CN115873130A - 一种靶向SIA-IgG的CAR分子和CAR-T细胞及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向SIA‑IgG的CAR分子和CAR‑T细胞及应用，所述CAR分子包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，所述胞外段包括scFv，所述scFv包括VH、VL以及连接VH和VL的linker，所述VH序列如SEQ ID NO.1所示，所述VL序列如SEQ ID NO.2所示；本发明靶向膀胱癌的CAR‑T细胞，对膀胱癌的杀伤效果良好，而且比目前存在的靶向HER2的CAR‑T细胞对膀胱癌的杀伤特异性更强，能够避免对正常组织的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种靶向SIA-IgG的CAR分子和CAR-T细胞及应用。
背景技术
膀胱癌发病率位居全球恶性肿瘤第十位，然而缺乏有效的治疗手段。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T细胞免疫疗法是目前最有希望攻克肿瘤的疗法之一，在膀胱癌的治疗中有极大的应用前景。
CAR-T细胞是指通过基因工程使T细胞表达可以识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体。目前最常用的二代CAR的组成包含单链抗体可变片段(Single chain fragmentvariable,scFv)、铰链区、胞内激活结构域(CD3ζ)，以及一个胞内共刺激结构域(Costimulatory domain,CM)，通常为CD28或4-1BB。在CAR-T的临床治疗中，通常首先收集患者的T细胞，在体外活化T细胞并通过慢病毒或逆转录病毒将CAR转运至T细胞内，即CAR-T细胞，经过大约两周的体外扩增培养，CAR-T细胞会被重新输入至患者体内。
CAR-T细胞通过scFv识别肿瘤细胞表面抗原，继而被激活，释放大量的细胞因子、穿孔素和颗粒酶等，最终诱导对肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。CAR-T细胞杀伤效果强，杀伤肿瘤特异性好，然而目前膀胱癌缺乏CAR-T治疗有效且特异的靶点，多数膀胱癌相关抗原往往在正常组织中也有一定程度的表达，难以避免CAR-T治疗膀胱癌过程中对正常组织的损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向SIA-IgG的CAR分子和CAR-T细胞及应用，该CAR-T细胞对膀胱癌细胞的特异性强，能够避免对正常组织的损伤。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种靶向SIA-IgG的CAR分子，所述CAR分子包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其特征在于，所述胞外段包括scFv，所述scFv包括VH、VL以及连接VH和VL的linker，所述VH序列如SEQ ID NO.1所示，所述VL序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述scFv中VH在前，VL在后；所述linker序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述胞内段包括胞内共刺激结构域，所述胞内共刺激结构域为CD28或4-1BB。
优选地，所述胞外段还包括Hinge，所述scFv通过Hinge与跨膜段连接。
本发明第二方面提供一种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞包括上述CAR分子。
本发明中CAR分子包含单链抗体可变片段(Single chain fragment variable,scFv)、铰链区(Hinge)、胞内激活结构域(CD3ζ)，以及一个胞内共刺激结构域(Costimulatory domain,CM；如4-1BB或CD28)。scFv由单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)通过多肽(Linker)连接组成，可特异性识别肿瘤相关抗原；铰链区的长度由抗原表位的位置及暴露程度决定；CD3ζ提供T细胞活化的第一信号，CM提供T细胞活化的第二信号。
CAR-T细胞通过scFv识别肿瘤细胞表面抗原，继而被激活，CAR分子在T细胞膜上聚集和固定，形成免疫突触，CD3ζ链上的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptortyrosine-based activation motif,ITAM)磷酸化并通过70kDa酪氨酸激酶相关蛋白(ZAP70)等启动下游信号传递，释放大量的细胞因子、穿孔素、颗粒酶等，最终诱导对肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。
本发明第三方面提供一种上述CAR-T细胞的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
(a)采用密度梯度离心法从健康者或膀胱癌患者的血液中富集得到T细胞；
(b)采用分子克隆技术将scFv序列连接到CAR载体上，得到CAR分子；
(c)采用慢病毒将CAR分子转入T细胞中，即得所述CAR-T细胞。
优选地，所述CAR载体为二代CAR载体。
本发明第四方面提供一种上述CAR分子或CAR-T细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。
优选地，所述肿瘤为膀胱癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明靶向膀胱癌的CAR-T细胞，对膀胱癌的杀伤效果良好，而且比目前存在的靶向HER2的CAR-T细胞对膀胱癌的杀伤特异性更强，能够避免对正常组织的损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例2中构建的四种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞的结构及CAR的病毒转染效率；
图2为本发明实施例3中激光共聚焦显微镜观察SIA-IgG-CAR在T细胞膜上分布情况以及激光共聚焦显微镜下CAR分子在Jurkat细胞与肿瘤细胞的接触面聚集情况；
图3为本发明实施例4中荧光倒置显微镜下不同CAR-T细胞对膀胱癌细胞5637及成纤维细胞SC2的杀伤情况；
图4为本发明实施例4中荧光素酶检测不同CAR-T细胞对膀胱癌细胞5637及成纤维细胞SC2的杀伤效率；
图5为本发明实施例5中荧光倒置显微镜下PBMC、SIA-IgG-CAR-T和HER2-CAR-T细胞对SV-HUC-1、HK-2、293T的杀伤情况；
图6为本发明实施例5中荧光素酶检测的PBMC、SIA-IgG-CAR-T和HER2-CAR-T细胞与SV-HUC-1、HK-2、293T共培养48h后，存活靶细胞的比例。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明实施例提供一种靶向SIA-IgG的CAR分子，该CAR分子包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其特征在于，所述胞外段包括scFv，所述scFv包括VH、VL以及连接VH和VL的linker，VH序列如SEQ ID NO.1所示，VL序列如SEQ ID NO.2所示。
VH序列具体为：CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGATGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACTGACTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCGATTGATACTTCTGATAGTTATACTAGGTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTTCATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCATCTATGACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。
VL序列具体为：GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTAGCAATCAAAAGAGCTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
优选地，所述scFv中VH在前，VL在后；所述linker序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT。
进一步地，胞内段包括胞内共刺激结构域，胞内共刺激结构域为CD28或4-1BB。
进一步地，胞外段还包括Hinge，scFv通过Hinge与跨膜段连接。
进一步地，SIA-IgG的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为QVQLQQPGAELVMPGASVKMSCKASGYTFTDYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDTSDSYTRYNQKFKDKATLTVDESSSTAFMQLSSLTSEDSAVYYCARSIYDWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKSYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPSTFGGGTKLEIK。
本发明实施例还提供一种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞，该CAR-T细胞包括上述CAR分子。
本发明中CAR分子包含单链抗体可变片段(Single chain fragment variable,scFv)、铰链区(Hinge)、胞内激活结构域(CD3ζ)，以及一个胞内共刺激结构域(Costimulatory domain,CM；如4-1BB或CD28)。scFv由单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)通过多肽(Linker)连接组成，可特异性识别肿瘤相关抗原；铰链区的长度由抗原表位的位置及暴露程度决定；CD3ζ提供T细胞活化的第一信号，CM提供T细胞活化的第二信号。
CAR-T细胞通过scFv识别肿瘤细胞表面抗原，继而被激活，CAR分子在T细胞膜上聚集和固定，形成免疫突触，CD3ζ链上的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptortyrosine-based activation motif,ITAM)磷酸化并通过70kDa酪氨酸激酶相关蛋白(ZAP70)等启动下游信号传递，释放大量的细胞因子、穿孔素、颗粒酶等，最终诱导对肿瘤细胞的细胞毒性杀伤。
本发明实施例又提供一种上述CAR-T细胞的构建方法，该构建方法包括如下步骤：
(a)采用密度梯度离心法从健康者或膀胱癌患者的血液中富集得到T细胞；
(b)采用分子克隆技术将scFv序列连接到CAR载体上，得到CAR分子；
(c)采用慢病毒将CAR分子转入T细胞中，即得所述CAR-T细胞。
优选地，所述CAR载体为二代CAR载体。
本发明实施例又提供一种上述CAR分子或CAR-T细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。
进一步地，上述CAR分子或CAR-T细胞在制备抗膀胱癌制剂中的应用。
以下通过具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。
实施例1
本实施例为一种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞构建方法，该构建方法包括如下步骤：
(a)采用密度梯度离心法从膀胱癌患者的血液中富集得到T细胞；
(b)采用分子克隆技术将scFv序列连接到二代CAR载体(购买于addgene)上，得到CAR分子；具体包括：
从addgene公司购买了共刺激受体为CD28或4-1BB的两种二代CAR质粒，使用限制性内切酶BamHI和NotI对质粒进行双酶切获得CAR的载体骨架，通过聚合酶链式反应(PCR)将包含scFv的质粒片段进行扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳及胶回收得到所需的质粒片段，将CAR的载体骨架和scFv质粒片段进行Gibson无缝连接，连接产物加入DH5α感受态细胞进行转化、涂板、挑选单克隆，通过测序鉴定质粒序列正确；
(c)利用293T细胞包装携带CAR的慢病毒载体，用其感染经过CD3和CD28抗体刺激活化的T细胞，即得上述靶向SIA-IgG的CAR-T细胞。
实施例2
按照实施例1的方法构建四种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞，CAR1结构为重链(VH)在前、轻链(VL)在后，共刺激受体为4-1BB(简称VH-VL 4-1BB)；CAR2结构为VL在前、VH在后，共刺激受体为4-1BB(简称VL-VH 4-1BB)；CAR3结构为VH在前、VL在后，共刺激受体为CD28(简称VH-VL CD28)；CAR4结构为VL在前、VH在后，共刺激受体为CD28(简称VL-VH CD28)。构建的四种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞的结构如图1中A所示，采用慢病毒感染48h后，通过流式细胞仪检测病毒感染效率，检测结果如图1中B所示；
由图1中B可知，病毒感染效率为20％-50％，其中，VH在前，VL在后，胞内共刺激结构域为CD28，感染效率最高。
实施例3
将绿色荧光蛋白GFP与CAR直接融合，GFP可代表CAR的位置，通过激光共聚焦显微镜观察SIA-IgG-CAR在T细胞膜上分布情况，观察结果如图2中A所示；
由图2中A可知，CAR和GFP成功在膜上表达，SIA-IgG-CAR在T细胞膜成功折叠。
将CAR分子导入Jurkat细胞(人白血病T淋巴细胞，不具备杀伤能力)来模拟SIA-IgG-CAR-T细胞与膀胱癌细胞5637(红色)的接触过程，在激光共聚焦显微镜下发现1小时内CAR分子(绿色)会在Jurkat细胞与肿瘤细胞的接触面聚集，形成免疫突触(图2中B)；
由图2中B可知，肿瘤细胞与CAR-Jurkat细胞之间形成了免疫突触。
实施例4
本实施例为SIA-IgG-CAR-T的体外杀伤效率检测
通过荧光倒置显微镜和荧光素酶杀伤实验评估四种SIA-IgG-CAR-T对膀胱癌细胞5637及成纤维细胞SC2的杀伤作用，以HER-CAR-T作为阳性对照，以CD19-CAR-T作为阴性对照；
荧光倒置显微镜的杀伤实验结果如图3所示，图3中，CD19代指CD19-CAR-T；HER2代指HER2-CAR-T；四种SIA-IgG-CAR-T的简称详见实施例2。显微镜下各种CAR-T细胞对膀胱癌细胞5637及成纤维细胞SC2的杀伤情况。靶细胞均为贴壁细胞，CAR-T杀伤靶细胞后会聚团，在培养基呈悬浮状态(荧光倒置显微镜4×)；
荧光素酶杀伤实验结果如图4所示，杀伤效率＝(实验组荧光素酶发光值-对照组荧光素酶发光值)/对照组荧光素酶发光值×100％。E:T＝Effector:Target，即效应细胞(SIA-IgG-CAR-T)与靶细胞(5637或SC2)的比值；
由图3、图4可知：靶向SIA-IgG的CAR-T细胞对5637的杀伤效果良好，且以T细胞剂量依赖的方式逐渐增强，其中以VH-VL、共刺激信号为CD28的CAR-T细胞杀伤效果最佳。此外，效靶比为4:1时SIA-IgG-CAR-T对肿瘤细胞的杀伤效果与效靶比为2:1时HER2-CAR-T细胞的杀伤效果相当。然而，SIA-IgG-CAR-T对SC2细胞无明显杀伤，但HER2-CAR-T细胞对SC2杀伤作用很强。因此，SIA-IgG-CAR-T对肿瘤的杀伤特异性优于HER2-CAR-T。
实施例5
本实施例为SIA-IgG-CAR-T与HER2-CAR-T的安全性和肿瘤杀伤特异性的研究：
将相同数量的SIA-IgG-CAR-T细胞和HER2-CAR-T细胞分别加入三种永生化正常细胞系里，即人肾上皮细胞系293T，人肾皮质近曲小管上皮细胞HK2，人膀胱上皮细胞SV-HUC-1，检测SIA-IgG-CAR-T和HER2-CAR-T对这三种正常细胞系的杀伤能力；
荧光倒置显微镜的杀伤实验结果如图5所示，靶细胞均为贴壁细胞，CAR-T杀伤靶细胞后会聚团，在培养基呈悬浮状态(荧光倒置显微镜4×)；
图6为通过荧光素酶检测的PBMC、SIA-IgG-CAR-T和HER2-CAR-T细胞与SV-HUC-1、HK-2、293T共培养48h后，存活靶细胞的比例。活细胞(％)＝实验组荧光素酶发光值/对照组荧光素酶发光值×100％。
由图5、图6可知，HER2-CAR-T细胞对正常细胞也有很强的杀伤效果，而SIA-IgG-CAR-T对正常细胞的杀伤效果并不显著，因此，SIA-IgG-CAR-T对肿瘤细胞的杀伤特异性远远强于目前已进入临床实验的HER2-CAR-T细胞，生物安全性更高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (9)
1.一种靶向SIA-IgG的CAR分子，所述CAR分子包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其特征在于，所述胞外段包括scFv，所述scFv包括VH、VL以及连接VH和VL的linker，所述VH序列如SEQ ID NO.1所示，所述VL序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的CAR分子，其特征在于，所述scFv中VH在前，VL在后；所述linker序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的CAR分子，其特征在于，所述胞内段包括胞内共刺激结构域，所述胞内共刺激结构域为CD28或4-1BB。
4.根据权利要求1所述的CAR分子，其特征在于，所述胞外段还包括Hinge，所述scFv通过Hinge与跨膜段连接。
5.一种靶向SIA-IgG的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞包括权利要求1～4任一所述的CAR分子。
6.权利要求5所述的CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)采用密度梯度离心法从健康者或膀胱癌患者的血液中富集得到T细胞；
(b)采用分子克隆技术将scFv序列连接到CAR载体上，得到CAR分子；
(c)采用慢病毒将CAR分子转入T细胞中，即得所述CAR-T细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述CAR载体为二代CAR载体。
8.权利要求1～4任一所述的CAR分子或权利要求5所述的CAR-T细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为膀胱癌。
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