CN111518834B - Car-t细胞及其制备方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种CAR‑T细胞及其制备方法和药物。本发明通过特定步骤的培养纯化操作，将未成功转导CAR基因的阴性T细胞去除，保留了具有嘌呤霉素抗性基因的T细胞，其中CAR阳性T细胞的比例获得大大提升。更重要的是，通过实验比较发现，经过本发明特定步骤的培养纯化操作获得的CAR‑T细胞，虽然培养时间有所增加，但其应用时的副作用显著降低，例如炎性细胞因子IL‑6以及其它促炎相关细胞因子分泌水平降低；Th17细胞亚群成分减少，IL‑17/IL‑17A分泌降低；抗炎相关细胞因子分泌增高；而且在体外和小鼠体内对肿瘤细胞的杀伤能力也大大增强，小鼠生存时间也延长了。

Description

CAR-T细胞及其制备方法和药物
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种CAR-T细胞及其制备方法和药物。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T)疗法，这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。T细胞也叫T淋巴细胞，是人体白细胞的一种，来源于骨髓造血干细胞，在胸腺中成熟，然后移居到人体血液、淋巴和周围组织器官，发挥免疫功能。其能够抵御病原体感染，清除肿瘤、外来异物等。通过基因工程技术将嵌合抗原受体(CAR)导入人类T细胞，获得CAR-T细胞。当CAR-T细胞输入肿瘤患者体内，CAR能特异识别相应的肿瘤细胞抗原，CAR-T细胞随之被激活，并激活体内其它免疫细胞，通过释放大量的多种效应细胞因子，以及启动细胞毒性T细胞释放穿孔素、颗粒酶B等，诱导肿瘤细胞凋亡，从而能高效地杀灭肿瘤细胞，以达到治疗恶性肿瘤的目的。但是，CAR-T细胞在应用中仍然存在副作用较大，如引起严重的细胞因子释放综合征(CRS)，以及部分对肿瘤细胞的杀伤能力不强等问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种副作用较小、对肿瘤细胞的杀伤能力较强的CAR-T细胞的制备方法。
一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将T细胞接种于CAR-T培养基中，培养18～24小时；
(2)将携带嵌合抗原受体序列和嘌呤霉素抗性基因的载体导入步骤(1)获得的细胞，培养18～24小时；
(3)收集步骤(2)获得的细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，培养36～48小时；
(4)收集步骤(3)获得的细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，并加入嘌呤霉素，培养36～48小时；
(5)收集步骤(4)获得的细胞并除去其中的死细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，并加入嘌呤霉素，培养36～48小时，得到所述CAR-T细胞。
在其中一个实施例中，所述CAR-T培养基为含有CTSTM Immune Cell SR、非必需氨基酸、HEPES、丙酮酸钠、链霉素-青霉素、GlutaMAX和IL-2的无血清培养基。
在其中一个实施例中，所述CAR-T培养基中，CTSTM Immune Cell SR、非必需氨基酸、HEPES、丙酮酸钠、链霉素-青霉素和GlutaMAX的体积百分比分别为3％～7％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％，IL-2的含量为30～100Unit/ml。
在其中一个实施例中，步骤(5)中除去死细胞的步骤包括：用FBS-1640培养基重悬步骤(4)获得的细胞，将细胞悬液置于Paque Ficoll溶液上，然后于500g～1200g条件下离心10min～30min使其分层，收集活细胞层。
在其中一个实施例中，步骤(4)和步骤(5)中所述嘌呤霉素的工作浓度为0.5～3μg/ml。
在其中一个实施例中，在细胞培养过程中，使用磁珠Dynabeads HumanT-Activator CD3/CD28激活T细胞，细胞与磁珠的数量比为1:0.3～1.5。
在其中一个实施例中，上述载体为慢病毒载体。
在其中一个实施例中，步骤(2)中将携带嵌合抗原受体序列和嘌呤霉素抗性基因的载体导入细胞的步骤包括：使用纤连蛋白溶液包被培养板，包被完毕去掉纤连蛋白溶液；将慢病毒载体加入所述培养板中，加入Polybrene至终浓度为3～8μg/ml，于25℃～34℃、1500g～2000g条件下离心1～3小时；弃去上清液，将步骤(1)获得的细胞接种至所述培养板中，补充Polybrene至终浓度为3～8μg/ml，于25℃～34℃、1000g～1500g条件下离心1～3小时。
本发明还提供了一种根据上述制备方法制备得到的CAR-T细胞。
本发明还提供了一种用于肿瘤治疗的药物，其含有上述CAR-T细胞。
目前通常将培养8-12天的CAR-T细胞用于临床治疗，最近研究证实培养3～5天的CAR-T细胞状态最佳，其抗肿瘤能力相较于培养更长时间的CAR-T更强。但通常临床应用制备CAR-T细胞时不会进行筛选纯化。这种常规培养的CAR-T细胞，实际上是一群混合的细胞群，其中包含了表达完整CAR基因的T细胞，也包含了不表达CAR基因的T细胞，还可能包含了表达不完整CAR基因的T细胞，部分研究中心将CAR-T转导效率标准定为CAR阳性细胞≥2％。本发明通过特定步骤的培养纯化操作，将未成功转导CAR基因的阴性T细胞去除，保留了具有嘌呤霉素抗性基因的T细胞，其中CAR阳性T细胞的比例获得大大提升。更重要的是，通过实验比较发现，经过本发明特定步骤的培养纯化操作获得的CAR-T细胞(pureCAR-T，pCAR-T)，虽然培养时间有所增加，但其应用时的副作用显著降低，例如炎性细胞因子IL-6以及其它促炎相关细胞因子分泌水平降低；Th17细胞亚群成分减少，IL-17/IL-17A分泌降低；抗炎相关细胞因子分泌增高；而且在体外和体内对肿瘤细胞的杀伤能力也大大增强了。
附图说明
图1为嘌呤霉素筛选人T淋巴细胞杀灭曲线；
图2为d8pCAR-T与常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T的转导效率(CAR阳性率)对比；
图3为d8pCAR-T与常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T体外杀伤能力对比；
图4为d8pCAR-T与常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T分别与白血病细胞共培养上清中的IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B(Granzyme B)分泌水平对比，其中A为IFN-γ分泌水平，B为TNF-α分泌水平，C为颗粒酶B分泌水平；
图5为d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T中胞内的IL-6分子表达水平对比；
图6为d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T与肿瘤细胞共培养上清中的IL-6分泌水平对比；
图7为d8pCAR-T细胞与常规制备的d4 CAR-T中的Th17细胞亚群含量对比；
图8为d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T与肿瘤细胞共培养上清中的IL-17/IL-17A分泌水平对比；
图9为d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T与肿瘤细胞共培养上清中的多种炎性相关细胞因子分泌水平对比，其中A为IL-10分泌水平，B为CCL2分泌水平，C为CXCL9分泌水平，D为IL-2分泌水平；
图10为培养相同时间、相同细胞数量的d8pCAR-T和d8CAR-T分别治疗B-ALL小鼠的生存率变化图；
图11为相同细胞数量的d8pCAR-T、d13pCAR-T和d4CAR-T分别治疗B-ALL小鼠的生存率变化图；
图12为不同筛选时间获得的CAR-T细胞的转导效率对比；
图13为不同筛选时间获得的CAR-T细胞的体外杀伤能力对比；
图14为不同筛选时间获得的CAR-T细胞分别与白血病细胞共培养上清中的TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B分泌水平对比，其中A和B为TNF-α分泌水平，C和D为IFN-γ分泌水平，E和F为颗粒酶B分泌水平；
图15为不同筛选时间获得的CAR-T细胞与白血病细胞RS4；11共培养上清中的IL-6分泌水平对比，其中A为d4CAR-T与d8pCAR-T的对比，B为d8pCAR-T、d10pCAR-T、d13pCAR-T和d16pCAR-T的对比；
图16为不同筛选时间获得的CAR-T细胞与白血病细胞RS4；11共培养上清中的IL-17/IL-17A分泌水平对比，其中A为d4CAR-T与d8pCAR-T的对比，B为d8pCAR-T、d10pCAR-T、d13pCAR-T和d16pCAR-T的对比；
图17为不同筛选时间获得的CAR-T细胞与白血病细胞RS4；11共培养上清中的IL-10、CCL2、CXCL9、IL-2分泌水平对比，其中A和B为IL-10分泌水平，C和D为CCL2分泌水平，E和F为CXCL9分泌水平，G和H为IL-2分泌水平。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。反而，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)将T细胞接种于CAR-T培养基中，培养18～24小时；
(2)将携带嵌合抗原受体序列和嘌呤霉素抗性基因的载体导入步骤(1)获得的细胞，培养18～24小时；
(3)收集步骤(2)获得的细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，培养36～48小时；
(4)收集步骤(3)获得的细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，并加入嘌呤霉素，培养36～48小时；
(5)收集步骤(4)获得的细胞并除去其中的死细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，并加入嘌呤霉素，培养36～48小时，得到CAR-T细胞。
在过去的研究中，通常将体外培养8～12天的CAR-T细胞用于临床治疗，最新研究认为培养3～5天的CAR-T细胞为状态最佳，其抗肿瘤能力相较于培养更长时间的CAR-T更强，但临床上，通常都不会对CAR-T细胞进行筛选纯化，尤其培养3～5天的CAR-T细胞，由于培养时间较短，更不会考虑筛选纯化。这种常规培养的CAR-T细胞，实际上是一群混合的细胞群，其中包含了表达完整CAR基因的T细胞，也包含了不表达CAR基因的T细胞，还可能包含了表达不完整CAR基因的T细胞，部分研究中心将CAR-T转导效率标准定为CAR阳性细胞≥2％。本发明通过特定步骤的培养纯化操作，将未成功转导CAR基因的阴性T细胞去除，保留了具有嘌呤霉素抗性基因的T细胞，其中CAR阳性T细胞的比例获得大大提升。更重要的是，通过实验比较发现，经过本发明特定步骤的培养纯化操作获得的CAR-T细胞，虽然培养时间有所增加，但其应用时的副作用显著降低，例如炎性细胞因子IL-6以及其它促炎相关细胞因子分泌水平降低；Th17细胞亚群成分减少，IL-17/IL-17A分泌降低；抗炎相关细胞因子分泌增高；而且在体外和体内对肿瘤细胞的杀伤能力也大大增强了，是十分具有潜力的细胞治疗产品，将可能造福于广大肿瘤患者。
可以理解，本发明中上述嵌合抗原受体可以是各种工程化蛋白分子，其具有识别特定的细胞表面的抗原，并诱导免疫细胞活化的功能。优选地，嵌合抗原受体为将识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体与诱导T细胞活化的信号转导区融合而得到的人工嵌合蛋白。更优选地，嵌合抗原受体包含配体/受体结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。
可以理解，本发明中上述CAR-T细胞针对的肿瘤类型可以是白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌和甲状腺癌等。
在一个具体示例中，上述CAR-T培养基为含有CTSTM Immune Cell SR、非必需氨基酸、HEPES、丙酮酸钠、链霉素-青霉素、GlutaMAX和IL-2的无血清培养基。
在一个具体示例中，上述CAR-T培养基中，CTSTM Immune Cell SR、非必需氨基酸、HEPES、丙酮酸钠、链霉素-青霉素和GlutaMAX的体积百分比分别为3％～7％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％，IL-2的含量为30～100Unit/ml。
在一个具体示例中，步骤(5)中除去死细胞的步骤包括：用FBS-1640培养基重悬步骤(4)获得的细胞，将细胞悬液置于Paque Ficoll溶液上，然后于500g～1200g条件下离心10min～30min使其分层，收集活细胞层。
在一个具体示例中，步骤(4)和步骤(5)中嘌呤霉素的工作浓度为0.5～3μg/ml。如图1所示，通过加入不同浓度的嘌呤霉素对比测试，在96h内能全部杀死T淋巴细胞的嘌呤霉素最低浓度为0.5μg/ml，因此嘌呤霉素的工作浓度优选为0.5μg/ml。
在一个具体示例中，在细胞培养过程中，使用磁珠Dynabeads Human T-ActivatorCD3/CD28激活T细胞，细胞与磁珠的数量比为1:0.3～1.5，可以有效地提供T细胞活化和扩增所需的原始和共刺激信号，无需抗原呈递细胞或抗原。
在一个具体示例中，上述载体为慢病毒载体。可以理解，载体还可以是逆转录病毒载体或腺相关病毒载体等，不限于此。
在一个具体示例中，步骤(2)中将携带嵌合抗原受体序列和嘌呤霉素抗性基因的载体导入细胞的步骤包括：使用纤连蛋白溶液包被培养板，室温2小时或4℃过夜，包被完毕去掉纤连蛋白溶液；将慢病毒载体加入上述培养板中，加入Polybrene至终浓度为3～8μg/ml，于25℃～34℃、1500g～2000g条件下离心1～3小时；弃去上清液，将步骤(1)获得的细胞接种至所述培养板中，补充Polybrene至终浓度为3～8μg/ml，于25℃～34℃、1000g～1500g条件下离心1～3小时。
下面主要结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1(d8pCAR-T)
从健康供者获得10mL外周全血或白细胞单采术获得白细胞采集物，使用STEMCELLTechnologies公司的试剂盒RosetteSep Human T Cells enrichment cocktail，操作按说明书进行，从外周全血或白细胞采集物中分离获得纯度为99％以上的CD3+T细胞，冻存于液氮或直接使用。
D0天：取一定量的CD3+T细胞，用CAR-T培养基(无血清培养基+3％CTSTMImmuneCell SR+1％非必需氨基酸+1％HEPES+1％丙酮酸钠+1％链霉素-青霉素+1％GlutaMAX+100Unit/ml IL-2)进行培养，并加入Invitrogen公司的磁珠Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，加入比例为细胞数：磁珠数＝2：1。在37℃，5％CO2培养箱培养18h～24h。
D1天：使用TAKARA公司的纤连蛋白溶液包被六孔培养板，室温2h或4℃过夜，包被完毕，去掉纤连蛋白溶液，将携带CAR(包含靶向急/慢性B淋巴细胞白血病细胞抗原CD19的单链抗体可变区、跨膜区、共刺激分子CD137结构域和CD3ζ信号转导结构域)的慢病毒加入该六孔板中，加入Polybrene至终浓度为4μg/mL，25℃，1800g离心2h。弃上清液，将D1天收获的CD3+T细胞连同磁珠一同加入上述六孔板中，补充Polybrene至终浓度为4μg/mL，25℃，1000g离心2h。离心毕，将六孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养18h～24h。
D2天：细胞换液，收集所有细胞，常温，350g离心5min，弃上清液，补充新鲜的CAR-T培养基，维持细胞密度为0.5～1×106/ml，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
D4天：收获D4天CAR-T细胞，检测其转导效率，即CAR阳性率。将其重悬为1×106/ml，以每瓶5～8mL种入25cm2培养瓶中，各瓶加入Invitrogen公司的嘌呤霉素，使其终浓度为0.5μg/ml，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
D6天：使用磁铁装置去除磁珠，收集所有CAR-T细胞，用2ml FBS-1640培养基重悬CAR-T细胞，充分混匀，在1支15ml离心管中加入3ml GE healthcare公司的Paque FicollPremium溶液，将2ml CAR-T细胞悬液轻轻置于3ml Paque Ficoll之上，使其形成明显的分层，800g离心15min。离心毕，可见分四层，最上一层是培养基溶液，中间一层为白色的细胞，此即为活的CAR-T细胞，下一层为透明的Paque Ficoll Premium溶液，最下面的为白色的细胞沉淀，此为死细胞。小心吸取中间白色的细胞层，收集于1支新的无菌离心管中，用新鲜的CAR-T培养基离心洗涤2次，弃上清，CAR-T细胞沉淀用添加了0.5μg/ml嘌呤霉素的新鲜CAR-T培养基重悬，保持细胞密度为0.5～1×106/ml，以5～8ml种入25cm2培养瓶，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
D8天：收获所有CAR-T细胞，此为纯化富集的CAR-T细胞，称为d8pCAR-T，后续可用于检测、治疗或冻存。
对比例1(d4CAR-T)
从健康供者获得10mL外周全血或白细胞单采术获得白细胞采集物，使用STEMCELLtechnologies公司的试剂盒RosetteSep Human T Cells enrichmentcocktail，操作按说明书进行，从外周全血或白细胞采集物中分离获得纯度为99％以上的CD3+T细胞，冻存于液氮或直接使用。
D0天：取一定量的CD3+T细胞，用CAR-T培养基(无血清培养基+3％CTSTM ImmuneCell SR+1％非必需氨基酸+1％HEPES+1％丙酮酸钠+1％链霉素-青霉素+1％GlutaMAX+100Unit/ml IL-2)进行培养，并加入Invitrogen公司的磁珠Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，加入比例为细胞数：磁珠数＝2：1。在37℃，5％CO2培养箱培养18h～24h。
D1天：使用TAKARA公司的纤连蛋白溶液包被六孔培养板，室温2h或4℃过夜，包被完毕，去掉纤连蛋白溶液，将携带CAR的慢病毒加入该六孔板中，加入Polybrene至终浓度为4μg/mL，25℃，1800g离心2h。弃上清液，将D1天收获的CD3+T细胞连同磁珠一同加入上述六孔板中，补充Polybrene至终浓度为4μg/mL，25℃，1000g离心2h。离心毕，将六孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养18h～24h。
D2天：细胞换液，收集所有细胞，常温，350g离心5min，弃上清液，补充新鲜的CAR-T培养基，维持细胞密度为0.5～1×106/ml，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
D4天：收获D4天CAR-T细胞，称为d4CAR-T，检测其转导效率，即CAR阳性率。
对比例2(d8CAR-T)
从健康供者获得10mL外周全血或白细胞单采术获得白细胞采集物，使用STEMCELLtechnologies公司的试剂盒RosetteSep Human T Cells enrichment cocktail，操作按说明书进行，从外周全血或白细胞采集物分离获得纯度为99％以上的CD3+T细胞，冻存于液氮或直接使用。
D0天：取一定量的CD3+T细胞，用CAR-T培养基(无血清培养基+3％CTSTM ImmuneCell SR+1％非必需氨基酸+1％Heps+1％丙酮酸钠+1％链霉素-青霉素+1％GlutaMAX+100Unit/ml IL-2)进行培养，并加入Invitrogen公司的磁珠Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，加入比例为细胞数：磁珠数＝2：1。在37℃，5％CO2培养箱培养18h～24h。
D1天：使用TAKARA公司的纤连蛋白溶液包被六孔培养板，室温2h或4℃过夜，包被完毕，去掉纤连蛋白溶液，将携带CAR的慢病毒加入该六孔板中,加入Polybrene至终浓度为4μg/mL，25℃，1800g离心2h。弃上清液，将D1天收获的CD3+T细胞连同磁珠一同加入上述六孔板中，补充Polybrene至终浓度为4μg/mL，25℃，1000g离心2h。离心毕，将六孔板放入37℃，5％CO2培养箱中培养18h～24h。
D2天：细胞换液，收集所有细胞，常温，350g离心5min，弃上清液，补充新鲜的CAR-T培养基，维持细胞密度为0.5～1×106/ml，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，定期更换补充新鲜培养基。
D8天：收获D8天CAR-T细胞，称为d8CAR-T，检测其转导效率，即CAR阳性率。
一、d8pCAR-T及常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T的对比
实施例1中纯化过程从D4天开始，D8天结束，培养时间增加了4天，因此我们用培养至第8天的d8pCAR-T与常规培养4天获得的d4CAR-T(传统观点认为抗白血病能力为最佳)以及常规培养8天获得的d8CAR-T进行了比较。
1、d8pCAR-T细胞转导效率(CAR阳性率)提高
分别检测d8pCAR-T及常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T的转导效率，结果如图2所示。可见，本发明的制备方法获得的d8pCAR-T细胞平均CAR阳性率大大提高(d8pCAR-T、d4CAR-T、d8CAR-T分别为：37.8％、23.1％、20.45％)。
2、d8pCAR-T体外对靶肿瘤细胞的杀伤能力提高
分别检测d8pCAR-T及常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T的体外杀伤能力，结果如图3所示。可见，本发明制备的d8pCAR-T细胞对白血病细胞系RS4；11的体外杀伤能力大大提高，在效靶比为1:10时，即能将白血病细胞全部杀死，而d4CAR-T在效靶比为1:2时，才能将白血病细胞全部杀死，d8CAR-T在效靶比为10:1时，才能将白血病细胞全部杀死。
分别检测d8pCAR-T及常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T分别与白血病细胞共培养上清中的IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B分泌水平，结果如图4所示。从图可知，当d8pCAR-T及常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T分别与白血病细胞共培养时，从上清中效应细胞因子IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B的分泌水平来看，无论是效靶比5:1还是1:1混合，本发明制备的d8pCAR-T细胞都能释放出较多的效应细胞因子。相较于d4CAR-T细胞，d8pCAR-T细胞在体外多培养了4天，但其效应功能并未降低，依然能分泌产生较多的IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B等，有较强的杀死白血病细胞的能力，而d8CAR-T细胞的效应细胞因子分泌显著降低，其效应功能明显下降，这与图3的体外杀伤结果一致。
3、d8pCAR-T细胞在治疗时细胞因子释放综合征(CRS)风险可能减小
(1)炎性细胞因子IL-6分泌水平降低
分别检测d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T细胞中胞内IL-6分子的表达水平，结果如图5所示。由图5可看出，本发明制备的d8pCAR-T细胞中，无论是CD4+还是CD8+T细胞，都不表达IL-6分子。而常规培养的d4CAR-T细胞，CD4+T和CD8+T细胞都表达IL-6分子。
分别检测d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养上清中的IL-6分泌水平，结果如图6所示。由图6可看出，无论效靶比5:1还是1:1，与白血病细胞系RS4；11共培养上清中，本发明制备的d8pCAR-T细胞释放的IL-6显著低于常规制备的d4CAR-T细胞，这与图5结果一致。
细胞因子释放综合征(Cytokine releasing syndrome,CRS)是CAR-T细胞应用于临床过程中，出现的较为严重的炎症性副反应，80％以上患者出现不同级别的CRS反应，临床试验发现该反应的发生与患者血清中出现大量炎性相关细胞因子相关，其中已证实、且被临床医生认可的与CRS发生相关的细胞因子之一为IL-6。目前临床上已常规使用抗IL-6受体的抗体，即tocilizumab来治疗CAR-T治疗过程中的CRS。虽然如此，但依然有部分患者因CRS而死亡。我们发现常规制备的d4CAR-T细胞自身表达较高水平的IL-6分子，当其与靶肿瘤细胞共培养时，培养上清中分泌较高水平的IL-6，这可能与CAR-T治疗过程引起CRS相关。而本发明制备的d8pCAR-T细胞低表达IL-6分子，且与靶肿瘤细胞共培养时，释放低水平或不释放IL-6，因此，d8pCAR-T细胞引起CRS的风险降低，临床应用可能更安全。
(2)Th17细胞亚群成分减少
分别检测d8pCAR-T细胞与常规制备的d4CAR-T细胞中Th17细胞亚群含量，结果如图7所示。由图7可看出，d8pCAR-T细胞中，CD4+和CD4-的T细胞几乎不表达胞内IL-17A，说明其不包含Th17细胞亚群，而d4CAR-T细胞中，无论是CD4+还是CD4-的T细胞，均表达IL-17A，说明其包含了部分Th17细胞亚群。
分别检测d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养上清中的IL-17/IL-17A分泌水平，结果如图8所示。由图8可看出，当与白血病细胞RS4；11共培养时，无论是效靶比为5:1还是1:1，d8pCAR-T细胞释放到培养上清中的IL-17/IL-17A细胞因子水平都明显低于常规d4CAR-T细胞，这与图7结果一致。d8pCAR-T和d8CAR-T细胞相较于d4CAR-T细胞都出现IL-17/IL-17A水平降低，可能的原因为，体外培养较短时间的CAR-T细胞与靶肿瘤细胞作用时，IL-17A分泌较多，随着体外培养时间延长，逐渐分化为其它细胞亚群，因此分泌IL-17A水平降低了。
Th17细胞与多种严重自身免疫性疾病、急性炎症反应相关，如多发性硬化症、银屑病、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎等。IL-17A是Th17细胞亚群的标记，通常使用CD3+CD4+IL-17A+作为Th17细胞的标记。本发明制备的d8pCAR-T细胞，与常规制备的d4CAR-T细胞相比，大大减少了Th17细胞亚群成分，降低了由于Th17细胞可能导致的急性炎症反应的风险。
(3)其它促炎相关细胞因子分泌减少、抗炎相关细胞因子分泌增高
分别检测d8pCAR-T细胞和常规制备的d4CAR-T、d8CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养上清中的多种炎性相关细胞因子分泌水平，结果如图9所示。
CCL2是趋化因子受体CCR2的配体，对单核细胞和嗜碱性粒细胞具有趋化作用，能辅助T细胞外渗，与炎性反应有关；CXCL9，能结合CXCR3，对中性粒细胞和激活的T细胞具有趋化作用，参与炎性反应；IL-2，T细胞增殖所必须，正调控炎性反应，正调控IFN-γ和IL-17产生。IL-10是主要的免疫调节因子，具有显著的抗炎作用，能限制炎症导致的过量组织损伤。
由图9可看出，当d4CAR-T细胞和d8pCAR-T以效靶比5:1或1:1，分别与RS4；11共培养时，d8pCAR-T细胞分泌促炎细胞因子CCL2、CXCL9、IL-2等低于d4CAR-T细胞，而抗炎细胞因子IL-10的分泌，d8pCAR-T细胞要高于d4CAR-T细胞。d8CAR-T细胞与RS4；11共培养上清中，促炎和抗炎细胞因子分泌都大大降低，可能提示d8CAR-T细胞免疫功能降低。以上结果说明本发明制备的d8pCAR-T细胞在与靶肿瘤细胞共培养时，分泌的部分促炎细胞因子的水平降低，抗炎细胞因子升高，这预示着使用d8pCAR-T细胞治疗患者时，发生多种炎性细胞因子释放导致的毒副反应可能降低，临床应用可能更安全。
4、d8pCAR-T细胞在动物体内抗白血病能力增强、安全性提高，小鼠生存时间延长
分别用培养至同一天且同一剂量的d8pCAR-T细胞和常规培养的d8CAR-T细胞(2×105)治疗B-ALL小鼠，观察小鼠生存时间，结果如图10所示。从图可知，d8pCAR-T细胞在小鼠体内抗肿瘤能力强于常规培养的d8CAR-T细胞，由此d8pCAR-T细胞治疗的B-ALL小鼠生存时间(平均生存时间为74.25天)明显长于常规d8CAR-T细胞治疗的小鼠(平均生存时间为60.875天)。d8pCAR-T细胞治疗的B-ALL小鼠生存时间平均延长约14天，证明本发明制备的d8pCAR-T细胞在体内控制肿瘤能力更强。
分别使用相同数量的(2×105)d8pCAR-T细胞和常规培养的d4CAR-T细胞治疗B-ALL小鼠，观察和比较小鼠生存时间。结果如图11所示。文献中认为培养较短时间的CAR-T细胞(d3～5)具有更强的白血病控制能力，然而，动物体内实验证实，本发明制备的d8pCAR-T细胞相较于常规制备的d4CAR-T细胞，在治疗B-ALL小鼠时，小鼠生存时间延长(d8pCAR-T治疗的B-ALL小鼠平均生存时间为75.67天，而d4CAR-T治疗的B-ALL小鼠平均生存时间为62.25天)，前者延长小鼠平均生存时间约13.5天，证明本发明制备的d8pCAR-T细胞在体内更安全。
二、体外筛选时间的对比
我们进一步改变筛选时间，对不同筛选时间获得的pCAR-T在细胞转导效率、体外杀伤功能、效应细胞因子分泌、炎性相关细胞因子分泌水平等方面进行了比较。以下是使用0.5μg/ml嘌呤霉素，在不同筛选时间(即从d4天的CAR-T开始筛选，此为d4CAR-T，分别连续筛选4天得到d8pCAR-T、筛选6天得到d10pCAR-T、筛选9天得到d13pCAR-T、筛选12天得到d16pCAR-T)的结果比较。
1、d10pCAR-T细胞转导效率最高，d8pCAR-T次之
不同筛选时间获得的CAR-T和pCAR-T转导效率如图12所示，可以看出，d4CAR-T、d8pCAR-T、d10pCAR-T、d13pCAR-T、d16pCAR-T的转导效率分别为7.21％，37.8％，57.8％，12.1％，3.87％。其中d10pCAR-T转导效率最高，d8pCAR-T次之，d13pCAR-T和d16pCAR-T转导效率大大降低。
2、d8pCAR-T细胞体外对肿瘤细胞杀伤能力最强
不同筛选时间获得的pCAR-T体外杀伤能力如图13所示，可以看出，将pCAR-T细胞与白血病细胞系RS4；11以不同的效靶比(效靶比10:1至1:10)共培养72h后，杀伤能力最强的是d8pCAR-T，在效靶比为1:10时，能将96.6％的白血病细胞杀死。d16pCAR-T杀伤能力次之，在效靶比1:10时能杀死95.7％的白血病细胞，而其它如d13pCAR-T、d4CAR-T、d10pCAR-T在效靶比1:10时，分别仅能杀死61.9％，41.4％，23.1％的白血病细胞。
3、与白血病细胞共培养后细胞因子分泌水平的变化
(1)d8pCAR-T分泌的关键效应细胞因子水平最高
不同筛选时间的pCAR-T细胞分别与白血病细胞RS4；11共培养上清中的TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B分泌水平如图14所示。从图可知，常规培养以及筛选不同时间的pCAR-T细胞分别与白血病细胞RS4；11共培养时，上清中效应细胞因子TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B的分泌水平，无论是效靶比5:1还是1:1共培养，d8pCAR-T细胞分泌的效应细胞因子都是最强的，这决定了其优越的体外杀伤能力。随着筛选时间延长，效应细胞因子分泌水平不断降低。
(2)d8pCAR-T以及筛选更长时间的pCAR-T的关键炎性相关因子分泌水平均降低
不同筛选时间的pCAR-T细胞与白血病细胞RS4；11共培养上清中的IL-6分泌水平如图15所示。可以看出，除了常规培养的d4CAR-T外，筛选后的pCAR-T细胞的IL-6分泌水平都降低，低至＜1pg/mL，说明筛选后的pCAR-T由IL-6引起的CRS风险降低。
不同筛选时间的pCAR-T细胞与白血病细胞RS4；11共培养上清中的IL-17/IL-17A分泌水平如图16所示。可以看出，随着筛选时间延长，所得到的pCAR-T细胞与白血病细胞系RS4；11以不同效靶比共培养后，分泌到上清中的IL-17/IL-17A因子水平逐渐降低。虽然d8pCAR-T细胞分泌的IL-17/IL-17A水平较筛选更长时间的pCAR-T高，但相较于常规培养的d4CAR-T，其浓度降低了近10倍，说明其由Th17细胞亚群引起的炎性副反应风险降低。
不同筛选时间pCAR-T细胞与白血病细胞RS4；11共培养上清中的IL-10、CCL2、CXCL9、IL-2分泌水平如图17所示。可以看出，不同筛选时间的pCAR-T以效靶比5:1或1:1，分别与RS4；11共培养时，d8pCAR-T细胞分泌促炎细胞因子CCL2、CXCL9、IL-2以及抗炎细胞因子IL-10的水平，都较筛选更长时间的pCAR-T细胞高，但相较于常规培养的d4CAR-T，促炎细胞因子已经大大降低。
综上可知，本发明经过两步离心转导法以及筛选纯化法获得的d8pCAR-T细胞，其转导效率提高、体外杀伤能力增强、促炎细胞因子IL-6和IL-17/IL-17A分泌水平降低，其它促炎细胞因子CCL2、CXCL9、IL-2的分泌水平降低，且使用该细胞体内治疗的B-ALL小鼠生存时间延长。综合来看，d8pCAR-T细胞无疑是最优的。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将T细胞接种于CAR-T培养基中，培养18～24小时；
(2)将携带嵌合抗原受体序列和嘌呤霉素抗性基因的载体导入步骤(1)获得的细胞，培养18～24小时；
(3)收集步骤(2)获得的细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，培养36～48小时；
(4)收集步骤(3)获得的细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，并加入嘌呤霉素，培养36～48小时；
(5)收集步骤(4)获得的细胞并除去其中的死细胞，以0.5～1×106/ml的细胞密度接种于CAR-T培养基中，并加入嘌呤霉素，培养36～48小时，得到所述CAR-T细胞；步骤(4)和步骤(5)中所述嘌呤霉素的工作浓度为0.5～3μg/ml；
所述CAR-T培养基为含有CTSTM Immune Cell SR、非必需氨基酸、HEPES、丙酮酸钠、链霉素-青霉素、GlutaMAX和IL-2的无血清培养基；所述CAR-T培养基中，CTSTM Immune Cell SR、非必需氨基酸、HEPES、丙酮酸钠、链霉素-青霉素和GlutaMAX的体积百分比分别为3％～7％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％、0.5％～1.5％，IL-2的含量为30～100Unit/ml；
在细胞培养过程中，使用磁珠Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28激活T细胞，细胞与磁珠的数量比为1:0.3～1.5。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中除去死细胞的步骤包括：用FBS-1640培养基重悬步骤(4)获得的细胞，将细胞悬液置于Paque Ficoll溶液上，然后于500g～1200g条件下离心10min～30min使其分层，收集活细胞层。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将携带嵌合抗原受体序列和嘌呤霉素抗性基因的载体导入细胞的步骤包括：使用纤连蛋白溶液包被培养板，包被完毕去掉纤连蛋白溶液；将慢病毒载体加入所述培养板中，加入Polybrene至终浓度为3～8μg/ml，于25℃～34℃、1500g～2000g条件下离心保持1～3小时；弃去上清液，将步骤(1)获得的T细胞接种至所述培养板中，补充Polybrene至终浓度为3～8μg/ml，于25℃～34℃、1000g～1500g条件下离心1～3小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体为逆转录病毒载体。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述载体为腺相关病毒载体。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的CAR-T细胞。
8.一种用于肿瘤治疗的药物，其含有权利要求7所述的CAR-T细胞。
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