CN115737841A - 一种用于增强t细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用。该基因纳米药物通过超声双乳化等方法将可以增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因激活工具CRISPRa表达质粒或基因过表达质粒包载到阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒当中。此基因纳米药物不仅可以通过调节纳米颗粒的阳离子脂质种类、电势以及PEG密度等特性提升其在肿瘤中的富集与内化；并且通过向质粒中引入肿瘤特异性启动子，可实现肿瘤部位趋化因子以及免疫检查点阻断剂等免疫效应分子的特异性表达。因而此基因纳米药物可以高效、特异且安全地增强肿瘤部位T细胞的浸润与活化等抗肿瘤免疫效应，在多种实体瘤的治疗中有良好的应用前景。

Description

一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制 备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物及其制备方法与应用。

背景技术

癌症是全球性的公共健康问题，已成为我国第一大死因，严重威胁着我国居民的健康。近年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，其中T细胞扮演着关键角色。T细胞主要通过识别抗原提呈细胞提呈的肿瘤抗原、动员后向肿瘤部位迁移浸润、识别肿瘤细胞后活化并发挥细胞毒性作用进行肿瘤杀伤。研究人员已开发出多种策略增强T细胞抗肿瘤作用，例如免疫检查点抗体阻断、CAR-T细胞疗法等，但这些免疫疗法的临床效果并不乐观。这是因为多数实体瘤属于T细胞难以浸润的“冷”肿瘤、抗体药物难以高效进入肿瘤组织，并且药物非特异作用会引发免疫相关不良反应等，极大地限制了T细胞抗肿瘤免疫功能的效果。因此，亟需发展增强T细胞抗肿瘤免疫作用的新策略。

在肿瘤杀伤过程中，T细胞(效应T细胞为主)的浸润主要依靠细胞表面的趋化因子受体CXCR3，接收肿瘤组织表达的趋化因子的信号，包括趋化因子配体9(CXCL9)、趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子配体11(CXCL11)等，向实体瘤内浸润。然而，多种实体瘤都会下调这些趋化因子的表达，抑制T细胞向实体瘤浸润。已有研究人员通过瘤内注射趋化因子重组蛋白或系统注射趋化因子病毒表达载体提升T细胞向肿瘤浸润。免疫检查点抗体药物可以高效解除免疫检查点信号通路对T细胞杀伤功能的抑制，但传统抗体药物给药方式为全身给药，会导致其在肿瘤组织中的利用率较低，且在非肿瘤部位会引起不良反应。已有研究人员利用局部给药或靶向给药系统提升抗体药物的肿瘤富集。如何增加T细胞的趋化与活化提升T细胞抗肿瘤效应，为肿瘤免疫治疗的关键点。

CRISPR介导的基因激活工具CRISPRa表达质粒通过表达失活核酸内切酶dCas9结合不同引导RNA(gRNA)将转录激活因子招募至转录起始位点，可以成千上万倍地激活多种内源基因的表达。目前已有多种研究通过CRISPRa上调特定基因表达进行不同疾病的治疗。基因过表达质粒可以通过过表达一种或多种特定基因从而同时增加一种或多种功能蛋白的水平。它是一种有力的基因治疗工具，已在恶性肿瘤、遗传病、感染性疾病、心血管疾病以及自身免疫疾病等中取得了一定的效果。利用CRISPRa上调肿瘤细胞趋化因子的表达或利用基因过表达质粒驱使肿瘤细胞高效表达趋化因子与免疫检查点阻断剂有望增强T细胞向实体瘤的定向浸润与活化，提升抗肿瘤疗效，但CRISPRa质粒以及基因过表达质粒在实际应用中还存在许多限制因素。

首先，常用的CRISPRa系统有多种，以激活效果最强的dCas9-SAM系统为例，整个系统包括165kDa的dCas9转录激活域融合蛋白dCas9-VP64、161bp的内源基因特异性MS2gRNA、46kDa的转录激活辅助蛋白MS2-p65-HSF1。整个系统的核苷酸数量超过5.8kb，而常用的病毒载体的包装容量有限，大多不超过4.7kb。病毒载体递送时需要将此系统进行拆分，以三质粒的形式进行包装，大大地降低了基因表达效率。另外，病毒元件具有免疫原性，会引起免疫相关反应；病毒存在随机整合到基因组的致癌风险；病毒设计复杂且难以规模化生产。基因过表达质粒在进行多基因表达时也会面临以上问题。其次，常用的质粒表达骨架均使用强启动子如CMV、CBh或EF1α启动子驱动目的基因表达，这种方式不具有细胞或组织特异性，进入体内也会对除肿瘤组织外的正常组织进行非特异地基因操纵，从而引发不良反应。

综上，如何利用基因激活工具CRISPRa或基因过表达质粒高效且特异、安全地增强肿瘤细胞趋化因子以及免疫检查点阻断剂的表达，增强T细胞的趋化与活化，提升T细胞介导的抗肿瘤免疫效应仍有待实现进一步突破。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是开发一种基因纳米药物可实现基因激活工具CRISPRa质粒或基因过表达质粒向肿瘤细胞的高效递送以及肿瘤特异性基因表达，显著提升T细胞向肿瘤中的定向浸润以及活化杀伤作用，从而增强T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗效果。且此方法简单便捷、高效特异且安全，具有良好的应用潜力。

具体技术方案如下：

一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，包括质粒和阳离子脂质辅助纳米颗粒，所述质粒为增强T细胞免疫相效应相关基因表达质粒，所述阳离子脂质辅助纳米颗粒为阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒。

进一步，所述质粒为基因激活工具CRISPRa质粒和基因过表达质粒中的至少一种。CRISPRa为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Activation的缩写，即规律成簇间隔短回文重复基因转录激活工具。

进一步，质粒启动子为强启动子或肿瘤特异性启动子其中至少一种。

进一步，所述强启动子为巨细胞病毒CMV启动子、鸡β-肌动蛋白CBh启动子、延伸因子-1αEF1α启动子中的一种；肿瘤特异性启动子为酪氨酸酶Tyr启动子、生存素Sur启动子中的至少一种。强启动子驱动的基因表达没有选择性，在多种细胞中均具有基因表达作用；肿瘤特异性启动子选择性驱动肿瘤细胞的基因转录与表达，而对其他正常细胞无作用。酪氨酸酶启动子可以实现黑色素瘤特异性基因表达，生存素启动子则可以实现多种肿瘤的特异性基因表达。

进一步，所述基因激活工具CRISPRa质粒为靶向激活趋化因子配体9(CXCL9)的CRISPRa质粒、靶向激活趋化因子配体10(CXCL10)的CRISPRa质粒、靶向激活趋化因子配体11(CXCL11)的CRISPRa质粒中的至少一种；所述基因过表达质粒为趋化因子配体9(CXCL9)、抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD L1 scFv)表达质粒中的至少一种。

进一步，所述质粒为人源、鼠源基因的至少一种。

进一步，所述基因激活工具CRISPRa质粒包括两个质粒，其中一个质粒包括靶向趋化因子配体9(CXCL9)，趋化因子配体10(CXCL10)，趋化因子配体11(CXCL11)的具有噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构的引导RNA(MS2gRNA)以及失活核酸内切酶dCas9与转录激活因子VP64融合表达质粒(即质粒元件dCas9-VP64)，另一个质粒包括转录辅助激活蛋白噬菌体MS2外壳蛋白、NF-κB转录因子p65蛋白及热休克调节蛋白HSF1蛋白融合表达质粒(即质粒元件MS2-p65-HSF1)；基因过表达质粒序列为趋化因子配体9(CXCL9)与抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD-L1 scFv)通过P2A切割肽连接而成的一个共表达质粒。质粒元件dCas9-VP64与MS2gRNA构建pgCXCL-dCas9质粒。质粒元件MS2-p65-HSF1构建pMPH质粒。

进一步，所述质粒的终止子为bGH polyA。

进一步，所述阳离子脂质辅助纳米颗粒中的脂质为阳离子胆固醇衍生物、烷基链阳离子脂质中的至少一种。

进一步，所述阳离子胆固醇衍生物为N，N-双(2-羟乙基)-N-甲基-N-(2-胆固醇氧羰基氨基乙基)溴化铵(BHEM-Chol)、实验室合成阳离子胆固醇衍生物CL3、实验室合成阳离子胆固醇衍生物CL7中的至少一种，所述烷基链阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、实验室合成烷基链阳离子脂质AL6、实验室合成烷基链阳离子脂质AL7中的至少一种。

进一步，阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒中的聚合物为聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-b-PLGA)以及聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)中的至少一种。

进一步，阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒中的聚合物为聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-b-PLGA)以及聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)，聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-b-PLGA)占全部聚合物比例范围为60％-100％。

进一步，所述阳离子脂质辅助纳米颗粒的平均粒径为50nm-200nm。

一种所述的于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，将增强T细胞抗肿瘤免疫效应质粒与水溶液混合；将脂质、聚乙二醇修饰的聚酯、聚酯与三氯甲烷有机溶剂混合，得油相；

步骤二，将油相和水相制备成水包油包水的乳剂；

步骤三，将乳剂浓缩后得基因纳米药物。

进一步，增强T细胞抗肿瘤免疫效应质粒在水相中的浓度为1-4mg/ml；聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-b-PLGA)或聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)在油相中的浓度为62.5mg/ml；脂质在油相中的浓度为10-30mg/ml。

进一步，将油相和水相制备成水包油包水的乳剂的方法为超声乳化法、微流控、微通道反应法至少一种；乳剂浓缩的方法为旋转蒸发、冷冻干燥中的至少一种。

一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物通过增强T细胞趋化与活化作用用于提升T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗疗效。

一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物与免疫检查点阻断疗法或CAR-T细胞疗法联合应用于增强抗肿瘤免疫疗效。

质粒可以强效提升特定目的基因的表达量。质粒为强启动子或肿瘤特异性启动子驱动的质粒。T细胞主要依靠其表面的趋化因子受体CXCR3感知肿瘤组织中趋化因子配体9(CXCL9)、趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子配体11(CXCL11)的信号，顺外周组织与肿瘤组织中趋化因子的浓度差向肿瘤组织定向迁移与浸润。利用基因激活工具CRISPRa可以同时激活肿瘤细胞趋化因子配体9(CXCL9)、趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子配体11(CXCL11)的表达，形成显著的趋化因子浓度梯度，诱导大量T细胞向肿瘤浸润从而进行肿瘤杀伤。利用基因过表达质粒同时提升肿瘤细胞趋化因子配体9(CXCL9)、抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD-L1 scFv)的表达，不仅可以增强T细胞向肿瘤部位的定向浸润，同时肿瘤细胞表面的PD-L1这一免疫检查点可以被抗PD-L1 scFv高效阻断从而增强肿瘤浸润T细胞活化与肿瘤杀伤功能。在临床前研究时，选择使用鼠源基因，而在实际临床应用时，如果用于人体治疗，则使用人源基因。相比于之前dCas9-SAM三质粒的慢病毒表达系统，所述基因激活工具CRISPRa双质粒表达系统表达效率更高、应用更加灵活，降低了质粒自身的免疫原性。所述基因过表达质粒序列趋化因子配体9(CXCL9)、抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD-L1 scFv)由一个质粒进行共表达，可以同时增强T细胞的趋化与活化，具有相互协同作用；另外，趋化因子配体9(CXCL9)、抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD-L1 scFv)序列间由P2A切割肽进行连接，不会影响各自的表达效率及蛋白功能。质粒终止子为bGH polyA，在真核细胞中可以实现更加有效的聚腺苷酸化和转录终止。阳离子脂质优选为DOTAP，其辅助形成的纳米颗粒具有更高的质粒包封率、更好的细胞摄取效果以及更强的质粒转染效果。所述聚乙二醇修饰的聚酯占全部聚合物比例范围为60％-100％。优选比例为100％，其聚乙二醇(PEG)密度最高，在体内循环时间持久且在细胞内快速释放质粒。所述纳米颗粒的平均粒径为50nm-200nm。优选地，粒径范围在80nm-120nm，纳米颗粒可以更高效地在肿瘤部位富集。

本发明用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，可以提升肿瘤细胞的趋化因子以及免疫检查点阻断剂的表达，从而招募T细胞向肿瘤组织定向浸润，解除免疫检查点对T细胞的抑制，增强T细胞对肿瘤的杀伤效应。此基因纳米药物具有肿瘤特异性可增强T细胞对特定肿瘤或多种实体瘤的抗肿瘤免疫反应。

本发明用于增强T细胞趋化与活化的基因纳米药物还可以与其他肿瘤免疫疗法联用，起到协同增效的作用。与免疫检查点阻断抗体药物联用，可以增加T细胞向肿瘤部位地浸润，从而提升ICB抗体药物的响应性。另外，与CAR-T细胞疗法联用可以改善CAR-T细胞在实体瘤中浸润不足的问题，从而增强CAR-T细胞对实体瘤的杀伤效果。

设计了一种可以用于高效激活趋化因子等表达的便于非病毒载体递送的质粒系统。该质粒系统去掉了用于病毒转导的元件，使用短小的连接肽代替，从而实现将三质粒系统优化精简为二质粒系统；同时，设计的质粒中将报告基因使用T2A切割肽序列连接至激活元件后表达，实现激活元件和报告基因的共表达；并且，在设计时，将报告基因连接至激活元件的后方，便于表征激活元件的表达二又不影响激活元件的功能。

设计了一种可以同时高效提升趋化因子与免疫检查点阻断剂等表达的便于非病毒载体递送的质粒系统。该质粒利用P2A切割肽将趋化因子配体9(CXCL9)以及抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD-L1 scFv)等多个基因序列进行连接，实现单个质粒的多基因表达。

利用肿瘤特异性启动子酪氨酸酶启动子或生存素启动子驱动基因激活工具CRISPRa质粒或基因过表达质粒在肿瘤细胞特异性表达，高效且特异性地提升肿瘤细胞趋化因子配体9(CXCL9)，趋化因子配体10(CXCL10)，趋化因子配体11(CXCL11)，抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段(抗PD-L1 scFv)等免疫效应分子的表达。

利用实验室开发的阳离子脂质辅助纳米颗粒(CLAN)在体内递送肿瘤特异性基因激活工具CRISPRa质粒或基因过表达质粒。

在现有CLAN的制备工艺上，通过调控阳离子脂质的种类与掺入量以及聚乙二醇修饰的聚酯与聚酯的掺入比例制备了一系列具有不同电荷、表面聚乙二醇(PEG)密度等纳米特性的CLAN载体库。通过材料库组合通量筛选，优选肿瘤高效递送基因激活工具CRISPRa质粒或基因过表达质粒的CLAN纳米颗粒。

设计了一种肿瘤特异性的基因激活纳米药物或基因纳米药物，此类药物经系统给药后可以在体内特异性地提升肿瘤部位趋化因子以及免疫检查点阻断剂的表达，而在其他正常组织中几乎无作用，从而有效诱导T细胞的迁移浸润及活化杀伤。

提供了一种用于增强T细胞趋化与活化的基因纳米药物，显著提升肿瘤免疫治疗、免疫检查点阻断疗法以及CAR-T细胞疗法疗效。

与现有技术相比，本发明具有一下有益效果：

纳米载体是尺寸在1～1000nm以内的非病毒递送载体，可以帮助质粒克服体内递送障碍，增加质粒药物的生物相容性和安全性，在肿瘤细胞中进行转运、分布，最终发挥基因表达作用。但纳米颗粒仅能相对地提升质粒药物在肿瘤中的富集，也会将质粒递送到肝脏、肾脏以及肺脏等器官组织当中。这种非特异性的质粒药物递送会导致药物的利用率低以及在正常器官中引发免疫相关不良反应。

肿瘤特异性启动子在肿瘤细胞中有特异的转录活性，而在正常细胞中无转录活性，这为治疗基因高效地在肿瘤细胞中特异性的表达提供了可能。酪氨酸酶是黑色素合成中的限速酶，在产生色素的细胞中特异性表达，通过使用酪氨酸酶启动子可以实现转基因的黑色素瘤特异性表达。生存素在多种癌症的生长和进展中起重要作用，该启动子可以在多种肿瘤细胞中实现基因的表达。

本发明利用阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒递送质粒，通过亲疏水相互作用形成水包油包水的双乳化纳米颗粒，将质粒包载在内核当中，具有优异的稳定性，聚乙二醇(PEG)壳层可在体内实现长循环，纳米级(约100nm)的尺寸可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)增加颗粒在肿瘤中的富集，阳离子脂质可以辅助纳米颗粒被细胞摄取。并且，通过调整阳离子脂质种类、掺入量以及聚乙二醇修饰聚酯的掺入比例等，建立具有不同电势以及不同PEG密度的纳米颗粒材料库，可以进一步筛选出靶向肿瘤组织高效递送质粒的纳米颗粒。

本发明的CRISPRa质粒设计精巧，实现将三质粒系统优化精简为二质粒系统，便于非病毒载体递送的使用，并且提高了表达效率和将所有激活元件递送至同一细胞中的概率；将报告基因引入至激活元件后，不仅精简了结构，而且提升了报告目的基因表达的准确性。

本发明中的基因激活CRISPRa质粒或基因过表达质粒具有独特性，使用酪氨酸酶启动子或生存素启动子等肿瘤特异性启动子驱动质粒表达。将上述质粒分别包载在CLAN纳米颗粒当中形成基因激活纳米药物或基因纳米药物，经体内系统给药后纳米药物会在肿瘤中富集，但也会有少部分进入到正常组织当中。由于肿瘤特异性启动子具有选择性转录活性，使得CRISPRa元件或基因过表达质粒仅在肿瘤细胞中表达，赋予纳米药物精准的肿瘤特异性性质，实现基因药物在肿瘤处特异性发挥效用。并且该药物可以装载更大容量的基因激活质粒或基因过表达质粒。

本发明特异性提升肿瘤细胞趋化因子以及免疫检查点阻断剂等免疫效应分子的表达。肿瘤特异性地分泌大量趋化因子，可在肿瘤组织与外周组织之间形成显著的趋化因子浓度梯度，促使效应T细胞向肿瘤组织定向浸润；肿瘤分泌的细胞程序性死亡配体1(PD-L1)阻断剂可以邻近高效地封闭肿瘤表面PD-L1免疫检查点，增强肿瘤浸润T细胞的活化以及对肿瘤的杀伤作用。利用这种方法，同时增强了肿瘤浸润T细胞的趋化与活化，提升T细胞介导的抗肿瘤免疫效力，并改善肿瘤微环境，高效特异地增强肿瘤免疫治疗效果。

本发明无论肿瘤病人异质性如何，均可在多种实体瘤中增强肿瘤免疫疗效，且可与免疫检查点阻断疗法以及CAR-T细胞疗法联用增强疗效，具有巨大的临床应用前景。

本发明的脂质辅助纳米颗粒是由FDA批准的高分子聚酯和脂质组装而成，具有优异的生物相容性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.不同聚合物和阳离子脂质含量的纳米颗粒配方图；

图2.不同聚合物和阳离子脂质含量的纳米颗粒电势与粒径表征结果图；

图3.不同聚合物和阳离子脂质含量的纳米颗粒转染效率测定结果图；

图4.不同阳离子脂质的结构式；

图5.不同阳离子脂质种类的纳米颗粒电势与粒径表征结果图；

图6.不同阳离子脂质种类的纳米颗粒转染效率测定结果图；

图7.基因激活质粒系统pCRISPRa图谱；

图8.基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa的粒径、电势及形貌表征结果图；

图9.基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa增强多种肿瘤细胞CXCL9，CXCL10，CXCL11的mRNA表达水平检测结果图；

图10.基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa增强多种肿瘤细胞CXCL9，CXCL10，CXCL11的蛋白表达水平检测结果图；

图11.基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa体外增强T细胞迁移检测结果图；

图12.基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa体内瘤内注射增强T细胞浸润、抑制多种肿瘤生长检测结果图；

图13.基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa尾静脉注射后体内肿瘤和脏器分布结果图；

图14.肿瘤特异性基因激活质粒系统pTyr-CRISPRa图谱；

图15.肿瘤特异性基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa体内特异性增强肿瘤中趋化因子表达、T细胞浸润检测结果图；

图16.肿瘤特异性基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa体内抑制黑色素瘤生长、特异性增强肿瘤组织中T细胞浸润检测结果图；

图17.肿瘤特异性基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa增强ICB疗法抗肿瘤疗效检测结果图；

图18.肿瘤特异性基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa增强CAR-T细胞疗法抗实体瘤疗效检测结果图；

图19.肿瘤特异性基因表达质粒pTyr-C9AP、pSur-C9AP图谱；

图20.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP的粒径、电势、形貌及稳定性表征结果图；

图21.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP、CLAN_pSur-C9AP介导的肿瘤特异性基因表达定量PCR检测结果图；

图22.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP促使肿瘤细胞表达CXCL9与αPD-L1scFv蛋白的检测结果图；

图23.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP在体外增强T细胞浸润与杀伤功能检测结果图；

图24.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP体内特异性表达检测结果图；

图25.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP在体内抑制黑色素瘤生长、增强T细胞浸润与活化的检测结果图；

图26.肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pSur-C9AP在体内抑制多种肿瘤生长、增强T细胞浸润与活化的检测结果图；

图27为本发明增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物的设计方案图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所用原料来源：

聚酯材料购于西安瑞禧生物科技有限公司；

DOTAP购于艾伟拓医药科技有限公司；

三氯甲烷购于国药集团化学试剂有限公司；

B16-F10、CT26、Panc02、4T1、C2C12、NIH-3T3、DC2.4、RAW264.7细胞购自ATCC；

CD8分选磁珠购于Miltenyi Biotec公司；

BV510-anti mouse CD45、APC anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD8、BV785anti-mouse CD8a、BV605 anti-mouse CD69流式抗体购于Biolegend公司；

Anti-His tag抗体购于Abcam公司；

Anti-βactin抗体购于Biosharp公司；

小鼠CXCL9,CXCL10,CXCL11 ELISA试剂盒购于Abcam公司；

DiI细胞膜染料购于美仑生物公司。

实施例中所用仪器型号及公司：

超声波细胞破碎仪：型号为VCX130，美国Sonics公司；

台式微量冷冻离心机：型号为Microfuge 20R，美国Beckman公司；

纳米粒度及Zeta电位仪：型号为Nano ZSE，英国Malvern公司；

旋转蒸发仪：型号为RV10 digital V数显型，德国IKA公司；

透射电子显微镜：型号为Talos L120C，美国Thermo Fisher公司；

分析型流式细胞仪：型号为FACSCelesta，美国BD公司；

激光共聚焦显微镜：型号为LSM 880,德国ZEISS公司；

荧光定量PCR仪：型号为LightCycler96，美国Roche公司；

化学发光成像仪：型号为ChemiDoc MP，美国Bio-RAD公司；

酶标仪：型号为800TS，美国Bio Tek公司。

实施例1、不同PEG_5k-b-PLGA_11k质量分数以及阳离子脂质含量的阳离子脂质辅助纳米颗粒的制备及纳米库的构建与表征

配制聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG_5k-b-PLGA_11k)的三氯甲烷溶液，浓度为25，22.5，20，15mg/mL，配制聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA_11k)的三氯甲烷溶液，有助于聚合物材料溶解以及更充分的乳化，浓度为0，2.5，5，10mg/mL将上述两组分进行混合，形成PEG_5k-b-PLGA_11k质量分数为100％，90％，80％，60％的聚合物三氯甲烷溶液。配制阳离子脂质BHEM-Chol的三氯甲烷溶液，浓度为1，1.5，2，3mg/mL。取400μL的不同PEG_5k-b-PLGA_11k质量分数的聚合物三氯甲烷溶液以及100μL的不同浓度的BHEM-Chol三氯甲烷溶液于50mL离心管中，取100μg的增强T细胞抗肿瘤免疫效应的质粒溶解在25μL的水溶液中并加入离心管中，利用超声波细胞破碎仪进行乳化；超声功率65W,振幅为30％，超声5s停2s,总共超声时间为1min；再加入5mL DEPC水，继续超声，超声功率65W,振幅为30％，超声10s停2s,总共超声时间为2min；超声结束后将乳液转移至50mL的圆底烧瓶，利用旋转蒸发仪，按照真空度120，100，80，60，40mbar的顺序依次保持2min去除三氯甲烷，最后降至25mbar后在37℃水浴条件下旋蒸浓缩至1至2mL后收集阳离子辅助纳米颗粒备用。我们将此纳米库中的纳米颗粒以图1中的方式命名。

取实施例1中的纳米颗粒，利用纳米粒度及Zeta电位仪，于样品池中检测纳米颗粒水化直径，对应的纳米颗粒粒径以及Zeta电位分布图如图2所示。PEG_5k-b-PLGA_11k在聚合物中质量分数的变化对粒径无明显影响，颗粒电势与阳离子脂质的含量成正比。

将B16-F10黑色素瘤细胞进行种板，待细胞密度长至约70％-80％时准备转染。将原有培养基换为基础培养基后加入包含1μg质粒的纳米库中不同特性的纳米颗粒，转染6h后换液为完全培养基。转染48h后消化收取B16-F10细胞进行流式细胞分析，结果如图3所示，转染效果的差异主要来源于阳离子脂质的含量。

实施例2、不同阳离子脂质种类的阳离子脂质辅助纳米库的制备与表征

上述结果可知阳离子脂质对纳米颗粒进行细胞转染的影响显著，接下来利用不同阳离子脂质构建阳离子脂质纳米库。按照实施例1中的制备方法，向50mL离心管中加入400μL浓度为62.5mg/mL的PEG_5k-b-PLGA_11k三氯甲烷溶液，100μL浓度为20mg/mL的不同阳离子脂质，如图4所示，包括BHEM-Chol、实验室合成阳离子胆固醇衍生物CL3,CL7中以及烷基链阳离子脂质DOTAP、实验室合成烷基链阳离子脂质AL6,AL7的三氯甲烷溶液，并加入25μL浓度为4μg/μL的质粒水溶液，利用超声双乳化法构建包含不同阳离子脂质种类的基因纳米药物库。

取上述各颗粒，利用纳米粒度及Zeta电位仪，于样品池中检测纳米颗粒水化直径，对应的纳米颗粒粒径以及Zeta电位分布图如图5所示。

将B16-F10细胞进行种板，待细胞密度长至约70％-80％时准备转染。将原有培养基换为基础培养基后加入包含1μg质粒的纳米库中不同阳离子脂质种类的纳米颗粒，转染6h后换液为完全培养基，转染48h后收取细胞进行流式细胞分析。结果如图6所示，DOTAP阳离子脂质辅助的纳米颗粒的质粒递送能力最强。

实施例3、非病毒载体递送的可激活趋化因子表达的CRISPRa基因激活质粒构建

将文献Konermann S,et al.Nature.2015Jan 29；517(7536):583-8.中失活核酸内切酶与转录转录激活因子即dCas9-VP64元件(Addgene，61422)与包含噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构的引导RNA即MS2gRNA元件(Addgene，61424)构建到一个表达质粒当中，将转录辅助激活蛋白噬菌体MS2外壳蛋白、NF-κB转录因子p65蛋白及热休克调节蛋白HSF1即MS2-p65-HSF1元件(Addgene，61426)构建到另一个质粒当中，质粒骨架为pX330质粒(Addgene，42230)，得到质粒结构精简的、用于聚合物载体递送的基因激活双质粒表达系统。构建基因激活质粒所需的元件由上海生工生物工程公司合成。使用AflIII、KpnI、AgeI、EcoRI限制性内切酶和T4连接酶，将dCas9-VP64元件和MS2gRNA元件构建至同一个质粒中，得到pgCXCL-dCas9质粒，如图7A，该表达质粒的主要元件包含Ori复制起始位点、U6启动子、激活趋化因子配体9(CXCL9)，趋化因子配体10(CXCL10)，趋化因子配体11(CXCL11)表达的MS2gRNA、CBh启动子、dCas9-VP64、T2A、报告基因EGFP、氨苄抗性基因；使用AflIII、KpnI、AgeI、EcoRI限制性内切酶和T4连接酶，将用于结构精简的linker和MS2-p65-HSF1构建至另一个质粒中，得到pMPH质粒，如图7B，该表达质粒的主要元件包含Ori复制起始位点、CBh启动子、MS2-p65-HSF1、T2A、报告基因tdTomato、氨苄抗性基因。其中，可以激活CXCL9，CXCL10，CXCL11表达的MS2gRNA由https://zlab.bio/guide-design-resources网站设计。pgCXCL-dCas9质粒和pMPH质粒共同构成pCRISPRa基因激活系统质粒。

实施例4、基因激活纳米药物的制备与形貌表征

按照实施例1中的制备方法，向50ml离心管中加入400μl浓度为62.5mg ml^-1的PEG_5k-b-PLGA_11k三氯甲烷溶液，100μl浓度为20mg ml^-1的BHEM-Chol阳离子脂质，并加入25μl浓度为4μgμl^-1的pCRISPRa水溶液，利用超声双乳化法制备基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa，使用旋蒸法将制备得到的基因激活纳米药物浓缩至0.5ml。

取制备好的CLAN_pCRISPRa于样品池中，利用纳米粒度及Zeta电位仪进行表征，检测纳米颗粒水化直径，对应的纳米颗粒粒径以及Zeta电位分布图如图8A所示。此种基因激活药物为纳米级尺寸，粒径分布均一且带有正电性。

取制备好的CLAN_pCRISPRa用超纯水稀释50倍后超声分散颗粒，取10μl颗粒溶液滴加至铜网上，停留1分钟后使用滤纸吸尽液体，再在铜网上滴加10μl的2％磷钨酸溶液，染色30s后吸尽液体，充分自然干燥后进行冷冻透射电镜拍摄。如图8B所示，此种基因激活纳米药物为具有聚乙二醇(PEG)壳层的纳米级球形结构。

实施例5、基因激活纳米药物体外激活趋化因子表达

在24孔板中每孔接种1×10⁵个B16-F10、Panc02、CT26或4T1肿瘤细胞，待细胞汇合度达到50％时进行转染。弃去24孔板中的旧培养基，更换为无双抗的基础培养基。用10×PBS将制备的基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa调整为等渗溶液，每孔加入质粒含量为500ng的CLAN_pCRISPRa，轻轻摇匀后放置培养箱中孵育6小时后，更换为新鲜的完全培养基。72小时后收集培养上清和细胞，用于后续检测。

mRNA水平表征：将收集的细胞加入RNAiso plus提取总RNA，使用PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser将总RNA逆转录成cDNA，通过qRT-PCR检测基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa激活肿瘤细胞中CXCL9，CXCL10，CXCL11的mRNA表达水平。如图9所示，CLAN_pCRISPRa可以高效激活B16-F10、Panc02、CT26、4T1肿瘤细胞趋化因子CXCL9，CXCL10，CXCL11的mRNA表达。

蛋白水平表征：将收集的培养上清离心去除细胞碎片后，使用小鼠ELISA检测试剂盒，对基因激活纳米药物激活肿瘤细胞CXCL9，CXCL10，CXCL11的表达量分别进行定量检测。结果如图10所示，CLAN_pCRISPRa可以高效地激活B16-F10、Panc02、CT26、4T1肿瘤细胞趋化因子的蛋白表达。其中，C57BL/6来源的B16-F10、Panc02细胞CXCL11基因发生突变，因而不对其蛋白水平进行进一步的分析。

实施例6、基因激活纳米药物体外诱导T细胞迁移功能

将B16-F10、Panc02、CT26或4T1肿瘤细胞分别接种于24孔板中，每孔接种1×10⁵个，待细胞汇合度达到50％时进行转染。弃去24孔板中的旧培养基，更换为无双抗的基础培养基。用10×PBS将制备的基因激活纳米药物CLAN_pCRISPRa调整为等渗溶液，每孔加入质粒含量为500ng的CLAN_pCRISPRa，轻轻摇匀后放置培养箱中孵育6小时后，更换为新鲜的完全培养基。72小时后收集培养上清，用于后续检测。

使用磁珠分选得到小鼠原代CD3⁺T细胞，之后加入αCD3、αCD28抗体刺激活化CD3⁺T细胞72小时。离心收集活化的CD3⁺T细胞，使用DiI荧光染料进行标记，之后使用完全培养基洗去细胞表面残余的DiI荧光染料及粘附的碎片。

将0.5ml转染后的肿瘤培养上清加入Transwell下室，将0.1ml含有2×10⁶个DiI荧光染料标记的CD3⁺T细胞的培养基加入Transwell上室，之后使用高内涵成像系统实时连续拍摄观察3小时内CD3⁺T细胞的迁移情况。结果如图11所示，CLAN_pCRISPRa促进B16-F10、Panc02、CT26或4T1细胞分泌趋化因子后，可以有效诱导活化T细胞从Transwell上室向下室迁移。

实施例7、基因激活纳米药物体内增强实体瘤T细胞浸润与肿瘤生长抑制效应

为了检测CLAN_pCRISPRa在多种实体瘤中诱导T细胞浸润以及抗肿瘤的效应，取10只植有B16-F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠、20只植有Panc02胰腺癌的C57BL/6小鼠、20只植有CT26结直肠癌、20只植有4T1原位乳腺癌的BALB/c小鼠，每种小鼠肿瘤模型随机分为两组，分别瘤内注射50μl含有5μg质粒的CLAN_pCRISPRa或等体积的CLAN，隔天给药，共给药3次。在治疗过程中，每天使用游标卡尺对肿瘤大小进行测量。肿瘤体积计算公式如下：体积(mm³)＝0.5×长×宽²。治疗结束后，分离小鼠肿瘤组织，并利用流式细胞术对肿瘤组织中浸润的T细胞进行分析。如图12，在多种实体瘤模型中，CLAN_pCRISPRa显著地增加了T细胞的浸润，并有效抑制了小鼠模型的肿瘤生长。

实施例8、肿瘤特异性基因激活纳米药物的设计和制备

为了使用临床上应用更为友好的静脉给药方式代替瘤内注射，用于对设计构建的基因激活纳米药物进行给药，我们使用荧光染料罗丹明B，对前述制备的基因激活纳米药物进行标记，之后将250μl标记的药物静脉注射至植有B16-F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠模型中，评估基因激活纳米药物使用尾静脉注射后能否有效到达肿瘤部位并发挥作用。如图13所示，可以看到，由于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，CLAN_pCRISPRa可以有效在肿瘤处富集。但是，在其他正常的脏器例如肝脏中，也有明显的荧光标记的基因激活药物富集。并且进一步检测显示，静脉注射后CLAN_pCRISPRa也激活了荧光富集明显的脏器例如肝脏中趋化因子的表达，并致使活化的T细胞在肝脏处产生富集。因而，我们设想能否开发一种肿瘤特异性的基因激活纳米药物，使药物仅在肿瘤部位发挥作用。

目前的肿瘤特异性纳米药物，多是通过在药物上偶联可以结合肿瘤细胞生物标志物的配体制备的，但是利用该种方法设计的纳米药物在静脉注射进入体内后仍有可能被正常组织细胞摄取，并释放载体中包载的药物，从而产生脱靶效应。

为了使设计的基因激活纳米药物能够实现肿瘤特异性趋化因子激活表达，我们在构建的CRISPRa系统表达质粒中，使用KpnI、AgeI限制性内切酶和T4连接酶对pgCXCL-dCas9和pMPH质粒进行酶切，使用T4连接酶将肿瘤特异性启动子酪氨酸酶启动子连接到酶切后的质粒中，分别构建得到pgCXCL-Tyr-dCas9质粒和pTyr-MPH质粒，如图14A与14B所示，这两种质粒共同形成黑色素瘤特异性的pTyr-CRISPRa系统。

按照实施例1中的制备方法，向50ml离心管中加入400μl浓度为62.5mg ml^-1的PEG_5k-b-PLGA_11k三氯甲烷溶液，100μl浓度为20mg ml^-1的BHEM-Chol阳离子脂质，并加入25μl浓度为4μgμl^-1的pTyr-CRISPRa无酶水溶液，利用超声双乳化法制备得到黑色素瘤特异性的基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa。

实施例9、肿瘤特异性基因激活纳米药物体内肿瘤特异性检测

为了检测设计的肿瘤特异性基因激活纳米药物的体内特异性，将250μl含有25μg质粒的CLAN_pTyr-CRISPRa或等体积的CLAN，静脉注射至植有B16-F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠模型中，72小时后分离小鼠肿瘤组织、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心脏、皮肤以及眼睛用于后续检测。如图15所示，可以看到CLAN_pTyr-CRISPRa特异性的激活了肿瘤处趋化因子的表达，而对其他正常脏器组织影响较小，并且也显著增加了肿瘤处T细胞的富集浸润。这说明该策略即使是使用临床上更为友好的静脉给药方式而非瘤内注射，也可以实现精准的肿瘤特异性，提高了肿瘤免疫治疗的安全性，具有良好的临床应用前景。

为了验证CLAN_pTyr-CRISPRa的抗肿瘤效应，我们取20只植有B16-F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠，并将以上小鼠随机分为两组，CLAN_pTyr-CRISPRa组11只小鼠，CLAN组9只小鼠，分别尾静脉注射250μl含有25μg质粒的CLAN_pTyr-CRISPRa或CLAN，隔天给药，共给药3次。整个治疗过程中，每天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量。治疗结束后，分离小鼠肿瘤组织，并利用流式细胞术对肿瘤组织中浸润的T细胞进行分析。如图16所示，CLAN_pTyr-CRISPRa显著地抑制了小鼠黑色素肿瘤的生长，并在给药后小鼠肿瘤中T细胞浸润明显增加。

实施例10、肿瘤特异性基因激活纳米药物增强ICB和CAR-T细胞疗法

为了验证肿瘤特异性基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa增强免疫检查点阻断抗体抗肿瘤的效果，我们尾静脉注射250μl含有25μg质粒的CLAN_pTyr-CRISPRa、腹腔注射100μg的αPD-L1抗体或50μg的αCTLA-4抗体，至植有B16-F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠模型，隔天给药，共给药3次。整个治疗过程中，每天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量。如图17所示，CLAN_pTyr-CRISPRa显著地增强了αPD-L1抗体和αCTLA-4抗体的抗肿瘤疗效。

为了验证基因激活纳米药物CLAN_pTyr-CRISPRa增强CAR-T细胞疗法抑制实体瘤的效果，我们构建了B16-F10-FAP皮下黑色素瘤小鼠模型，首先尾静脉输注了1×10⁷个FAP5CAR-T细胞，同时腹腔注射了2×10⁵units IL-2并静脉注射了250μl含有25μg质粒的CLAN_pTyr-CRISPRa，隔天给药，共给药3次。整个治疗过程中，每天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量。肿瘤体积计算公式如下：体积(mm³)＝0.5×长×宽²。如图18A，CLAN_pTyr-CRISPRa显著地增强了CAR-T细胞的抗肿瘤疗效。治疗结束后，分离小鼠肿瘤组织并固定，制备石蜡切片后进行免疫荧光染色，使用共聚焦进行拍摄，如图18B，CLAN_pTyr-CRISPRa显著地增强了CAR-T细胞向实体瘤中的浸润。

实施例11、构建肿瘤特异性启动子驱动趋化因子9或抗PD-L1 scFv表达的基因过表达质粒

αPD-L1 scFv序列来自专利US20100169296A1,趋化因子配体9(CXCL9)cDNA序列来自CCDS数据库(CCDS39152.1)，酪氨酸酶启动子(Tyr promoter)和生存素启动子(Surpromoter)序列分别来自文献Klüppel M,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1991May 1；88(9):3777-81和Zhu ZB,et al.Cancer Gene Ther.2004Apr；11(4):256-62.。以上序列均由上海生工生物工程公司合成，并在αPD-L1scFv序列与CXCL9 cDNA序列之间引入了P2A切割肽序列，使得αPD-L1 scFv蛋白与CXCL9蛋白可以在细胞中分开表达。

通过分子克隆技术，利用限制性内切酶分别将αPD-L1 scFv-P2A-CXCL9序列、Tyr启动子序列、Sur启动子序列以及DNA表达载体pU57质粒骨架进行酶切。先将酶切后的αPD-L1 scFv-P2A-CXCL9片段插入pU57质粒骨架当中,再分别将酶切后的Tyr promoter片段、Sur promoter片段插入αPD-L1scFv-P2A-CXCL9片段上游，分别形成pTyr-C9AP,pSur-C9AP质粒，如图19A,B，该表达质粒的主要元件包含Ori复制起始位点、酪氨酸酶启动子Tyr或生存素启动子Sur、抗PD-L1抗体单链可变片段(αPD-L1)、切割肽P2A、趋化因子配体9(CXCL9)、氨苄抗性基因Amp。

实施例12、肿瘤特异性基因纳米药物的制备与形貌、稳定性表征

按照实施例1中的制备方法以及实施例1,2中的筛选结果，向50mL离心管中加入400μL浓度为62.5mg/mL的PEG_5k-b-PLGA_11k三氯甲烷溶液，100μL浓度为20mg/mL的DOTAP阳离子脂质，并加入25μL浓度为4μg/μL的pTyr-C9AP或pSur-C9AP水溶液，利用超声双乳化法制备肿瘤特异性基因纳米药物CLAN_pTyr-C9AP或CLAN_pSur-C9AP，使用旋蒸法将制备得到的基因激活纳米药物浓缩至1mL。

取CLAN_pTyr-C9AP作为代表性颗粒进行表征，利用纳米粒度及Zeta电位仪，于样品池中检测纳米颗粒水化直径，对应的纳米颗粒粒径以及Zeta电位分布图如图20A所示。此种基因纳米药物为纳米级尺寸，粒径分布均一且带有正电性。

取CLAN_pTyr-C9AP用超纯水稀释50倍后超声分散颗粒，取10μL颗粒溶液滴加至铜网上，停留1min后吸尽液体，再向铜网上滴加10μL 2％磷钨酸溶液，染色30s后吸尽液体，充分干燥后进行冷冻透射电镜的拍摄。如图20B所示，此种基因纳米药物为具有PEG壳层的纳米级球形结构。

取CLAN_pTyr-C9AP颗粒，加入含10％胎牛血清(FBS)的培养基中，于37℃孵育。利用纳米粒度及Zeta电位仪，分别于3,12,24,48,72,96,120h取样加入样品池中检测纳米颗粒水化直径，对应的纳米颗粒粒径以及PDI稳定性变化趋势如图20C所示。结果显示，此种基因纳米药物在含血清的培养基中可以保持稳定。

实施例13、肿瘤特异性基因纳米药物体外特异性表达

为了验证CLAN_pTyr-C9AP的体外肿瘤特异性基因表达，我们将包括B16-F10、CT26、Panc02、4T1、C2C12、NIH-3T3、DC2.4、RAW264.7细胞或SkMC、T细胞、BMDC、BMDM种于六孔板中，待细胞密度长至约50％-70％时准备转染。用10×PBS将颗粒调整为等渗溶液，去除六孔板中的原有培养基，更换为含有CLAN_pTyr-C9AP或CLAN_pSur-C9AP的基础培养基，质粒用量为2μg/孔。孵育6h后，更换为Opti-MEM培养基；72h后收集上清和细胞，用于后续检测。

mRNA水平表征：取出转染颗粒后的细胞，弃去原有培养基并用PBS洗去残留培养基。加入RNAiso plus提取总RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser将总RNA逆转录成cDNA，通过qRT-PCR检测CLAN_pTyr-C9AP或CLAN_pSur-C9AP处理后各种细胞中αPD-L1scFv和CXCL9的mRNA表达情况。如图21A所示，CLAN_pTyr-C9AP可以特异性地提升B16-F10细胞的αPD-L1 scFv和CXCL9 mRNA的表达,对其它肿瘤细胞及其它细胞无作用，是一种黑色素瘤特异性的基因纳米药物；如图21B所示，CLAN_pSur-C9AP可以显著提升多种肿瘤细胞的αPD-L1scFv和CXCL9 mRNA的表达,而对其它类型细胞几乎无作用，是一种通用型的肿瘤特异性基因纳米药物。

蛋白水平表征：(一)、αPD-L1 scFv-6×His蛋白的检测：收集细胞转染后上清，去除细胞碎片后进行纯化。用预冷的1×PBS润洗镍珠，再将细胞上清加入到镍珠中，在4℃层析柜中旋转吸附1h。离心除去杂质蛋白后，加入1×PBS重悬镍珠并离心进行洗涤。加入500mM(pH 7.0)咪唑溶液，将镍柱上带有His标签的蛋白充分洗脱，离心收集滤过液。将滤过液于截留分子量为10KDa的超滤管中进行超滤浓缩，去除溶液中的小分子咪唑，最终超滤浓缩体积到100μL。用BCA蛋白定量法测定蛋白质的浓度，调整上样量后进行蛋白变性。将处理后的蛋白样品用SDS-PAGE胶进行电泳，通过western blot检测αPD-L1 scFv-6×His蛋白的表达情况。(二)、CXCL9检测：将收集转染后细胞上清，去除细胞碎片后，在4℃条件下500g离心5分钟，收集上清于冰上待用。按照Abcam公司的小鼠CXCL9 ELISA检测试剂盒对CXCL9的表达量进行定量检测。结果如图22A和B所示，CLAN_pTyr-C9AP可高效地提升B16-F10细胞的αPD-L1 scFv和CXCL9的蛋白表达水平，用于提升T细胞的浸润与活化。

实施例14、肿瘤特异性基因纳米药物在体外促进T细胞迁移与活化功能

同实施例13所述，将B16-F10细胞种于六孔板中，待细胞密度长至约50％-70％时准备转染。用10×PBS将颗粒调整为等渗溶液，去除六孔板中的原有培养基，更换为含有CLAN_pTyr-C9AP的基础培养基，质粒用量为2μg/孔。孵育6小时后，更换为Opti-MEM培养基，72小时后收集上清备用，用于后续检测。另外，利用磁珠分选获取小鼠原代CD8⁺T细胞，之后加入αCD3，αCD28抗体刺激活化CD8⁺T细胞72h后备用。

如图23A,在Transwell小室的下室种B16-F10-OVA-EGFP细胞，过夜培养后将原有培养基替换成300μL转染后的肿瘤细胞培养上清。向活化后的CD8⁺T细胞中加入Hoechst染料，37℃孵育15min后用1×PBS洗三次，取100万个染料标记后的CD8⁺T细胞加于Transwell上室进行共孵育。孵育18h后进行共聚焦观测，如图23B，CLAN_pTyr-C9AP可以增加T细胞的浸润，并促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。收取下室上清液并离心收集CD8⁺T细胞，加入FITCanti-mouse CD8α流式抗体进行荧光标记。标记结束后加入1×PBS洗两次，最终加入300μL预冷的1×PBS重悬细胞。在细胞悬液中加入10μL的Precision Count Beads，混匀后用流式细胞仪检测并计算迁移至下室中的CD8⁺T细胞的数量。再消化收集下室中的肿瘤细胞，通过PI标记后进行流式分析。结果如图23C，D所示，CLAN_pTyr-C9AP可以同时增强T细胞的浸润与活化。

实施例15、肿瘤特异性基因纳米药物体内水平特异性表达

为了验证CLAN_pTyr-C9AP的体内肿瘤特异性基因表达，我们取12只植有B16-F10皮下黑色素瘤的C57BL/6小鼠，随机分为两组，每组6只小鼠，分别尾静脉注射400μL的CLAN_Control或CLAN_pTyr-C9AP，剂量为1mg质粒/kg体重，每两天给药一次，共给药3次。给药结束后，牺牲小鼠，分离获取小鼠的肿瘤组织以及心脏、肝脏、脾脏、肺以及肾脏组织用于后续检测。

一部分小鼠的肿瘤以及正常脏器分离后被用于流式细胞分析：向各组织中添加1mg/mL胶原酶IV、100μg/mL核酸酶以及100μg/mL透明质酸酶并将其置于37℃恒温箱中振荡20min进行消化，再经过研磨、红细胞裂解以及200目尼龙网过滤后分散为单细胞，最后使用分析型流式细胞仪进行检测。结果如图24A所示，CLAN_pTyr-C9AP特异性地促使肿瘤组织进行pTyr-C9AP质粒表达，而在其它正常组织中几乎无表达。

另一部分小鼠的肿瘤及正常脏器则被用于qRT-PCR的检测：各组织经液氮快速冻结后迅速研磨，加入RNAiso提取其总RNA，再逆转录成cDNA后，通过qRT-PCR检测αPD-L1scFv和CXCL9在各组织脏器中mRNA水平的表达情况。如图24B，CLAN_pTyr-C9AP处理组的小鼠肿瘤中有显著的αPD-L1 scFv和CXCL9的基因表达提升，在正常组织中几乎检测不到。综上所述，CLAN_pTyr-C9AP是一种肿瘤特异性基因纳米药物，可以在体内特异地提升αPD-L1 scFv和CXCL9的表达水平。这种策略可以实现精准的肿瘤特异性，提高了肿瘤免疫治疗的安全性，具有良好的临床应用前景。

实施例16、肿瘤特异性基因纳米药物在动物水平增强T细胞浸润与活化，发挥抗肿瘤效应

为了验证CLAN_pTyr-C9AP的抗肿瘤效应，我们取20只植有B16-F10皮下黑色素瘤的C57BL/6小鼠，随机分为两组，每组10只小鼠，分别尾静脉注射400μL的CLAN_Control或CLAN_pTyr-C9AP，剂量为1mg质粒/kg体重，每两天给药一次，共给药5次。整个治疗过程中，每两天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量。肿瘤体积计算公式如下：体积(mm³)＝0.5×长×宽²。治疗结束后，分离小鼠肿瘤组织并进行称重，如图25A,CLAN_pTyr-C9AP显著地抑制了小鼠肿瘤的生长。

向各组织中添加1mg/mL胶原酶IV、100μg/mL核酸酶以及100μg/mL透明质酸酶并将其置于37℃恒温箱中振荡20min进行消化，再经过研磨、红细胞裂解以及200目尼龙网过滤后分散为单细胞。向组织单细胞中加入αCD16/32抗体，4℃孵育15min进行封闭。再加入BV510 anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD3、BV785 anti-mouse CD8以及BV605 anti-mouse CD69流式抗体混合物，4℃孵育1h进行标记，标记结束后加入PBS洗去未标记上的抗体。最后利用分析型流式细胞仪对肿瘤组织进行免疫分析。结果如图25B所示，CLAN_pTyr-C9AP显著地提升了肿瘤中T细胞的浸润，并增加了活化的细胞毒性T细胞的数目。

为了验证CLAN_pSur-C9AP在多种实体瘤治疗中的通用性，我们各取12只植有B16-F10皮下黑色素瘤的C57BL/6小鼠、CT26结直肠癌或4T1原位乳腺癌的BALB/c小鼠，每种肿瘤模型小鼠随机分为两组，每组6只小鼠，分别尾静脉注射400μL的CLAN_Control或CLAN_pSur-C9AP，剂量为1mg质粒/kg体重，每两天给药一次，共给药5次。另外，我们取12只植有Panc02皮下胰腺癌的C57BL/6小鼠，分组和给药量同上，每四天给药一次，共给药5次。整个治疗过程中，每两天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量。如图26A,CLAN_pSur-C9AP显著地抑制了多种类型肿瘤的生长。

治疗结束后，分离小鼠肿瘤组织利用流式细胞术对肿瘤组织中浸润的T细胞进行分析。结果如图26B所示，CLAN_pSur-C9AP显著地提升了多种肿瘤中T细胞的浸润与活化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：包括质粒和阳离子脂质辅助纳米颗粒，所述质粒为增强T细胞免疫相效应相关基因表达质粒，所述阳离子脂质辅助纳米颗粒为阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述质粒为基因激活工具CRISPRa质粒和基因过表达质粒中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：质粒启动子为强启动子或肿瘤特异性启动子其中至少一种。

4.根据权利要求3所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述强启动子为巨细胞病毒启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子中的一种；肿瘤特异性启动子为酪氨酸酶启动子、生存素启动子中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述基因激活工具CRISPRa质粒为靶向激活趋化因子配体9的CRISPRa质粒、靶向激活趋化因子配体10的CRISPRa质粒、靶向激活趋化因子配体11的CRISPRa质粒中的至少一种；所述基因过表达质粒为趋化因子配体9、抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段表达质粒中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述质粒为人源、鼠源基因的至少一种。

7.根据权利要求5所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述基因激活工具CRISPRa质粒包括两个质粒，其中一个质粒包括靶向趋化因子配体9，趋化因子配体10，趋化因子配体11的具有噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构的引导RNA以及失活核酸内切酶dCas9与转录激活因子VP64融合表达质粒，另一个质粒包括转录辅助激活蛋白噬菌体MS2外壳蛋白、NF-κB转录因子p65蛋白及热休克调节蛋白HSF1蛋白融合表达质粒；基因过表达质粒序列为趋化因子配体9与抗细胞程序性死亡-配体1单链可变区片段通过P2A切割肽连接而成的一个共表达质粒。

8.根据权利要求2所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述质粒的终止子为bGH polyA。

9.根据权利要求1所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述阳离子脂质辅助纳米颗粒中的脂质为阳离子胆固醇衍生物、烷基链阳离子脂质中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述阳离子胆固醇衍生物为N，N-双(2-羟乙基)-N-甲基-N-(2-胆固醇氧羰基氨基乙基)溴化铵、实验室合成阳离子胆固醇衍生物CL3、实验室合成阳离子胆固醇衍生物CL7中的至少一种，所述烷基链阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、实验室合成烷基链阳离子脂质AL6、实验室合成烷基链阳离子脂质AL7中的至少一种。

11.根据权利要求1所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒中的聚合物为聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)以及聚(乙交酯-co-丙交酯)中的至少一种。

12.根据权利要求11所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：阳离子脂质辅助的聚合物纳米颗粒中的聚合物为聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)以及聚(乙交酯-co-丙交酯)，聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)占全部聚合物比例范围为60％-100％。

13.根据权利要求1所述的用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物，其特征在于：所述阳离子脂质辅助纳米颗粒的平均粒径为50nm-200nm。

14.一种如权利要求1所述的于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一，将增强T细胞抗肿瘤免疫效应质粒与水溶液混合；将脂质、聚乙二醇修饰的聚酯、聚酯与三氯甲烷有机溶剂混合，得油相；

步骤二，将油相和水相制备成水包油包水的乳剂；

步骤三，将乳剂浓缩后得基因纳米药物。

15.根据权利要求14所述的于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物的制备方法，其特征在于：增强T细胞抗肿瘤免疫效应质粒在水相中的浓度为1-4mg/ml；聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)或聚(乙交酯-co-丙交酯)在油相中的浓度为62.5mg/ml；脂质在油相中的浓度为10-30mg/ml。

16.根据权利要求14所述的于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物的制备方法，其特征在于：将油相和水相制备成水包油包水的乳剂的方法为超声乳化法、微流控、微通道反应法至少一种；乳剂浓缩的方法为旋转蒸发、冷冻干燥中的至少一种。

17.一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物通过增强T细胞趋化与活化作用用于提升T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗疗效。

18.一种用于增强T细胞抗肿瘤免疫效应的基因纳米药物与免疫检查点阻断疗法或CAR-T细胞疗法联合应用于增强抗肿瘤免疫疗效。

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