CN111171158B - 同时靶向bcma和cd38的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其制备方法；本发明公开了一种针对多发性骨髓瘤细胞表面BCMA和CD38双靶点的嵌合抗原受体的构建与应用。本发明以BCMA抗原和CD38的空间表位为靶点，将BCMA抗体的scfv区，CD38抗体的scfv区，CD8的跨膜区，4‑1BB胞内信号区，CD3zeta胞内信号区，进行串联，构建的嵌合抗原受体用于治疗多发性骨髓瘤，以解决CAR‑T细胞疗法在在治疗多发性骨髓瘤中的高复发问题；有效治疗多发性骨髓瘤瘤，并为多发性骨髓瘤复发/转移的有效防治提供新策略。

Description

同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术，尤其涉及一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)，是以骨髓中浆细胞异常增殖为特征的恶性“克隆性疾病”，仅有25％的患者接受化疗后生存期在5年以上；在血液学恶性肿瘤中，其发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤，是第三大常见血液肿瘤，全世界每年新增病例约114,000例；自1959-2017年，针对多发性骨髓瘤已上市20款药物，主要集中于蛋白酶抑制剂、免疫调节剂，这些新的治疗手段使MM患者的生存率有了很大的提高。然而值得关注的是，大部分的MM患者经过多次治疗后,依旧会出现复发；故更为安全有效的药物，仍为临床急需。
BCMA(B-cell maturation antigen)是B细胞成熟抗原，由185个氨基酸残基组成的III型跨膜蛋白，属TNF受体超家族，其配体属于TNF超家族，如增殖诱导配体(APRIL)B淋巴细胞刺激因子(BAFF)，BCMA与其配体结合后，可激活B细胞的增殖和存活。BCMA特异高表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面，而在造血干细胞和其他正常组织细胞中均不表达，因此，BCMA可以作为MM的靶向性治疗的理想靶点。
目前以BCMA为靶点的抗体主要有CA8(专利：US 20140105915A1)；C11D5.3、C12A3.2(专利：WO 2010104949A2)；J22.9-xi(PDB：4ZFO)；13A4(专利：WO 2014122143)，实验数据显示这些抗体与BCMA有很好的结合，并可以很有效地阻断配体与受体的结合，在体外对BCMA高表达的细胞有很强的结合率，以及抑制由BAFF和APIRL诱导引起的增殖抑制作用，同时临床前荷瘤鼠模型中均显示出很好肿瘤细胞清除率，其中以鼠源抗体CA8为基础设计的ADC药物(J6M0-mcMMAF)进入临床治疗阶段。Nitya S等设计出了以C11D5.3为基础的，通过化学偶联得到的BCMA、CS1双特异性Fab抗体，发现其对多发性骨髓瘤细胞有更强的抑制作用。
CD38分子是单链Ⅱ型跨膜糖蛋白，催化环腺苷二磷酸核糖的合成和降解，参与钙动员，与受体调节的黏附作用密切相关。所有多发性骨髓瘤细胞均高表达，正常情况下在一些非造血组织的淋巴细胞、骨髓细胞相对低表达.Kong等证明了新型鼠抗人CD38单抗daratumumab可通过补体介导细胞毒作用(CDC)或抗体依赖性细胞毒作用在无论骨髓基质细胞是否存在的条件下杀伤CD38+骨髓瘤细胞。另外，结合daratumumab和抗免疫球蛋白G抗体可诱导骨髓瘤细胞凋亡。鼠多发性骨髓瘤模型研究发现，雷利度胺预处理瘤细胞，daratumumab的抗体依赖性细胞毒作用杀伤作用加强.
嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体，其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力。CAR由CD8a引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、跨膜区、以及T细胞的一系列信号转导区(CD28，CD3，CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。T细胞经修饰后，表面表达的CAR首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合，然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内，靶向地激活T细胞对肿瘤细胞杀伤活性。将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的T细胞，使T细胞表面表达相应的CAR，再将此修饰的T细胞再输回患者体内，修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，达到清除肿瘤细胞的效果。
目前，以BCMA为靶点的CAR-T细胞疗法已开展了多个临床试验，在一项早期临床试验中，35名多发性骨髓瘤患者接受了针对B细胞成熟蛋白(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫治疗，其中33名(94％)患者出现临床缓解。大多数患者只有轻微的副作用。该研究由Fan等人在2017年ASCO年会(摘要LBA3001)上提出。但是BCMA-CART面临一个高复发率的问题，复发的可能原因是BCMA靶点的丢失。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其应用。
技术方案：本发明所述的一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，包括能同时结合BCMA抗原和CD38抗原的胞膜外抗原结合区、跨膜区和胞内结构域，其中，所述胞膜外抗原结合区包括用于结合BCMA抗原的anti-BCMAscFv和用于结合CD38抗原的anti-CD38scfv；所述anti-BCMA scfv的重链氨基酸序列如SEQ NO.1所示，轻链序列如SEQ NO.2所示；所述anti-CD38 scfv的重链氨基酸序列如SEQ NO.3所示，轻链序列如SEQ NO.4所示。
其中，所述anti-BCMA scfv和anti-CD38 scfv采用串联或并联的方式通过Linker链接。
进一步的，上述嵌合抗原受体的胞外结构为VH1-VL1-VH2-VL2、VL1-VH1-VH2-VL2、VH1-VL1-VL2-VH2、VL1-VH1-VL2-VH、VH2-VL2-VH1-VL1、VH2-VL2-VL1-VH1、VL2-VH2-VH1-VL1、VL2-VH2-VL1-VH1中的任一种，其中1为anti-BCMA scfv，2为anti-CD38 scfv。
优选的，所述胞膜外抗原结合区氨基酸序列如SEQ NO.5所示。
进一步的，上述嵌合抗原受体还包括胞外信号肽结构，信号肽结构为CD8a信号肽，氨基酸序列如SEQ NO.6所示；还包括连接胞外区肽段与跨膜区肽段的铰链区CD8a，氨基酸序列如SEQ NO.7所示。
进一步的，所述跨膜区结构为CD8a，其氨基酸序列如SEQ NO.8所示；所述胞内信号结构域或共刺激信号结构域为CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD3。
优选的，所述胞内结构域包含SEQ NO.10所示的CD3zeta氨基酸序列，胞内共刺激信号结构域包含SEQ NO.9所示的4-1BB氨基酸序列。
综上，本申请嵌合抗原受体包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括信号肽、能同时结合BCMA抗原和CD38抗原的胞膜外抗原结合区，所述跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段，所述胞内结构域为CD3zeta，共刺激信号结构域为4-1BB。其中，所述胞外区肽段与跨膜区肽段通过铰链区肽段相连。
优选的，所述嵌合抗原受体编码的氨基酸序列如SEQ NO.11所述。
编码所述同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体的基因也在本发明的保护范围内。所述基因的核酸序列如SEQ NO.12所示。
一种含有上述基因的重组表达载体也在本发明的保护范围内。
一种含有上述基因或者重组表达载体的宿主细胞也在本发明保护范围内。
本发明还公开了上述嵌合抗原受体、核酸分子、载体、宿主细胞用于制备预防或治疗肿瘤的药物的用途。所述肿瘤为多发性骨髓瘤。
有益效果：本发明以人BCMA、CD38为靶点，同时靶向多发性骨髓瘤的两个表面标志物，可以有效防止因单个靶点丢失导致的肿瘤复发，靶向杀伤多发性骨髓瘤，有效降低治疗后肿瘤复发率，延长病人生存周期。
附图说明
图1是本发明中嵌合抗原受体的示意图；
图2是BCMA-CD38-CAR-T细胞对靶细胞RPMI8226的杀伤能力对比结果图；
图3是BCMA-CD38-CAR-T细胞分泌IL-2能力对比结果图；
图4是BCMA-CD38-CAR-T细胞分泌IFN-γ能力对比结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
实施例一 嵌合抗原受体(CAR)慢病毒表达载体构建
以4-1BB(又称CD137)的胞内结构域和CD3Zeta的ITAM区作为激活信号，与BCMA和CD38的单链抗体进行融合，构建嵌合抗原受体表达载体，并亚克隆至PLVX-EF1a(购自clontech)载体中。构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中各个元件的组合顺序如图1所示：
所构建的嵌合抗原受体中各元件氨基酸序列分别如下：
VH1：SEQ1：
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS
VL1：SEQ2：
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK
VH2：SEQ3：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVVFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS
VL2：SEQ4：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
信号肽：SEQ NO.6
MALPVTALLLPLALLLHAARP
胞外抗原结合区序列：SEQ NO.5
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVVFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
CD8铰链区：SEQ NO.7
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8跨膜区：SEQ NO.8
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
CD137(4-1BB)胞内域：SEQ NO.9
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEGGCEL
CD3Zeta：SEQ NO.10
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ NO.11
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVVFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ NO.12
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACGCCATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACACCAACACCCGCGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGCGGCCGCTTCGCCTTCAGCCTGGAGACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTCTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGGCCGTGAGCCCCGGCCAGCGCGCCACCATCACCTGCCGCGCCAGCGAGAGCGTGAGCTTCCTGGGCATCAACCTGATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACCAGGCCAGCAACAAGGACACCGGCGTGCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAACCCCGTGGAGGCCAACGACACCGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAGCCGCACCATCCCCCGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCCGTGAGCGGCTTCACCTTCAACAGCTTCGCCATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCGCCATCAGCGGCAGCGGCGGCGGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGGTGTTCTGCGCCAAGGACAAGATCCTGTGGTTCGGCGAGCCCGTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGCGCGCCACCCTGAGCTGCCGCGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCGCGCCACCGGCATCCCCGCCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCGCAGCAACTGGCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGACCACCACCCCCGCCCCCCGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGC
实施例二 慢病毒制备
具体实验步骤如下：
S1、准备15cm皿，接种5*106个293T细胞(购自ATCC)，加入完全培养基(DMEM高糖、10％FBS、双抗)，置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。
S2、从冰箱中取出100μM PEI及慢病毒包装质粒(Lenti-EF1a-CAR、pGP、pVSVG)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入10μg Lenti-EF1a-CAR、4μg pGP、2μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μL 100μM PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
S3、将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。
连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，加入20％体积的50％PEG6000溶液，4度孵育2h，转至离心管中，配平后，3000xg 4℃离心0.5小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。
实施例三 原代T细胞的分离
具体实验步骤如下：
S1、将淋巴细胞分离液上下颠倒数次，充分混匀Lymphoprep试剂。
S2、在生物安全柜中，向50mL离心管(或15mL离心管，视分离血样的体积而定)中加入15mL Lymphoprep试剂，备用。
S3、将血样使用等体积的PBS+2％FBS进行稀释。
S4、使用移液枪小心的将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。
S5、将离心机设置为800xg，转速下降速度设为最慢，室温离心20分钟。
S6、离心结束后，收集上层浅黄色血清至另一个无菌离心管中，贮存于-80℃。
S7、轻轻的将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。
S8、将细胞密度调整至1*108细胞/mL(总体积不超过2.5mL)，重悬于5mL的圆底管中。
S9、加入100μl/mL的抗体cocktail，充分混匀后，室温孵育15分钟。
S10、取出磁珠，用移液枪上下吹打至少5次，充分混匀。
S11、吸取50μl磁珠/mL至上述样品中，充分混匀后，室温孵育10分钟。
S12、添加完全培养基至管内总体积为2.5mL，将管子(开盖)插入磁极中，室温静置5分钟。
S13、孵育完毕后，管子继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。
S14、将细胞重悬于X-vivo 15培养基中，并添加10％FBS，300U/mL IL-2,5ng/mLIL-15和10ng/mL IL-7。
实施例四 原代T细胞的激活与慢病毒感染
具体实验步骤如下：
S1、调整细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度为300U/mL的IL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、500ng/mL Anti-CD3(OKT3)、2ug/mL Anti-CD28)，连续培养48小时。
S2、按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度.
S3、从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800xg离心1小时。
S4、离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％CO2的培养箱中，继续培养24小时。
S5、250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用。
实施例五 CAR-T细胞对靶细胞裂解
具体实验步骤如下：
S1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
S2、用靶细胞重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，过夜培养。
S3、离心收集上述制备的CAR-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入CAR-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；Maxi lysis和Mini lysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加CAR-T细胞。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养6小时。
S4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向Maxi lysis孔加入LDH检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL至另一个新的96孔板中，加入LDH检测试剂后，使用酶标仪读取OD值。
靶细胞裂解百分数计算公式：
Figure BDA0002371706690000101
S5、将上述处理后的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
实验结果：
以CAR-T细胞为效应细胞，以天然表达BCMA骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的CAR-T细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，检测培养基上清中LDH的释放量，以此反映CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力，结果如图2所示，靶向BCMA/CD38的嵌合抗原受体，在效靶比为1：1时即可高效的介导T细胞对肿瘤细胞或重组细胞的杀伤；随着效靶比的升高，CAR-T细胞对靶细胞RPMI8226的杀伤作用也随之升高，在效靶比为8:1时达到最高。
实施例六 CAR-T细胞因子分泌水平检测
具体实验步骤如下：
S1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
S2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO237℃培养箱中，过夜培养。
S3、离心收集上述制备的CAR-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入CAR-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养6小时。同时设置对照T细胞组。
S4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL培养基上清，使用ELISA kit检测IFN-γ和IL-2的表达，使用酶标仪读取OD值。
S5、将上述获取的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
实验结果：
以CAR-T细胞为效应细胞，以天然表达BCMA和CD38的骨髓瘤细胞株RPMI8226.按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的CAR-T细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，用ELISA的方法检测培养基上清中由CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后分泌的IFN-γ和IL-2的表达量；结果如图3和图4所示，BCMA-CD38-CART嵌合抗原受体与靶向肿瘤细胞结合后，可以有效的激活原代T细胞，并引起细胞因子分泌表达量的升高；在效靶比为1:1时，CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后，即可分泌大量的IFN-γ和IL-2,显著高于对照T细胞；在效靶比为8:1时分泌量达到最高值。
序列表
<110> 南京蓝盾生物科技有限公司
<120> 同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Leu
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Val Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
130 135 140
Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Ser Phe Leu Gly Ile Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Asn Lys Asp Thr
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
260 265 270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn
275 280 285
Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
305 310 315 320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
325 330 335
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Val
340 345 350
Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp
355 360 365
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
385 390 395 400
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
405 410 415
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
420 425 430
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
435 440 445
Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
450 455 460
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly
485 490 495
Thr Lys Val Glu Ile Lys
500
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 11
<211> 744
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Arg Glu Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
145 150 155 160
Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys
165 170 175
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Phe Leu Gly Ile Asn Leu Ile His Trp
180 185 190
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala
195 200 205
Ser Asn Lys Asp Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
290 295 300
Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
305 310 315 320
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
340 345 350
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
355 360 365
Asp Thr Ala Val Val Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly
370 375 380
Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
405 410 415
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
435 440 445
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
450 455 460
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
485 490 495
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
500 505 510
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala
515 520 525
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
530 535 540
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
545 550 555 560
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
565 570 575
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
580 585 590
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
595 600 605
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
610 615 620
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
625 630 635 640
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
645 650 655
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
660 665 670
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
675 680 685
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
690 695 700
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
705 710 715 720
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
725 730 735
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
740
<210> 12
<211> 2232
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggccctgc ccgtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60
ccccaggtgc agctggtgca gagcggcagc gagctgaaga agcccggcgc cagcgtgaag 120
gtgagctgca aggccagcgg ctacaccttc accagctacg ccatgaactg ggtgcgccag 180
gcccccggcc agggcctgga gtggatgggc tggatcaaca ccaacacccg cgagcccgcc 240
tacgcctacg acttccgcgg ccgcttcgcc ttcagcctgg agaccagcgc cagcaccgcc 300
tacctgcaga tcaacaacct gaagtacgag gacaccgcca cctacttctg cgccctggac 360
tacagctacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagcggcggc 420
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg acatcgtgct gacccagagc 480
cccgccagcc tggccgtgag ccccggccag cgcgccacca tcacctgccg cgccagcgag 540
agcgtgagct tcctgggcat caacctgatc cactggtacc agcagaagcc cggccagccc 600
cccaagctgc tgatctacca ggccagcaac aaggacaccg gcgtgcccgc ccgcttcagc 660
ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg accatcaacc ccgtggaggc caacgacacc 720
gccgtgtact actgcctgca gagccgcacc atcccccgca ccttcggcgg cggcaccaag 780
ctggagatca agggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcgag 840
gtgcagctgc tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgcctgagc 900
tgcgccgtga gcggcttcac cttcaacagc ttcgccatga gctgggtgcg ccaggccccc 960
ggcaagggcc tggagtgggt gagcgccatc agcggcagcg gcggcggcac ctactacgcc 1020
gacagcgtga agggccgctt caccatcagc cgcgacaaca gcaagaacac cctgtacctg 1080
cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc gccgtggtgt tctgcgccaa ggacaagatc 1140
ctgtggttcg gcgagcccgt gttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 1200
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcga gatcgtgctg 1260
acccagagcc ccgccaccct gagcctgagc cccggcgagc gcgccaccct gagctgccgc 1320
gccagccaga gcgtgagcag ctacctggcc tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc 1380
cgcctgctga tctacgacgc cagcaaccgc gccaccggca tccccgcccg cttcagcggc 1440
agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tggagcccga ggacttcgcc 1500
gtgtactact gccagcagcg cagcaactgg ccccccacct tcggccaggg caccaaggtg 1560
gagatcaaga ccaccacccc cgccccccgc ccccccaccc ccgcccccac catcgccagc 1620
cagcccctga gcctgcgccc cgaggcctgc cgccccgccg ccggcggcgc cgtgcacacc 1680
cgcggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ccctggccgg cacctgcggc 1740
gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 1800
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc 1860
agctgccgct tccccgagga ggagggcggc tgcgagctgc gcgtgaagtt cagccgcagc 1920
gccgacgccc ccgcctacaa gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1980
cgccgcgagg agtacgacgt gctggacaag cgccgcggcc gcgaccccga gatgggcggc 2040
aagccccgcc gcaagaaccc ccaggagggc ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg 2100
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgcc gcggcaaggg ccacgacggc 2160
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc 2220
ctgccccccc gc 2232

Claims (4)

1.一种同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ NO.11所述。
2.编码权利要求1所述同时靶向BCMA和CD38的嵌合抗原受体的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列如SEQ NO.12所述的。
3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体或宿主细胞。
4.权利要求1所述嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体或宿主细胞在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤为骨髓瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112175092B (zh) * 2020-09-08 2022-02-22 徐州医科大学附属医院 同时靶向lmp1和gp350的双靶标嵌合抗原受体及其应用
CN113549157B (zh) * 2021-07-05 2023-05-02 北京中医药大学 双靶向嵌合抗原受体及其应用
CN113663061A (zh) * 2021-08-04 2021-11-19 上海优卡迪生物医药科技有限公司 Cd38在制备car-t药物中的应用
CN116410331B (zh) * 2021-12-31 2024-01-30 合源生物科技(天津)有限公司 靶向cs1的嵌合抗原受体、靶向bcma/cs1的双特异性嵌合抗原受体及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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