CN103421884A - 人fzr1基因的用途及其相关药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人FZR1基因的用途及其相关药物，具体公开了人FZR1基因在肿瘤治疗及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了针对人FZR1基因的分离的寡核苷酸分子、人FZR1基因干扰慢病毒载体、人FZR1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的寡核苷酸分子或者包含该寡核苷酸分子序列的慢病毒载体、慢病毒能够特异性抑制人FZR1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中FZR1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

人FZR1基因的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人FZR1基因的用途及其相关药物。

背景技术

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是生物进化中一项保守的防御机制，于1998年首先发现（Fire A,Xu S,Montgomery MK,Kostas SA,Driver SE,Mello CC.Potent and specificgenetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature.1998;391(6669):806-11.）。其本质是由双链RNA介导的与之同源的mRNA特异性降解，进而抑制相应基因表达的过程。由于其基因抑制效果确切，具有级联式放大效应和高穿透性等特点，因而在恶性肿瘤的研究中具有很好的应用前景（Angaji SA,Hedayati SS,Poor RH,Madani S,Poor S S,Panahi S.Application of RNA interference in treating human diseases.JGenet.2010;89(4):527-37.）。研究表明，长度为21-23nt的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi（Tuschl T，Zamore PD,Sharp PA,BartelDP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23nucleotide intervals.Cell 2000;101:25-33.）。因此，通过适当的技术生产特异性的siRNA并使其能有效地作用于靶基因的mRNA，即能实现基因沉默的目的。

细胞周期末期促进复合物（anaphase-promoting complex，APC）是由多种蛋白质组成的泛素连接酶E3，是细胞内主要的泛素蛋白酶小体系统，在几个关键的细胞生理过程中发挥着重要的作用，包括有丝分裂过程中DNA复制、细胞分化、细胞基因组的完整性和信号转导（Vogel G.Gold medal from cellular trash.Science.2004;306(5695):400-401.）。

哺乳动物细胞FZR1（fizzy/cell division cycle 20related 1）蛋白（也称为Cdh1）由fzr1基因编码，是APC的一个调节亚基，在有丝分裂晚期及G1期激活APC，使之与蛋白质连接并将泛素转移给底物，可使泛素化的底物被蛋白酶体降解（Peters JM.The anaphasepromoting complex/cyclosome:a machine designed to destroy.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2006;7,644-656.）。APC-Cdh1能识别的底物包括有丝分裂细胞周期蛋白（Cyclin A和B），有丝分裂激酶（Aurorakinases，PLK1，Nek2A），参与染色体分离的蛋白质（Securin，Sgo1），DNA复制蛋白（Geminin，Cdc6），一个F-box结构蛋白（SKP2）和转录因子（Ets2，FoxM1），在调控有丝分裂向G1期转化过程中发挥着关键作用（Manchado E,Eguren M,and MalumbresM.The anapha promoting complex/cyclosome(APC/C):cell-cycle-dependent and indepdentfunctions.Biochem.Soc.Trans.2010;38,65-71.Wasch R,Robbins JA,and Cross FR.Theemerging role of APC/CCdh 1in controlling differentiation,genomic stability and tumorsuppression.Oncogene 2010;29,1-10.）。

最近有研究显示APC和多种疾病有一定的联系，APC-CDH1底物，如CyclinA，PLK1，Aurora A，CDC20或SKP2，对细胞周期和基因组稳定性有影响。因此，有必要深入研究FZR1在肿瘤细胞恶性增殖中作用以及影响肿瘤细胞增殖的分子机制。

发明内容

本发明的目的在于公开与人FZR1(fizzy/cell division cycle 20related 1)基因相关的治疗方法及药物。

为了深入研究人FZR1基因在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取人肝癌SMMC7721细胞以及人胶质瘤U87细胞为模型，以RNAi为手段研究FZR1在上述肿瘤细胞的存活和凋亡命运中的作用。

本发明第一方面，公开了一种分离的FZR1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物的用途，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

较优的，所述FZR1基因来源于人。

所述将分离的FZR1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将FZR1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将FZR1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

所述将FZR1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将FZR1基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内FZR1基因的表达水平。

所述将FZR1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将FZR1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人FZR1基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的FZR1基因小分子干扰RNA（siRNA）即是以人FZR1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将FZR1基因及其蛋白作为作用对象。

所述将FZR1基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将FZR1基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与FZR1基因的表达相关的任一种肿瘤，更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：肝癌或胶质瘤。

所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制FZR1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制FZR1蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中FZR1基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。

所述肿瘤治疗药物可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。

所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有FZR1基因的启动子序列或人FZR1基因的信息序列。

所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人FZR1基因的转录或翻译，或者足够降低人FZR1蛋白的表达或活性的剂量。以使人FZR1基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。

采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人FZR1基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人FZR1基因表达水平的物质给药于患者。

本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中FZR1基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与FZR1基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与FZR1基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与FZR1基因中的靶序列基本相同。

进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与FZR1基因中靶序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA（siRNA）进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源FZR1基因表达的作用。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

进一步的，所述FZR1基因来源于人。

进一步的，所述FZR1基因的靶序列，为SEQ IDNO:1-11中任意一条序列。

所述FZR1基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默FZR1基因表达时，与所述siRNA互补结合的mRNA片段所对应的FZR1基因中的片段。

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。

更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：24所示，具体为：5’-GUGAAACUUCCACAGGAUUAAC-3’。SEQ ID NO：24所示的siRNA的第一链为以SEQID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人FZR1基因的小干扰RNA中的一条链，该第一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源FZR1基因表达的作用。

更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:12所示，具体为：5’-GUGAACUUCCACAGGAUUAACUUCAAGAGAGUUAAUCCUGUGGAAGUUCAC-3’。

shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人FZR1基因表达的作用。

所述分离的寡核苷酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为肝癌或胶质瘤。

当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的双链RNA或shRNA施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第三方面，公开了一种FZR1基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述的人FZR1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人FZR1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述FZR1基因干扰核酸构建体为FZR1基因干扰慢病毒载体。

该FZR1基因干扰慢病毒载体是将编码前述FZR1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述FZR1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默FZR1基因的表达。

编码所述FZR1基因shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO:1-11中之任一序列及其互补序列。

进一步的，所述FZR1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA 1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人FZR1基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-FZR 1-siRNA。

本发明第四方面，公开了一种FZR1基因干扰慢病毒，由前述FZR1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对FZR1基因的小分子干扰RNA，从而抑制肝癌、胶质瘤之任一肿瘤细胞的增殖。该FZR1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

本发明第五方面，还公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，FZR1基因干扰核酸构建体，和/或FZR1基因干扰慢病毒。

进一步的，所述药物组合物含有1～99wt%所述双链RNA、shRNA、FZR1基因干扰核酸构建体或FZR1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗肝癌、胶质瘤的肿瘤治疗药物中的应用。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，可将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。

本发明第六方面，公开了一种分离的FZR1基因的RNA干扰靶序列，为SEQ ID NO:1-11中任一序列。

所述分离的FZR1基因的RNA干扰靶序列，可应用于针对FZR1基因的siRNA的筛选与制备。

本发明还公开了FZR1基因的RNA干扰靶序列在制备治疗肝癌或胶质瘤的肿瘤治疗药物中的应用。

本发明第七方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的FZR1基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子、FZR1基因干扰核酸构建体，和/或所述的FZR1基因干扰慢病毒。

综上所述，本发明设计了针对人FZR1基因的11个RNAi靶点序列，构建相应的FZR1RNAi载体，其中针对靶序列SEQ ID NO:1的RNAi载体pGCSIL-GFP-FZR1-siRNA能够显著下调人FZR1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv）作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-FZR1-siRNA能够靶向地将针对FZR1基因的RNAi序列高效导入人肝癌SMMC7721细胞和胶质瘤U87细胞，降低FZR1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的人FZR1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的慢病毒载体、慢病毒能够特异性抑制人FZR1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中FZR1基因的表达，进而抑制肝癌、胶质瘤肿瘤细胞的生长，促进肝癌、胶质瘤肿瘤细胞凋亡，在肝癌、胶质瘤肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1：pGCSIL-GFP质粒DNA图谱

图2：siFZR1-Lentivirus慢病毒侵染人肝癌SMMC7721细胞和胶质瘤U87细胞5天后FZR1mRNA的表达水平

图3：siFZR1-Lentivirus慢病毒侵染人肝癌SMMC7721细胞5天后细胞增殖情况

图4：siFZR1-Lentivirus慢病毒侵染人胶质瘤U87细胞5天后细胞增殖情况

具体实施方式

本发明涉及了一组针对人FZR1基因的小分子干扰RNA（siRNA）序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人FZR1mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30（优选15-27，更优选19-23）个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的慢病毒载体，进一步包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源FZR1基因的表达。

发明人合成和测试了多种针对FZR1基因的siRNA，筛选出了可有效抑制FZR1的表达进而抑制人肝癌SMMC7721细胞、胶质瘤U87细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人FZR1基因的小干扰RNA（siRNA）序列，构建了可特异性沉默FZR1基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人FZR1基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调FZR1基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明FZR1基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默FZR1基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人FZR1基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人FZR1基因序列；预测siRNA位点；合成针对FZR1基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达FZR1基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体（Packing Mix，Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，包装表达FZR1基因的重组RNAi慢病毒颗粒。收集细胞培养上清中的慢病毒颗粒，纯化浓缩，即制得纯净、稳定表达FZR1siRNA的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了11个干扰FZR1基因的有效靶点（具体如SEQ ID NO 1-11所示），构建了特异干扰人FZR1基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种人FZR1基因RNAi慢病毒（FZR1-RNAi）及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低FZR1基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，FZR1基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，FZR1基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的FZR1基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如［美］Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：针对人FZR1基因RNAi慢病毒的制备

1.筛选针对人FZR1基因的有效的siRNA靶点

从Genbank调取FZR1（NM 001136198.1或NM 016263.3或NM 001136197.1）基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对FZR1基因（NM 001136198.1）的有效的siRNA靶点。在FZR1基因的编码序列（CDS）区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中11条针对FZR1基因的有效siRNA靶点序列。

表1靶向于人FZR1基因的siRNA靶点序列

2.慢病毒载体的制备

针对RNA干扰靶点（以SEQ ID NO：1为例）合成两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表2）；以AgeI和EcoRI限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体（上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1），使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体DNA和纯化好的双链DNAOligo连接，在适当的缓冲体系（连接体系如表5所示）中于16℃连接过夜，回收连接产物。

将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物（上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’（SEQ ID NO：13；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’（SEQ ID NO：14）），进行PCR鉴定实验（PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2）。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO.1的RNAi载体，命名为pGCSIL-GFP-FZR1-siRNA。

构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（SEQ ID NO：15）。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNAOligo序列（表3）,其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-FZR1-siRNA。

表3两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的双链DNA Oligo

表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

表5载体DNA和双链DNAOligo连接反应体系

表6-1PCR反应体系

表6-2PCR反应体系程序设定

3.慢病毒包装

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取步骤1制备的RNAi质粒pGCSIL-GFP-FZR1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。

转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5%CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix（PVM）20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。

将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5%CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore）纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（1）4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2）0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3）4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；（4）离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；（5）把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有能表达如SEQID NO:12所示shRNA的病毒颗粒，并且该病毒表达的shRNA（SEQ ID NO:12）在体内经过加工后，可以获得siRNA（第一链序列如SEQ ID NO:24所示）。

对照慢病毒的包装过程同FZR1-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-FZR1-siRNA载体。

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测FZR1基因的沉默效率

处于对数生长期的人肝癌SMMC7721细胞和胶质瘤U87细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，SMMC7721:10，U87:10）值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA（逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活）。

采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA）进行实时定量检测。FZR1基因的引物如下：上游引物5’-CCACCTCAGACAACGGCAAA-3’（SEQ ID NO：16）和下游引物5’-GGGAGACAGGGAGTAGGGAGAC-3’（SEQ ID NO：17）。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（SEQ ID NO：18）和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（SEQ ID NO：19）。按表8中的比例配置反应体系。

表7逆转录反应体系

表8Real-time PCR反应体系

设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-^ΔΔCt分析法计算侵染了FZR1mRNA的表达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA）的细胞作为对照。实验结果（图2）表明，人肝癌SMMC7721细胞和胶质瘤U87细胞中FZR1mRNA的表达水平显著降低，分别下调了73.9%和76.9%。

实施例3检测侵染FZR1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人肝癌SMMC7721细胞和胶质瘤U87细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，SMMC7721:10，U87:10），加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2×10⁴/ml），以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5%CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（ThermoFisher）检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果如图3、图4所示）。

结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了76.0%和84.8%，表明FZR1基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

Claims (17)

1.一种分离的人FZR1基因在制备或筛选肝癌、胶质瘤之任一的肿瘤治疗药物中的用途。

2.一种降低肿瘤细胞中FZR1基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与FZR1基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与FZR1基因杂交的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与FZR1基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与FZR1基因中的靶序列基本相同。

4.如权利要求2-3任一权利要求所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述FZR1基因来源于人。

5.如权利要求4所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述FZR1基因的靶序列，为SEQID NO:1-11中任一序列。

6.如权利要求4所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO:24所示。

7.如权利要求4所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:12所示。

8.一种FZR1基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求2-7任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

9.如权利要求8所述FZR1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述FZR1基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。

10.如权利要求9所述FZR1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。

11.如权利要求9或10所述FZR1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP 1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

12.一种FZR1基因干扰慢病毒，由权利要求9-11任一权利要求所述干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

13.一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求2-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-11任一权利要求所述FZR1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求12所述的FZR1基因干扰慢病毒。

14.权利要求13所述药物组合物在制备治疗肝癌或胶质瘤之任一肿瘤治疗药物中的应用。

15.一种分离的FZR1基因的RNA干扰靶序列，为SEQ ID NO:1-11中任一序列。

16.权利要求15所述的FZR1基因的RNA干扰靶序列在制备治疗肝癌、胶质瘤之任一的肿瘤治疗药物中的应用。

17.一种用于降低肿瘤细胞中FZR1基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的，权利要求2-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-11任一权利要求所述FZR1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求12所述的FZR1基因干扰慢病毒。

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