CN102277434A

CN102277434A - 人zfx基因的用途及其相关药物

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Publication number: CN102277434A
Application number: CN2011102247927A
Authority: CN
Inventors: 曹跃琼; 吕大龙; 朱向莹; 韩海雄; 瞿红花; 金杨晟
Original assignee: Individual
Current assignee: Shanghai Jikai Gene Medical Technology Co ltd
Priority date: 2011-07-28
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2031-08-05
Also published as: CN102277434B

Abstract

本发明公开了人ZFX基因的用途及其相关药物。本发明公开了人ZFX基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人ZFX基因小分子干扰RNA、人ZFX基因干扰核酸构建体、人ZFX基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人ZFX基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中ZFX基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

人ZFX基因的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人ZFX基因的用途及其相关药物。

背景技术

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)现象是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA)导入细胞后，该mRNA发生特异性降解，而导致该基因表达的沉默。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi(TuschlT，Zamore PD，Sharp PA，Bartel DP.RNAi：double-stranded RNA directs theATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell 2000；101：25-33.)。肿瘤是威胁人类健康的主要疾病。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤的发生和发展(Uprichard，Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005；579：5996-6007.)。

锌指蛋白是人体中最大的蛋白家族，是识别核酸最常见的结构元件。研究发现人类基因的1％属于锌指蛋白基因家族。锌指蛋白能够通过靶定在基因启动子区域而调节基因的表达，在组织细胞的生长、增殖和分化中均起重要作用，其异常表达可能导致许多疾病包括恶性肿瘤的发生(Yajima I，Kumasaka M，Thang ND，Yanagishita T，Ohgami N，KallenbergD，Naito Y，Yoshikawa T，Sakashita N，Kato M.Zinc finger protein 28 as a novelmelanoma-related molecule.J Dermatol Sci.2009；55：68-70.Oyanagi H，TakenakaK，Ishikawa S，Kawano Y，Adachi Y，Ueda K，Wada H，Tanaka F.Expression of LUN genethat encodes a novel RING finger protein is correlated with development andprogression of non-small cell lung cancer.Lung Cancer.2004；46：21-28.Witkiewicz-Kucharczyk A，Bal W.Damage of zinc fingers in DNA repair proteins，anovel molecular mechanism in carcinogenesis.Toxicol Lett.2006；162：29-42.Vendrell JA，Ghayad S，Ben-Larbi S，Dumontet C，Mechti N，Cohen PA.A20/TNFAIP3，a new estrogen-regulated gene that confers tamoxifen resistance in breast cancercells.Oncogene.2007；26：4656-4667.)。

ZFY(zinc finger-Y)基因家族在脊椎动物中是一个高度保守的基因家族，在分子结构上都具有一个酸性氨基末端和羧基末端，含有锌指结构的DNA结合区。目前已发现ZFY基因家族共包括三个成员：ZFX、ZFY和ZFA基因，他们在分子结构上非常相似(North M，SargentC，O’Brien J，Taylor K，Wolfe J，Affara NA，Ferguson-Smith MA.Comparison of ZFYand ZFX gene structure and analysis of alternative 3’untranslated regions of ZFY.Nucleic Acids Res.1991；19：2579-2586.)。一般哺乳动物均含有ZFX和ZFY基因，其中，ZFX基因位于X染色体上，而ZFY基因位于Y染色体上(Palmer MS，Berta P，SinclairAH，Pym B，Goodfellow PN.Comparison of human ZFY and ZFX transcripts.Proc NatlAcad Sci U S A.1990；87：1681-1685.)。已有大量研究证实ZFY基因家族与动物的性别有关，因此鉴定ZFX和ZFY也成为甄别动物性别的可靠指标。深入研究表明，ZFY基因家族可能与睾丸发育有关，决定了动物性别的发展(Schneider-

A，Beer-Romero P，Brown LG，Nussbaum R，Page DC.ZFX has a gene structure similar to ZFY，the putativehuman sex determinant，and escapes X inactivation.Cell.1989；57：1247-1258.)。

ZFX基因编码的全长蛋白中包含一个酸性转录激活域(AD)，一个核定位序列(NLS)和一个具有13个C2H2[Cys(2)His(2)]型锌指结构的DNA结合域(DBD)(Poloumienko A.Cloning and comparative analysis of the bovine，porcine，and equine sex chromosomegenes ZFX and ZFY.Genome.2004；47：74-83.)。在哺乳动物细胞中，C2H2锌指结构是最常见的蛋白质结构之一，具有转录调节的潜在功能。目前已发现800多种具有这种锌指结构的蛋白质，大部分已被证实存在重要的生理功能。近年来，科学家们在研究不同干细胞的基因表达过程中发现在几种不同的干细胞中ZFX基因均存在明显高表达(Ramalho-Santos M，Yoon S，Matsuzaki Y，Mulligan RC，Melton DA.Stemness″：transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells.Science.2002；298：597-600.)。另有报道，ZFX基因具有调节干细胞自我更新的功能(Cellot S，Sauvageau G.Zfx：at the crossroads of survival and self-renewal.Cell.2007；129：239-241.)。然而，迄今为止，ZFX基因在肿瘤相关领域的报道还是一片空白。

发明内容

本发明的目的在于公开与人ZFX(zinc finger-X)基因相关的治疗方法及药物。

本发明第一方面，公开了一种肿瘤治疗方法，为通过降低人ZFX基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人ZFX基因的表达相关的任一种肿瘤，更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质瘤。

所述肿瘤治疗方法，为将能有效降低人ZFX基因表达水平的物质给药于患者。

进一步的，所述的能有效降低人ZFX基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人ZFX基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)。该小分子干扰RNA(siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源ZFX基因的表达的作用。

进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-42之任一的序列作为特异性沉默人ZFX基因表达的靶点序列。

所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-42之任一的序列作为特异性沉默人ZFX基因表达的靶点序列是指：该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO：1-42中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人ZFX基因的表达。

进一步的，所述能够特异性沉默人ZFX基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括：将编码所述人ZFX基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体获得人ZFX基因干扰慢病毒载体，进而利用该人ZFX基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述siRNA。

人ZFX基因干扰慢病毒载体为将后获得，能产生人ZFX基因小分子干扰RNA。

进一步的，所述的慢病毒载体可选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体。

慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。

本发明第二方面，公开了将人ZFX基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人ZFX基因用于制备肿瘤诊断药物。

人ZFX基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人ZFX基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人ZFX基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

所述将人ZFX基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将人ZFX基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人ZFX基因的表达水平。

所述将人ZFX基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将人ZFX基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人ZFX基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之前所述的人ZFX基因小分子干扰RNA即是以人ZFX基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将ZFX基因作为作用对象。

所述将人ZFX基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人ZFX基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人ZFX基因的表达相关的任一种肿瘤，例如选自：喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质瘤。

所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。

进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人ZFX基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明第三方面，公开了一种分离的人ZFX基因小分子干扰RNA(siRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO 1-42中任意一条序列。

所述分离的人ZFX基因小分子干扰RNA(siRNA)靶标片段可应用于人ZFX基因小分子干扰RNA的筛选与制备。

本发明第四方面，公开了一种人ZFX基因小分子干扰RNA(siRNA)，能够特异性沉默人ZFX基因的表达。

所述人ZFX基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-42之任一的序列作为特异性沉默人ZFX基因表达的靶点序列。

进一步的，所述人ZFX基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO：1-42中之任一序列编码的RNA。

所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条RNA链上。

所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述人ZFX基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO：1-42之任一。

所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以UUCAAGAGA为茎环。

如实施例列举的，所述人ZFX基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO：43：GUCGGAAAUUGAUCCUUGUAAUUCAAGAGAUUACAAGGAUCAAUUUCCGAC。

本发明第五方面，公开了一种人ZFX基因干扰核酸构建体，包含编码前述人ZFX基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人ZFX基因小分子干扰RNA。

所述的人ZFX基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人ZFX基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入已知载体获得。

进一步的，所述人ZFX基因干扰核酸构建体为人ZFX基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人ZFX基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人ZFX基因小分子干扰RNA。

所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人ZFX基因干扰核酸构建体，命名为pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA-1。

进一步的，编码所述人ZFX基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO：1-42中之任一序列及其互补序列。

本发明的人ZFX基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人ZFX基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人ZFX基因小分子干扰RNA。

当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人ZFX基因小分子干扰RNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第六方面，公开了一种人ZFX基因干扰慢病毒，由前述人ZFX基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人ZFX基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明第七方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人ZFX基因小分子干扰RNA或人ZFX基因干扰慢病毒。

进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％如前所述的人ZFX基因小分子干扰RNA或人ZFX基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

综上所述，本发明设计了针对人ZFX基因的42个RNAi靶点序列，构建相应的ZFX RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO.19的RNAi载体pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA能够显著下调ZFX基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA能够靶向地将针对ZFX基因的RNAi序列高效导入人喉癌Hep 2细胞、肺癌95D细胞、胃癌AGS细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U251细胞，降低ZFX基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的ZFX基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人ZFX基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中ZFX基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱

图2表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人喉癌Hep 2细胞、肺癌95D细胞、胃癌AGS细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U251细胞5天后，ZFX mRNA的表达水平显著降低

图3表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人喉癌Hep 2细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图4表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人肺癌95D细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图5表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人胃癌AGS细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图6表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人肝癌SMMC-7721细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图7表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图8表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人胶质瘤U251细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图9使用ZFX抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果

a.人胰腺癌，b.乳腺癌，c.结直肠癌，d，e：肺癌，f，g，h，i：胃癌

图10使用ZFX抗体在癌旁组织中的免疫组化检测结果

a.人胰腺癌癌旁组织，b.乳腺癌癌旁组织，c.结直肠癌癌旁组织，d，e：肺癌癌旁组织，f，g，h，i：胃癌癌旁组织

图11浸染ZFX-siRNA慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力检测结果

a肿瘤生长曲线，b裸鼠体内肿瘤荧光检测

具体实施方式

本发明基于锌指蛋白可能与肿瘤细胞的增殖、耐药和血管形成等相关的研究，认为ZFX作为一个新发现的锌指蛋白可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。

本发明涉及了一组针对人ZFX基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人ZFX mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源ZFX基因的表达。

发明人发现，采用RNAi方法下调人ZFX基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明ZFX基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对ZFX基因的siRNA，筛选出了可有效抑制ZFX的表达进而抑制人喉癌Hep 2细胞、肺癌95D细胞、胃癌AGS细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U251细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人ZFX基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默ZFX基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人ZFX基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调ZFX基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明ZFX基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默ZFX基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人ZFX基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人ZFX基因序列；预测siRNA位点；合成针对ZFX基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达ZFX基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix，Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默ZFX基因的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了42个干扰ZFX基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO 1-42所示)，构建了特异干扰人ZFX基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种人ZFX基因RNAi慢病毒(ZFX-RNAi)及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低ZFX基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，ZFX基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，ZFX基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的ZFX基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：针对人ZFX基因RNAi慢病毒的制备

1.筛选针对人ZFX基因的有效的siRNA靶点

从Genbank调取ZFX(NM_003410.2)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对ZFX基因的有效的siRNA靶点。在ZFX基因的编码序列(CDS)区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中42条针对ZFX基因的有效siRNA靶点序列。

表1靶向于人ZFX基因的siRNA靶点序列

针对siRNA靶点(以SEQ ID NO：19为例)合成两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以AgeI和EcoRI限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物(上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO：44)；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO：45))，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO.19的RNAi载体，命名为pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA。

构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：46)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA。

表3两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo

编号

5’

颈

环

颈

3’

正义链

CCGG

TTCTCCGAACGTGTCACGT

TTCAAGAGA

ACGTGACACGTTCGGAGAA

TTTTTG

反义链

AATTCAAAAA

TTCTCCGAACGTGTCACGT

TCTCTTGAA

ACGTGACACGTTCGGAGAA

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体

表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl)	2.0
10×buffer	5.0
		100×BSA	0.5
AgeI(10U/μl)	1.0
		EcoRI(10U/μl)	1.0
dd H₂O	40.5
		Total	50.0

表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA(100ng/μl)	1.0	1.0	1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)	1.0	-	1.0
				10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0
T4噬菌体DNA连接酶	1.0	1.0	1.0
				dd H₂O	16.0	17.0	16.0
Total	20.0	20.0	20.0

表6-1PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		10×buffer	2.0
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1.0
		ddH₂O	15.2
Total	20.0

表6-2PCR反应体系程序设定

2.包装ZFX-siRNA慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION LentiviralPackaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA序列为SEQ ID NO：43。对照慢病毒的包装过程同ZFX-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA载体。

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测ZFX基因的沉默效率

处于对数生长期的人喉癌Hep 2细胞、肺癌95D细胞、胃癌AGS细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U251细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，Hep2：10，95D：2，AGS：100，SMMC-7721：20，MCF-7：20，U251：10)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表6，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。

采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。ZFX基因的引物如下：上游引物5’-GGCAGTCCACAGCAAGAAC-3’(SEQ ID NO：47)和下游引物5’-TTGGTATCCGAGAAAGTCAGAAG-3’(SEQ ID NO：48)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO：49)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO：50)。按表7中的比例配置反应体系。

表6逆转录反应体系

试剂	体积(μl)
		5×RT buffer	4.0
10mM dNTPs	2.0
		RNasin	0.5
M-MLV-RTase	1.0
		DEPC H₂O	3.5
Total	11.0

表7Real-time PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		SYBR premix ex taq：	10.0
上游引物(2.5μM)：	0.5
		下游引物(2.5μM)：	0.5
cDNA	1.0
		ddH₂O	8.0
Total	20.0

设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-^ΔΔCt分析法计算侵染了ZFX mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果(图2)表明，人喉癌Hep2细胞、肺癌95D细胞、胃癌AGS细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U251细胞中ZFX mRNA的表达水平下调了60.2％、68.5％、80.8％、62.6％、63.7％和83.9％。

实施例3：检测侵染ZFX-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人喉癌Hep 2细胞、肺癌95D细胞、胃癌AGS细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U251细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，Hep2：10，95D：2，AGS：100，SMMC-7721：20，MCF-7：20，U251：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomicsarrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图3-图8所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度。

实施例4肿瘤细胞中ZFX基因过表达的试验

组织样本：人胰腺癌，乳腺癌，结直肠癌，肺癌，胃癌的组织样本，以及上述肿瘤组织的癌旁区域的组织样本

ZFX抗体：购自Sigma公司

试验方法：

取出组织芯片，将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。然后对组织芯片脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯15分钟，二甲苯∶乙醇＝1∶1混液中，无水乙醇中，95％乙醇中，85％乙醇中，75％乙醇中，蒸馏水中依次浸泡10分钟；然后用用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H₂O₂，室温封闭10分钟；抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；10％血清(TBS配制)封闭30分钟；吸弃血清，勿洗加入ZFX抗体(1∶100稀释)孵育过夜；TBS洗2遍，每次5分钟；加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育60分钟；TBS洗4遍，每次5分钟；加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；用苏木浸30秒，清水漂洗7-8遍；脱水封片，于75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，二甲苯∶乙醇＝1∶1混液，二甲苯中，依次浸置5分钟；取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片，晾干，观察结果，拍照。(结果如图9和图10)

结果表明：

使用ZFX抗体对不同肿瘤组织进行免疫组化表达检测，结果发现，在人胰腺癌，乳腺癌，结直肠癌，肺癌，胃癌的组织样本中，都能发现zfx基因编码蛋白的高表达。图中棕色代表表达阳性。

而使用ZFX抗体对不同肿瘤组织的癌旁区域进行免疫组化表达检测，结果发现，在人胰腺癌，乳腺癌，结直肠癌，肺癌，胃癌的组织样本中，在癌旁区域，都没有发现ZFX蛋白的表达，代表在癌旁组织中，ZFX是无表达的状态。基于此实验结果，认为可通过检测组织细胞zfx基因的表达来辅助诊断癌症。

实施例5：浸染ZFX-siRNA慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力

处于对数生长期的人胃癌SGC7901细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液。用一次性注射器将细胞悬液(2×106cells/鼠)注射到5-6周龄雌性BALB/c裸鼠右侧腋窝。实验组注射感染ZFX-siRNA慢病毒的SGC7901细胞，对照组注射感染Lv-Scr-siRNA慢病毒的SGC7901细胞，每组5只裸鼠。注射后饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(一周)，然后每天用NightOWL II 983发光成像系统(Berthold Technologies)测量瘤块的体积，并绘制出肿瘤生长曲线(如图10a)。连续观察7天，于7天后对裸鼠体内肿瘤进行拍照(如图10b)。结果表明：实验组的肿瘤细胞体内成瘤能力远低于对照组。基于此实验结果，认为ZFX-siRNA可以在体内抑制肿瘤细胞的增殖。

Claims

1.人ZFX基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为其肿瘤细胞的增殖与人ZFX基因的表达相关的任一种肿瘤。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自：喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质瘤。

4.一种分离的人ZFX基因小分子干扰RNA靶标片段，其序列为SEQ ID NO 1-42中任意一条序列。

5.一种人ZFX基因小分子干扰RNA，能够特异性沉默人ZFX基因的表达。

6.如权利要求5所述人ZFX基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO：1-42之任一的序列作为特异性沉默人ZFX基因表达的靶点序列。

7.如权利要求5所述人ZFX基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO：1-42中之任一序列编码的RNA。

8.如权利要求7所述人ZFX基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15-27个核苷酸。

9.如权利要求7所述人ZFX基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段中间由茎环片段分隔。

10.如权利要求9所述人ZFX基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。

11.如权利要求5所述人ZFX基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO：43。

12.一种人ZFX基因干扰核酸构建体，包含编码权利要求5-11任一权利要求所述人ZFX基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达人ZFX基因小分子干扰RNA。

13.如权利要求12所述人ZFX基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述人ZFX基因干扰核酸构建体为人ZFX基因干扰慢病毒载体。

14.如权利要求13所述人ZFX基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

15.一种人ZFX基因干扰慢病毒，由权利要求12-14任一权利要求所述人ZFX基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

16.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求5-11任一权利要求所述人ZFX基因小分子干扰RNA或权利要求15所述人ZFX基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

17.如权利要求16所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗肿瘤，所述的肿瘤为其肿瘤细胞的增殖与人ZFX基因的表达相关的任一种肿瘤。

18.如权利要求17所述药物组合物，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤，选自喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质瘤之任一。