转染在293A细胞中下调受调控的miR-494。通过qRT-PCR确认该miRNA在转染后的减少的表达(图7D)。
miR-494的下调在蛋白质或mRNA水平上相较于用无规miR转染的293A细胞显著升高BIM的内源水平(图3C和3D)。综上所述，这些结果显示BIM 3'UTR是miR-494的直接靶。
PED-ERK1/2通过AP1调控BIM。
将PEDwt或PEDS104G转染进293A细胞，随后评估BIM表达水平以研究PED-ERK1/2-miR494对BIM表达的调控。
观察到在PED转染后BIM表达相较于PEDwt的显著增加(图4A)。为了确认PED对BIM表达的作用是通过ERK1/2介导，在不同的时间点用ERK抑制剂II(FR180204)处理miR-494–转染的细胞，随后通过Western印迹分析BIM表达水平。ERK抑制剂II能够降低p-ERK1/2和p-Elk1(ERK 1/2的细胞核底物)的细胞水平(图4B)。
此外，BIM表达在ERK1/2抑制剂施用后48h和72h被强烈上调。该作用不存在于用miR-494转染的细胞中(图4B)；因此，miR-494的过表达能够拯救PED对BIM表达的作用。
同样地，如图4C左图中显示的，miR-494在ERK1/2抑制剂施用后48h和72h被下调，从而确证ERK 1/2在miR-494表达中的作用。为了确认BIM上调与ERK1/2的下调相关，从而与AP1(c-Fos/c-Jun)的下调相关，使用qRT-PCR分析在ERK1/2和AP1(c-Jun/c-Fos)沉默后293A细胞的BIM mRNA和miR-494表达(图4D和4E)。观察到在c-Jun、c-Fos、ERK1/2和c-Jun/c-Fos一起沉默后miR-494下调并且BIM mRNA上调。这些结果强烈显示PED-ERK1/2通过AP1调控BIM。
miR-494和BIM在NSCLC中的作用。
为了确认PED-ERK-miR-494-BIM轴在肿瘤发生中的功能性作用，评价1小组5种NSCLC细胞中的miR-494和BIM的内源水平。如通过qRT-PCR评估的，在所分析的大多数NSCLC细胞系中发现miR-494表达与BIM mRNA表达之间的反相关(图8A–8C)。
这些结果显示miR-494的高表达水平是在NSCLC中用于负调控BIM的机制之一。为了确认miR-494影响肺癌中的BIM的内源水平，分析了miR-494在表达低水平的miR-494的H460肺癌细胞系中的异位表达的作用。
如图5A中显示的，BIM蛋白在miR-494过表达后在H460细胞中显著减少。相反地，表达高水平的内源miR-494的A549肺腺癌细胞中抗-miR-494对miR-494的敲低升高BIM的蛋白质水平(图5B)。
为了确认该调控是否也可能在NSCLC细胞中通过PED-ERK1/2途径发生，在A549细胞中沉默ERK1/2。ERK 1/2沉默能够减少miR-494在A549细胞中的表达(图8D，左)和诱导BIM上调(图5C和图8E，左)，如通过WB和qRT-PCR评估的。相反地，miR-494转染拮抗siERK1/2作用(图5C以及图8D和8E，右)。为了确认AP1在NSCLC中对miR-494转录激活和BIM上调的作用，用靶向ERK1/2、c-Fos和c-Jun的siRNA转染A549细胞(图5D)。
ERK1/2、c-Fos和c-Jun的沉默诱导miR-494下调(图8F)和BIM上调(图5D)。这些结果显示PED-ERK1/2通过AP1对BIM的调控是NSCLC中的相关途径。
miRNA-494通过BIM下调抑制NSCLC的细胞凋亡。
因为BIM沉默牵涉对不同药物的抗性，因此评价了通过miR-494产生的BIM下调在TRAIL抗性中的作用。为了测试miR-494在TRAIL-敏感性H460细胞中的过表达是否可诱导TRAIL抗性，在H460细胞中进行增殖和细胞凋亡测定。用无规miRNA或miR-494以及用对照siRNA或BIM siRNA转染H460细胞。在48h后，将转染的细胞暴露于TRAIL进行16h。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐测定评估细胞增殖，通过测量半胱天冬酶3/7活性来评估细胞凋亡。在miR-494强制表达或BIM下调后，H460细胞显示极高的增殖率并且更加抗TRAIL诱导的细胞死亡(图5E和5F)。
为了进一步确认miR-494在NSCLC中的作用，还在TRAIL抗性A549细胞中进行增殖和半胱天冬酶3/7测定。A549细胞在TRAIL处理后显示较低的增殖率并且容易经历TRAIL诱导的细胞死亡(图8G和8H)。
为了确定miR-494或BIM的失调是否可改变对TRAIL的反应，将敏感性H460细胞或抗性A549细胞暴露于TRAIL，进行40分钟，通过Western印迹评估聚(ADP核糖)聚合酶活化。miR-494在TRAIL敏感性H460细胞中的过表达或BIM在所述细胞中的沉默导致PARP切割的减少(图5G)；相反地，miR-494在抗性A549系中的下调导致PARP切割的增加(图8)。这些结果进一步显示miR-494介导的BIM下调在NSCLC的TRAIL抗性中起着重要作用。
miR-494在体内对致瘤性的作用。
miR-494通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)而在骨髓来源的抑制细胞的肿瘤进展中具有重要作用。在确认miR-494在NSCLC的致瘤性中是否具有作用的过程中，确定了在A549中抗-miR-494的转染后存在PTEN的强烈上调(图9A)，从而确认PTEN在NSCLC中也是miR-494的靶。
为了分析miR-494在体内的致瘤性，用为空的或含有全长miR-494的GFP慢病毒构建体稳定地感染H460细胞，以及用为空的(ZIP)或含有抗-miR-494的GFP慢病毒构建体稳定地感染A549细胞。通过qRT-PCR确认miR-494的上调和下调(图9B和10A)。
miR-494对细胞增殖的影响通过使用H460-和A549-稳定感染的细胞系生成生长曲线和进行克隆生成测定来测定。
如图6A和6B、图9C和图10B–10D中显示的，miR-494过表达显著增加H460细胞增殖，然而其在A549中的下调减少细胞增殖。
随后，将H460-miR-494细胞注射进5只裸鼠的胁腹的皮下组织(图6C)。注射后30天，miR-494的过表达导致肿瘤生长相较于表达空载体的肿瘤的显著增加(图6C和图9D)。
为了进一步确认miR-494对致瘤性的作用，还将A549-抗-miR-494细胞注射进5只裸鼠的胁腹(图10E和10F)。在该情况下，miR-494的下调导致肿瘤生长相较于表达空载体(ZIP)的肿瘤的显著减弱。组织病理学分析表明包含过表达miR-494的细胞的团块比利用空载体转染的细胞的团块大得多；坏死核心与活组织之间的界面上的凋亡细胞在数量上较少，并且在由miR-494-转染的细胞产生的团块中极少一起发生，然而它们通常在对照团块的该部位上簇集(图9E)。这些体内数据进一步确认体外数据，并且还显示miR-494作为调控因子在肺癌进展中的重要性。
实施例的讨论
本文中描述了基于PED的突变体(能够将ERK1/2阻断在细胞质中，从而仅阻断ERK1/2细胞核途径而不阻断细胞质途径的蛋白)的使用的方法。以此方式，由ERK激活的转录因子的诱导被阻断，并评估了受ERK1/2调控的miRNA。发现在PEDS104G过表达后几种miRNA被下调；miR494表现最高的倍数变化。
PEDS104过表达与miR-494的下调存在直接关联。具体地，成熟形式和pri-miRNA都被下调，从而显示PED突变体过表达与miR-494转录调控之间的直接关联。
此外，AP1(c-Jun和c-Fos)直接结合miR-494启动子。事实上，AP1和ERK1/2的沉默导致两个转录启动子位点活性降低，从而显示AP1在miR-494的转录中的重要作用。
为了分析miR-494的功能性作用，研究了蛋白质靶，诸如参与细胞内信号传导(和细胞死亡)的靶基因，例如，编码BIM的基因(BIM是促进许多肿瘤细胞诸如，例如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤和黑色素瘤细胞的细胞凋亡的蛋白)。
本文中不仅描述了293A细胞中miR-494与BIM的表达之间的反相关，而且还描述了miR-494直接靶向BIM 3’UTR。PEDS104G的过表达导致BIM表达的上调，该上调通过ERK1/2抑制由miR-494下调介导。
此外，miR-494下调和BIM上调也通过AP1介导。
通过激活miR-494，所述miR-494进而靶向BIM 3’UTR，ERK1/2诱导BIM的下调，从而显示了miR-494与BIM表达之间的反相关。
本文中还描述了miR-494在TRAIL抗性(TRAIL是基于细胞凋亡的抗肿瘤试剂)中的作用。通过下调BIM，miR-494在H460TRAIL-敏感性细胞中的过表达增强对TRAIL诱导的细胞凋亡的抗性。对于TRAIL抗性A549细胞获得了相同结果，miR494的下调使得A549细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感；从而确认miR-494在TRAIL抗性中的相关作用。
本文中还描述了miR-494在NSCLC致瘤性中的作用。通过向裸鼠中注射用全长miR-494慢病毒稳定感染的H460细胞和用α-miR-494稳定感染的A549细胞来在体内分析miR-494在肿瘤发生中的作用。在过表达miR-494的肿瘤中存在肿瘤负荷的增加，在注射α-miR-494的小鼠中存在肿瘤负荷的减轻。
本文中还描述了显示ERK1/2参与细胞凋亡过程和细胞增殖的调控的途径。ERK 1/2途径与BIM表达之间通过miR-494存在联系。此外，miR-494在NSCLC的TRAIL抗性中具有关键作用。miR-494的下调也可用于测定药物敏感性和扩增的抑制；具体地，用于针对肺癌的特异性治疗策略的开发。
材料和方法
细胞培养、转染和化学药品
接种H460、A549、293A和Meg-01细胞，将其在含10％FBS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI(Invitrogen)中生长。按照制造商的建议，通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行所有转染。用PEDwt和PEDS104G表达质粒转染293A细胞。用不含抗生素的无血清培养基在p60平板中将所有使用的细胞系培养至80％汇合，随后用100nmol的pre-miR-494寡核苷酸或阴性对照或抗-miR-494转染，进行48h或72h(Ambion)。
如萤光素酶测定部分中所述，转染pGL3对照BIM-3'UTR、突变的pGL3对照BIM-3'UTR以及pGL3basic S1和pGL3basic S2。使用Super-Killer TRAIL(Alexis Biochemicals)。在miR-494或BIMsiRNA和TRAIL处理(200ng/mL)后对H460细胞进行增殖和半胱天冬酶3/7测定。相对于未处理的H460细胞的P<0.05的显著性值。显示在无规miR、miR-494、siRNA对照(Ctr)和siBIM转染后，用(200ng/mL)TRAIL处理40分钟的H460细胞的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和切割的PARP表达的Western印迹。siRNA-c-Fos、siRNAc-Jun、siRNA ERK1/2和siRNA(全部来自Santa Cruz Biotechnology)用作转染的293A和A549细胞系的阴性对照。将细胞培养至80％汇合，随后如制造商的方案中所述，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染所述细胞。
靶分析
使用这些专用程序：Targetscan、Pictar和RNhybrid，进行生物信息学分析。
RNA提取
利用TRIzol溶液(Invitrogen)提取总RNA，利用AgilentBioAnalyzer 2100评估RNA的完整性。
统计分析
将连续变量表达为平均值±SD。将学生氏t检验用于在某些实验中确定miRNA miR-494诱导的TRAIL敏感性在NSCLC细胞上的NSCLC表达中的作用。
TaqMan阵列卡
使用TaqMan Array Human miRNA卡(卡A和B，分别地v2.1和v3.0；Applied Biosystems)在7900HT热循环仪(AppliedBiosystems)上进行miRNA表达谱分析。利用来自Sanger miRbasev14的人miRNA的750个独特测定、3个内源对照和1个阴性对照设计这两种卡。按照制造商的说明书，在使用Megaplex AssayPerformance(Megaplex RT引物池和Megaplex PreAmp池，两者都来自Applied Biosystems)的特异性RT和预扩增后扩增miRNA。将表达数据针对包含的对照miRNA的表达进行标准化。
Western印迹分析
接种A549、293A和H460细胞，将其在6孔板中在含有10％FBS的RPMI中生长72h。转染后，用冷PBS洗涤细胞，随后在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,20g/L SDS,5mM DTT,10mM苯甲磺酰基氟化物)中进行裂解。通过4％至20％SDS-PAGE分离等量的蛋白质裂解物(各自50μg)和分子量标志物(Bio-Rad Laboratories)，随后将其电转移至硝酸纤维素膜。用含有具有0.1％Tween-20的Tris-缓冲盐溶液中的5％脱脂奶粉的缓冲液封闭膜2h，随后在4℃用抗体温育过夜。在用含有0.1％Tween 20的Tris-缓冲盐溶液第二次洗涤后，用缀合有过氧化物酶的二抗(GE Healthcare,Amersham)温育膜，利用增强化学发光检测试剂盒(Pierce)进行显影。
用于Western印迹分析的抗体
将β-肌动蛋白(Sigma)和GAPDH(Cell Signaling Technologies)用作上样对照。ERK1/2来自Promega；Myc-标签、Jun、Fos和PTEN来自Santa Cruz Biotechnology；半胱天冬酶-3、磷酸化的ERK1/2、BIM、p-ELK1、聚(ADP核糖)聚合酶抗体来自Cell SignalingTechnologies；DROSHA来自abcam；以及Ki67来自ThermoScientific。
实时PCR
在Applied Biosystems 7900HT序列检测系统上，使用标准TaqMan PCR试剂盒方案进行qRT实时PCR。10-μL PCR包括0.67μL RT产物、1μL TaqMan Universal PCR预混合物(AppliedBiosystems)、0.2mM TaqMan探针、1.5mM正向引物和0.7mM反向引物。将反应物在96孔板中于95℃温育10分钟，随后进行在95℃持续15秒和在60℃持续1分钟的40个循环。以一式三份运行所有反应。将阈值循环(Ct)定义为荧光越过固定阈值时所处的分数循环数。将用于基因表达的相对定量的比较Ct方法(Applied Biosystems)用于测定miRNA表达水平。y轴代表2("ΔCt)，或不同miR的相对表达。计算相对于U44和U48rRNA的miR表达。对于每一个数据点以一式三份进行实验，通过使用软件(Bio-Rad)进行数据分析。
萤光素酶测定
为了生成BCL2-样11(BIM)萤光素酶报告构建体，通过PCR扩增3'UTR，随后将其在XbaI限制位点上克隆在pGL3-对照载体(Promega)的萤光素酶编码序列的下游。通过使用QuikChangeMutagenesis试剂盒(Stratagene)将突变引入miRNA-结合位点。用Lipofectamine 2000(Invitrogen)、1.2μg的含有BIM或突变的BIM-UTR的pGL3对照、200ng的海肾萤光素酶表达构建体(Promega)转染Meg-01细胞。24h后，裂解细胞，按照制造商的说明书，利用双重萤光素酶测定(Promega)对细胞进行测定。
为了研究AP1对miR-494启动子的作用，扩增在miR-494上游的含有推定的调控区的两个(S1,S2)DNA片段，将其克隆在pGL3basic(Promega)中。用Lipofectamine 2000(Invitrogen)、1.2μg的pGL3basic空载体或1.2μg的含有上述基因组片段的pGL3、200ng的海肾萤光素酶表达构建体pRL-TK(Promega)和ERK1/2、c-Jun、c-Fos siRNA转染Meg01细胞。24h后，裂解细胞，按照制造商的说明书，利用双重萤光素酶测定(Promega)对细胞进行测定。
用于克隆的引物是下列引物：
Bim 3'UTR fw:
5'tctagaGAGCCAAATGTCTGTGTGCAA 3'[SEQ ID NO:1]；
Bim 3'UTR rw:
5'tctagagagtgggagacagggatgttaat 3'[SEQ ID NO:2]；
Bim mut fw:
5'CTG TGT GAT GTG TCC TAC TAA TGC TGT AAC TTGTAG 3'[SEQ ID NO:3]；
Bim mut rw:
5'CTACAAGTTACAGCATTAGTAGGACA-CATCACACAG T[SEQ ID NO:4]；
Pr4941FW:
5'GGTAC CTCA TCA TCC CCA CCT AAC GTA GC 3'[SEQID NO:5]；
Pr4941RW:
5'AAGCTTCGTGAGAACACCAGTGAGA-GATG 3'[SEQ IDNO:6]；
Pr4942Fw:
5'GGTACCGTC GAA GTC ATG CAT ATG CAT CG 3'[SEQID NO:8]；和
Pr4942Rw:
5'AAGCTTGGTAAATTGTAGTGCTGTGTTGCTC 3'[SEQ IDNO:9].
染色质免疫沉淀
进行了染色质免疫沉淀。将来自293A细胞系的细胞(5×106)在37℃于1％甲醛中固定10分钟。用冰冷的1×PBS洗涤细胞，于1×PBS+蛋白酶抑制剂中刮取细胞，通过离心进行收集。随后对重悬浮于细胞裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl[pH 8.0],10mmol/L EDTA和1％SDS)+蛋白酶抑制剂中的细胞沉淀进行超声处理。使用5μg的抗-c-Jun抗体(Santa Cruz)或利用兔多克隆IgG对照(Zymed)免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。通过在65℃与蛋白酶K一起加热过夜来逆转免疫沉淀的染色质的交联，通过MinElute Reaction Cleanup柱(Qiagen)纯化DNA，将其重悬浮于水中。将纯化的染色质经历PCR，使用2％琼脂糖通过凝胶电泳分析产物。使用下列引物：
S1chip Fw:
5'ATG CATTAATTTAAAAGCTCTCAAATGGATG 3'[SEQ IDNO:10]；
S1chip Rw:
5'GACAAGAAATGGTCAGTGTGAGGCAT[SEQ ID NO:11]；
S2chip Fw:
5'ATGATCGTTGTAGAGCATCAGGCCT T[SEQ ID NO:12]；
S2chip Rw:
5'GATGAACTCTCAATTTGGATCAAACCCG 3'[SEQ IDNO:13]；
C-ChIP FW”
5'GTT GGG TGG TTC ATT TAA GGG TAT TCC TGA 3'[SEQ ID NO:14]；
C-ChIP RW:
5'TCATCAATGGGAGAATAATTTAATCAGCTC 3'[SEQ IDNO:15]。
细胞死亡和细胞增殖测定
将细胞以一式三份涂板在96孔板中，并在37℃于5％CO2培养箱中温育。如本文中所述使用Super-Killer TRAIL(AlexisBiochemicals)。按照制造商的方案，利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐Cell Titer 96AQueous One Solution细胞增殖测定(Promega)检查细胞的活力。通过向每一个孔中添加20μL来检测代谢活性细胞。在1小时的温育后，在Multilabel Counter(Bio-RadLaboratories)中分析平板。使用半胱天冬酶3/7活性评估细胞凋亡。以1.8×106个细胞/100mm培养皿接种细胞，将细胞在10％FBS/RPMI中生长过夜，用PBS洗涤细胞，随后用TRAIL 400ng/mL(对于A549)和200ng/mL(对于H460)处理16h。为了检测半胱天冬酶3/7活性，将细胞在96孔板中进行培养，用TRAIL 400ng/mL(对于A549)和200ng/mL(对于H460)进行处理，按照制造商的说明书使用半胱天冬酶-Glo 3/7测定试剂盒(Promega)进行分析。将半胱天冬酶活性的百分比针对本底进行校正。
具有miR-494过表达的H460稳定克隆和具有miR-494下调的A549稳定克隆的生成
用含有在两个不同启动子控制下的全长miR-494和GFP基因的人pre-miRNA表达构建体Lenti-miR表达质粒(System Biosciences)稳定地感染H460细胞。将空载体用作对照。用含有在两个不同启动子控制下的抗-miR-494和GFP基因的人抗-microRNA表达构建体Lenti-miR表达质粒(System Biosciences)稳定地感染A549细胞。用pPACKH1Lentivector包装质粒混合物(System Biosciences)将Pre-miR-494和抗-miR-494表达构建体和对照构建体包装在293TN包装细胞系中。使用PEGit病毒沉淀溶液浓缩病毒，使用UltraRapidLentiviral Titer试剂盒(System Biosciences)分析滴度。通过FACS分析(FACSCalibur；BD Bioscience)选择感染的细胞。通过荧光显微镜检查验证>90％的感染效率，通过miR表达的实时PCR确认所述感染效率。
克隆生成测定
以一式六份将各自(H460-空、H460miR-494、A549-Zip、A549-抗-miR-494)总共500个细胞接种在10-mm板中。2周后，对细胞进行染色，固定，随后计算集落。
体内实验
根据机构指导方针进行动物研究。使用H460-空、H460-miR-494、A549-Zip和A549-抗-miR-494稳定感染的细胞。将2×106个阳性细胞皮下注射入5只6周龄雄性裸鼠(Charles River Breeding Laboratories)的右胁腹。每2天利用数字测径器评估肿瘤尺寸。通过测量长度(l)和宽度(w)以及计算体积(V＝lw/2)来测定肿瘤体积。注射后30天，处死小鼠。通过使用学生氏t检验评价对照与经处理的动物之间的统计显著性。在美国俄亥俄州立大学的机构动物护理和使用委员会批准后进行动物实验。
其它实施例
治疗性/预防性方法和组合物
本文中还描述了通过对受试者施用有效量的治疗性化合物即单克隆(或多克隆)抗体、病毒载体、模拟物或拮抗剂进行治疗和预防的方法。在优选方面，治疗剂是大体上纯的。受试者优选为动物，包括但不限于动物诸如牛、猪、鸡等，并且优选为哺乳动物，最优选为人。
各种递送系统可用于施用治疗性化合物，例如脂质体、微粒、微囊剂中的封装，通过重组细胞的表达，受体介导的胞吞，作为逆转录病毒或其它载体的部分的治疗性核酸的构建等。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和口服途径。所述治疗性化合物通过任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注，通过经上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。
在具体的实施方案中，可能需要对需要治疗的区域局部施用治疗组合物；这可通过例如但不限于手术过程中的局部输注、局部敷用(例如，在手术后与伤口敷料结合)，通过注射，通过导管，通过栓剂或通过植入物(所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜诸如硅橡胶膜，或纤维)来实现。在一个实施方案中，施用是通过在恶性肿瘤或肿瘤性或肿瘤前组织的部位(或先前的部位)上的直接注射。
在其中治疗剂是编码蛋白质治疗剂的核酸的具体实施方案中，通过将所述核酸构建为适当的核酸表达载体的部分并施用其(以便其成为细胞内的)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂涂覆，或通过将其与已知进入细胞核的同源异型框样肽连接地施用，来体内施用所述核酸以调节其编码的蛋白质的表达。或者，可将核酸治疗剂引入细胞内，并通过同源重组掺入宿主细胞DNA内以用于表达。
药物组合物
这样的组合物包含治疗有效量的治疗剂，和药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。载体和组合物可以是无菌的。制剂将适合于施用模式。
需要时，组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂。可用常规粘合剂和载体诸如甘油三酯将所述组合物配制为栓剂。口服制剂可以包括标准载体诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在一个实施方案中，按照常规方法将组合物配制为适应于对人类静脉内施用的药物组合物。例如，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物还包含增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因以缓解注射部位的疼痛。通常地，以单位剂量形式，例如在密封容器诸如标明活性剂的量的安瓿瓶或药囊中作为干的冻干粉末或无水浓缩物，将成分混合在一起或单独地提供。当将通过输注施用组合物时，用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配其。当通过注射施用组合物时，提供一安瓿瓶的注射用无菌水或盐水，以便各成分在施用前混合。
可将治疗性制剂配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，诸如从盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等衍生的盐，以及与游离羧基形成的盐，诸如从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。
在特定病症或病况的治疗中有效的治疗性制剂的量将取决于所述病症或病况的性质，并且通过标准临床技术来确定。此外，可任选地将体外测定用于帮助鉴定最佳剂量范围。待用于制剂的精确剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的严重度，并且根据医生的判断和每一个患者的情况来确定。然而，用于静脉内施用的适当的剂量范围通常为约20-500微克的活性化合物/千克体重。用于鼻内施用的适当的剂量范围通常为0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
治疗癌症患者的方法
本实施例描述了选择可能对利用本文中的组合物的治疗具有有利反应的患者并治疗其的方法。
经诊断患有癌症的患者通常首先经历目的在于治愈的组织切除术。肿瘤样品获自从患者切除的组织的部分。随后使用本领域公知的用于小RNA提取的任何适当方法，例如通过使用TRIZOLTM从组织样品分离RNA。随后将纯化的RNA经历使用特异于miR-494或其它公开的差异表达的miRNA的引物的RT-PCR(任选地结合遗传分析)。运行这些测定以测定相关RNA在肿瘤中的表达水平。如果测定了差异表达的miR表达模式，尤其地如果确定了突变状态，则就患者是否是利用本文中的组合物进行治疗的候选者评价所述患者。
因此，按照本领域中已知的方法利用治疗有效量的组合物治疗患者。组合物的剂量和给药方案将取决于许多因素诸如患者的健康状态和癌症的分期而变化。通常地，随时间过去以许多剂量施用治疗。
不同时期的miR水平的评估可用于确定适当的剂量、改变治疗剂、停止治疗或开始治疗方案。
诊断癌症患者的方法
在一个具体方面，本文中提供了诊断受试者是否患有癌症或处于发展癌症的风险中的方法。所述方法通常包括测量相较于对照的miR的差异miR表达模式。如果确定了差异miR表达模式，则结果表明受试者患有癌症或处于发展癌症的风险中。在某些实施方案中，使用Northern印迹分析测量至少一种基因产物的水平。并且，在某些实施方案中，测试样品中至少一种基因产物的水平低于对照样品中对应miR基因产物的水平，和/或测试样品中至少一种miR基因产物的水平高于对照样品中对应miR基因产物的水平。
在一些实施方案中，含mRNA样品可获自血液、粘液、痰、支气管镜活检组织、针吸活检组织、切开活检组织或电视辅助胸腔镜手术。
测量miR基因产物
可通过从获自受试者的测试样品反转录RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸；将所述靶寡聚脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；和，将测试样品杂交谱与从对照样品生成的杂交谱相比较来测量至少一种miR基因产物的水平。至少一种miRNA的信号的改变表明受试者患有肺癌，特别是EGFR突变体肺癌，或处于发展所述癌症的风险中。
诊断和治疗应用
在另一个方面，本文中提供了治疗受试者的癌症的方法，其中至少一种miRNA的信号相对于从对照样品生成的信号失调(例如，被下调和/或上调)。
本文中还提供了通过如下步骤诊断受试者是否患有与受试者的一个或多个不利预后标志相关的癌症或处于发展所述癌症的风险中的方法：从获自受试者的测试样品反转录RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸；将所述靶寡聚脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；和，将测试样品杂交谱与从对照样品生成的杂交谱相比较。信号的改变表明受试者患有癌症，或处于发展所述癌症的风险中。
试剂盒
还提供了包含一个或多个装有本发明的药物组合物的一个或多个成分的容器的药物包装或试剂盒。任选地与这样的容器相随的是由监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的通告，所述通告反映了制造、使用或销售的机构批准用于人施用。
可将本文中描述的任何组合物包含在试剂盒中。在非限定性实例中，将用于分离miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评价miRNA群体的试剂包含在试剂盒中。所述试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。试剂盒从而在适当的容器装置中包含用于标记miRNA(通过掺入标记的核苷酸或未标记的核苷酸，所述未标记的核苷酸随后进行标记)的酶。其还可包括一种或多种缓冲液，诸如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液，用于制备miRNA探针的化合物和用于分离miRNA的组分。其它试剂盒还可包括用于制备包含与miRNA互补的寡核苷酸的核酸阵列的组分，从而可包括例如固体支持物。
对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可存在包含与本文中的任何序列的全部或部分相同或互补的序列的核酸分子。
可将试剂盒的组分包装在含水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括可将组分置于其中，优选适当地在其中进行等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。当试剂盒中存在超过一种组分(可将标记试剂和标记包装在一起)时，试剂盒通常还包含可将另外的组分单独地置于其中的第二、第三或其它另外的容器。然而，可将组分的各种组合包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包括用于包含核酸的装置，和严密封闭用于商业销售的任何其它试剂容器。这类容器可包括将所需小瓶保留在其中的注塑或吹塑成型的塑料容器。
当在一个和/或多个液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是一种优选溶液。可包含在试剂盒中的其它溶液是用于从混合样品分离和/或富集miRNA的那些溶液。
然而，可以以干粉形式提供试剂盒的组分。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可通过添加适当的溶剂来重建粉剂。预期还可在另一容器装置中提供所述溶剂。试剂盒还可包括促进标记的miRNA的分离的组分。其还可包括保存或维持miRNA或保护其免于降解的组分。所述组分可以不含RNA酶或保护免受RNA酶降解。
此外，试剂盒通常可在适当的装置中包含用于每一个单独的试剂或溶液的不同容器。试剂盒还可包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包含的任何其它试剂的说明书。说明书可包括可被应用的变型。预期这样的试剂是本发明的试剂盒的实施方案。同样地，试剂盒不限于上文中鉴定的特定项，其可包括用于miRNA的操作或表征的任何试剂。
还预期，在miRNA阵列的上下文中论述的任何实施方案可更通常地用于本发明的筛选或谱表征方法或试剂盒。换句话说，更通常地在miRNA谱表征的上下文中可实施描述包含在特定阵列中的物质的任何实施方案，所述实施方案不一定包括阵列本身。
还预期，任何试剂盒、阵列或其它检测技术或工具或任何方法可牵涉这些miRNA的任何miRNA的谱表征。同样地，预期可在本发明的方法中在利用或不利用阵列形式的情况下执行miRNA阵列的上下文中论述的任何实施方案；换句话说，可按照本领域普通技术人员已知的任何技术在本发明的任何方法中筛选或评价miRNA阵列中的任何miRNA。阵列形式不是执行的筛选和诊断方法所必需的。
用于使用miRNA阵列进行治疗、预后或诊断应用的试剂盒以及这样的用途由本发明人在本文中进行考虑。试剂盒可包括miRNA阵列以及关于阵列上的miRNA的标准或标准化的miRNA谱的信息。此外，在某些实施方案中，还可将对照RNA或DNA包括在试剂盒中。对照RNA可以是可用作用于标记和/或阵列分析的阳性对照的miRNA。
本教导的方法和试剂盒已在本文中进行了广泛和一般性描述。落在一般公开内容内的每一个更窄的种类和亚属分类也形成了本教导的部分。这包括具有限定条件或负面限制(从而从该属中除去任何主题)的本教导的一般描述，无论被排除的材料是否被明确在本文中引用。
阵列制备和筛选
本文中还提供了miRNA阵列的制备和使用，所述阵列是与多个miRNA分子或前体miRNA分子完全或几乎完全互补或相同并且以空间上分开的组织方式置于支持材料上的核酸分子(探针)的有序宏观阵列或微阵列。宏观阵列通常是已将探针点样在其上的硝酸纤维素或尼龙薄层。微阵列更密集地放置核酸探针，以便可将高达10,000个核酸分子放置在通常1至4平方厘米的区域中。
可通过将核酸分子例如基因、寡核苷酸等点样在衬底上或在衬底上原位制造寡核苷酸序列来制造微阵列。可以以达到每平方厘米约30种非相同核酸分子或更多例如达到每平方厘米约100或甚至1000种非相同核酸分子的高密度矩阵模式应用点样或制造的核酸分子。微阵列通常使用被涂覆的玻璃作为固体支持物，与过滤阵列的基于硝酸纤维素的材料相反。通过具有miRNA-互补核酸样品的有序阵列，可跟踪每一个样品的位置并将其与原始样品相联系。
其中多个不同的核酸探针与固体支持物的表面稳定结合的多种不同阵列装置对于本领域普通技术人员来说是已知的。用于阵列的有用衬底包括尼龙、玻璃和硅。阵列可以以许多不同的方式变化，包括平均探针长度、探针的序列或类型、探针与阵列表面之间的键的性质，例如共价或非共价键等。除了探针检测miRNA以外，本文中描述的标记和筛选方法以及阵列不限定于其关于任何参数的效用；因此，可将方法和组合物与多种不同类型的miRNA阵列一起使用。
在本说明书中提及的所有出版物，包括专利和非专利文献，通过引用明确地并入本文。任何本文中引用的文件的引用无意作为任何前述内容是相关现有技术水平的承认。所有关于日期的声明或关于这些文献的内容的陈述基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
尽管本发明已经参照各种优选实施方案进行了描述，但本领域普通技术人员应理解，可在不背离本发明的实质范围的情况下，对其要素进行各种改变，和用等同物替代其。此外，可进行许多变动以使特定情况或材料适应本发明的教导而不背离其实质范围。
因此，本发明无意被限制于本文中公开的构思用于执行本发明的特定实施方案，而是本发明将包括落入权利要求的范围内的所有实施方案。

Claims (15)

1.一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)中的TNF-相关细胞凋亡-诱导配体(TRAIL)抗性的方法，所述非小细胞肺癌显示TRAIL抗性，所述方法包括施用TRAIL和抗-miR-494以调控BIM的表达，从而促进NSCLC患者中的肿瘤细胞的细胞凋亡。
2.一种抑制TRAIL-抗性癌细胞中的Bcl-2-样蛋白11(BIM)的下调的方法，所述癌细胞过表达miR-494，所述方法包括对所述癌细胞施用有效量的至少一种miR-494抑制剂和抑制BIM下调。
3.权利要求2的方法，其中所述癌选自肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胃肠道肿瘤和黑色素瘤。
4.权利要求2的方法，其还包括：
在施用TRAIL和抗-miR-494之前测量癌细胞中的miR-494表达水平；
如果所述miR-494水平是对照水平的2-12倍，则将所述癌细胞归类为过表达miR-494；和
以足以降低miR-494水平的量施用miR-494的抑制剂；其中所述miR-494水平降低至少25％。
5.一种药物组合物，其包含大体上纯的抗-miR-494和TRAIL以及药学上可接受的载体。
6.一种通过抑制细胞的增殖和/或诱导细胞的细胞凋亡来影响细胞的方法，所述方法包括将有效量的至少miR-494的miR-特异性抑制剂引入所述细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述miR-特异性抑制剂包含与miR-494互补的至少6个连续核苷酸的核苷酸序列，并且与miR-494序列的其余部分具有至少50％的互补性，以及其中miR-494的所述miR-特异性抑制剂诱导BIM和TRAIL的至少一种在细胞中表达。
8.权利要求6的方法，其中所述miR-特异性抑制剂选自抗-miR和靶模拟物。
9.一种诊断赘生物是否抗化学疗法的方法，所述方法包括：
测定所述赘生物中miR-494和TRAIL表达的水平，以及
如果miR-494表达的水平在所述赘生物中比在正常对照中高并且TRAIL表达水平在所述赘生物中比在正常对照中低，则将所述赘生物鉴定为抗化学疗法的。
10.一种使用抗-miR-494作为治疗剂的方法，其中治疗作用是增强对细胞凋亡诱导性药剂的药物敏感性，所述方法包括：对有此需要的患者施用抗-miR-494。
11.权利要求10的方法，其还包括施用选自吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼和索拉非尼的化学治疗性化合物。
12.一种鉴定用于治疗TRAIL抗性癌症的治疗剂的方法，其包括在体外筛选一种或多种候选试剂以选择在TRAIL抗性癌细胞中下调miR-494并且增加BIM的表达的试剂，其中对PED突变细胞施用所述试剂。
13.权利要求12的方法，其中ERK1/2细胞核途径在所述PED突变细胞中被抑制，并且其中ERK1/2细胞质途径未被抑制。
14.一种确定获自受试者的细胞样品的细胞周期进程表型的方法，其包括：a)测量所述细胞样品中至少miR-494的水平；和b)将至少miR-494的水平与细胞周期进程参照值相比较，其中高于细胞周期进程参照值的水平表示所述细胞样品中加速的细胞周期进程。
15.一种用于分析病理样品的TRAIL抗性的试剂盒，所述试剂盒包含：于适当的容器中的用于测定miR-494的水平、BIM和TRAIL的一种或多种的水平的RNA杂交或扩增试剂，以及使用说明书。
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