CN110358737B - 一种利用外泌体制备嵌合抗原受体t淋巴细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用外泌体制备嵌合抗原受体T淋巴细胞的方法，其包括：(1)获得对象的T淋巴细胞；(2)将所述T淋巴细胞培养后，提取外泌体；其后所述T淋巴细胞继续培养，得到T淋巴细胞培养物A；(3)用表达抗原嵌合受体的质粒转染所述外泌体，得到含CAR质粒的外泌体；(4)将(3)中的所述含CAR质粒的外泌体与(2)中的所述T淋巴细胞培养物A混合并培养，培养后得到所述抗原嵌合受体T淋巴细胞。本发明还提供了一种外泌体，根据前述方法制备的抗原嵌合受体T淋巴细胞，以及前述抗原嵌合受体T淋巴细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

Description

一种利用外泌体制备嵌合抗原受体T淋巴细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，特别是涉及一种利用外泌体制备嵌合抗原受体T淋巴细胞的方法。
背景技术
嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，简称CAR-T)是肿瘤免疫治疗领域的一个新策略。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR-T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。
在现有的CAR-T淋巴细胞的制备方法中，通常采用慢病毒载体将CAR质粒转染到T淋巴细胞中。然而，慢病毒载体对T淋巴细胞具有毒性，并且慢病毒基因组被全部带入到T淋巴细胞中、并回输到患者体内也具有潜在的风险。为解决这些问题，本领域研究人员作出了诸多努力，例如，*Ziopharm公司研发的“睡美人”CAR-T疗法，已经申请了I期临床试验。然而，这些努力并没有十分有效地解决上述问题。
外泌体是微小的膜结合囊泡(直径30-150nm)，包含了复杂RNA和蛋白质。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长。
发明内容
本发明提供了一种制备抗原嵌合受体T淋巴细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)获得对象的T淋巴细胞；
(2)将所述T淋巴细胞培养1至5天、优选2-4天、更优选2天后，提取外泌体；其后所述T淋巴细胞继续培养，得到T淋巴细胞培养物A；
(3)用表达抗原嵌合受体的质粒转染所述外泌体，得到含CAR质粒的外泌体；
(4)将(3)中的所述含CAR质粒的外泌体与(2)中的所述T淋巴细胞培养物A混合并培养，培养后得到所述抗原嵌合受体T淋巴细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述T淋巴细胞来源于外周血、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带血或肿瘤。
在本发明的一个实施方案中，所述对象是人。
在本发明的一个实施方案中，通过电穿孔法将所述表达抗原嵌合受体的质粒转染到所述外泌体。
在本发明的一个实施方案中，(4)中所述含CAR质粒的外泌体与所述T淋巴细胞培养物A以1：10-1：100、优选1：20-1：80、更优选1：50的体积比混合。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原嵌合受体包含抗CD19单链抗体、抗BCMA单链抗体或抗HER2单链抗体。
本发明还提供了一种含CAR质粒的外泌体，其由以下方法制备：
(1)获得对象的T淋巴细胞；
(2)将所述T淋巴细胞培养1至5天、优选2-4天、更优选2天后，提取外泌体；
(3)用表达抗原嵌合受体的质粒转染所述外泌体，得到含CAR质粒的外泌体。
本发明还提供了根据前述方法制备的抗原嵌合受体T淋巴细胞。
本发明还提供了前述抗原嵌合受体T淋巴细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病和肺癌。
本发明提供的一种利用非病毒载体，即外泌体制备嵌合抗原受体T淋巴细胞的方法至少具有以下优势：一方面，采用非病毒载体，可以避免病毒载体的可能的潜在危害性；另一方面，应用T淋巴细胞自身分泌的外泌体作为运输载体，模拟体内正常的细胞通讯状态，因此对T淋巴细胞无任何毒副作用，可以最大限度的保证制备过程中T淋巴细胞的活性与状态。因此，本发明所提供的利用外泌体制备嵌合抗原受体T淋巴细胞的方法具有更好的优越性，更适于临床的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示了通过流式细胞术检测的本发明的嵌合抗原受体T淋巴细胞上CAR的表达情况；
图2显示了通过流式细胞术检测的与A2780细胞共培养前后本发明的嵌合抗原受体T淋巴细胞上CAR的表达情况；
图3显示了与A2780细胞共培养后本发明的嵌合抗原受体T淋巴细胞中细胞因子表达量的检测结果；
图4显示了肿瘤尺寸；
图5显示了注射前后的肿瘤体积；
图6显示了肿瘤增长速度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如本文使用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其它部分。多种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
如本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指的是被工程化以在免疫效应细胞上表达并特异性地结合抗原的人工T细胞受体。CAR可以被用作使用过继性细胞转移的疗法。T细胞从患者移出并且被修饰，使得它们表达特异于特定形式的抗原的受体。例如，在一些实施方式中，已经以对肿瘤相关抗原的特异性表达CAR。CAR还可以包括细胞内活化结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，该细胞外结构域包括肿瘤相关抗原结合区。在一些方面，CAR包括融合单链可变片段(scFv)衍生的单克隆抗体，其被融合至CD3-ζ跨膜和细胞内结构域。CAR设计的特异性可以源自受体的配体(例如，肽)。在一些实施方式中，通过重定向表达特异于肿瘤相关抗原的CAR的T细胞的特异性，CAR可以靶向癌症。
术语“对象”包括其中可以引发免疫应答的活的生物体(例如，哺乳动物)。如其中使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，比如羊、牛、猪、狗、猫和鼠哺乳动物。优选地，对象是人。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带和肿瘤。
如本文使用的术语“转染”指的是如下过程：通过该过程外源性核酸被转移或引入宿主细胞。“转染”的细胞是已经用外源性核酸转染的细胞。细胞包括原代对象细胞和其子代。
下面通过具体实施例的对比对本发明方法做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的试剂和仪器为本领域的市售产品，本发明采用的实验方法为本领域常规方法。
实施例1嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备
(1)分离T淋巴细胞
取人外周血样品(来源于健康志愿者献血)，分离T淋巴细胞(首先从外周血中应用Ficoll(Peiyuan L210)分离液分离PBMC，将分离好的PBMC放入培养箱中于37℃、5％CO2培养2个小时，小心吸取培养瓶中液体,液体中即包含所需要的T淋巴细胞，将分离出的T淋巴细胞放入T25细胞培养瓶中，在培养箱中、于37℃、5％CO2培养，T淋巴细胞培养基为vivo+IL-2(LONZA X-VIVO 15)。
(2)提取外泌体
培养两天后，收集上清，3000rpm离心30分钟，其中，T淋巴细胞主要存在于沉淀中，将沉淀放回T25细胞培养瓶中，加入新鲜的培养基继续培养；外泌体主要存在于上清中，将上清用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液，然后向滤液中加入体积为滤液体积的1/2的R试剂(total exosome isolation reagent/Thermofisher/4478359)，混合后置于4℃冰箱过夜培养。提取外泌体(依据total exosome isolation reagent/Thermofisher/4478359培养基外泌体提取标准流程)。
(3)CAR质粒转染外泌体
将步骤(2)提取的外泌体用100μl的PBS重悬，然后与20μg的CAR质粒共同放入电击杯(biorad，0.2cm)中。在200V电压下电击20ms后，将电击杯连同其中的液体放入37℃培养箱中恢复1小时。需要说明的是，CAR质粒的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有抗MSLN(mesothelin，间皮素)的单链抗体的编码序列。
(4)携带CAR质粒的外泌体转染T淋巴细胞
恢复完成后，将电击杯中的所有液体转移到步骤(2)中含有继续培养的T淋巴细胞(继续培养的T淋巴细胞在本发明中也称为T淋巴细胞培养物A)的培养瓶中，在培养箱中、于37℃、5％CO2继续培养2天，获得细胞培养物B。
实施例2嵌合抗原受体T淋巴细胞CAR表达百分比的检测
对实施例1步骤(4)获得的细胞培养物B进行CAR表达的检测，具体操作如下：取出100μl的细胞培养物B与0.3μg的MSLN蛋白(Sino Biological13128-H08H-50)混合，得到混合物1，将混合物1在冰上孵育1小时；同时，将抗his抗体(abcam ab137839，稀释比例1：1000)与4μl的FITC标记的二抗(Abcam ab6798)混合，得到混合物2，将混合物2在冰上共孵育1小时。将上述混合物1和混合物2混合，得到混合物3，将混合物3放置于冰上孵育1小时。孵育结束后，采用流式细胞术检测并计算细胞培养物B中能够表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞所占的百分比，简称CAR表达百分比。计算公式为：CAR表达百分比＝(表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞的数目/细胞培养物B中总细胞数目)×100％。由图1可已看出，嵌合抗原受体T淋巴细胞制备完成后，继续培养2天获得的细胞培养物B中，CAR表达百分比可达到47％左右。
实施例3与A2780卵巢癌细胞共培养后嵌合抗原受体T淋巴细胞CAR表达百分比的检测
A2780为人卵巢癌细胞系，其表面表达MSLN抗原。应用A2780细胞系作为靶细胞模型，检测嵌合抗原受体T淋巴细胞的CAR表达百分比。
将实施例1步骤(4)获得的细胞培养物B的25％与5×106个A2780细胞于37℃、5％CO2共培养，分别于培养前(Day 0)和共培养第八天(Day 8)两个时间点采用与实施例2相同的方法检测和计算嵌合抗原受体T淋巴细胞CAR表达百分比。
由图2可以看出，与含有MSLN抗原的A2780细胞共培养前，CAR表达百分比为46％，与A2780细胞共培养8天后，CAR表达百分比可达62％，提高了20％左右。由此结果可得，根据本发明的方法制备的嵌合抗原受体T淋巴细胞可以被抗原特异性地再次激活，并进一步提高CAR表达百分比。
实施例4与A2780卵巢癌细胞共培养后嵌合抗原受体T淋巴细胞的细胞因子表达水平的检测
将实施例1步骤(4)获得的细胞培养物B的25％与5×106个A2780细胞于37℃、5％CO2共培养，分别于培养前(Day 0)共培养第二天(Day2)、第四天(Day4)和第八天(Day 8)四个时间点，采用ELISA试剂盒Abcam ab46025，按照说明书的标准步骤检测培养基中细胞因子IFN-r的水平。
由图3可以看到，共培养第2天后(Day2)，培养基中的细胞因子水平显著提高，共培养第4天后细胞因子表达虽然稍微下降，但是相对于单独培养的嵌合抗原受体T淋巴细胞，其水平也是显著的增高，共培养第4天后，细胞因子已经明显的降低了，但是同样其含量还是比单独培养的嵌合抗原受体T淋巴细胞要高很多。实际上，在共培养第八天后，普通显微镜下观察显示绝大部分A2780细胞已经死亡。
通过以上结果也证实了，应用本发明的方法制备的嵌合抗原受体T淋巴细胞可以有效地杀伤肿瘤细胞。
实施例5嵌合抗原受体T淋巴细胞的体内抗肿瘤效果
应用NSG小鼠(购于百奥赛图)通过皮下注射2×105个A2780细胞制备卵巢癌动物模型，注射后第14天，小鼠皮下成瘤。实验组：于小鼠尾静脉注射实施例1步骤(4)获得的细胞培养物B，其中注射量为4×106个细胞/小鼠；对照组：尾静脉注射PBS 100μl之后继续饲养。注射后第八天，测量小鼠瘤体大小。
由图4可以看出，与对照组相比，实验组中注射了本发明的嵌合抗原受体T淋巴细胞的小鼠，其肿瘤尺寸明显减小(图4)，其肿瘤增长速度明显降低(图5和图6)。通过以上结果可以得出，本发明的方法制备的嵌合抗原受体T淋巴细胞在体内依然有良好的抗肿瘤效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 天津市中西医结合医院（天津市南开医院）
<120> 一种利用外泌体制备嵌合抗原受体T淋巴细胞的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> CAR质粒
<400> 1
gaattcatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg gatcccaggt acaactgcag cagtctgggc ctgagctgga gaagcctggc 120
gcttcagtga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta caccatgaac 180
tgggtgaagc agagccatgg aaagagcctt gagtggattg gacttattac tccttacaat 240
ggtgcttcta gctacaacca gaagttcagg ggcaaggcca cattaactgt agacaagtca 300
tccagcacag cctacatgga cctcctcagt ctgacatctg aagactctgc agtctatttc 360
tgtgcaaggg ggggttacga cgggaggggt tttgactact ggggccaagg gaccacggtc 420
accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggcggtggct ctagcggtgg cggatcggac 480
atcgagctca ctcagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 540
acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 600
tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc aggtcgcttc 660
agtggcagtg ggtctggaaa ctcttactct ctcacaatca gcagcgtgga ggctgaagat 720
gatgcaactt attactgcca gcagtggagt aagcaccctc tcacgtacgg tgctgggaca 780
aagttggaaa tcaaagctag cgcatccctt cacaaaggac tggatagtgc tgtggaagtc 840
tgtgttgtat atgggaatta ctcccagcag cttcaggttt actcaaaaac ggggttcaac 900
tgtgatggga aattgggcaa tgaatcagtg acattctacc tccagaattt gtatgttaac 960
caaacagata tttacttctg caaaattgaa gttatgtatc ctcctcctta cctagacaat 1020
gagaagagca atggaaccat tatccatgtg aaagggaaac acctttgtcc aagtccccta 1080
tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 1140
tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 1200
ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1260
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc 1320
aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1380
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1440
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1500
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1560
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1620
atgcaggccc tgccccctcg ctaaccgcgg 1650

Claims (7)

1.一种制备抗原嵌合受体T淋巴细胞的方法，其包括以下步骤：
（1）获得人的T淋巴细胞；所述T淋巴细胞来源于外周血；
（2）将所述T淋巴细胞培养1至5天后，提取外泌体；其后所述T淋巴细胞继续培养，得到T淋巴细胞培养物A；
（3）用表达抗原嵌合受体的质粒转染所述外泌体，得到含CAR质粒的外泌体；其中，所述CAR质粒的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
（4）将（3）中的所述含CAR质粒的外泌体与（2）中的所述T淋巴细胞培养物A混合并培养，培养后得到所述抗原嵌合受体T淋巴细胞；其中，所述含CAR质粒的外泌体与所述T淋巴细胞培养物A以1：10-1：100的体积比混合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，（2）中将所述T淋巴细胞培养2-4天后，提取外泌体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过电穿孔法将所述表达抗原嵌合受体的质粒转染到所述外泌体。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，（4）中所述含CAR质粒的外泌体与所述T淋巴细胞培养物A以1：20-1：80的体积比混合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，（4）中所述含CAR质粒的外泌体与所述T淋巴细胞培养物A以1：50的体积比混合。
6.一种根据权利要求1的方法制备的抗原嵌合受体T淋巴细胞。
7.根据权利要求6所述的抗原嵌合受体T淋巴细胞在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途。
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