CN111171160B

CN111171160B - 基于TGF-β改造的嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞

Info

Publication number: CN111171160B
Application number: CN202010094964.2A
Authority: CN
Inventors: 王永生; 李丹; 陈玥
Original assignee: West China Precision Medicine Industrial Technology Institute; West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Precision Medicine Industrial Technology Institute; West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111171160A

Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括dnTGF‑βRII结构域和IL‑2Rβ结构域，dnTGF‑βRII结构域和IL‑2Rβ结构域通过CD8跨膜结构域相连；所述dnTGF‑βRII结构域与TGF‑βII型受体的胞外段序列同源性在90％以上，且能特异性识别TGF‑β的蛋白结构域；所述IL‑2Rβ结构域是序列与IL‑2受体β链序列同源性在90％以上的蛋白结构域。本发明还提供了一种包括前述嵌合抗原受体的CAR‑T细胞。本发明可以增强CAR‑T细胞在实体瘤中的扩增能力，有利于CAR‑T技术在实体瘤治疗中的应用推广。

Description

基于TGF-β改造的嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞

技术领域

本发明属于癌症的免疫治疗药物领域，尤其涉及一种基于TGF-β改造的嵌合抗原受体。

背景技术

正常情况下，免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞，但为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫应答受到抑制而不能正常的杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤免疫治疗就是通过恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。肿瘤免疫疗法包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗等。近几年，肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破，其中CAR-T(Chimericantigen receptor Tcells，嵌合抗原受体修饰的T细胞)治疗与CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体治疗被认为肿瘤免疫治疗三大进展。

CAR-T疗法就是利用抗原抗体scFv片段，联合细胞内激活、增殖信号相关蛋白结构域，构建得到嵌合抗原受体，将其表达于T细胞，可使T细胞直接获得抗体的特异识别能力、成为不依赖HLA(人类白细胞抗原)限制的效应T细胞。经过设计的CAR-T细胞可在实验室培养生长，达到数十亿之多，再将扩增后的CAR-T细胞注入到患者体内，注入之后的T细胞也会在患者体内增殖，并杀死具有相应特异性抗原的肿瘤细胞，长期存活并形成免疫记忆。因其在难治性血液肿瘤中取得的突破性进展，疗效突出，2017年美国FDA接连批准Kymriah和Yescarta两种CAR-CD19疗法用于临床治疗。

也有研究将嵌合抗原受体表达于T细胞以外的免疫细胞，诸如单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞等，使这些免疫细胞也获得特异识别肿瘤细胞，发挥免疫治疗的功能。

遗憾的是，嵌合抗原受体以及表达嵌合抗原受体的免疫细胞至今在实体瘤临床应用进展缓慢，仅取得有限的治疗应答。主要原因之一为：肿瘤微环境中存在大量的抑制免疫细胞的细胞因子，这些细胞因子使得表达嵌合抗原受体的免疫细胞无法达到并维持一个较高的数量水平。

转化生长因子β(TGF-β)在众多抑制免疫细胞的细胞因子中，对T细胞的抑制作用最为明显。TGF-β在卵巢癌、肺癌、结直肠癌等大多数实体瘤都有高水平表达，不仅直接影响效应T细胞功能，还能抑制其扩增并诱导向抑制性T细胞分化。TGF-β还能抑制自然杀伤细胞、单核细胞和中性粒细胞的细胞毒性。

发明内容

本发明要解决的问题是，提供一种能帮助免疫细胞抵抗TGF-β抑制作用的新的嵌合抗原受体，及其修饰的免疫细胞。

本发明的技术方案包括：

一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域，dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域通过跨膜结构域相连；

所述dnTGF-βRII结构域是与TGF-βII型受体的胞外段序列同源性在90％以上，且能特异性识别TGF-β的蛋白结构域；

所述IL-2Rβ结构域是序列与IL-2受体β链序列同源性在90％以上的蛋白结构域。

如前述的嵌合抗原受体，所述dnTGF-βRII结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

和/或，所述IL-2RB结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

如前述的嵌合抗原受体，所述跨膜结构域是与CD28、CD8、CD3ζ、CD134、CD137、ICOS、DAP10或CD27蛋白跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域；

优选地，所述跨膜结构域是与CD8蛋白跨膜区序列同源性90％以上的蛋白结构域；

更优选地，所述跨膜结构域是CD8蛋白的跨膜结构域。

如前述的嵌合抗原受体，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

下文中，前述的嵌合抗原受体，也称为“本发明嵌合抗原受体”。

一种重组质粒，它包括能表达本发明嵌合抗原受体的DNA片段；

优选地，所述本发明嵌合抗原受体的DNA片段的序列如SEQ ID NO.8所示。

如前述的重组质粒，它还包括表达传统嵌合抗原受体的DNA片段；

所述传统嵌合抗原受体是能靶向识别肿瘤细胞表面蛋白的嵌合抗原受体；

优选地，所述表达传统嵌合抗原受体的DNA与表达本发明嵌合抗原受体的DNA之间通过表达自剪切2A肽段的DNA连接；进一步优选地，所述表达自剪切2A肽段的DNA序列如SEQID NO.7所示。

一种重组病毒，所述重组病毒能表达本发明嵌合抗原受体；

优选地，所述病毒携带前述重组质粒。

一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述免疫细胞含有本发明嵌合抗原受体，dnTGF-βRII结构域位于细胞膜外侧，IL-2Rβ结构域位于细胞膜内侧；

它还含有至少一种特异性靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体；

优选地，所述特异性靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体的胞外段可靶向CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、HER2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、ROR1、CD44等抗原中的至少一种。

如前述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述免疫细胞为T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)；优选地，为T细胞。

前述的嵌合抗原受体、重组质粒、重组病毒或嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途，优选地，所述恶性肿瘤为实体瘤，尤其可以为肺癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、胰腺癌或前列腺癌中的至少一种。

本发明中，术语“结构域”是指蛋白质中空间上可明显区分，又具有各自功能的区段；结构域中部分氨基酸残基的改变(替换、缺失和/或增加)并不会明显引起结构域功能的变化。因此应当知晓：本发明涉及的抗原受体，即使发生氨基酸残基改变，只要涉及的结构域功能无明显变化，均在本发明的范围内。

本发明的工作原理可能为：本发明嵌合抗原受体的dnTGF-βRII结构域，通过形成二聚体识别细胞外的TGF-β；与dnTGF-βRII结构域相连的IL-2Rβ结构域距离被拉近，也形成二聚体。IL-2Rβ形成二聚体后，可激活JAK-STAT信号通路，促进本发明嵌合抗原受体的宿主细胞(比如T细胞)的增殖。因此，原本抑制宿主细胞的TGF-β作用于本发明嵌合抗原受体后，会产生激活作用。即是说，本发明的嵌合抗原受体将TGF-β的抑制信号转化成了激活信号。

实验证明，将双嵌合抗原受体(本发明的嵌合抗原受体与传统嵌合抗原受体)共同表达于T细胞内，可以使T细胞在TGF-β高浓度的各种实体瘤中达到更大的数量，理论上可以显著增加T细胞对实体瘤的疗效，推进CAR-T疗法在实体瘤中的应用，具有十分良好的应用价值。

本发明的嵌合抗原受体依赖外源的TGF-β发挥激活T细胞的功能，但另有实验表明，即使没有TGF-β存在，同时表达双嵌合抗原受体的T细胞，相比仅表达传统嵌合抗原受体的T细胞，活性更高。

虽然本发明说明书中只提供了本发明的嵌合抗原受体在T细胞内表达产生的效果，但本领域已知TGF-β对T细胞、中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞均有抑制作用，且本发明嵌合抗原受体的IL-2Rβ结构域形成二聚体后激活的JAK-STAT信号通路对免疫细胞具有普遍的激活作用。所以，可以合理推测，将本发明的嵌合抗原受体在中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞内表达能产生与在T细胞内表达的类似促增值和激活效果。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是本发明CAR-T作用机制模式略图。

图2是本发明病毒载体中嵌合抗原受体功能单元结构组成图。

图3是CAR-T与靶细胞共培养后，T细胞FAR RED信号检测图。

图4是CAR-T与癌细胞共孵育时，IFN-γ和TNF-α的产量图。

具体实施方式

本发明的嵌合抗原受体关键结构域是dnTGF-βRII与IL-2Rβ，连接两者的是跨膜结构域，优选地，为CD8蛋白的跨膜结构域CD8TM，对应的嵌合抗原受体为dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ。以下将以dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ为例，对本发明的嵌合抗原受体及其对应CAR-T进行描述。

实施例1本发明CAR-T制备方法

1.基因片段准备以及载体构建：

本发明的嵌合抗原受体dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ理论上没有靶向肿瘤细胞的能力，只负责激活T细胞，因此，在制备具有肿瘤杀伤效果的CAR-T时，除了要转入表达dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ，需要同时转入靶向肿瘤表面蛋白的传统嵌合抗原受体(传统CAR)。

为了提高转基因效率，本实施例将dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ基因与传统CAR基因连在一起转入细胞，两基因间事先加入一段自剪切2A肽段(可以为P2A/T2A/E2A/F2A)，其作用是基因表达后将dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ与传统CAR分开，成为独立的蛋白发挥各自的作用。将本发明嵌合抗原受体基因和传统CAR基因分两次转入T细胞以构建CAR-T也是可行的。

用于转基因的目的片段具体包括：

1)传统CAR基因片段：靶向ROR1的CAR基因片段，依次由scFv、Hinge/spacer、CD28tm、CD28intra、4-1BB和CD3 zeta构成，具体DNA序列如下：

scFv(SEQ ID NO.1)：

Hinge/spacer(SEQ ID NO.2)：

CD28tm(SEQ ID NO.3)：

CD28intra(SEQ ID NO.4)：

4-1BB(SEQ ID NO.5)：

CD3 zeta(SEQ ID NO.6)：

2)自剪切2A肽段对应基因序列：P2A的DNA序列(SEQ ID NO.7)：

3)dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ的DNA序列(SEQ ID NO.8)：

其中，dnTGF-βRII段的DNA序列(SEQ ID NO.9)：

dnTGF-βRII段对应的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)：

IL-2Rβ段对应的DNA序列(SEQ ID NO.11)：

IL-2Rβ段对应的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)：

CD8TM段对应DNA序列(SEQ ID NO.13)：

CD8TM段对应氨基酸序列(SEQ ID NO.14)：

合成目的片段后，选择BamHI和EcoRI作为酶切位点，采用引物：F：CGGGATCCGCCACCATGCTGCTGCTGGTGACA(SEQ ID NO.15)，R：GGAATTCTTACACTAAATGG(SEQ ID NO.16)，对基因片段进行PCR扩增，扩增产物跑胶回收以后使用BamHI和EcoRI对回收片段进行双酶切，并同时双酶切质粒载体pWPXLd。使用T4连接酶连接基因酶切后的基因片段以及载体。酶连完成后，进行DNA的转化。连接产物转化感受肽细胞DH5α。转化后的感受态培养后挑选单克隆，提取质粒进行酶切鉴定。对于酶切鉴定成功的质粒，送到公司进行基因测序鉴定，采用启动子EF1-alpha的通用引物作为测序引物，进行批量化标准化测序。基因测序验证正确后，采用质粒大批量提取。

2. 293T细胞的培养和传代：

打开生物安全柜，用75％的酒精棉擦拭台面，并将移液器、移液枪、枪尖盒、15ml离心管、离心管架、10cm²新的细胞培养皿放于生物安全柜中，关闭柜门，开启生物安全柜的紫外开关，照射半小时以消毒灭菌。将含10％的胎牛血清和100U/ml青霉素链霉素的DMEM及胰酶放于37℃水浴锅中预热。打开生物安全柜，开启通风开关，将已长到80％-90％的293T细胞培养皿从37℃、5％的CO₂的培养箱中取出，放于生物安全柜。用75％的酒精消毒双手、培养基瓶瓶口、移液管筒口等。用无菌移液管吸尽培养皿中的培养基，弃于废液缸中。加入1ml胰酶简略冲洗掉平皿中残存的培养基，以中和胰酶抑制物，随后吸尽并移除。向培养皿中滴入1-2ml胰酶，镜下观察细胞，直到细胞变圆分离，吸除胰酶。向培养皿中加入6-8ml新鲜完全培养基，轻柔吹打下细胞。将细胞悬液分于其他培养皿，并添加培养基以达到每皿10ml。十字式晃动培养皿数次，摇匀细胞，镜下观察后放入37℃培养箱。24h后观察细胞状态，待细胞长到80％-90％时进行下一次传代培养。

3.慢病毒原液的获取：

Day 1：铺板。90％密度状态良好的293T细胞消化，1∶5传代，约1.0×10⁷cells/20ml/15cm平皿，5％CO₂、37℃培养过夜。24h细胞密度约50-70％(不超过70％)。

Day2：转染。转染前2h，使用预热的10％DMEM高糖培养基20ml/皿进行换液。所有试剂平衡至室温。

转染步骤如下：

a.在50ml BD管中配制以下DNA混合物(每15cm平皿)，psPAX2(packagingplasmid)22.5μg；pMD.2G(envelope plasmid)11.25μg；pWPXLd(lentivirus vector，由实施例1制备得到)22.5μg。

b.加水定容至1125μl。

c.2.5M CaCl₂125μl滴入DNA溶液，涡旋5s。

d.将BD管置于涡旋仪上(4档)，2×BBS(1250μl)溶液逐滴加入DNA-CaCl₂混合液，震荡5s。

e.室温静置15min。将2.25ml转染混合物滴入平皿，“十”字(各10次)轻轻摇晃混匀，3％CO₂，37℃培养(12-16h)。吸去培养基，10ml PBS洗一次。使用预热的5％DMEM培养基进行一次换液，5％CO₂，37℃培养至48h。

Day 4：转染后48h。收细胞上清，加预热的5％FBS新鲜DMEM培养基15ml，5％CO₂，37℃培养；病毒上清0.45μm滤器过滤，4℃保存(最多1周)。

Day 5：转染后72h，收病毒上清，0.45μm滤器过滤，4℃保存。

4.慢病毒的浓缩：

仪器：超高速离心仪，配套的转子与套筒，超速离心管，配平用天平。将套筒及天平至生物安全柜紫外仪下消毒。确保每个套筒内无液滴后，将合适的离心管放至套筒里。将用0.45μm的滤器过滤的病毒悬液加至离心管内。每个装了病毒悬液的离心管严格配平，使用精度为0.001g及以上的天平，盖上套筒盖后再次用天平验证是否完全配平。将配平好的各套简装至离心仪转子里，准备离心。离心：离心条件为：20℃，70000g，2h。待离心仪速度上升至70000g再离开。离心完毕后，将培养基倒掉，离心管倒置在灭菌滤纸上吸干剩余培养基。使用PBS重悬病毒沉淀，每个离心管PBS量依据自己需要而定，一般每个离心管用100μl重悬，最后再用100μl PBS将各离心管洗一遍吸出。将重悬的病毒分装至小EP管里，-80℃冰箱保存，待使用。

5.浓缩病毒液感染293T细胞后，293T细胞表面CAR分子表达的检测，以验证病毒效率：

浓缩病毒液感染293T细胞：6孔板铺293T细胞，2ml 10％培养基中加入10μl病毒浓缩液，混匀，加入6孔板中，感染细胞，24h换2ml 10％培养基，48h做流式，检测CAR的表达量。

6.人外周血T淋巴细胞的分离：

抽取血液，使用绿头盖抗凝取血管收集，一般一次抽取15-20ml血液即可。血液缓慢逐滴加入FICOLL淋巴细胞分离液中，淋巴细胞分离液与血液比例为1∶1。淋巴细胞分离液与血液的混合液离心。条件是1000g，30min，18℃。离心过后可以看到血液分为4层，而淋巴细胞所在层，为中间白色透明层。枪尖缓慢吸取中间白色透明层淋巴细胞，切勿吸取其余2层液体。吸取的淋巴细胞加入到20ml无血清无抗生素X-VIVO培养基中离心，500g，10min。倒掉上清，用10ml无菌裂红液重悬沉淀的淋巴细胞，裂红时间不超过5min，2-3min即可。离心500g，10min。倒掉上清，用4ml 5％人胎牛血清，2.5％IL-2的X-VIVO培养基，带血清和IL-2的X-VIVO培养基最好现配现用。重悬T淋巴细胞，之后进行细胞计数，根据细胞数量决定6孔板每孔加入培养基量，一般每毫升为3×10⁶个淋巴细胞。

病毒感染T细胞前一天，用纤维连接蛋白(Retronectin)稀释液包被病毒感染实验中将要使用的六孔板(Retronectin使用PBS稀释，浓度为50μg/ml)，稀释好后每2ml的Retronectin包被六孔板的一个孔。4℃密封过夜备用。感染当天，吸去Retronectin稀释液，使用2％BSA(牛血清白蛋白)溶液(PBS配制)封闭六孔板30min。吸去BSA，使用PBS润洗数次。(此步骤后，该六孔板可于4℃保存一周)。每孔预备1ml慢病毒悬液，混匀，加入六孔板中，32℃，1000g，2h离心。取出六孔板，吸去上清。PBS润洗一次。各孔加入2ml浓度为1.5×10⁶cell/ml的PBMC细胞悬液，32℃，1000g，10min离心。37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。48h后换液。慢病毒感染时，MOI值控制在4～40之间效果最佳。

7.浓缩病毒液感染T细胞后，T细胞表面CAR分子表达的检测：

浓缩病毒液感染T细胞，48h后做流式，检测CAR的表达量。

8.CAR-T细胞的培养：

淋巴细胞分离液(Fillco)密度梯度离心分离出的外周血单核细胞，细胞技术板对其进行计数，获得细胞数总量，然后以1∶1比率加入同数量相同的CD3/CD28磁珠(Gibco)。在有磁力架的情况下，在50ml的BD管里加入10ml左右X-VIVO培养基，然后加入经计数计算后的实际磁珠体积，轻吹重悬后，把BD管放入磁力架中静置3-4分钟，仅剩下纯磁珠吸附在BD管壁上。向BD管中加入用X-VIVO重悬了的PBMC(外周血单个核细胞)。PBMC的浓度尽量控制在1-2×10⁶/ml，用移液器吹打重悬。加入5％总培养基体积的商品化人AB血清(sigma)。控制T细胞的密度为3×10⁶/ml。至少48h换液一次，若培养基出现明显变黄的现象，可以24h换液，重新调整细胞密度。在T细胞的培养中，每24h观察一次，观察克隆形态，清楚T细胞的形态变化，凋亡衰老倾向以及是否存在真菌细菌污染。同时估算T细胞总量。每次换液的时候血清和IL-2都需要即时溶解即时配。T细胞的离心换液，离心推荐为15ml BD管作为离心管，室温下300g/min，离心3min。

以下将以实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例1癌细胞对本发明CAR-T的增殖促进作用

1.方法

使用FAR RED细胞示踪荧光染料标记T细胞；该细胞示踪荧光染料附着于细胞膜上，若细胞分裂，一个细胞上的膜染料会随分裂而分布到两个新的细胞的膜上，从而细胞上的荧光会减弱一半；所以荧光强度越弱，表明细胞膜上的荧光染料更少，则细胞分裂越多，增殖越多。

被FAR RED细胞示踪荧光染料标记的T细胞有3组：

ROR1 CAR-T组：ROR1-CAR-T，即仅将实施例1中传统CAR基因片段通过病毒载体转入T细胞所得的CAR-T。

ROR1 dnTGFβRII-IL2β CAR-T组：本发明CAR-T，同时表达传统CAR(靶向ROR1的嵌合抗原受体)以及本发明的嵌合抗原受体dnTGF-βRII-CD8TM-IL-2Rβ，使用实施例1的方法得到。

NT组：Non-Transfected T，未转染病毒的T细胞，不表达CAR基因以及其他外源基因片段。

在5ng/ml TGF-β存在情况下，将前述三组T细胞与与卵巢癌细胞株SKOV3共培养，效靶比为3比1(T细胞为癌细胞的3倍)；24h后，检测T细胞的荧光。

2.结果

如图3所示，横轴代表FAR RED荧光信号强度，纵轴代表某一强度区间内细胞数量，曲线形成的峰越靠近原点，则荧光信号越弱。由图可知，ROR1 dnTGFβRII-IL2βCAR-T组荧光信号最弱，表明其增殖能力最强；ROR1CAR-T组增殖能力其次，NT组增殖能力最弱。

本实验例表明，针对TGF-β的改造能促进CAR-T的增殖活性。

实验例2本发明CAR-T在癌细胞/TGF-β环境中细胞因子分泌情况检测

1.方法

将T细胞(ROR1 CAR-T组、ROR1 dnTGFβRII-IL2β CAR-T组、NT组，同实验例1)与1×10⁴的卵巢癌细胞株SKOV3共培养，效靶比4∶1，在无TGF-β或存在5ng/ml TGF-β的情况下，培养24h；使用ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ和TNF-αt的水平。

注：SKOV3也可以释放少量的TGF-β，发明人曾经测过2×10⁵SKOV3 24h释放的TGF-β量是1934pg/ml，所以1×10⁴的SKOV3 24h也只释放96pg/ml左右，远远达不到5ng/ml，可以忽略不计。选择5ng/ml的TGF-β是参考现有文献[Zhang，Q.et al.Adoptive transfer oftumor-reactive transforming growth factor-beta-insensitive CD8+ T cells：eradication of autologous mouse prostate cancer.Cancer Res.65，1761-1769(2005).Foster，A.E.et al.Antitumor activity of EBV-specific T lymphocytestransduced with a dominant negative TGF-beta receptor.J.Immunother.31，500-505(2008).]的研究，模拟体内的TGF-β水平。

2.结果

如图4所示，在无TGF-β和5ng/ml TGF-β的情况下，ROR1 dnTGFβRII-IL2βCAR-T组的IFN-γ和TNF-α的释放水平均优于ROR1 CAR-T组。

结果表明，本发明的CAR-T相比传统CAR-T(ROR1-CAR-T)在TGF-β抑制的情况下具有更强的细胞因子释放能力，部分扭转了TGF-β的抑制作用。

本发明CAR-T是通过带有dnTGF-βRII和IL-2Rβ结构域的蛋白，将TGF-β的抑制信号转变成激活信号，然而，在没有TGF-β存在的情况下，本发明的CAR-T仍然可以比传统CAR-T更加高效地释放细胞因子。

综上，本发明的嵌合抗原受体能提高T细胞的增殖活性，相应的提升CAR-T释放IFN-γ和TNF-α的水平。表达该嵌合抗原受体的DNA片段以及带有该DNA片段的CAR-T(本发明的CAR-T)，具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

成都华西精准医学产业技术研究院有限公司

<120> 基于TGF-β改造的嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞

<130> GY819-2019P018214CC

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列（scFv）

<400> 1

gccaccatgc tgctgctggt gacaagcctg ctgctgtgcg agctgcccca ccccgccttt 60

ctgctgatcc cccaggaaca gctcgtcgaa agcggcggca gactggtgac acctggcggc 120

agcctgaccc tgagctgcaa ggccagcggc ttcgacttca gcgcctacta catgagctgg 180

gtccgccagg cccctggcaa gggactggaa tggatcgcca ccatctaccc cagcagcggc 240

aagacctact acgccacctg ggtgaacgga cggttcacca tctccagcga caacgcccag 300

aacaccgtgg acctgcagat gaacagcctg acagccgccg accgggccac ctacttttgc 360

gccagagaca gctacgccga cgacggcgcc ctgttcaaca tctggggccc tggcaccctg 420

gtgacaatct ctagcggcgg aggcggatct ggtggcggag gaagtggcgg cggaggatct 480

gagctggtgc tgacccagag cccctctgtg tctgctgccc tgggaagccc tgccaagatc 540

acctgtaccc tgagcagcgc ccacaagacc gacaccatcg actggtatca gcagctgcag 600

ggcgaggccc ccagatacct gatgcaggtg cagagcgacg gcagctacac caagaggcca 660

ggcgtgcccg accggttcag cggatctagc tctggcgccg accgctacct gatcatcccc 720

agcgtgcagg ccgatgacga ggccgattac tactgtggcg ccgactacat cggcggctac 780

gtgttcggcg gaggcaccca gctgaccgtg accggc 816

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Hinge/spacer）

<400> 2

gagtctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列（CD28tm）

<400> 3

atgttctggg tgctggtggt ggtgggcggg gtgctggcct gctacagcct gctggtgaca 60

gtggccttca tcatcttttg ggtg 84

<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列（CD28intra）

<400> 4

aggagtaaga ggagcagggg ctgccacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 5

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（4-1BB）

<400> 5

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（CD3 zeta）

<400> 6

cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120

cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240

aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列（P2A）

<400> 7

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 8

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列（dnTGF-βRII- CD8TM-IL-2Rβ）

<400> 8

atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60

gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120

aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180

tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240

caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300

tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360

tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420

gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480

ttgctagtca tatttcaaat ctacatttgg gcccctttag ccggcacatg tggcgtgctg 540

ctgctgtctt tagtgatcac aaactgcaga aacaccggcc cttggctgaa gaaggtgctg 600

aagtgcaaca cacccgaccc ttccaagttc ttcagccagc tgagctccga gcatggaggc 660

gacgtgcaga agtggctgtc cagccccttc cccagctcca gcttcagccc cggtggactg 720

gcccccgaaa tcagccctct ggaggtgctg gagagagaca aggtgacaca gctgctgctg 780

cagcctttat ccggagaaga tgacgcctac tgcacctttc cctctcgtga cgatttactg 840

ctgttctccc cttccttatt aggaggacct agccctccta gcaccgctcc cggtggaagc 900

ggtgctggcg aagagaggat gcctccttct ttacaagaaa gggtgcccag agactgggat 960

cctcagcctc tgggtccccc tacacccggt gtgcccgatc tggtggactt ccagccccct 1020

cccgaactgg tgctgaggga agctggtgaa gaggtccccg atgccggccc tagagaaggc 1080

gtgagctttc cttggagcag accccccggc caaggcgaat ttagagcttt aaatgctcgt 1140

ctgcctctga acaccgacgc ctatttatct ttacaagaac tgcaaggtca agatcctacc 1200

catttagtgt aa 1212

<210> 9

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列（dnTGF-βRII）

<400> 9

atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60

gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120

aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180

tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240

caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300

tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360

tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420

gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480

ttgctagtca tatttcaa 498

<210> 10

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列（dnTGF-βRII蛋白）

<400> 10

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

20 25 30

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

50 55 60

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

65 70 75 80

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

130 135 140

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu

145 150 155 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln

165

<210> 11

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列（IL-2Rβ）

<400> 11

aactgcagaa acaccggccc ttggctgaag aaggtgctga agtgcaacac acccgaccct 60

tccaagttct tcagccagct gagctccgag catggaggcg acgtgcagaa gtggctgtcc 120

agccccttcc ccagctccag cttcagcccc ggtggactgg cccccgaaat cagccctctg 180

gaggtgctgg agagagacaa ggtgacacag ctgctgctgc agcctttatc cggagaagat 240

gacgcctact gcacctttcc ctctcgtgac gatttactgc tgttctcccc ttccttatta 300

ggaggaccta gccctcctag caccgctccc ggtggaagcg gtgctggcga agagaggatg 360

cctccttctt tacaagaaag ggtgcccaga gactgggatc ctcagcctct gggtccccct 420

acacccggtg tgcccgatct ggtggacttc cagccccctc ccgaactggt gctgagggaa 480

gctggtgaag aggtccccga tgccggccct agagaaggcg tgagctttcc ttggagcaga 540

ccccccggcc aaggcgaatt tagagcttta aatgctcgtc tgcctctgaa caccgacgcc 600

tatttatctt tacaagaact gcaaggtcaa gatcctaccc atttagtg 648

<210> 12

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列（IL-2Rβ蛋白）

<400> 12

Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn

1 5 10 15

Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly

20 25 30

Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe

35 40 45

Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu

50 55 60

Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp

65 70 75 80

Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser

85 90 95

Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val

115 120 125

Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val

130 135 140

Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu

145 150 155 160

Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe

165 170 175

Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala

180 185 190

Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln

195 200 205

Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

210 215

<210> 13

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（CD8TM）

<400> 13

atctacattt gggccccttt agccggcaca tgtggcgtgc tgctgctgtc tttagtgatc 60

aca 63

<210> 14

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（CD8TM蛋白）

<400> 14

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（引物F）

<400> 15

cgggatccgc caccatgctg ctgctggtga ca 32

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（引物R）

<400> 16

ggaattctta cactaaatgg 20

Claims

1.一种带有dnTGF-βRII和IL-2Rβ结构域的蛋白，其特征在于，所述蛋白由dnTGF-βRII结构域和IL-2Rβ结构域，通过跨膜结构域相连而成；

所述dnTGF-βRII结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，且其是能特异性识别TGF-β的蛋白结构域；

所述IL-2Rβ结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

2.一种重组质粒，其特征在于：它包括能表达权利要求1所述蛋白的DNA片段。

3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述能表达权利要求1所述蛋白的DNA片段的序列如SEQ ID NO.8所示。

4.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：它还包括表达传统嵌合抗原受体的DNA片段；

所述传统嵌合抗原受体是能靶向识别肿瘤细胞表面蛋白的嵌合抗原受体。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述表达传统嵌合抗原受体的DNA与表达权利要求1所述蛋白的DNA之间通过表达自剪切2A肽段的DNA连接。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述表达自剪切2A肽段的DNA序列如SEQID NO.7所示。

7.一种重组病毒，其特征在于：所述重组病毒能表达权利要求1所述的蛋白。

8.如权利要求7所述的重组病毒，其特征在于：所述病毒携带权利要求4-6任一项所述的重组质粒。

9.一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞含有权利要求1所述的蛋白，dnTGF-βRII结构域位于细胞膜外侧，IL-2Rβ结构域位于细胞膜内侧；

它还含有至少一种特异性靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体。

10.如权利要求9所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述特异性靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体的胞外段可靶向CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、HER2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、ROR1、CD44抗原中的至少一种。

11.如权利要求10所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞为T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。

12.如权利要求11所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞为T细胞。

13.权利要求1所述的蛋白、权利要求2～6任一所述的重组质粒、权利要求7或8所述的重组病毒或权利要求9～12任一所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备预防或治疗恶性肿瘤的药物中的用途；所述恶性肿瘤为实体瘤。