CN109880804B

CN109880804B - 一种靶向b7h3的car-t细胞的制备方法及应用

Info

Publication number: CN109880804B
Application number: CN201910168714.6A
Authority: CN
Inventors: 王刚; 郑骏年; 方琳; 柴大飞; 李慧忠; 杜红伟; 田卉
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Jiangsu Jicui Juchuang Biotechnology Research Institute Co.,Ltd.
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2039-03-06
Also published as: CN109880804A

Abstract

本发明涉及一种靶向B7H3的CAR‑T细胞的制备方法，首先准备PBMC细胞；然后将含有CAR结构的穿梭质粒LV‑B7H3、辅助质粒psPAX2和包膜质粒VSV‑G共转染293T细胞后，得到包装的B7H3‑CAR病毒；接着取PBMC细胞，采用anti‑human CD3和anti‑human CD28作为活化剂，培养活化48h后，加入B7H3‑CAR病毒进行感染，即得。该制备方案使得CAR‑T细胞IFN‑γ表达增多，细胞杀伤活性高。本发明的靶向B7H3的CAR‑T细胞对多种实体瘤细胞具有杀伤作用，杀伤活性高，并且安全有效，可用于肾癌、肺癌以及肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌等的免疫细胞治疗。

Description

一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，属于免疫学技术领域。

背景技术

嵌合抗原修饰的T细胞(ChimericAntigen Receptor modifiedT cell,CAR-T)是一种经过基因改造的T细胞，利用基因转导技术将含有肿瘤抗原特异性识别单链抗体(scFv)和T细胞激活基序的CAR导入患者T细胞，使得这些转导了CAR的T细胞能直接识别癌细胞表面抗原而活化，进而杀死癌细胞。正是因为CAR-T细胞杀伤癌细胞不需要借助抗原递呈，而大大提高癌细胞杀伤效率。2012年美国宾夕法尼亚大学Carl June教授使用靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T细胞治愈白血病患儿EmilyWhitehead，2017年美国FDA又突破性批准两款CAR-T细胞药物用于B细胞白血病和淋巴瘤治疗，成为细胞治疗领域的一个里程碑。

与传统自体免疫细胞疗法相比CAR-T细胞有诸多优势：(一)靶向性：通过肿瘤抗原特异性单链抗体或配体识别，使CAR-T细胞可以特异性靶向肿瘤细胞；(二)杀伤效率高：2018年Nature报道个例中来源于1个TET2缺失的CAR-T细胞杀死全部肿瘤细胞，治愈白血病；(三)抗原识别范围广：CAR-T细胞能发现所有被抗体识别的肿瘤抗原，包括蛋白抗原、糖类抗原和脂类抗原等；(四)无MHC限制性：CAR-T细胞通过武装的scFv直接识别肿瘤细胞，可以克服肿瘤下调MHC-I分子而发生的免疫逃逸。

针对血液系统肿瘤，CAR-T细胞治疗已取得巨大成就，目前，美国FDA已经先后批准了诺华和吉利德公司的CAR-T细胞产品上市，用于治疗急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，定价分别为47.5万美元(约合300万人民币)和37.3万美元(约合250万人民币)。截至目前，在ClinicalTrials网站注册CAR-T细胞治疗肿瘤临床试验407项，其中针对血液系统肿瘤276项，针对实体瘤131项。在我国，国家药品监督管理局已经受理26项CAR-T细胞治疗肿瘤药物临床申请，仅有1种靶向实体瘤(GPC3)，目前，已有传奇生物、恒润达生、科济生物等公司8项获得药物临床试验批件，标示着国内CAR-T细胞治疗规范化时代已经来临。

目前，靶向CD19、CD22、BCMA的CAR-T细胞治疗血液系统肿瘤已取得长足进步，疗效显著，但针对实体肿瘤的CAR-T细胞治疗进展缓慢，缺乏安全有效的特异性肿瘤抗原靶点是重要的阻滞因素之一。

B7H3又称CD276，属于B7免疫检查点超家族，是一种I型跨膜蛋白，由包含两对相同免疫球蛋白可变区和恒定区的胞外区和较短的胞内区构成。其mRNA表达较为广泛，但蛋白表达非常局限。诸多研究揭示B7H3在多种肿瘤中高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等，其表达水平与患者预后不良密切相关。因此，本发明人选用作为靶点，制备的CAR-T细胞靶向广谱实体肿瘤，可应用范围广。而靶向B7H3的抗体药物、抗体-药物偶联物、放射材料标记抗体、CD3-B7H3双特异性抗体等药物已开展多项针对腹膜癌、神经胶质瘤以及中枢神经肿瘤等肿瘤的I、II期临床试验，显示令人鼓舞的初步结果，未出现不良事件，表明靶向B7H3的疗法是安全可靠的。

发明内容

本发明的目的在于解决上述背景技术的不足，提供一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，制得的靶向B7H3的CAR-T细胞对多种实体瘤细胞具有杀伤作用，并且杀伤能力强，应用范围广，对人体安全有效。

技术方案

一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)准备PBMC细胞；

(2)将含有CAR结构的穿梭质粒LV-B7H3、辅助质粒psPAX2和包膜质粒VSV-G共转染297T细胞后，得到包装的B7H3-CAR病毒；

(3)取PBMC细胞，采用anti-human CD3和anti-human CD28作为活化剂，培养活化48h后，加入步骤(2)制得的B7H3-CAR病毒进行感染，得到靶向B7H3的CAR-T细胞。

进一步，步骤(1)中，PBMC细胞的获取方法为：取健康外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，离心，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗涤，离心弃上清，即得。

进一步，步骤(2)中，穿梭质粒LV-B7H3的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，步骤(2)中，穿梭质粒LV-B7H3的构建方法，包括如下步骤：

1)合成靶向人B7H3的scFv编码序列，所述scFv包括重链VH和轻链VL，二者之间由G4S短肽连接；

2)将慢病毒载体pLenti和步骤1)合成的靶向人B7H3的scFv经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；

3)挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为LV-B7H3。

上述构建方法中，重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，G4S短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，步骤(2)中，转染PBMC细胞的方法为：将含有CAR结构的穿梭质粒LV-B7H33.75μg、辅助质粒psPAX23.75μg、包膜质粒VSV-G 2.5μg混合在300μl opti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入20μl PEI试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有PEI试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293T细胞培养皿中，轻摇混匀，48小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。

进一步，步骤(3)中，PBMC细胞培养活化的方法为：首先用1μg/ml anti-human CD3(OKT3)和anti-human CD28(CD28.2)包被24孔板，4℃孵育过夜；然后将PBMC细胞用含有2-5％自体血浆、500U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基重悬至1×10⁶/ml，每孔接种1ml细胞悬液，进行培养活化。

进一步，步骤(3)中，采用B7H3-CAR病毒进行感染的方法：将B7H3-CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的PBMC细胞，然后加入RetroNectin包被过的24孔板中，1500g、30℃离心2小时后去上清，补加含有2-5％自体血浆、500U/ml IL-2、10ng/ml IL-7、5ng/ml IL-15和20ng/ml IL-12的X-Vivo培养基，继续培养，即可。

本发明的有益效果：本发明提供了一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，制得的靶向B7H3的CAR-T细胞对多种实体瘤细胞具有杀伤作用，杀伤活性高，并且安全有效，可用于肾癌、肺癌以及肝癌、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌等的免疫细胞治疗。

附图说明

图1为穿梭质粒LV-B7H3的构建模式图；

图2为实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞的流式检测结果；

图3为ELISA检测实施例1及对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞的IFN-γ释放情况；

图4为实施例1及对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞肿瘤细胞针对肾癌786-O细胞的杀伤效果；

图5为实施例1及对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞肿瘤细胞针对肺癌H23细胞的杀伤效果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中，所用的质粒载体均购自Addgene；所用的PEI转染试剂购自Polysciences公司；所用流式抗体购自Biolegend公司；所用内切酶和连接酶购自NEB公司；所用活化抗体购自Bio-X-Cell公司；所用细胞因子购自PrimeGene；所用培养基购自Gibco和Lonza公司。

实施例1

一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)准备PBMC细胞；

取健康志愿者外周血20ml，离心(1300g，10分钟)后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，离心(600g，25分钟)，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗涤，离心(400g，10分钟)，弃上清，即得PBMC细胞。

(2)将含有CAR结构的穿梭质粒LV-B7H33.75μg、辅助质粒psPAX23.75μg、包膜质粒VSV-G 2.5μg混合在300μl opti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入20μl PEI试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有PEI试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入细胞培养液中，轻摇混匀，48小时后，收集上清，经0.45μm针孔滤器过滤，得到包装的B7H3-CAR病毒，分装为1ml/管，–80℃冻存，备用；

穿梭质粒LV-B7H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，穿梭质粒LV-B7H3的构建方法，包括如下步骤：

1)合成靶向人B7H3的scFv的编码序列(即为B7H3scFv)，其中scFv包括重链VH和轻链VL，二者之间由G4S短肽连接；

2)将(含有CD8a Hinge和跨膜区的TM、共刺激分子CD28/CD137/CD3ζ和安全开关tEGFR的)慢病毒载体pLenti和步骤1)合成的B7H3scFv经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶进行连接，然后转化Stbl3感受态细胞；

3)挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送苏州金维智公司测序确认，正确的质粒即为LV-B7H3。

LV-B7H3的构建模式图见图1，其中，SP为前导信号肽，TM为CD8a Hinge和跨膜结构域，CD28为共刺激分子CD28胞内区，CD137为共刺激分子CD137胞内区，CD3ζ为TCR受体ζ链，T2A为自剪切小肽，tEGFR为表达胞外区和跨膜区的截短型EGFR。

重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，G4S短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，前导信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CD8a的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD28胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CD137胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

(3)用1μg/ml anti-human CD3(OKT3)和anti-human CD28(CD28.2)包被24孔板，4℃孵育过夜，然后将PBMC细胞用含有2-5％自体血浆、500U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基重悬至1×10⁶/ml，每孔接种1ml细胞悬液，培养活化48小时后，得到活化的PBMC细胞；将B7H3-CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的PBMC细胞，然后加入RetroNectin包被过的24孔板中，1500g30℃离心2小时后去上清，补加含有2-5％自体血浆、500U/ml IL-2、10ng/ml IL-7、5ng/ml IL-15和20ng/ml IL-12的X-Vivo培养基，继续培养10-12天，得到靶向B7H3的CAR-T细胞。

对比例1

将步骤(3)中的20ng/ml IL-12去掉，其余与实施例1相同。

实验测试：

(一)检测靶向B7H3的CAR-T细胞的成分及CAR阳性率

1.分别取没有进行病毒感染的细胞及实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞悬液少量至1.5ml EP管，400g离心5分钟，收集细胞；

2.先用1μg/ml B7H3-Fc融合蛋白4℃孵育30分钟，10倍体积PBS洗涤1次；

3.再加入1μg/ml PE anti-human IgG Fc抗体，4℃孵育30分钟，10倍体积PBS洗涤1次；

4.然后加入1μg/ml FITC-CD3、APC-CD8和PerCp-Cy5.5-CD4抗体混合物，4℃孵育15分钟，10倍体积PBS洗涤1次；

5.用500μl PBS重悬细胞并转移至流式管，进行流式分析，CAR-T细胞的成分及CAR阳性率见图2。

图2中，A为没有进行病毒感染的细胞，B为实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞，由图2可以看出，实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞中，CD3+T细胞比例大于97％，其中CD4+和CD8+T细胞比例各占月30％和67％，实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞中，B7H3CAR+细胞比例为82.6％。这说明本发明实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞细胞纯度高，CAR+细胞数高，制备方法可靠。

(二)靶向B7H3的CAR-T细胞的细胞因子释放检测

取实施例1和对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞，用不含细胞因子和自体血浆的X-vivo培养基重悬至1×10⁶/ml；将预先铺好肾癌细胞786-O或肺癌细胞H23的24孔板中培养基弃掉，分别加入1ml实施例1和对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞悬液，孵育过夜；收集上清，ELISA检测IFN-γ含量，结果见图3。

图3中，Blank为仅有肿瘤细胞的对照组，可以看出，实施例1和对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞均被激活，释放出IFNγ，且实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞IFNγ细胞因子释放更多，杀伤活性更强。

(三)靶向B7H3的CAR-T细胞肿瘤细胞杀伤实验

1.将10000-20000个肾癌786-O细胞或肺癌H23细胞接种于RTCA孔板中，监测培养过夜；

2.分别取实施例1和对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞，用不含细胞因子和自体血浆的X-vivo培养基重悬至1×10⁶/ml；

3.按CAR-T细胞与肿瘤细胞效靶比1：5的比例，接种至预先监测过夜的RTCA孔板中，继续监测培养3天，杀伤结果见图4、图5。

由图4和图5可见，不添加CAR-T细胞的靶细胞增殖不受影响，曲线上升，加入实施例1和对比例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞后，肿瘤细胞被杀死，细胞生长曲线下降，而实施例1制得的靶向B7H3的CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤能力更强。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2784

<212> DNA

<213> 嵌合抗原修饰的t细胞(chimeric antigen Receptor modified t cell)

<400> 1

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

cccgaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgccag 120

gtgcagctgg tgcagagcgg cgcggaagtg gtgaaaccgg gcgcgagcgt gaaagtgagc 180

tgcaaagcga gcggctatac ctttaccaac tatgatatta actgggtgcg ccagcgcccg 240

gaacagggcc tggaatggat tggctggatt tttccgggcg atggcagcac ccagtataac 300

gaaaaattta aaggccgcgt gaccatgacc accgatacca gcaccagcac cgtgtatatg 360

gaactgagca gcctgcgcag cgaagatacc gcggtgtatt tttgcgcgcg ccagaccacc 420

gcgacctggt ttgcgtattg gggccagggc accctggtga ccgtgagcag cggtggaggc 480

ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcggaaa ttgtgatgac ccagagcccg 540

gcgaccctga gcgtgagccc gggcgaaagg gtgaccctga gctgccgcgc gagccagagc 600

attagcgatt atctgcattg gtatcagcag aaaagccatc aggcgccgcg cctgctgatt 660

aaatatgcga gccagagcat tagcggcatt ccggcgcgct ttagcggcag cggcagcggc 720

agcgaattta ccctgaccat tagcagcctg cagccggaag attttggcgt gtattattgc 780

cagaacggcc atagctttcc gctgaccttt ggccagggca ccaaactgga actgaaacgc 840

acgcgtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 900

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 960

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1020

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaggagta agaggagcag gctcctgcac 1080

agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 1140

tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1200

cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1260

gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1320

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1380

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cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1500

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1560

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1620

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgcgcat gcggatctgg agagggcaga 1680

ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctatgtg gctgcagagc 1740

ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc atctctcgca aagtgtgtaa cggaataggt 1800

attggtgaat ttaaagactc actctccata aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac 1860

tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc ctgccggtgg catttagggg tgactccttc 1920

acacatactc ctcctctgga tccacaggaa ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc 1980

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aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc 2100

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gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt 2400

ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag aactctgagt gcatacagtg ccacccagag 2460

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<210> 2

<211> 408

<212> DNA

<213> 嵌合抗原修饰的t细胞(chimeric antigen Receptor modified t cell)

<400> 2

gaatttggcc tgagctggct gtttctggtg gcgattctga aaggcgtgca gtgccaggtg 60

cagctggtgc agagcggcgc ggaagtggtg aaaccgggcg cgagcgtgaa agtgagctgc 120

aaagcgagcg gctatacctt taccaactat gatattaact gggtgcgcca gcgcccggaa 180

cagggcctgg aatggattgg ctggattttt ccgggcgatg gcagcaccca gtataacgaa 240

aaatttaaag gccgcgtgac catgaccacc gataccagca ccagcaccgt gtatatggaa 300

ctgagcagcc tgcgcagcga agataccgcg gtgtattttt gcgcgcgcca gaccaccgcg 360

acctggtttg cgtattgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagc 408

<210> 3

<211> 323

<212> DNA

<213> 嵌合抗原修饰的t细胞(chimeric antigen Receptor modified t cell)

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aaattgtgat gacccagagc ccggcgaccc tgagcgtgag cccgggcgaa agggtgaccc 60

tgagctgccg cgcgagccag agcattagcg attatctgca ttggtatcag cagaaaagcc 120

atcaggcgcc gcgcctgctg attaaatatg cgagccagag cattagcggc attccggcgc 180

gctttagcgg cagcggcagc ggcagcgaat ttaccctgac cattagcagc ctgcagccgg 240

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gcaccaaact ggaactgaaa cgc 323

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<213> 嵌合抗原修饰的t细胞(chimeric antigen Receptor modified t cell)

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<210> 5

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<212> DNA

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ccc 63

<210> 6

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<212> DNA

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tcc 123

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gaggaaggag gctgtgagct gaga 144

<210> 9

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<212> DNA

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<400> 9

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cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> 嵌合抗原修饰的t细胞(chimeric antigen Receptor modified t cell)

<400> 10

ggatctggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cct 63

<210> 11

<211> 1059

<212> DNA

<213> 嵌合抗原修饰的t细胞(chimeric antigen Receptor modified t cell)

<400> 11

atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tcgcaaagtg 60

tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt 120

aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt 180

aggggtgact ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa 240

accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac 300

ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt 360

tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata 420

agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 480

tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 540

aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg 600

ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg 660

gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata 720

cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca 780

gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg 840

gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg 900

tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt 960

ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg 1020

ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatgtaa 1059

Claims

1.一种靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

（1）准备PBMC细胞；

（2）将含有CAR结构的穿梭质粒LV-B7H3、辅助质粒psPAX2和包膜质粒VSV-G共转染293T细胞，得到包装的B7H3-CAR病毒；所述穿梭质粒LV-B7H3上包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（3）用1μg/ml anti-human CD3和anti-human CD28包被24孔板，4℃孵育过夜，然后将PBMC细胞用含有2-5%自体血浆、500U/ml IL-2、10ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的X-Vivo培养基重悬至1×10⁶/ml，每孔接种1ml细胞悬液，培养活化48小时后，得到活化的PBMC细胞；将B7H3-CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/ml polybrene，混匀，接着用该病毒液重悬活化的PBMC细胞，然后加入RetroNectin包被过的24孔板中，1500g 30℃离心2小时后去上清，补加含有2-5%自体血浆、500U/ml IL-2、10ng/ml IL-7、5ng/ml IL-15和20ng/ml IL-12的X-Vivo培养基，继续培养10-12天，得到靶向B7H3的CAR-T细胞。

2.如权利要求1所述靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，PBMC细胞的获取方法为：取健康外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，离心，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗涤，离心弃上清，即得。

3.如权利要求1所述靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，穿梭质粒LV-B7H3的构建方法，包括如下步骤：

1）合成靶向人B7H3的scFv编码序列，所述scFv包括重链VH和轻链VL，二者之间由G4S短肽连接；

2）将慢病毒载体pLenti和步骤1）合成的靶向人B7H3的scFv经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；

3）挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为LV-B7H3。

4.如权利要求1所述靶向B7H3的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，转染293T细胞的方法为：将含有CAR结构的穿梭质粒LV-B7H3 3.75μg、辅助质粒psPAX2 3.75μg、包膜质粒VSV-G 2.5μg混合在300μl opti-MEM培养基中，在另一300μl opti-MEM培养基中逐滴加入20μl PEI试剂，震荡混匀，室温静置5分钟，将含有PEI试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293T细胞培养皿中，轻摇混匀，48小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤。

5.权利要求1至4任一所述制备方法所制得的靶向B7H3的CAR-T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌或卵巢癌中的任意一种。