CN110698564A

CN110698564A - 一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN110698564A
Application number: CN201910967249.2A
Authority: CN
Inventors: 张坤
Original assignee: Huaxia Yuan (shanghai) Cell Genetic Engineering Ltd By Share Ltd
Current assignee: Huaxia Yuan (shanghai) Cell Genetic Engineering Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: CN110698564B

Abstract

本发明公开了一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、靶向GPC3单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，靶向GPC3单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。该双靶点嵌合抗原受体能够避免低丰富抗原表达肿瘤细胞产生逃逸的问题，从而有效降低肿瘤复发的风险。

Description

一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用。

背景技术

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，大部分的原发性肝癌为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)，它在恶性肿瘤的发病率中排名第五，致死率为第三。在我国，肝癌的发病率和死亡率位居癌症中的第二位。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor gene-modified T cell，CAR-T)技术是将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建而成。CAR-T在血液瘤中的应用中表现出令人可喜的治疗效果，特别对复发、难治的B淋巴细胞白血病病人，缓解达到90％以上。但在实体瘤的应用方面，特别是肝癌方面，由于缺乏肿瘤特异性抗原和实体瘤本身的肿瘤异质性和肿瘤微环境更为复杂，致使其抗肿瘤的效果不佳。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种双靶点嵌合抗原受体，包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、靶向GPC3单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述靶向GPC3单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

具体地，所述双靶点嵌合抗原受体还包括连接肽，所述连接肽连接在所述靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区和所述靶向GPC3单链抗体之间。

进一步地，所述连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

具体地，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述双靶点嵌合体抗原受体。

进一步地，所述载体为慢病毒载体。

再一方面，本发明实施例提供了一种上述双靶点嵌合体抗原受体的应用，所述应用包括：将所述双靶点嵌合体抗原受体作为抗肿瘤药物，且所述肿瘤表达靶蛋白NKG2DL和靶蛋白GPC3中的至少一种。

具体地，所述应用包括：将所述双靶点嵌合体抗原受体作为抗肝癌药物。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、靶向GPC3单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够有效识别NKG2DL抗原或GPC3抗原共同表达的肿瘤细胞，还能够有效识别NKG2DL抗原和GPC3抗原共同表达的肿瘤细胞，而且，相较于常规的单靶点嵌合抗原受体，双靶点嵌合抗原受体及其表达载体具有更强的抗肿瘤活性，使该双靶点嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，从而展现出良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的双靶点嵌合抗原受体的结构示意图；

图2是本发明实施例二提供的慢病毒转染效率图；

图3是本发明实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图4是本发明实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图5为本发明实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本发明实施例提供的双靶点嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对PLC/PRF/5细胞的杀伤能力，B为未转染的T细胞对PLC/PRF/5细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本发明提供了一种双靶点嵌合抗原受体，如图1所示，该双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽(CD8α leader)、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区(NKG2D ECD)、靶向GPC3单链抗体(GPC3 scFv)、加长CD8α铰链区(CD8α Hinge)、跨膜区(CD8αtransmembrane)、共刺激因子和胞内信号域(CD3ζ signal)，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，靶向GPC3单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

具体地，双靶点嵌合抗原受体还包括连接肽，连接肽连接在靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区和靶向GPC3单链抗体之间。

进一步地，连接肽可以为(EAAAK)n，其中n可以为3，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO：7所示。

具体地，共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，共刺激因子为4-1BB，且共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：8所示。

在本实施例中，靶向GPC3单链抗体包括重链可变区V_H和轻链可变区V_L，信号肽、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、靶向GPC3单链抗体的重链可变区V_H、靶向GPC3单链抗体的轻链可变区V_L、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域之间可以直接连接，也可以采用接头序列连接，接头序列可以为连接肽(G₄S)₃。

从NCBI网站数据库分别搜索到人靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、人CD8α信号区、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB、胞内区和人CD3ζ胞内区基因序列信息，靶向GPC3单链抗体的重链可变区V_H和轻链可变区V_L，这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因全合成嵌合抗原受体基因序列，结构为CD8α leader-NKG2D ECD-连接肽(EAAAK)₃-GPC3 scFv-CD8αHin ge-CD8α transmembrane-(4-1BB signal)-CD3ζ signal，标记为CAR02。

本实施例中，该双靶点嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。相应地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

实施例二

本发明提供了一种表达载体，表达载体包括载体和实施例一提供的双靶点嵌合抗原受体。载体可以为慢病毒载体。

下面简单介绍一下该表达载体的制备方法，具体如下：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增并获得CAR02基因序列，在CAR02基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoR I，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和EcoR I的双酶切反应，得到含有CAR02的酶切片段和含有ppCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系(总体积50μL)包括：5μL的10×buffer；5μg的待酶切物的DNA；2μL的Xba I酶；2μL的EcoR I酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。

将含有CAR02的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CAR02的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CAR02酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。

将得到的CAR02酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-CAR02-T2A-copGFP，即表达载体。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的CAR02酶切产物、1μL的T4 DNA连接酶和1μL的10×T4DNA连接酶Buffer。

将连接产物转入Stb13感受态细胞(购置于TRANSGEN BIOTECH)中，具体方法如下：

取出保存在-80℃冰箱中的Stbl3感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。

将转化产物加入900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。

将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司)上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。

在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。

鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：

将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，获得了大小约为2000bp的目标片段。经测序鉴定可知该目标序列为CAR02基因序列。

提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。

将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物(菌体)。

采用无内毒素质粒大提试剂盒(购自天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。

慢病毒载体质粒包装：在转染前6h，以每皿约8.5×10⁶个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80％左右，且均匀分布于培养皿中。

制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液(8个培养皿一起包装的量)，溶液B包括：72ug质粒(target plasmid)、37.04ug包装质粒PLP1、34.8ug包装质粒PLP2、24.08ug包装质粒PLP-VSVG和400μL 2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3～5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面(注意晃动时不要旋转培养皿)，将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm/min离心5min后保留上清液，收集合慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。

将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20％的蔗糖(每8mL含慢病毒载体质粒的滤液加1mL蔗糖)。以PBS(phosphatebuffer saline，磷酸缓冲盐溶液)平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm/min离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μL PBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的慢病毒(嵌合抗原受体的基因质粒载体)，在实现时可将浓缩的慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

慢病毒滴度检测：取浓缩的慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞(1×10⁵个/孔)24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA，并将基因组DNA浓度稀释至5～100ng/μL。采用TransLv^TM Lentivirus qPCR Titration Kit(购自TransGen)，具体方法按照其说明书进行。经检测可知该慢病毒滴度为3.6×10⁸TU/mL。

制备嵌合抗原受体的T细胞，具体方法如下：

PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞)的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10％的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.2×10⁷个。

慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×10⁶/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到抗人50ng/mL CD3抗体和50ng/mL CD28抗体中，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将慢病毒以MOI＝5的感染系数进行转染，并添加8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8～13天。得到转染的CAR-T细胞。

慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的CAR-T细胞，于1000rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用PBS溶液洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的CAR-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图2所示。

CAR-T细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：

为了检测经过慢病毒转染后的CAR-T细胞是否被有效激活，本实施例采用CAR-T细胞和不表达CAR的T细胞分别与靶细胞(表达NKG2DL和GPC3靶蛋白的人肝癌亚力山大细胞，PLC/PRF/5)细胞共培养，通过ELISA试剂盒检测细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2的分泌量。具体地，分别将每孔1×10⁶个CAR-T细胞和每孔1×10⁵个靶细胞接种至6孔板中，于37℃、浓度为5％的CO₂中培养24h。吸取培养的上清液，于1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2。如图3和图4所示，图3为细胞因子IL-2分泌量的对比图，图4为细胞因子IFNγ分泌量的对比图。结合图3和图4可知，本发明实施例提供的CAR-T细胞分泌的细胞因子IL-2和细胞因子IFNγ均增加，由此可知该经过慢病毒转染后的CAR-T细胞已经被有效激活。

体外抗肿瘤效果：①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基(记作Ab)，第二组中均加入100μL培养基和100μL1×10⁴个靶细胞(记作Ack)，第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第四组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝1∶1)，第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第六组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝5∶1)，第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作Acn)，第八组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝10∶1)。①组靶细胞为人肝癌亚力山大细胞(PLC/PRF/5)，效应细胞为转染CAR结构的CAR-T细胞。

②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为人肝癌亚力山大细胞(PLC/PRF/5)，效应细胞为未转染的T细胞(不表达CAR结构的T细胞)。

将96孔板孵育4h后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％，式中，As为试验孔(含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8)，Ack为靶细胞对照孔(含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液)，Acn为效应细胞对照孔(含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液)，Ab为空白对照(不合细胞的培养基和CCK-8溶液)。图5为本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，如图5所示，本发明实施例提供的双靶点嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞对PLC/PRF/5细胞杀伤能力明显优于不合CAR结构的T细胞。由此可见，本发明实施例提供的表达载体具有良好的抗肿瘤活性。

又一方面，本发明提供了一种上述靶向NKG2DL和GPC3的双靶点嵌合抗原受体的应用，应用包括：将双靶点嵌合抗原受体作为抗肿瘤药物，且肿瘤表达靶蛋白NKG2DL和靶蛋白GPC3中的至少一种。

具体地，该应用还可以包括：将双靶点嵌合体抗原受体作为抗肝癌药物，且该肝癌表达靶蛋白NKG2DL和靶蛋白GPC3中的至少一种。

本发明实施例提供了一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、靶向GPC3单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够有效识别NKG2DL抗原或GPC3抗原共同表达的肿瘤细胞，还能够有效识别NKG2DL抗原和GPC3抗原共同表达的肿瘤细胞，而且，相较于常规的单靶点嵌合抗原受体，双靶点嵌合抗原受体及其表达载体具有更强的抗肿瘤活性，使该双靶点嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，从而展现出良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华夏源(上海)细胞基因工程股份有限公司

<120> 一种双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60

aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120

gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180

gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240

acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300

attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360

aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405

<210> 3

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgtcgtca tgacgcagtc accgctttca cttcctgtca cacctgggga gcccgcaagc 60

attagctgcc gctcaagtca gtcactggtt cactctaatg caaacacata cctgcactgg 120

taccttcaaa agcccggtca aagcccacaa cttctgatat ataaggtaag caatagattc 180

tccggtgtac ctgataggtt ttcaggaagt gggtccggta cagactttac attgaaaata 240

agtagagtgg aggcagagga tgtaggagtg tactactgtt ctcaaaacac ccacgtacca 300

ccgacatttg ggcaggggac aaagttggaa attaagagag gtggcggtgg ctcgggcggt 360

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420

aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480

gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540

cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600

gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660

gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720

gtctcctca 729

<210> 4

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180

atctgggcg 189

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 60

cacaggaac 69

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaagccgccg caaaggaagc tgctgccaaa gaagcagccg ctaag 45

<210> 8

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 9

<211> 1962

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120

aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180

tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240

gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300

ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360

ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420

gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga agccgccgca 480

aaggaagctg ctgccaaaga agcagccgct aaggacgtcg tcatgacgca gtcaccgctt 540

tcacttcctg tcacacctgg ggagcccgca agcattagct gccgctcaag tcagtcactg 600

gttcactcta atgcaaacac atacctgcac tggtaccttc aaaagcccgg tcaaagccca 660

caacttctga tatataaggt aagcaataga ttctccggtg tacctgatag gttttcagga 720

agtgggtccg gtacagactt tacattgaaa ataagtagag tggaggcaga ggatgtagga 780

gtgtactact gttctcaaaa cacccacgta ccaccgacat ttgggcaggg gacaaagttg 840

gaaattaaga gaggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctcag 900

gtgcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 960

tgcaaggctt ctggatacac cttcaccgac tatgaaatgc actgggtgcg acaggcccct 1020

ggacaagggc ttgagtggat gggagctctt gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt 1080

cagaagttca agggcagagt cacgctgacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 1140

gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtacaag attctactcc 1200

tatacttact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct cagcggccgc attcgtgccg 1260

gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 1320

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 1380

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 1440

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac 1500

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1560

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1620

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1680

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1740

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1800

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1860

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1920

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1962

<210> 10

<211> 654

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ala Gly Gly Val Gly Ile Pro Leu Thr

20 25 30

Gly Ser Thr Cys Gly Pro Cys Pro Leu Ala Thr Ile Cys Thr Leu Ala

35 40 45

Ala Cys Thr Gly Pro Pro Ala Gly Ser Leu Ala Thr Thr Gly Ser Gly

50 55 60

Ala Ser Cys Met Ser Gly Ala Ala Ser Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu

65 70 75 80

Gly Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Val Leu Ser Thr His Thr Met Gly

85 90 95

Leu Val His Ile Pro Thr Ala Gly Ser Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ser

100 105 110

Ile Leu Ser Pro Ala Leu Leu Thr Ile Ile Gly Met Gly Leu Gly Ala

115 120 125

Cys Ala Leu Thr Ala Ser Ser Pro Leu Gly Thr Ile Gly Ala Cys Ser

130 135 140

Thr Pro Ala Thr Thr Ile Cys Met Gly Ala Thr Val Gly Ala Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Leu Ala Val Val Met Thr

165 170 175

Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Gly Pro Ala Ser Ile

180 185 190

Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Val His Ser Ala Ala Ala Thr Thr

195 200 205

Leu His Thr Thr Leu Gly Leu Pro Gly Gly Ser Pro Gly Leu Leu Ile

210 215 220

Thr Leu Val Ser Ala Ala Pro Ser Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser Gly

225 230 235 240

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile Ser Ala Val Gly Ala

245 250 255

Gly Ala Val Gly Val Thr Thr Cys Ser Gly Ala Thr His Val Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Leu Val

290 295 300

Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro Gly Ala Ser Val Leu Val Ser

305 310 315 320

Cys Leu Ala Ser Gly Thr Thr Pro Thr Ala Thr Gly Met His Thr Val

325 330 335

Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Ala Leu Ala Pro

340 345 350

Leu Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ser Gly Leu Pro Leu Gly Ala Val Thr

355 360 365

Leu Thr Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Met Gly Leu Ser Ser

370 375 380

Leu Ala Ser Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys Thr Ala Pro Thr Ser

385 390 395 400

Thr Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

405 410 415

Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala

420 425 430

Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser

435 440 445

Leu Ala Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

450 455 460

Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala

465 470 475 480

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys

485 490 495

Ala His Ala Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu

500 505 510

Gly Pro Pro Met Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys

515 520 525

Ser Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val

530 535 540

Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala

545 550 555 560

Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val

565 570 575

Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala

580 585 590

Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu

595 600 605

Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala

610 615 620

Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu

625 630 635 640

Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

645 650

Claims

1.一种双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区、靶向GPC3单链抗体、加长CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述靶向GPC3单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述加长CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号域的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述双靶点嵌合抗原受体还包括连接肽，所述连接肽连接在所述靶向NKG2DL的受体NKG2D胞外区和所述靶向GPC3单链抗体之间。

3.根据权利要求2所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

4.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括载体和如权利要求1～5任一项所述的双靶点嵌合体抗原受体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。

8.一种如权利要求1～5任一项所述的双靶点嵌合体抗原受体的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述双靶点嵌合体抗原受体作为抗肿瘤药物，且所述肿瘤表达靶蛋白NKG2DL和靶蛋白GPC3中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述应用包括：将所述双靶点嵌合体抗原受体作为抗肝癌药物。