CN104726593A - 人nlk基因相关的用途及其相关药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了NLK基因的用途及其相关药物。本发明公开了NLK基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子、含有该分离的寡核苷酸分子的细胞及NLK基因干扰慢病毒，并公开了他们的用途。本发明提供的可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或者NLK基因干扰慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NLK基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

人NLK基因相关的用途及其相关药物

本申请是申请日为2011年12月23日，申请号为201110440594.4，发明名称为：《人NLK基因相关的用途及其相关药物》的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人NLK基因相关的用途及其相关药物。

背景技术

Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)定位于细胞核，是一种属于脯氨酸介导的蛋白激酶超家族中保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，最初认为与果蝇的眼细胞的极化及脊椎动物多种发育过程有关(Choi KW,Benzer S.Rotation of photoreceptor clusters in the developingDrosophila eye requires the Nemo gene.Cell.1994；78:125-36.Verheyen EM,Mirkovic I,MacLean SJ,Langmann C,Andrews BC,MacKinnon C.The tissue polarity gene Nemo carriesout multiple roles in patterning during Drosophila development.Mech Dev.2001；101:119-32.)。近年来的研究认为NLK可调节、磷酸化转录因子，并通过多种信号途径参与细胞的凋亡过程(Brott BK,Pinsky BA,Erikson RL.Nlk is a murine protein kinase related to Erk/MAP kinasesand localized in the nucleus.Proc Natl Acad Sci U S A.1998；95:963-8.Mirkovic I,Charish K,Gorski SM,McKnight K,Verheyen EM.Drosophila Nemo is an essential gene involved in theregulation of programmed cell death.Mech Dev.2002；119:9-20.)。

Wnt信号传导通路包括：细胞外因子(Wnt)、跨膜受体(Frizzled，Fz)、胞质蛋白(Dsh，β-catenin/APC/Axin复合体等)及核内转录因子(TCF/LEF)，与多种肿瘤的发生发展密切相关(Bienz M,Clevers H.Linking colorectal cancer to Wnt signaling.Cell 2000；103:311-20.)。NLK是Wnt/β-catenin信号通路的负调节因子，可使TCF/LEF磷酸化，抑制β-catenin/TCF复合体的转录活性。c-myb原癌基因表达物c-Myb蛋白作为转录因子可调控下游多种基因转录，影响造血干细胞的增殖与凋亡。Wnt-1通过转化生长因子β激活性激酶TAK1诱导NLK直接结合并磷酸化c-Myb蛋白多个位点，后续发生遍在蛋白化及蛋白酶依赖的降解，可能造成细胞周期G1期的阻滞，然而对Myb家族另一成员a-Myb的调控则主要表现为磷酸化并抑制其与DNA结合区结合而发挥作用(Kanei-Ishii C,Ninomiya-Tsuji J,Tanikawa J,Nomura T,Ishitani T,Kishida S,Kokura K,Kurahashi T,Ichikawa-Iwata E,Kim Y,Matsumoto K,Ishii S.Wnt-1 signal induces phosphorylation and degradation of c-Myb protein via TAK1,HIPK2,and NLK.Genes Dev.2004；18:816-29.)。另外，研究发现，TAK1-NLK通路可磷酸化具有影响细胞凋亡、应激、DNA损伤/修复、肿瘤发生的转录因子FOXO1，并促使FOXO1从胞核至胞质的移位，而抑制FOXO1的转录功能(Kim S,Kim Y,Lee J,Chung J.Regulationof FOXO1 by TAK1-Nemo-like kinase pathway.J Biol Chem.2010；285:8122-9.)。进一步研究发现，NLK还可通过磷酸化转录共激活因子CBP/P300的C-末端区域而影响转录因子如NF-κB、AP-1、Smad等的转录活性的方式参与细胞凋亡过程(Yasuda J,Yokoo H,Yamada T,Kitabayashi I,Sekiya T,Ichikawa H.Nemo-like kinase suppresses a wide range of transcriptionfactors,including nuclear factor-kappaB.Cancer Sci.2004；95:52-7.Shi Y,Ye K,Wu H,Sun Y,Shi H,Huo K.Human SMAD4 is phosphorylated at Thr9 and Ser138 by interacting with NLK.Mol Cell Biochem.2010；333:293-8.)。

关于NLK在肿瘤中的研究已有在结直肠癌、前列腺癌和肝癌中的报道。NLK被认为是结肠癌Wnt/β-catenin信号通路的抑癌基因。野生型的NLK在结直肠癌中被诱导表达，通过磷酸化TCF/LEF抑制细胞生长，促进p53非依赖的细胞凋亡，但不影响细胞周期(Yasuda J,Tsuchiya A,Yamada T,Sakamoto M,Sekiya T,Hirohashi S.Nemo-like kinase induces apoptosisin DLD-1 human colon cancer cells.Biochem Biophys Res Commun 2003；308:227-33.)。在前列腺癌中，NKL负调节雄性激素受体信号转导途径。NLK过表达可显著诱导雄性激素受体阳性表达的前列腺癌细胞发生细胞凋亡。进一步的研究发现，NLK能够通过与雄激素受体形成复合物的方式抑制雄激素受体对靶基因的转录活性，且在转录水平抑制雄激素受体mRNA的表达(Emami KH,Brown LG,Pitts TE,Sun X,Vessella RL,Corey E.Nemo-like kinaseinduces apoptosis and inhibits androgen receptor signaling in prostate cancer cells.Prostate.2009；69:1481-92.)。而在人肝癌细胞系中，敲除NLK的表达可以抑制细胞生长，同时发现，G1-S期细胞增加，细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK2的表达也明显降低，说明NLK在肝癌形成中可能具有通过作用cyclin D1、CDK2而发挥促有丝分裂的作用(Jung KH,Kim JK,NohJH,Eun JW,Bae HJ,Xie HJ,Ahn YM,Park WS,Lee JY,Nam SW.Targeted disruption ofNemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin D1 and CDK2in human hepatocellular carcinoma.J Cell Biochem.2010；110:687-96.)。综上，NLK在不同肿瘤的发生发展中可能发挥不同的生物学功能。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi(Tuschl T,Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotideintervals.Cell 2000；101:25-33.)。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard,Susan L.Thetherapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters 2005；579:5996-6007.)。

为了深入研究NLK在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取肺癌、乳腺癌和前列腺癌细胞模型，以RNAi为手段研究NLK在肺癌、乳腺癌和前列腺癌发生和发展中的作用。

发明内容

本发明的目的在于公开与人NLK(Nemo-like kinase)基因相关的治疗方法及药物。

本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了NLK基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了NLK基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

较佳的，所述NLK基因来源于人。

NLK基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平。

所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将NLK基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如可NLK基因为作用对象筛选获得的小分子干扰RNA，将之用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将NLK基因作为作用对象。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与NLK基因的表达相关的任一种肿瘤，例如选自：肺癌、乳腺癌和前列腺癌。

所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制NLK蛋白的表达或活性的分子。所述肿瘤治疗药物能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖、生长、增殖、分化和/或存活。

所述肿瘤治疗药物包括：核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或肽。

所述核酸包括：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。

所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有NLK基因的启动子序列或NLK基因的信息序列。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含正义链和反义链，所述正义链含有与NLK基因中的靶序列基本相同的核苷酸序列，且所述正义链和反义链共同形成RNA二聚体。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人NLK基因的表达。

所述shRNA可经载体表达，如将可转录该的shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后表达。

所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低NLK基因的转录或翻译，或者足够降低NLK蛋白的表达或活性的剂量。以使NLK基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子包含：

1)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；

2)或者shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；或者

所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与NLK基因中15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述第二链与第一链基本互补。较佳的，所述第一链与NLK基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述第一链与NLK基因中19、20或者21个连续的核苷酸基本相同。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA。

所述shRNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段与NLK基因中15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述反义RNA片段与正义RNA片段基本互补,且所述正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔。所述shRNA经酶切后可成为小干扰RNA进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NLK基因的表达的作用。较佳的，所述正义RNA片段与NLK基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述正义RNA片段与NLK基因中19、20或者21个连续的核苷酸基本相同。

所述shRNA的茎环片段的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义RNA片段与NLK基因中的靶序列基本相同。

所述NLK基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默NLK基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的NLK基因中的片段。

较佳的，所述NLK基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-39中之任一序列。

较佳的，所述NLK基因来源于人。

如本发明的实施例列举的，所述shRNA的序列含有SEQ ID NO:40。

GCAGCCGUCAUUACAGCAAUUCAAGAGAUUGCUGUAAUGACGGCUGC

本发明第三方面，公开了一种NLK基因干扰慢病毒载体，为含有编码所述shRNA的基因片段的慢病毒载体，能表达所述shRNA。

NLK基因干扰慢病毒载体可由将编码所述shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得。

所述NLK基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，并进而转录出所述shRNA。

所述NLK基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。

所述慢病毒载体可选自以下任一：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP和Lenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。

所述分离的寡核苷酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。

当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的双链RNA或shRNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第四方面，公开了一种NLK基因干扰慢病毒，为将能够在肿瘤细胞中经转录成为所述shRNA的核苷酸片段克隆入慢病毒载体后，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生特异性沉默NLK基因的所述小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

所述NLK基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。

本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物中含有所述的能够降低NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或NLK基因干扰慢病毒。

所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，可将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述肿瘤可选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。

采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

进一步的，采用该方法的对象为人。

本发明第六方面，公开了一种分离的降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子的靶标寡核苷酸片段，所述寡核苷酸序列含有选自SEQ ID NO 1-39之任一的序列。

本发明第七方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的NLK基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的寡核苷酸分子或所述的NLK基因干扰慢病毒。

本发明设计了针对人NLK基因的39个RNAi靶点序列，构建相应的NLK RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO 20的RNAi载体pGCSIL-GFP-siNLK能够显著下调NLK基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-siNLK能够靶向地将针对NLK基因的RNAi序列高效导入人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞，降低NLK基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖。因此慢病毒介导的NLK基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或者NLK基因干扰慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NLK基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。

图2表示Lv-siNLK慢病毒侵染人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞5天后，NLK mRNA的表达水平显著降低。

图3表示Lv-siNLK慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制。

图4表示Lv-siNLK慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，引起细胞增殖抑制。

图5表示Lv-siNLK慢病毒侵染人前列腺癌PC-3细胞5天后，引起细胞增殖抑制。

图6使用NLK抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果

A为乳腺癌，b、c、d为肺癌

图7浸染Lv-siNLK慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力检测结果

a瘤体体积 b瘤体大小

具体实施方式

发明人发现，采用RNAi方法下调人NLK基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，表明NLK基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对NLK基因的siRNA，筛选出了可有效抑制NLK的表达进而抑制人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人NLK基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默NLK基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人NLK基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调NLK基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明NLK基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默NLK基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人NLK基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人NLK基因编码区序列，预测siRNA位点，设计针对NLK基因的有效的siRNA序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与Age I和EcoR I限制性内切酶酶切的慢病毒载体连接产生短发卡RNA慢病毒质粒；将筛选得到的有效的短发卡RNA慢病毒质粒与慢病毒包装所需的辅助载体(Packing Mix，Sigma-aldrich公司)共转染293T细胞，包装表达NLK基因的重组慢病毒颗粒。收集细胞培养上清中的慢病毒颗粒，纯化浓缩，即制得纯净、稳定表达NLK siRNA的慢病毒(Lv-siNLK)。

基于上述方法，本发明提供了39个干扰NLK基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO 1-39所示)，构建了特异干扰人NLK基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种针对人NLK基因的RNAi慢病毒及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低NLK基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长。本研究表明，NLK基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，NLK基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的NLK基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：针对人NLK基因RNAi慢病毒的制备

1.构建针对人NLK基因的RNAi慢病毒质粒

从Genbank调取NLK(NM_016231)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对NLK基因的有效的siRNA靶点。在NLK基因的编码序列(CDS)区域内，每隔一个碱基起始获得19-21个碱基的序列，表1列出了其中39条针对NLK基因的有效siRNA靶点序列。

表1 靶向于人NLK基因的siRNA靶点序列

针对siRNA靶点(以SEQ ID NO 20为例)合成单链DNA Oligo序列，退火形成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo(表2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过Age I和EcoR I限制性内切酶将pGCSIL-GFP质粒酶切，使其线性化，反应体系如表3所示，反应条件：37℃，1h。

表3 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		质粒(1μg/μl)	2
buffer(10×)	5
		BSA(100×)	0.5
Age I(10U/μl)	1
		EcoR I(10U/μl)	1
H2O	40.5
		Total	50

通过T4 DNA连接酶将载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo在适当的缓冲体系中连接，反应体系如表4所示，反应条件：16℃，12h。

表4 连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA(100ng/μl)	1	1	1
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)	1	-	1
				T4噬菌体DNA连接酶缓冲液(10×)	1	1	1
T4噬菌体DNA连接酶	1	1	1
				dd H2O	16	17	16
Total	20	20	20

将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物(上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’)，进行PCR扩增实验，反应体系如表5所示，循环条件如表6所示。

表5 PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		Buffer(10×)	2
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1
		ddH2O	15.2
Total	20

表6 PCR反应循环条件

PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定为阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有NLK-siRNA-20(表1中SEQ ID NO 20)序列的RNAi载体，命名为pGCSIL-GFP-siNLK。

构建pGCSIL-GFP-siScr阴性对照质粒，RNAi阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，经在GenBank比对，不与人基因组任一段序列同源。构建pGCSIL-GFP-siScr阴性对照质粒时，针对Scr(scramble)siRNA靶点合成两端含AgeI和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表7),其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-siNLK。

表7 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

2.包装针对人NLK基因的RNAi慢病毒(Lv-siNLK)

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-siNLK的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％ CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至293T细胞的培养基中，37℃，5％ CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为慢病毒Lv-siNLK浓缩液。测定慢病毒浓缩液的滴度，分装后于-80度保存。同时制备阴性对照RNAi慢病毒(Lv-siScr)，包装和纯化方法同Lv-siNLK慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-siScr载体代替pGCSIL-GFP-siNLK载体。

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测NLK基因的沉默效率

处于对数生长期的人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺癌PC-3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI)值，加入适宜量的病毒(H1299的MOI＝10，PC-3和MCF-7的MOI＝20)，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA，反应体系见表7，反应条件：42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min，使逆转录酶失活。

表7 逆转录反应体系

试剂	体积(μl)
		RT buffer(5×)	4
10mM dNTPs	2
		RNasin	0.5
M-MLV-RTase	1
		DEPC H2O	3.5
Total	11

NLK基因的引物序列：上游引物为5’-ATCATCAGCACTCGCATCATC-3’，下游引物为5’-GACCAGACAACACCAAAGGC-3’。以管家基因GAPDH为内参，引物序列：上游引物为5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物为5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行定量检测，反应体系见表8。反应程序为：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

表8 Real-time PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		SYBR premix ex taq:	10
上游引物(2.5μM)	0.5
		下游引物(2.5μM)	0.5
cDNA	1.0
		ddH2O	8.0
Total	20

PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-^ΔΔCt分析法计算侵染了NLK mRNA的表达丰度。与侵染对照慢病毒(Lv-siScr)的细胞比较，实验组中人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和前列腺PC-3细胞的NLK mRNA表达水平分别下降了50.8％、83.4％和82.1％(图2)。

实施例3：检测侵染Lv-siNLK慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人肺癌H1299细胞、乳腺癌MCF-7细胞和人前列腺癌PC-3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI)值，加入适宜量的病毒(H1299的MOI＝10，MCF-7的MOI＝20，PC-3的MOI＝20)，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪(ThermoScientific)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics仪的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图3-图5所示)。结果表明，Lv-siNLK慢病毒侵染的人肺癌H1299细胞和乳腺癌MCF-7细胞和人前列腺癌PC-3细胞在体外培养5天后，活力细胞数分别下降了，84.4％、91.0％和88.5％，表明NLK基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

实施例4肿瘤细胞中NLK基因过表达的试验

组织样本：人乳腺癌，肺癌的组织样本NLK抗体：购自Sigma公司

试验方法：

取出组织芯片，将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟。然后对组织芯片脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯15分钟，二甲苯：乙醇＝1:1混液中，无水乙醇中，95％乙醇中，85％乙醇中，75％乙醇中，蒸馏水中依次浸泡10分钟；然后用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H₂O₂，室温封闭10分钟；抗原修复在微波炉里高火加热0.01M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，低火维持20分钟；自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡10分钟；10％血清(TBS配制)封闭30分钟；吸弃血清，勿洗加入NLK抗体(1：100稀释)孵育过夜；TBS洗2遍，每次5分钟；加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育60分钟；TBS洗4遍，每次5分钟；加入DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；用苏木浸30秒，清水漂洗7-8遍；脱水封片，于75％乙醇，85％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，二甲苯：乙醇＝1:1混液，二甲苯中，依次浸置5分钟；取出后，滴加30ul中性树胶，用盖玻片封片，晾干，观察结果，拍照。(结果如图6)

结果表明：

使用NLK抗体对不同肿瘤组织进行免疫组化表达检测，结果发现，在人乳腺癌，肺癌的组织样本中，都能发现nlk基因编码蛋白的高表达。图中深灰色代表表达阳性。基于此实验结果，认为可通过检测组织细胞nlk基因的表达来辅助诊断癌症。

实施例5：浸染Lv-siNLK慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力

处于对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI：20)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液。用一次性注射器将细胞悬液(2×10⁶cells/鼠)注射到5-6周龄雌性BALB/c裸鼠右侧腋窝。实验组注射感染Lv-siNLK慢病毒的MCF-7细胞，对照组注射感染Lv-siScr慢病毒的MCF-7细胞，每组6只裸鼠。注射后饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(一周)，然后用NightOWLⅡ983发光成像系统(BertholdTechnologies)测量瘤块的体积(如图7a)和重量(如图7b)。结果表明：实验组的肿瘤细胞体内成瘤能力远低于对照组。基于此实验结果，认为Lv-siNLK可以在体内抑制肿瘤细胞的增殖。

Claims (9)

1.人NLK基因在制备或筛选肺癌、乳腺癌和前列腺癌的肿瘤治疗药物，或者在制备肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一肿瘤诊断药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述NLK基因来源于人。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，NLK基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将NLK基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌中的一种或多种的组合。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制NLK蛋白的表达或活性的分子，所述肿瘤治疗药物能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖、生长、增殖、分化和/或存活。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物选自核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或肽中的一种或多种的组合。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低NLK基因的转录或翻译，或者足够降低NLK蛋白的表达或活性的剂量，以使NLK基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。