具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明,具体说明发明的实施例不应解释为限制本分明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进,所有这些改进,均应落入本发明的的精神和范围之内。
下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照制造商所建议的条件。除非另有说明,否则百分比按重量计算。一下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
虽然在本发明的实施例中可以使用与本发明所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处列举优选的材料和方法。
实施例1制备表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞
本发明所述的表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞制备方法如下:
一、优化密码子:准备CD133嵌合抗原受体(CAR),进行密码子优化,使之更易于在人体细胞内表达,密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
二、构建携带CD133-CAR及抗体基因的慢病毒质粒:
通过基因合成获得CD133-CD8-CD28-4-1BBL-CD3ζ+EF1+anti PD1基因,且基因两端分别带有SanB1/Sall酶切位点。所述CD133基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,EF1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,CD8、CD28、4-1BBL、CD3ζ等基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。SnaB1/Sall双酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体(见图1),通过in-Fusion技术将各基因片段克隆至载体中,挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向CD133且分泌PD-1抗体的慢病毒载体,命名为pCDH-CMV-CD133-Myc-EF1-anti-PD1-3rd质粒,如图2所示。
三、携带CD133-CAR及抗体基因的重组慢病毒质粒感染293FT细胞,制备可感染T细胞的重组慢病毒载体;
1.293FT细胞长到90%时,提前1h换无双抗培养液(此时细胞营养充分,细胞会变的饱满和圆润,细胞状态很好);
2.配制lipo2000(40μL)+1.5ml OptimMEM(一个10cm dish的用量),混匀,静置5min;
3.配制质粒混合液:准备一支无菌的5mL离心管加入1.5mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒(pRSV-Rev(addgene,#12253)、pCMV-VSV-G(addgene,#8454)、pMDLg-pRRE(addgene,#12251),分别见图3-5)和慢病毒表达质粒pCDH-CMV-CD133-Myc-EF1-anti-PD1-3rd(见图2),充分吹打混匀;
4.Coating dish:10% Ploy-L-Lys+90% PBS,3ml/10cm dish,37℃10min;
5.将lipo2000和质粒一起混匀,静置20min;
6.1X TE消化293FT细胞,37℃消化1min(此细胞比较容易消化,1min即可);
7.1000rpm离心3min收集细胞,PBS或DMEM清洗一次;
8.将Ploy-L-Lys coating好的dish用PBS清洗3次(Ploy-L-Lys对细胞有毒,必须清洗干净);
9.向coating好的dish中加入5ml DMEM(10% FBS,无双抗);
10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液;
11.向每个dish中加入3ml用DMEN重悬的293FT细胞,充分混匀,均匀铺版,37℃培养(悬浮转染,一盘90%的细胞全部用来转染);
12.12h后换液,DMEM含10% FBS,无双抗(液体和移液管必须84消毒处理);
13.36h后观察细胞中荧光表达情况(荧光表达丰富,细胞培养液变黄,即可收病毒);
14.收集细胞培养液,4℃保存(与下次收集的病毒一起纯化);
15.向培养皿中加入8ml培养液(10%FBS,无双抗),继续37℃培养,生产病毒(由于第二次生产的病毒会变少,故培养液液相应少加);
16.36h后收集培养液(50ml收集管用封口膜封口,培养皿用84消毒液处理);
17.4500rpm离心5min;
18.0.45μm滤膜过滤;
19.将滤液放入超速离心管中,18000rpm离心3h;
20.弃上清,沉淀用DMEM重悬(1ml DMEN/管);
21.再用1ml DMEN洗一次,将重悬液加入真空超速离心管中,共6-7ml;
22.向离心管底部加3ml 20%蔗糖溶液;
23.24000rpm离心2h;
24.弃上清,吸干液体;
25.用100μl PBS重悬沉淀;
26.4℃摇床溶解;
27.-80℃保存(分装5μL/管);
28.有限稀释法感染293FT细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。
四、从供者提供的外周血中分离PBMC;
1.用抗凝管采集健康人(或患者)外周血15mL,室温静止30min;
2.350g离心5min(慢升慢降),吸出血浆备用;
3.用PBS稀释抗凝血(1:1)混匀,依据样品体积取15mL离心管,按1:2加入淋巴细胞分离液(Ficoll)(Ficoll:血样=1:2),血液样本缓慢加入Ficoll,速度尽量缓慢(铺平后可适当的加快速度),450g离心,25min;
4.离心结束后,小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层,转入一个新的15mL离心管中,加入PBS,300g离心10min,弃上清;
5.再次加入10mL PBS重悬细胞,160g离心15min,弃上清;
6.最后加入10mL的RPMI 1640培养基重悬,300g离心10min,弃上清即得到PBMC。
五、使用磁珠分离、活化T细胞:
1.以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养液培养,并按照磁珠:细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠和终浓度为300U/mL的重组人IL-2刺激培养48h;
2.Retronectin包被24孔板,每孔加入380μL 5μg/mL的Retronectin溶液(PBS),4℃孵育过夜;
3.去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS),1mL PBS洗2次。
六、采用步骤(3)所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞,产生表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞:
1.在转染前1h,步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/mL的Polybrene以提高转染效率,将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板中,每孔细胞数目3×105,培养液体积600μL。
2.按照MOI=10,在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒,32℃,1800rpm,离心40min后,转移至细胞培养箱中培养。
七、将步骤(6)所得细胞体外培养:按照MOI=10,在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒,32℃,1800rpm,离心40min后,转移至细胞培养箱中培养。
八、将步骤(7)所得细胞大量扩增:感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代,同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300U/mL的重组人IL-2。
九、取部分细胞悬液,加入BFA 24h后,ELISA检测上清液中PD-1的分泌情况(见图6),与对照组相比实验组分泌PD-1抗体,说明成功制得表达CD133-CAR且分泌PD-1抗体的CAR-T细胞,将细胞扩大培养并冻存。
十、培养7天后收集细胞,获得表达CD133-CAR(能靶向识别CD133)且分泌PD-1抗体的CAR-T细胞。
实施例2制备表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞
本发明所述的表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞制备方法如下:
一、优化密码子:准备CD133嵌合抗原受体(CAR),即CD133-CAR,进行密码子优化,使之更易于在人体细胞内表达,密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
二、构建携带CD133-CAR及细胞因子基因的慢病毒载体骨架。
通过基因合成获得CD133-CD8-CD28-4-1BBL-CD3ζ+NFAT+IL12基因,且基因两端分别带有SanB1/Sall酶切位点。所述NFAT启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,CD8、CD28、4-1BBL、CD3ζ等基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。SnaB1/Sall双酶切pCDH-CMV-MCS-NFAT-copGFP载体,通过IN-Fusion技术将各基因片段克隆至载体中,挑选阳性克隆测序。鉴定正确的质粒扩大培养。获得靶向CD133且分泌IL-12细胞因子的慢病毒载体,命名为pCDH-CMV-CD133-Myc-NFAT-IL12-3rd质粒,见图7所示。
三、携带CD133-CAR及细胞因子基因的重组慢病毒质粒感染293FT细胞,制备可感染T细胞的重组慢病毒载体。
1.293FT细胞长到90%时,提前1h换无双抗培养液(此时细胞营养充分,细胞会变的饱满和圆润,细胞状态很好);
2.配制lipo2000(40μL)+1.5ml OptimMEM(一个10cm dish的用量),混匀,静置5min;
3.配制质粒混合液:准备一支无菌的5mL离心管加入1.5mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒(pRSV-Rev(addgene,#12253)、pCMV-VSV-G(addgene,#8454)、pMDLg-pRRE(addgene,#12251),分别见图3-5)和慢病毒表达质粒pCDH-CMV-CD133-Myc-NFAT-IL12-3rd(见图7),充分吹打混匀;
4.Coating dish:10% Ploy-L-Lys+90% PBS,3ml/10cm dish,37℃10min;
5.将lipo2000和质粒一起混匀,静置20min;
6.1x TE消化293FT细胞,37℃消化1min(此细胞比较容易消化,1min即可);
7.1000rpm离心3min收集细胞,PBS或DMEM清洗一次;
8.将Ploy-L-Lys coating好的dish用PBS清洗3次(Ploy-L-Lys对细胞有毒,必须清洗干净);
9.向coating好的dish中加入5ml DMEM(10% FBS,无双抗);
10.向每个dish中加入3ml lipo2000和质粒的混合液;
11.向每个dish中加入3ml用DMEN重悬的293FT细胞,充分混匀,均匀铺版,37℃培养(悬浮转染,一盘90%的细胞全部用来转染);
12.12h后换液,DMEM含10% FBS,无双抗(液体和移液管必须84消毒处理);
13.36h后观察细胞中荧光表达情况(荧光表达丰富,细胞培养液变黄,即可收病毒);
14.收集细胞培养液,4℃保存(与下次收集的病毒一起纯化);
15.向培养皿中加入8ml培养液(10%FBS,无双抗),继续37℃培养,生产病毒(由于第二次生产的病毒会变少,故培养液液相应少加);
16.36h后收集培养液(50ml收集管用封口膜封口,培养皿用84消毒液处理);
17.4500rpm离心5min;
18.0.45μm滤膜过滤;
19.将滤液放入超速离心管中,18000rpm离心3h;
20.弃上清,沉淀用DMEM重悬(1ml DMEN/管);
21.再用1ml DMEN洗一次,将重悬液加入真空超速离心管中,共6-7ml;
22.向离心管底部加3ml 20%蔗糖溶液;
23.24000rpm离心2h;
24.弃上清,吸干液体;
25.用100μl PBS重悬沉淀;
26.4℃摇床溶解;
27.-80℃保存(分装5μL/管);
28.有限稀释法感染293FT细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度。
四、从供者提供的外周血中分离PBMC。
1.用抗凝管采集健康人(或患者)外周血15mL,室温静止30min;
350g离心5min(慢升慢降),吸出血浆备用;
2.用PBS稀释抗凝血(1:1)混匀,依据样品体积取15mL离心管,按1:2加入淋巴细胞分离液(Ficoll)(Ficoll:血样=1:2),血液样本缓慢加入Ficoll,速度尽量缓慢(铺平后可适当的加快速度),450g离心,25min;
3.离心结束后,小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层,转入一个新的15mL离心管中,加入PBS,300g离心10min,弃上清;
4.再次加入10mL PBS重悬细胞,160g离心15min,弃上清;
5.最后加入10mL的RPMI 1640培养基重悬,300g离心10min,弃上清即得到PBMC。
五、使用磁珠分离、活化T细胞。
1.以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养液培养,并按照磁珠:细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠和终浓度为300U/mL的重组人IL-2刺激培养48h;
2.Retronectin包被24孔板,每孔加入380μL 5μg/mL的Retronectin溶液(PBS),4℃孵育过夜;
3.去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS),1mL PBS洗2次;
六、采用步骤三所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞,产生表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子IL12的CAR-T细胞。
1.在转染前1h,步骤(5)所得培养液中补加终浓度为10μg/mL的Polybrene以提高转染效率,将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板中,每孔细胞数目3×105,培养液体积600μL;
2.按照MOI=10,在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒,32℃,1800rpm,离心40min后,转移至细胞培养箱中培养。
七、将步骤六所得细胞体外培养:按照MOI=10,在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒,32℃,1800rpm,离心40min后,转移至细胞培养箱中培养。
八、将步骤七所得细胞大量扩增:感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代,同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度为300U/mL的重组人IL-2。
九、取部分细胞悬液,与靶细胞U251-CD133共培养后,再用PMA刺激两天,ELISA检测上清液中IL12的分泌情况(见图8),与对照组相比IL12的分泌增强,说明成功制得表达CD133-CAR且分泌细胞因子IL-12的CAR-T细胞。
十、培养7天后收集细胞,获得表达CD133-CAR(能靶向识别CD133)且分泌细胞因子IL-12的CAR-T细胞。
实施例3制备的表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞体外杀伤验证
分别培养Raji细胞和效应细胞表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的CAR-T细胞。
收集靶细胞Raji4×105cells和效应细胞(CAR-T细胞)各3×106cells,300g,离心10min,慢升慢降,弃上清;用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞,300g,离心10min,慢升慢降,弃上清;重复一次;用700μl培养基(AIM-V培养基+10%FBS)重悬效应细胞,用2ml培养基(1640培养基+10%FBS)重悬靶细胞。
设置效靶比为1:1、5:1、10:1、20:1的实验孔,并设置对照组,每组3个复孔,37℃5%CO2培养箱中培养2h;500g,离心5min,慢升慢降平板离心;取每个孔的20μl上清到新96孔板中,并且每孔加入50μl底物溶液(避光操作),室温避光孵育15min;每孔加入50μl终止液,酶标仪检测490nm吸光度。结果如图9所示,不同效靶比条件下,表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞在Raji靶细胞中杀伤效率明显强于表达CD133-CAR的CAR-T细胞,当效靶比为20:1时,本发明制得的表达CD133-CAR的同时分泌IL12的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌PD-1抗体的CAR-T细胞肿瘤杀伤能力分别为56%和60%(见图9)。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州茂行生物科技有限公司
<120> 一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccctcagg tgcagctgca gcagtcagga gcagaactcg tgagaccagg agcctcagtg 120
aagctgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcagcgact tcgagatgca ttgggtgaag 180
cagacaccag tgcacggcct cgagtggatt ggcgatatcg acccaggcac aggcgataca 240
gcctacaacc tgaagttcaa gggcaaggcc accctgacca ccgataagag cagcagcacc 300
gcctacatgg agctgagaag cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtacta ttgcaccctg 360
ggagccttcg tgtattgggg acagggcaca ctggtgacag tgtccgccgc taaaaccacc 420
cctaagctgg aggagggcga gtttagcgag gctagagtgg acgtggtggt gacacagacc 480
cctctgtctc tgccagtgtc cttcggcgat caggtgtcca tctcttgccg gagctctcag 540
agcctggcca acagctacgg caacacctac ctgtcttggt acctgcacaa gcccggacag 600
agccctcagc tgctgatcta cggcatctcc aaccggttca gcggcgtgcc agacagattc 660
agcggaagcg gcagcggcac agacttcacc ctgaagatca gcaccatcaa gcccgaggac 720
ctgggcatgt actattgcct gcagggcacc caccagcctt atacctttgg cggaggcacc 780
aagctggaga tcaagagagc cgacgccgct gcagccggat ct 822
<210> 2
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcgtccccg tgttcctgcc tgccaagcca acaactaccc ctgctccacg accacctact 60
ccagcaccta ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca 120
gctggaggag cagtgcacac ccgaggcctg gacttcgcat gcgatatcta catttgggca 180
ccactggctg gaacctgtgg ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtattgtaac 240
cacagaaat 249
<210> 3
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggagcaaac gctcccgact gctgcattcc gactacatga acatgacacc tcggagacca 60
ggccccacta gaaagcatta ccagccatat gccccaccca gggatttcgc agcctatcgg 120
agc 123
<210> 4
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggttcagcg tcgtgaaaag ggggcgcaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcctttt 60
atgcgcccag tgcagacaac tcaggaggaa gacggatgct cttgtcggtt cccagaggag 120
gaggaaggag gctgcgagct g 141
<210> 5
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agagtgaagt tcagccggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gaatatgacg tgctggataa gcgacgagga 120
cgggaccccg aaatgggagg aaaacccaga aggaagaacc ctcaggaggg gctgtataat 180
gaactgcaga aagacaagat ggctgaggca tacagcgaaa ttggaatgaa aggagagcgc 240
cgacggggga agggacacga tgggctgtac cagggactgt caaccgccac taaagatacc 300
tacgacgcac tgcacatgca ggctctgccc ccaagatga 339
<210> 6
<211> 524
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc ccgctagggg 60
gcagcagcga gccgcccggg gctccgctcc ggtccggcgc tccccccgca tccccgagcc 120
ggcagcgtgc ggggacagcc cgggcacggg gaaggtggca cgggatcgct ttcctctgaa 180
cgcttctcgc tgctctttga gcctgcagac acctgggggg atacggggaa aaggcctgga 240
ggaaaaactg tttcatacag aaggcgggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgggagg 300
aaaaactgtt tcatacagaa ggcgggagga aaaactgttt catacagaag gcgggaggaa 360
aaactgtttc atacagaagg cgggaggaaa aactgtttca tacagaaggc gattttgaca 420
cccccataat atttttccag aattaacagt ataaattgca tctcttgttc aagagttccc 480
tatcactctc tttaatcact actcacagta acctcaactc ctgc 524
<210> 7
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccaccatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt tctggcatct 60
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ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga agatggtatc 180
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gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga ggttctaagc 300
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agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga ggacagtgcc 600
tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt tcacaagctc 660
aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc tgacccaccc 720
aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag ctgggagtac 780
cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt tcaggtccag 840
ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc agccacggtc 900
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ggcggtggcg gcagcagaaa cctccccgtg gccactccag acccaggaat gttcccatgc 1080
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gcttcctaa 1629
<210> 8
<211> 546
<212> DNA
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<400> 8
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cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
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ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360
tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420
cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480
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<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atggagttct ggttgtcatg ggtctttctg gtagctattc ttaagggagt acagtgtcag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgtggaagtg aaaaaaccgg gcgcgagcgt gaaagtgagc 120
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