CN114456270B - 一种gd2嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种GD2嵌合抗原受体及其应用，所述人源化的GD2的scFv抗体具有结合GD2抗原的活性；所述人源化的GD2的scFv抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同一性。本发明还提供了GD2嵌合抗原受体以及表达所述GD2嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞。本发明所述的人源化的GD2的scFv抗体具有更好的生物活性以及相容性；所述的GD2嵌合抗原受体与GD2结合后有更好的反应效果，免疫反应更强，且具有更好的长效性；所述的嵌合抗原受体T细胞具有更高的安全性与持久性，应用价值极高。

Description

一种GD2嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，尤其涉及一种GD2嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般情况下，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。
CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR移植的T细胞以非HLA限制性的方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。目前，CAR-T的治疗在血液肿瘤上取得了令人振奋的效果，二代CD19CAR-T在复发难治的B系急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴白血病以及淋巴瘤上都被证实有抗肿瘤的功效，整体反应率根据肿瘤的不同约在50％～90％之间。
GD2(Disialoganglioside 2，神经节苷酯2)广泛地表现在神经母细胞瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤与肉瘤等肿瘤当中，在正常组织中低量且局限性地表达，是一种免疫治疗理想的肿瘤抗原。目前此癌症抗原最多应用于神经母细胞瘤的治疗当中，此为儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤，其中约50％的病童发病后，即有肿瘤大规模的扩散与转移，常规的手术、化疗、放疗与自体干细胞移植对于这群病人的治疗效果有限，即使在控制病情达到缓解后，也有80％以上的病人会于一年内复发并且死亡。
目前在神经母细胞瘤的免疫治疗中，发展较为成熟的有针对GD2的抗体治疗，这一方式在临床上取得了初步的成功，但已发表的临床研究报告指出，GD2单抗治疗毒性较大，有52％的患者会产生三到四级的毒性反应，部分患者出现神经毒性。除此之外，抗体施打后存在于外周血中，较难精准地进入肿瘤组织或肿瘤微小残留的部位，且无法长期存在体内。因此，制备一种嵌合抗原受体GD2 CAR-T细胞，除了具有抗体治疗的优点，且由于T细胞本身的特性，可精准地进入肿瘤组织，并长期存在于体内，能为复发难治的神经母细胞瘤病童提供一个更有效的治疗选择。目前通过GD2 CAR-T治疗神经母细胞瘤的临床报导皆初步显示了CAR-T的有效性，但仍缺乏长期观察的数据。
目前，CAR-T技术治疗实体肿瘤的效果并不十分理想，许多CAR-T的scFv区域多从鼠源的抗体衍生而来，鼠源scFv容易遭到人类免疫系统的排斥，造成CAR-T于体内无法长期存在，从而使治疗效果受限。有报导指出，这也是许多急性淋巴细胞白血病的病人在使用CD19 CAR-T完全缓解后又复发的原因之一，且也造成了再治疗的困难性。
因此，如何提供治疗效果好、持续时间长的人源化的GD2 CAR-T，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种GD2嵌合抗原受体及其应用，含有所述的GD2嵌合抗原受体的CAR-T可以清除GD2阳性的实体肿瘤，有效清除骨髓中的微小残留，且没有发生不良反应，结合优化的T细胞讯息传导区域，提高了CAR-T的安全性、有效性、记忆性以及长期维持性。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种人源化的GD2的scFv抗体，所述人源化的GD2的scFv抗体具有结合GD2抗原的活性；
所述人源化的GD2的scFv抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同一性。
SEQ ID NO.1：
QVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKASQSVSNDVTWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQDYSSFGAGTKLELK。
本发明中，所述人源化的GD2的scFv抗体针对肿瘤表面抗原GD2进行了人源化密码与抗体结构的特异性改造，改造后的scFv抗体在人体内功能更强，相合度更好，且不易被免疫系统排斥。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的人源化的GD2的scFv抗体的衍生抗体结合物。
第三方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的人源化的GD2的scFv抗体或第二方面所述的人源化的GD2的scFv抗体的衍生抗体结合物。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO.2具有80％以上的同一性。
SEQ ID NO.2：
caggtccagttggtcgaatctgggcctggggttgtacagccaggtcgaagtcttcgcatatcttgtgcagtatctggcttcagtgttaccaattacggtgtacactgggtgagacaacccccaggtaaagggttggaatggcttggagtgatatgggctgggggcattactaactacaactccgcttttatgtcacggctgactatttcaaaagataactccaagaatacggtgtacttgcaaatgaattcactccgcgcagaggatacagctatgtattattgtgccagtcggggcggccattacggctatgctctggactattggggacaagggacgctcgttacggtatccagtggtagtacgtcaggctccgggaaacctggaagctcagagggtagcaccaaaggcgatatcgtcatgtcacaatccccaagttccctcgcggtaagcgttggggagaaggtaaccatgtcttgtaaggcatctcagtcagtttcaaatgacgtgacgtggtaccaacagaagccgggacaatctcctaagttgttgatctactctgcaagtaacaggtactccggagtgccggaccgctttaccggctctggctcaggcacggacttcacgctgacgatatctagcgtcaaagccgaagacctcgcggtgtattactgtcaacaagattactctagtttcggtgctggaacgaagctggagctgaaa。
第四方面，本发明提供了GD2嵌合抗原受体，所述GD2嵌合抗原受体经过人源化改造，包括GD2抗原结合scFv结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域；
所述GD2抗原结合scFv结构域包括第一方面所述的人源化的GD2的scFv抗体或第二方面所述的人源化的GD2的scFv抗体的衍生抗体结合物。
本发明中，基于共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域与可诱导自杀(inducible caspase 9，iCasp9)融合结构域串联而成的靶向GD2的嵌合抗原受体，通过使用人源化抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原GD2，再通过对抗原结合结构域单链抗体进行特定的基因改造，相比于其他嵌合抗原受体，对抗原的结合能力更佳，进而提升CAR-T的效果。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。
根据本发明，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域与T cosignal信号传导结构域的结合，其中的CD28信号传导结构域和T cosignal信号传导结构域，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28信号传导结构域、T cosignal信号传导结构域的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响。
优选地，所述共刺激信号传导区包括CD28和CD27信号结构传导区或CD28和IL-15Ra信号结构传导区。
优选地，所述CD28和CD27信号结构传导区的氨基酸序列与SEQ ID NO.3具有90％以上的同一性。
优选地，所述CD28和IL-15Ra信号结构传导区的氨基酸序列与SEQ ID NO.4具有90％以上的同一性。
SEQ ID NO.3：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP；
SEQ ID NO.4：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL。
优选地，所述可诱导自杀融合结构域包括胱天蛋白酶9结构域(FKBP.Casp9)。
优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO.5具有90％以上的同一性。
SEQ ID NO.5：
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS。
优选地，所述GD2嵌合抗原受体还包括信号肽和/或2A序列。
根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的分泌蛋白基因信号肽。
根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域串联，所述2A序列可以使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使所述嵌合抗原受体发挥作用；通过注入激活剂，从而使可诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。
优选地，所述信号肽包括Secretory信号肽。
优选的，所述Secretory信号肽为CD8α基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.6：MALPVTALLLPLALLLHAARP。
优选的，所述Secretory信号肽为GM-CSFR基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。
本发明中，所述嵌合抗原受体还包括铰链区，氨基酸序列为多个GGGGS的重复组合，例如可以是：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO.8)。本领域技术人员可以根据实际情况对铰链区进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
优选地，所述GD2嵌合抗原受体包括Secretory信号肽、GD2抗原结合scFv结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域。
作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、GD2抗原结合scFv结构域、CD8α和/或CD28跨膜结构域、CD28和CD27信号结构传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：Secretory signal-GD2 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28跨膜结构域及其胞内信号结构传导区；
或所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、GD2抗原结合scFv结构域、CD8α和/或CD28跨膜结构域、CD28和IL-15Ra信号结构传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：Secretory signal-GD2 scFv-CD28-IL-15Ra-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28跨膜结构域及其胞内信号结构传导区。
本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1a或任何一种高表达启动子。
第五方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子编码第四方面所述的GD2嵌合抗原受体。
第六方面，本发明提供了病毒载体，所述病毒载体含有至少一个拷贝的第五方面所述的核酸分子。
本发明中，所述病毒载体可有效修饰免疫细胞，从而制备靶向细胞。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。
第七方面，本发明提供了重组病毒，所述重组病毒为第六方面所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞包装得到。
优选地，所述包装辅助质粒包括pNHP和pHEF-VSVG。
优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或TE671细胞中的任意一种。
第八方面，本发明提供了嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达第四方面所述的GD2嵌合抗原受体。
本发明中，所述嵌合抗原受体T细胞具有良好靶向杀伤作用，同时释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤的反应性质，其作用机理的示意图如图1所示。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞为将第五方面所述的核酸分子转染到免疫细胞中制备得到。
优选地，所述转染的方式包括通过病毒载体、通过真核表达质粒或通过mRNA中的任意一种，优选为通过病毒载体。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞为通过病毒载体将第五方面所述的核酸分子转染到T细胞中制备得到。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞为经过第六方面所述的病毒载体修饰后的T细胞。
第九方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括第一方面所述的人源化的GD2的scFv抗体、第二方面所述的人源化的GD2的scFv抗体的衍生抗体结合物、第四方面所述的GD2嵌合抗原受体、第七方面所述的重组病毒或第八方面所述的嵌合抗原受体T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第十方面，本发明提供第一方面所述的人源化的GD2的scFv抗体、第二方面所述的人源化的GD2的scFv抗体的衍生抗体结合物、第四方面所述的GD2嵌合抗原受体、第七方面所述的重组病毒、第八方面所述的嵌合抗原受体T细胞或第九方面所述的组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括GD2特异抗原表达的肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括GD2特异抗原表达的神经系统肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括神经母细胞瘤。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的嵌合抗原受体通过对针对肿瘤表面抗原GD2人源化嵌合抗原受体的共刺激信号传导区进行特定的基因改造，改造后的嵌合抗原受体在专一性地与GD2结合后有更好的反应效果，使得CAR-T细胞对肿瘤产生更强的免疫反应，相比于其他GD2嵌合抗原受体也具有更好的长效性。
(2)本发明的嵌合抗原受体T细胞相较于其他的GD2嵌合抗原受体T细胞具有更高的安全性与持久性，即使发生了过强的免疫反应引起病人的免疫因子风暴，由于具有诱导凋亡机制，也能通过诱导CAR-T细胞凋亡的药物将其撤除；本发明的嵌合抗原受体T细胞在进行CAR-T细胞回输后，可在体内长期监测到CAR-T的存在，证明其具有长效性，能使病人达到长期缓解的作用。
(3)本申请中的人源化抗体相关制剂可针对所有GD2阳性疾病发挥作用，其中，已实际应用于表达肿瘤特异靶点GD2的IV期神经母细胞瘤病人中，针对骨髓微小残留的患者，有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效清除对化疗不敏感的微小残留。此外，GD2CAR-T也联合其他靶点CAR-T应用于脑胶质瘤患者当中，并于病人体内长期监测到GD2CAR-T的存在，对维持长期缓解有所助益。
附图说明
图1为嵌合抗原受体T细胞的作用机理的示意图；
图2为2种嵌合抗原受体的结构示意图；
图3为慢病毒载体的骨架载体pTYF的质粒图谱；
图4A为24h与48h时不同类型的T细胞对GD2阳性肿瘤细胞株的体外杀伤图片(放大倍数为50×)；
图4B为24h与48h时不同类型的T细胞对GD2阳性肿瘤细胞株杀伤后的流式细胞仪定量剩余靶细胞的统计结果图片；
图4C为24h时不同类型的T细胞对GD2阳性肿瘤细胞株杀伤后靶细胞死亡比例的统计结果图片；
图5A为GD2 CAR-T治疗神经母细胞瘤的流程示意图(其中插图的放大倍数为20×)；
图5B为实施例8中GD2 CAR-T回输后体内CAR拷贝数检测的曲线图；
图6A为GD2 CAR-T细胞联合其他靶点治疗脑胶质瘤的流程示意图(其中插图的放大倍数为20×)；
图6B为2位脑胶质瘤患者的肿瘤切片免疫组化染色结果图片(放大倍数为20×)；
图6C为实施例9中GD2 CAR-T回输后体内CAR拷贝数检测的曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种人源化的GD2的scFv抗体，所述人源化的GD2的scFv抗体具有结合GD2抗原的活性；
所述人源化的GD2的scFv抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
QVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKASQSVSNDVTWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQDYSSFGAGTKLELK。
实施例2嵌合抗原受体的构建
本实施例提供2种嵌合抗原受体，其结构示意图如图2所示。
其中一种嵌合抗原受体为Secretory信号肽、GD2抗原结合scFv结构域、CD28跨膜结构域、CD28和CD27信号结构传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：Secretory signal-GD2 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28跨膜结构域及其胞内信号结构传导区；
另一种嵌合抗原受体为Secretory信号肽、GD2抗原结合scFv结构域、CD28跨膜结构域、CD28和IL-15Ra信号结构传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：Secretory signal-GD2scFv-CD28-IL-15Ra-CD3ζ-2A-FKBP.Casp9，其中的CD28代表CD28跨膜结构域及其胞内信号结构传导区。
其中，Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.6：MALPVTALLLPLALLLHAARP。
CD28跨膜结构域的序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
CD28和CD27信号结构传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CD28和IL-15Ra信号结构传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP；
SEQ ID NO.4：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL。
CD3ζ信号传导结构域的序列如SEQ ID NO.8所示。
SEQ ID NO.8：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；
2A序列的序列如SEQ ID NO.9所示。
SEQ ID NO.9：TSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP。
胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5：
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS。
实施例3
本实施例提供2种慢病毒载体，所述慢病毒载体编码实施例2中的2种嵌合抗原受体。
其中，所述慢病毒载体的骨架载体为pTYF，具体可参见如发表：Chang,L.-J.andZaiss,A.-K.(2001)Methods for the preparation and use of lentivirusvectors.Methods in Molecular Medicine,Gene Therapy Protocols,2nd Ed.,pp 303-318,Ed.Jeffrey Morgan,Humana Press,Inc.；Cui,Y.and Chang,L.-J.(2003)Detectionand selection of lentiviral vector transduced cells.“Methods in MolecularBiology Vol.229:Lentivirus Gene Engineering Protocols”pp 69-85,Ed.MaurizioFederico,Humana Press,Inc；Oka,M.Chang,L.-J.,Costantini,F.,and Terada,N.(2005)Lentivirus mediated gene transfer in embryonic stem cells.Series:“Methods inMolecular Biology”Embryonic Stem Cells 2.。
质粒图谱如图3所示。
实施例4慢病毒包装
本实施例提供2种重组慢病毒，所述重组慢病毒为实施例3中的慢病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞包装得到，步骤如下：
(1)培养293T细胞17～18h；
(2)加入新鲜的DMEM(Thermo Fisher)；
(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔加入DMEM、包装辅助质粒(pNHP和pHEF-VSV-G)以及pTYF CAR DNA载体(具体操作可参见Chang,L.-J.and Zaiss,A.-K.(2001)Methods for the preparation and use of lentivirus vectors.Methods inMolecular Medicine,Gene Therapy Protocols,2nd Ed.,pp 303-318,Ed.JeffreyMorgan,Humana Press,Inc.)，漩涡振荡；
(4)将Superfect(Qiagene)加至离心管中，室温静置7～10min；
(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入培养细胞中，漩涡；
(6)37℃CO2培养箱里培养4～5h；
(7)吸除培养液，用AIM-V(BRL)冲洗培养基，并加入新的AIM-V继续培养；
(8)将细胞放回CO2培养箱中培养过夜，第二天观察转染效率。
实施例5慢病毒的纯化和浓缩
1.病毒纯化
通过离心(1000g，5min)去除细胞碎片，得到病毒上清液，用0.45μm的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，分装，于-80℃储存；
通常情况下，每毫升的培养基中，转染细胞可以产生106～107转导单位滴度的慢病毒载体。
2.用离心过滤器浓缩慢病毒
(1)在生物安全柜中，取浓缩离心管，消毒无菌清洗2次；
(2)每个离心过滤管中加入病毒上清液，离心直到病毒体积减小20～50倍；
(3)震荡过滤管，离心收集浓缩病毒到收集杯中，将所有管中的病毒集中到一个离心管中。
实施例6 CAR-T细胞的制备
本实施例提供2种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达实施例2中的嵌合抗原受体，制备方法如下：
将活化后的T细胞悬浮于培养液中并且添加10μg/mL的polybrene(Sigma)，培养液为含有细胞培养因子IL-2、IL-7与IL-15(均购自Peprotech)的AIM-V，分别加入浓缩后的实施例5中的慢病毒，100g室温离心100min后，置于37℃培养24h，加入培养液，培养4天后，将细胞收获并计数，培养2天后输至病人体内。
实施例7 CAR-T体外杀伤试验
(1)向GD2阳性的肿瘤细胞株中通过慢病毒载体转入绿色荧光蛋白使其稳定表达。
(2)将T细胞与非专一性的CAR-T细胞(CD44v6 CAR-T)作为阴性对照组，实施例6中的2种CAR-T作为实验组：一种结构为GD2 ScFv-CD28-CD27-CD3ζ，简写CD27-GD2CAR-T；另一种结构为GD2 ScFv-CD28-IL15R-CD3ζ，简写成IL15R-GD2 CAR-T。将上述四种细胞与步骤(1)的肿瘤置于37℃、5％CO2培养箱共培养24～48h，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞的杀伤情形，结果如图4A所示。死亡的肿瘤细胞没有绿色荧光蛋白的表达，可以看出CD27-GD2CAR-T组和IL15R-GD2 CAR-T组的杀伤效果明显优于对照组，其中以IL15R-GD2 CAR-T组的杀伤效果最好。
同时使用流式细胞仪定量剩余靶细胞的绿色荧光，并进行统计，结果如图4B所示，可以看出，CD27-GD2 CAR-T组和IL15R-GD2 CAR-T组剩余的靶细胞较少，表明相应的T细胞的杀伤能力较强。
(3)使用PI/AnnexinV染剂(Sigma)定量靶细胞的凋亡情形，观察CAR-T对靶细胞的杀伤情形，结果如图4C所示，可以看出CD27-GD2 CAR-T组和IL15R-GD2 CAR-T组中靶细胞的死亡率较高，与之前的结果保持一致。
上述实验重复三次以上。
综合图4A、图4B和图4C的结果，可以看出，相较于两组阴性对照组，两种GD2 CAR-T细胞皆有明显的杀伤能力，且IL15R-GD2 CAR-T的杀伤效果优于CD27-GD2 CAR-T。
实施例8 GD2 CAR-T细胞治疗神经母细胞瘤
(1)征集6位四期神经母细胞瘤病人作为对象，其经过多线治疗后骨髓无法缓解，骨髓有微小残留。整体治疗流程如图5A所示。
(2)病人的肿瘤白片通过免疫组化染色确认GD2的阳性表达，相关信息整理于表1中。
(3)采集病人白血球浓厚液，通过Ficoll密度梯度离心法分离白血球浓厚液中的外周血单个核淋巴细胞，并使用CD3磁珠筛选出T细胞并加入抗CD28的抗体(BDBiosciences)进行T细胞活化，以2×106CAR-T细胞数/千克体重进行后续的GD2 CAR-T制备。
(4)回输前病人以小剂量化疗进行预处理，预处理方案为250mg/m2的环磷酰胺(Sigma)处理3天，25mg/m2的氟达拉滨(Sigma)处理3天，预处理与CAR-T输入间隔24h，总体3天。
(5)以静脉注射的方式回输CAR-T细胞，回输剂量见表1。
(6)回输后由临床医生对病人进行监测与毒性反应评估，表1中汇总了6位病人回输后的临床毒性反应即免疫因子风暴(Cytokine release syndrome，CRS)，结果显示6位病人皆没有观察到CRS反应。
(7)回输后定期抽取病人的少量外周血，分离外周血单个核淋巴细胞后抽取细胞染色体DNA(gDNA)，使用专一性引物以qPCR方式(具体操作可参见Chang,L.-J.and Zaiss,A.-K.(2001)Methods for the preparation and use of lentivirus vectors.Methodsin Molecular Medicine,Gene Therapy Protocols,2nd Ed.,pp 303-318,Ed.JeffreyMorgan,Humana Press,Inc.)定量外周血中CAR拷贝数，图5B为6位病人体内CAR拷贝变化曲线图，其中pt3为观察最久的病人，于3个月后仍能检测到外周血中的CAR-T拷贝。
(8)GD2 CAR-T回输前后由医院抽取骨髓穿刺液，检测其中的肿瘤细胞，其中有4位病人于回输后骨髓微小残留得到清除，有2位病人回输后骨髓仍有微小残留，详见表1。
表1
实施例9 GD2 CAR-T细胞联合其他靶点治疗脑胶质瘤
(1)征集2位难治脑胶质瘤患者作为对象，整体治疗流程如图6A所示。
(2)病人的肿瘤白片通过免疫组化染色确认靶点表达，最后选择GD2、辅以另一表达量较高的肿瘤抗原作为CAR-T治疗靶点，切片免疫组化染色结果如图6B所示。
(3)采集病人白血球浓厚液，通过Ficoll密度梯度离心法分离白血球浓厚液中的外周血单个核淋巴细胞，并使用CD3磁珠筛选出T细胞并加入抗CD28的抗体进行T细胞活化，以2×106CAR-T细胞数/千克体重进行后续的CAR-T制备。
(4)回输前病人以小剂量化疗进行预处理，预处理方案为250mg/m2的环磷酰胺处理3天，25mg/m2的氟达拉滨处理3天，预处理与CAR-T输入间隔24h，总体3天。
(5)以静脉注射的方式同时回输两种CAR-T细胞，回输剂量见表2。
(6)回输后由临床医生对病人进行监测与毒性反应评估，表2汇总了2位病人回输后的临床毒性反应即免疫因子风暴(Cytokine release syndrome，CRS)，结果显示2位病人皆没有观察到CRS反应。
(7)回输前后通过MRI对患者肿瘤病灶进行评估，其临床反应整理于表2中，一位患者评估为病情稳定，一位则达到部分缓解效果。
(8)回输后定期抽取病人的少量外周血，分离外周血单个核淋巴细胞后抽取细胞染色体DNA(gDNA)，使用专一性引物以qPCR方式定量外周血中CAR拷贝数，图6C为2位病人体内CAR拷贝变化的曲线图，患者一回输后第183天与202天后外周血仍有1.20％与0.05％的CAR-T拷贝，患者二于回输后第209天与254天后还能测到0.42％与0.45％的CAR-T拷贝，证明了GD2 CAR-T在体内可以长期维持。
表2
综上所述，本发明所述的GD2嵌合抗原受体具有更好的反应效果及长效性。应用于表达肿瘤特异靶点GD2的IV期神经母细胞瘤病人中，针对骨髓微小残留的患者具有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效清除对化疗不敏感的微小残留。此外，GD2 CAR-T也可以联合其他靶点CAR-T应用于脑胶质瘤患者的治疗中，并且可以在病人体内长期监测到GD2CAR-T的存在，对维持长期缓解有所助益。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 北京美康基免生物科技有限公司
<120> 一种GD2嵌合抗原受体及其应用
<130> 2022
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230 235 240
Lys
<210> 2
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggtccagt tggtcgaatc tgggcctggg gttgtacagc caggtcgaag tcttcgcata 60
tcttgtgcag tatctggctt cagtgttacc aattacggtg tacactgggt gagacaaccc 120
ccaggtaaag ggttggaatg gcttggagtg atatgggctg ggggcattac taactacaac 180
tccgctttta tgtcacggct gactatttca aaagataact ccaagaatac ggtgtacttg 240
caaatgaatt cactccgcgc agaggataca gctatgtatt attgtgccag tcggggcggc 300
cattacggct atgctctgga ctattgggga caagggacgc tcgttacggt atccagtggt 360
agtacgtcag gctccgggaa acctggaagc tcagagggta gcaccaaagg cgatatcgtc 420
atgtcacaat ccccaagttc cctcgcggta agcgttgggg agaaggtaac catgtcttgt 480
aaggcatctc agtcagtttc aaatgacgtg acgtggtacc aacagaagcc gggacaatct 540
cctaagttgt tgatctactc tgcaagtaac aggtactccg gagtgccgga ccgctttacc 600
ggctctggct caggcacgga cttcacgctg acgatatcta gcgtcaaagc cgaagacctc 660
gcggtgtatt actgtcaaca agattactct agtttcggtg ctggaacgaa gctggagctg 720
aaa 723
<210> 3
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys
115 120 125
Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys
145 150 155 160
Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
165
<210> 4
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala
115 120 125
Ser Val Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr
130 135 140
Ser Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
145 150 155
<210> 5
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro
20 25 30
Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His
35 40 45
Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp
50 55 60
Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly
100 105 110
Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys
115 120 125
Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val
130 135 140
Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu
145 150 155 160
Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe
165 170 175
Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys
180 185 190
Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val
195 200 205
Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu
210 215 220
Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu
225 230 235 240
Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr
245 250 255
Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe
260 265 270
Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe
275 280 285
Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala
290 295 300
Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp
305 310 315 320
Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala
325 330 335
Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr
340 345 350
Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr
355 360 365
Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly
385 390 395 400
Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu
405 410 415
Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser
420
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Thr Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20

Claims (23)

1.一种人源化的GD2的scFv抗体，其特征在于，所述人源化的GD2的scFv抗体具有结合GD2抗原的活性；
所述人源化的GD2的scFv抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的人源化的GD2的scFv抗体；
所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
3.GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述GD2嵌合抗原受体经过人源化改造，包括GD2抗原结合scFv结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域；
所述GD2抗原结合scFv结构域为权利要求1所述的人源化的GD2的scFv抗体。
4.根据权利要求3所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域。
5.根据权利要求3所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号传导区为CD28和CD27信号结构传导区或CD28和IL-15Ra信号结构传导区。
6.根据权利要求5所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28和CD27信号结构传导区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
7.根据权利要求5所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28和IL-15Ra信号结构传导区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
8.根据权利要求3所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述可诱导自杀融合结构域为胱天蛋白酶9结构域。
9.根据权利要求8所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。
10.根据权利要求3所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述GD2嵌合抗原受体还包括信号肽和/或2A序列。
11.根据权利要求10所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽为Secretory信号肽。
12.根据权利要求3所述的GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述GD2嵌合抗原受体为Secretory信号肽、所述GD2抗原结合scFv结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域。
13.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求3-12中任一项所述的GD2嵌合抗原受体。
14.病毒载体，其特征在于，所述病毒载体含有至少一个拷贝的权利要求13所述的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包括慢病毒载体或逆转录病毒载体。
16.根据权利要求15所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。
17.重组病毒，其特征在于，所述重组病毒为权利要求16所述的病毒载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞包装得到；
所述包装辅助质粒包括pNHP和pHEF-VSVG；
所述哺乳动物细胞包括293细胞、293T细胞或TE671细胞中的任意一种。
18.嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求3-12中任一项所述的GD2嵌合抗原受体。
19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞为将权利要求13所述的核酸分子转染到免疫细胞中制备得到。
20.根据权利要求19所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述转染的方式包括通过病毒载体、通过真核表达质粒或通过mRNA中的任意一种。
21.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞为通过病毒载体将权利要求13所述的核酸分子转染到T细胞中制备得到。
22.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的人源化的GD2的scFv抗体、权利要求3-12任一项所述的GD2嵌合抗原受体、权利要求17所述的重组病毒或权利要求18-21中任一项所述的嵌合抗原受体T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
23.权利要求1所述的人源化的GD2的scFv抗体、权利要求3-12中任一项所述的GD2嵌合抗原受体、权利要求17所述的重组病毒、权利要求18-21中任一项所述的嵌合抗原受体T细胞或权利要求22所述的组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备肿瘤治疗药物中的应用；
所述肿瘤为神经母细胞瘤或脑胶质瘤。
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