CN113684226A - 基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法 - Google Patents
基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113684226A CN113684226A CN202110631393.6A CN202110631393A CN113684226A CN 113684226 A CN113684226 A CN 113684226A CN 202110631393 A CN202110631393 A CN 202110631393A CN 113684226 A CN113684226 A CN 113684226A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- car
- cells
- culture
- plasmid
- minicircle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 75
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 claims abstract description 45
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 119
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 37
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 6
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 5
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 5
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010005465 AC133 Antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005908 AC133 Antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 claims description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 abstract description 4
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 abstract 1
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1scFv的CAR‑T细胞的制备方法。本发明所述的制备方法包括：睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒的构建；睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒的制备；电转制备CAR‑T细胞；扩增富集CAR‑T细胞；以及CAR‑T细胞收获和鉴定。本发明通过非病毒方法得到分泌PD1scFv且靶向CD133的CAR‑T细胞，该细胞不仅能有效地将CAR‑T细胞和免疫检查点抑制剂的优势联合起来，且采用的非病毒睡美人转座子联合微环的方法，还能进一步去除质粒上的抗性基因，能最大程度保证CAR‑T细胞在临床应用的安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1单链抗体scFv的CAR-T细胞的制备方法，具体涉及一种基于睡美人转座子和微环载体技术构建非病毒CAR-T细胞的方法。
背景技术
原发性肝癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，传统的手术、放化疗仍难有效治疗肿瘤，迫切需要开发新的治疗手段，免疫治疗已成为当前肿瘤治疗研究和临床应用的热点。其中，通过基因工程手段在体外修饰T细胞后再回输至患者体内的CAR-T细胞疗法，在治疗血液系统恶性肿瘤中展现出巨大的优势，但其在实体瘤中的治疗效果不佳，因此有必要研究如何改进CAR-T细胞的功能，使之能在实体瘤中得到更好的应用。
CD133是一种跨膜糖蛋白，有研究报道，CD133在中晚期肝癌中表达，除此之外，CD133还是肿瘤干细胞和内皮祖细胞的标志，常常伴随着肿瘤的转移和复发，这些特征使CD133成为CAR-T细胞合理的靶点。免疫检查点抑制剂如PD1单抗，能通过解除T细胞表面PD1抑制性受体的信号，恢复T细胞对肿瘤的杀伤能力，在多种实体瘤中延长患者的生存时间。因此，CAR-T细胞和免疫抑制点疗法给攻克肿瘤带来了很多希望，而构建一种能分泌PD1scFv且靶向肿瘤的CAR-T细胞能有效将这两种技术有机结合在一起，有望为治疗实体瘤提供一种新的策略。然而，在制备能分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的过程中仍有很多亟需解决的问题，如目前大多数CAR-T细胞是基于慢病毒或逆转录病毒载体构建的，基于病毒的方法能保证CAR-T细胞的高转染效率，但是病毒载体的制备过程复杂，成本昂贵。此外，病毒载体潜在地能引起插入突变、致瘤性，并且在载体效力、安全性评估以及运输上都存在挑战。
免疫检查点抑制剂如PD1抗体在临床上也取得了很好的疗效，但其价格昂贵，且患者需要多次回输，PD1抗体常通过静脉给药，难以精准靶向肿瘤。同时，PD1抗体在体内非肿瘤组织的富集也会降低PD-1抗体的作用并引起一定的副作用。因此，研发一种快速、安全的非病毒基因递送系统，并通过该方法构建出能分泌PD1 scFv的CAR-T细胞有望同时发挥细胞治疗和免疫抑制点治疗的优点，为中晚期肝癌的治疗提供一种新策略具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1scFv的CAR-T细胞的制备方法，该方法能解决目前用病毒制备CAR-T细胞和质粒修饰T细胞常带有抗性基因等安全性不足的问题，通过联合睡美人转座子和微环载体技术实现CAR基因对T细胞的稳定整合，同时也避免了质粒抗性基因在人体应用中的潜在风险。
本发明所述的基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法，是通过非病毒方法构建一种能自分泌PD1 scFv且靶向CD133的CAR-T细胞，包括以下步骤：
A.睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒的构建：合成构建靶向CD133且能分泌PD1-scFv的CAR序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过同源重组的方法构建入微环母体质粒中，即为睡美人CAR微环母体质粒；合成构建睡美人转座酶序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过酶切方式构建入微环母体质粒中，即为睡美人转座酶微环母体质粒。
B.睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒的制备：将步骤A所构建的睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒在42℃通过热激的方法转入感受态细胞中，随后加入200μl SOC培养基，置于摇床上37℃、250rpm摇60min，随后将菌液涂于含卡那抗性的培养板上，37℃过夜培养；第二天，挑单克隆至含卡那抗性的400ml LB培养基中，30℃、250rpm摇4～6小时，随后转至400ml TB培养基中，37℃、250rpm过夜培养，但不超过16小时；第三天加入等体积的LB培养基，进行阿拉伯糖诱导培养，在32℃、250rpm置于摇床上再摇5h,离心收菌液沉淀，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，测浓度，得到睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒。
电泳检验：用SalI酶切后跑琼脂糖凝胶电泳验证，若此时酶切后电泳显示仅有1条条带，且较母体质粒更小，即可视为微环质粒制备成功。
C.电转制备CAR-T细胞：用磁珠分选PBMC中的T细胞，计算细胞的密度，取1×107个T细胞，离心去除上清，DPBS洗2遍，100μl电转液重悬细胞，并将制备好的睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒按1:1的比例加入电转液进行电转，电转取出后放入预包被CD133抗原和CD28抗体的6孔板中，放入37℃培养箱中培养，电转后的培养基采用T细胞无血清培养基；培养3-5天后，根据细胞状态更换培养液并转至T25培养瓶中培养，在第7-10天(根据细胞扩增数量)检测CAR-T阳性率、存活率，并转移至T75培养瓶中扩增培养。
D.扩增富集CAR-T细胞：继续在T75培养瓶中将所述CAR-T细胞培养至第14天或第15天，检测CAR-T细胞的阳性率，若CAR-T细胞阳性率＞50％，则不进行富集；若CAR-T细胞阳性率＜50％，且细胞数超过1×107个，则通过加入myctag-生物素抗体对细胞进行富集，并通过磁珠分选得到CAR-T细胞，分选得到后的CAR-T细胞放置在6孔板中继续培养。
E.CAR-T细胞收获和鉴定：培养扩增富集后的CAR-T细胞，收集CAR-T细胞，通过流式细胞术检测CAR-T的阳性率，qPCR和WB共同鉴定，收集细胞上清检测PD1 scFv的分泌情况；杀伤实验鉴定细胞的靶向杀伤功能。
优选地，步骤A中所述的睡美人转座子所需的末端重复序列可采用文献报道的已知序列(文献J Mol Biol.2002May 17；318(5):1221-35.doi:10.1016/s0022-2836(02)00237-1)。
本发明所述的CD133特异性且能自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞简称为“CD133 CAR&PD1 scFv CAR-T细胞”，构建该细胞的元件包括：信号肽、CD133 scFv、CD8α、CD137、CD3ζ。PD1 scFv来源于PD1抗体中的VH和VL段，为方便检测，PD1 scFv后连接有myctag标签。
优选地，步骤B中用于制备微环的感受态细胞为ZYCY10P3S2T(NatBiotechnol.2010Dec；28(12):1287-9.doi:10.1038/nbt.1708.)。该细胞是一个用于制备微环的感受态细胞，来源于BW27783 E.coli，该感受态细胞上有诱导产生微环的酶，如PhiC31整合酶和I-Sce1归巢内切酶等元件；质粒载体在CAR的基因序列合成时引入了单酶切位点SalI。
优选地，步骤B中，所述阿拉伯糖诱导培养是在800ml LB培养基中加入16ml 1mol/L NaOH和0.4ml 20％L-阿拉伯糖进行培养。
根据本发明所述的培养方法进一步特征，所述步骤C中，电转后的T细胞无血清培养基为X-Vivo培养基，并添加IL-2、IL-7、IL-15和2％FBS进行培养。
本发明所采用的T细胞无血清培养基可选自目前已商业化的各种产品，例如：X-VIVO 15(Lonza,Walkersville,MD)；Stem Cell Growth Media(SCGM；LifeTechnologies)。
本发明可采用LONZA4D细胞核转染系统。电转液现配现用，每个电转用100μl电转液；包板采用CD133抗原胞外段(R&D)，大小32KD,包板浓度5μg/ml和CD28抗体，包板浓度5μg/ml；提前1天将CD133和CD28包被于6孔板上，4℃过夜，次日再用DPBS洗涤1-2次后待用；CAR-T的阳性率采用流式细胞术检测(通过检测CAR基因上的myctag标签)；电转后细胞的存活率同样采用流式细胞术检测，7AAD阴性即为细胞存活数。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征，所述步骤C中，所述扩增培养包括：扩增激活使用CD3/CD28刺激剂，每毫升培养物加入25μl刺激剂；培养T细胞所用培养基为X-Vivo培养基，每毫升培养物加入IL-2 1000IU。
根据本发明所述的培养方法的进一步特征，所述步骤D中，所述富集的抗体采用myctag-生物素(CST)，二抗采用抗生物素磁珠，过磁珠分离柱，留在柱子上的即为富集的CAR-T细胞，加入5ml洗脱缓冲液于分离柱上，将其从磁力架上取下，用配套的活塞推动柱子，从柱子上下来的即为CAR-T细胞，DPBS洗涤一遍后放于6孔板培养扩增。
优选地，所述步骤D中，每1×107个细胞加入myctag-生物素抗体10μl和抗生物素磁珠20μl。
与现有技术相比，本发明通过非病毒方法得到分泌PD1 scFv且靶向CD133的CAR-T细胞，该细胞不仅能有效地将CAR-T细胞和免疫检查点抑制剂的优势联合起来，且采用的非病毒睡美人转座子联合微环的方法，还能进一步去除质粒上的抗性基因，能最大程度保证CAR-T细胞在临床应用的安全性；与此同时，通过标签富集培养后，CAR-T细胞的阳性率也达到50％以上，该转染效率能满足CAR-T细胞在临床上的应用。因此，本发明所述的通过睡美人转座子构建能靶向CD133且能分泌PD1 scFv的CAR-T细胞，较普通的病毒转染方法更加安全、而通过联合微环技术去除质粒上的抗性基因则使安全性进一步提高，且由于质粒变得更小，其电转效率也更高。
附图说明
图1是睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒的结构示意图和检验结果图。其中，图a是能靶向CD133且分泌PD1 scFv CAR-T的睡美人转座子序列结构示意图；图b显示pMC.BESPX-CD133&PD1(9392bp)经阿拉伯糖诱导后的微环质粒MC(CD133&PD1)大小在4000-7000bp；图c显示pMC.BESPX-SB100(6106bp)经阿拉伯糖诱导后的微环质粒MC(SB100)大小约为2000多bp。
图2是电转睡美人微环CAR质粒至三位捐赠者的T细胞获得三种CAR-T细胞的阳性率、存活率和分泌PD1 scFv能力的检测结果。图2中，图a、图b和图c分别是电转空质粒+MC-SB100质粒(1:1)、MC-CD133 CAR质粒+MC-SB100质粒(1:1)、MC-CD133&PD1 scFv CAR质粒+MC-SB100(1:1)至T细胞后，流式细胞术检测第6天CAR-T细胞的阳性率，CAR阳性的T细胞分别为0.33％，5.79％，8.32％(典型图)；图d、图e和图f分别为Mock-T(电转空质粒)、MC133CAR-T、MC133&PD1 scFv CAR-T在体外培养不同时间CAR的阳性率；不同颜色代表不同的患者；图g为电转T细胞后细胞的存活率，三位捐赠者的细胞存活率均大于80％；图h为收集Mock-T，MC133 CAR-T,MC133&PD1 scFv CAR-T的细胞上清，通过Westernblot检测PD1 scFv(myc-tag标签)的表达，证明了MC133&PD1 scFv CAR-T能成功分泌PD-1scFv。
图3是富集培养后CAR-T细胞阳性率的检测结果及其对不同CD133表达水平的肝癌细胞特异性杀伤能力的检测结果，显示了三种CAR-T细胞对SK和3B细胞的杀伤能力，以及IFN-γ、TNF-α和IL-2分泌水平。图3中，图a、图b、图c分别是通过磁珠分选并在体外富集培养5天后，通过流式细胞术检测CAR-T的阳性率，MC133 CAR-T的阳性率达到65％，MC133&PD1scFv CAR-T的阳性率为58.70％(典型图)；图d是选取的三株肝癌细胞CD133的表达量，SK几乎不表达，G2低表达(7.66％)，3B高表达(98.02％)；图g、图h和图i分别是将Mock T和MC133&PD1 scFv CAR-T和三株肝癌细胞共孵育(效靶比＝T细胞/肿瘤细胞分别为1:1、5:1、10:1)，通过Annexin-V/PI检测肿瘤凋亡/死亡情况，研究结果发现，MC133&PD1 scFv CAR-T随着效靶比的升高而对高表达CD133的肝癌3B细胞有特异性杀伤能力，而对几乎不表达CD133的SK细胞无杀伤能力，其杀伤能力甚至不如普通的T细胞。
图4为降低效靶比(1:4)后CAR-T细胞和肝癌3B细胞共孵育后第3天的镜下观察图及T细胞和3B细胞的占比，显示能分泌PD1 scFv的CAR-T对肿瘤细胞的杀伤能力。图4中，图a是MC133 CAR-T与3B共孵育后第3天镜下观察图，可见CAR-T细胞得到大量扩增，但仍有部分肿瘤贴壁生长；图b是MC133&PD1 scFv CAR-T与3B共孵育后第3天镜下图，可见大量T细胞聚团，几乎无肿瘤细胞贴壁；图c显示流式细胞术检测共孵育3天后MC133 CAR-T细胞和3B细胞的比例，可见肿瘤细胞占比为56.54％；图d显示流式细胞术检测共孵育3天后MC133&PD1scFv CAR-T细胞和3B细胞的比例，可见肿瘤细胞占比为1.52％，和镜下观察的结果相一致。
图注：pMC.BESPX-CD133&PD1：靶向CD133且能分泌PD1 scFv的微环母体质粒；pMC.BESPX-SB100：睡美人转座子系统所需的SB100转座酶的微环母体质粒；Mock-T：电转入空载体的T细胞；MC133 CAR-T：电转入靶向CD133微环质粒的CAR-T细胞；MC133&PD1 scFvCAR-T：电转入靶向CD133且能分泌PD1 scFv微环质粒的CAR-T细胞。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉本领域技术的人员可由本说明书所提示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
本发明提供了一种联合睡美人转座子和微环载体的方法制备靶向CD133且能分泌PD1 scFv的CAR-T细胞。
实施例一：微环CAR质粒的构建：
通过检索CD133抗体和PD1抗体序列，从中选出CD133和PD1抗体序列中的scFv段，采用第二代CAR-T技术设计CAR-T序列，通过P2A连接PD1 scFv，序列两端连接上睡美人转座子系统所需的末端重复序列，交由公司构建，并测序验证。
将上述序列构建入制备微环的母体质粒pMC.BESPX-MCS中的多功能克隆位点；购买转座酶质粒pCMV(CAT)-T7-SB100，将该质粒上的CMV-SB100×-SV40 polyA段通过同源重组的方式整合进入微环母体质粒pMC.BESPX-MCS；上述2个质粒均测序验证(参见图1的a图)。
将上述质粒通过热激的方法转入感受态细胞ZYCY10P3S2T中，随后加入200μl SOC培养基,在摇床上250rpm培养60min,随后涂于含卡那抗性的LB培养板上；次日挑单克隆摇菌在TB培养基过夜培养(不超过16h)，再混入等体积的LB培养基，同时加入16ml 1mol/LNaOH和0.4ml 20％L-阿拉伯糖，调整温度至32℃，在摇床上再摇5h，离心，收集菌液，采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒；采用SalI单酶切验证质粒，跑凝胶电泳检测质粒，若此时酶切后电泳显示仅有1条条带，且制备后的质粒大小较母体质粒更小，且仅有1条带，则视为微环质粒制备成功(参见图1的b图和c图)。
实施例二：CAR-T细胞制备阶段
取健康捐赠人的血液，500g离心10min,弃上层血浆，加入等体积的PBS，重悬，转移至预留20ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，用生理盐水补齐至50ml；800g离心20min(升9，降6)，分为4层，取白色絮状物(白膜)至新的15ml离心管中，洗脱缓冲液洗涤白膜，计数；每107个T细胞，60μl洗脱缓冲液中加入5ul Pan T Cell Biotin抗体，4℃孵育5min；再加入10ul Pan T细胞磁珠在4℃孵育10min；孵育结束后，将液体加入至LS分离柱中，经磁珠分选后，从柱子上下来的细胞即为T细胞；取1×107个T细胞放至6孔板中，2ml X-vivo，IL-21000IU/ml，并加入CD3/CD28过夜刺激；同日，用DPBS将CD133抗原肽段和CD28包被至6孔板中，置于4℃待用；第二天见T细胞初步形成小球，即证明T细胞已被刺激活化，此时可开始电转。
取制备好的含CD133 CAR且能分泌PD1 scFv的睡美人转座子微环质粒，和睡美人转座酶微环质粒各4μg,用电转液100μl重悬T细胞，加入电转杯中，控制总体积不超过110μl，采用Lonza电转仪中sti E0115程序电转，电转后立即转入包被有CD133抗原肽和CD28抗体的6孔板中，3ml培养基培养(例如X-Vivo培养基，并添加IL-2、IL-7、IL-15和2％FBS进行培养)，培养3-5天后，根据细胞的密度和状态决定是否更换培养基，以及是否需要扩大至T25培养瓶中培养，继续培养至7-10天，采用流式细胞术通过CAR上的标签(myctag)检测CAR-T阳性率(参见图2)，7aad检测CAR-T的存活率，收集细胞上清检测PD1 scFv是否有分泌；继续培养至14-15天(具体天数应该根据T细胞的扩增情况决定)，再次检测CAR-T的阳性率(取5×105个T细胞，用myctag-PE流式抗体在冰上孵育30min，流式细胞术检测阳性率；离心取培养基上清，再次离心去除碎片，采用超滤管将上清浓缩至200μl左右后收集上清中的蛋白跑Westernblot，检测上清中是否有PD-1scFv的分泌)，若CAR-T阳性率＞50％，此时则不进行CAR-T的富集培养；若CAR-T阳性率＜50％，则在此时用10μl myctag-生物素抗体与细胞共孵育，再加入20μl anti-biotin的microbeads共孵育，上磁珠吸附柱；将细胞加入吸附柱中，舍弃从分离柱上下来的细胞，将分离柱从磁力架上取下，加入5ml洗脱缓冲液，用注射器将细胞推出，即为经富集后的CAR-T细胞。先在6孔板中培养，随后根据细胞密度调整是否转移至T25或T75培养瓶中扩大培养，用CAR标签(myctag-PE)跑流式检测CAR-T阳性率，富集培养后的CAR-T阳性率高达50％以上(参见图3)。
取1×107富集后的CAR-T细胞，采用RNA快速提取试剂盒(ES Science)提取RNA，取1ug RNA,加入2μl DNA酶，加水至16μl,用移液器轻柔吹打5-10次混匀，室温(25℃)反应5分钟，置于冰上待用；再加入4μl 5×RT Mix，用移液器吹打10次，充分混匀，42℃反应15分钟；稀释5倍后作为模板进行qPCR或冻存于-80℃冰箱保存；取1ul上述模板，加入正反向引物各0.4μl,Master Mix5μl,补加无酶水3.2μl至10μl,用荧光定量PCR仪(ROCHE 480)跑50个循环后，采用2-ΔΔCT计算，结果显示CAR-T较Mock T有更高的CAR基因的拷贝。
取1×107富集后的CAR-T细胞，用100μl RIPA(加入蛋白酶抑制剂)在冰上裂解30min,4℃10000rpm离心10min，取上清用BCA测定浓度，并调整浓度至一致，加入5×loading并置于100℃金属浴10min。跑WB，一抗采用CD3ζ,经检测，Mock T仅有内源性CD3ζ，而构建好的CAR-T则有外源性CD3ζ的表达。
以上通过流式、qPCR、WB均检测到CAR基因在T细胞上的整合。
实施例三：CAR-T细胞的杀伤试验
选取肝癌细胞系SK-Hep1(SK)和Hep-3B(3B)，跑流式检测出SK上几乎无CD133的表达，3B上高表达CD133(＞90％)，将Mock T和MC133&PD1 scFv CAR-T与这2种肿瘤细胞按效靶比1:1，5:1，10:1共孵育4h后，通过凋亡试剂盒(PI/Annexin-V)检测肿瘤细胞的凋亡和死亡情况，结果显示，所制备的CAR-T细胞较普通T细胞具有更强的杀伤能力(参见图3)。
为进一步验证，对比单独的MC133 CAR-T和MC133&PD1 scFv CAR-T的杀伤能力，将这两种细胞按1:4的效靶比与3B细胞共孵育3天后，通过流式细胞术检测到：MC133&PD1scFv CAR-T细胞能将肿瘤细胞几乎完全杀灭，而MC133 CAR-T与3B的共孵育体系中则仍有肿瘤细胞残留(参见图4)，普通Mock T则和肿瘤细胞共同生长，上述杀伤过程均拍照并录制视频监测到。
上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，则同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (6)
1.一种基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒的构建：合成构建靶向CD133且能分泌PD1-scFv的CAR序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过同源重组的方法构建入微环母体质粒中，即为睡美人CAR微环母体质粒；合成构建睡美人转座酶序列，两端插入睡美人转座子所需的末端重复序列，将上述基因序列通过酶切方式构建入微环母体质粒中，即为睡美人转座酶微环母体质粒；
B.睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒的制备：将步骤A所构建的睡美人CAR微环母体质粒和睡美人转座酶微环母体质粒在42℃通过热激的方法转入感受态细胞中，随后加入200μl SOC培养基，置于摇床上37℃、250rpm摇60min，随后将菌液涂于含卡那抗性的培养板上，37℃过夜培养；第二天，挑单克隆至含卡那抗性的400ml LB培养基中，30℃、250rpm摇4～6小时，随后转至400ml TB培养基中，37℃、250rpm过夜培养，但不超过16小时；第三天加入等体积的LB培养基，进行阿拉伯糖诱导培养，在32℃、250rpm置于摇床上再摇5h,离心收菌液沉淀，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，测浓度，得到睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒；
C.电转制备CAR-T细胞：用磁珠分选PBMC中的T细胞，计算细胞的密度，取1×107个T细胞，离心去除上清，DPBS洗2遍，100μl电转液重悬细胞，并将制备好的睡美人CAR微环质粒和睡美人转座酶微环质粒按1:1的比例加入电转液进行电转，电转取出后放入预包被CD133抗原和CD28抗体的6孔板中，放入37℃培养箱中培养，电转后的培养基采用T细胞无血清培养基；培养3-5天后，根据细胞状态更换培养液并转至T25培养瓶中培养，在第7-10天(根据细胞扩增数量)检测CAR-T阳性率、存活率，并转移至T75培养瓶中扩增培养；
D.扩增富集CAR-T细胞：继续在T75培养瓶中将所述CAR-T细胞培养至第14天或第15天，检测CAR-T细胞的阳性率，若CAR-T细胞阳性率＞50％，则不进行富集；若CAR-T细胞阳性率＜50％，且细胞数超过1×107个，则通过加入myctag-生物素抗体对细胞进行富集，并通过磁珠分选得到CAR-T细胞，分选得到后的CAR-T细胞放置在6孔板中继续培养；
E.CAR-T细胞收获和鉴定：培养扩增富集后的CAR-T细胞，收集CAR-T细胞，通过流式细胞术检测CAR-T的阳性率，qPCR和WB共同鉴定，收集细胞上清检测PD1 scFv的分泌情况；杀伤实验鉴定细胞的靶向杀伤功能。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤B中，所述阿拉伯糖诱导培养是在800ml LB培养基中加入16ml 1mol/L NaOH和0.4ml 20％L-阿拉伯糖进行培养。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤C中，电转后的T细胞无血清培养基为X-Vivo培养基，并添加IL-2、IL-7、IL-15和2％FBS进行培养。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤C中，所述扩增培养包括：扩增激活使用CD3/CD28刺激剂，每毫升培养物加入25μl刺激剂；培养T细胞所用培养基为X-Vivo培养基，每毫升培养物加入IL-2 1000IU。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤D中，所述富集的抗体采用myctag-生物素(CST)，二抗采用抗生物素磁珠，过磁珠分离柱，留在柱子上的即为富集的CAR-T细胞，加入5ml洗脱缓冲液于分离柱上，将其从磁力架上取下，用配套的活塞推动柱子，从柱子上下来的即为CAR-T细胞，DPBS洗涤一遍后放于6孔板培养扩增。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：所述步骤D中，每1×107个细胞加入myctag-生物素抗体10μl和抗生物素磁珠20μl。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110631393.6A CN113684226A (zh) | 2021-06-07 | 2021-06-07 | 基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110631393.6A CN113684226A (zh) | 2021-06-07 | 2021-06-07 | 基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113684226A true CN113684226A (zh) | 2021-11-23 |
Family
ID=78576515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110631393.6A Pending CN113684226A (zh) | 2021-06-07 | 2021-06-07 | 基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113684226A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109735500A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-05-10 | 苏州茂行生物科技有限公司 | 一种分泌型靶向cd133的car-t细胞及其制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-06-07 CN CN202110631393.6A patent/CN113684226A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109735500A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-05-10 | 苏州茂行生物科技有限公司 | 一种分泌型靶向cd133的car-t细胞及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SABRINA PROMMERSBERGER等: "CARAMBA: a first-in-human clinical trial with SLAMF7 CAR-T cells prepared by virus-free Sleeping Beauty gene transfer to treat multiple myeloma", 《GENE THER》, vol. 28, no. 9, pages 560 - 571, XP037568563, DOI: 10.1038/s41434-021-00254-w * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108531457A (zh) | 一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法 | |
| CN109504660B (zh) | 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用 | |
| CN109517820A (zh) | 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法 | |
| CN114929862A (zh) | 用于制备表达嵌合抗原受体的t细胞的生产方法 | |
| WO2023123195A1 (zh) | 一种目的基因可调控的工程化免疫细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110760480B (zh) | 一种抗肿瘤nk细胞及其制备方法 | |
| CN117402248B (zh) | 抗体组合物的应用、检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法及试剂盒 | |
| JP2017520582A (ja) | 関節リウマチ治療のための間葉系間質細胞 | |
| JP2023547887A (ja) | セーフハーバー遺伝子座 | |
| KR102030364B1 (ko) | 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 결핍 세포주로부터 제조된 인공항원제시세포 및 이의 용도 | |
| US20230121065A1 (en) | Method of delivering nucleic acid to immune cells using rbcev | |
| CN111484993B (zh) | 长链非编码rna il21-as1及其用途 | |
| JP5911810B2 (ja) | 制御性ｔ細胞の製造方法 | |
| WO2017036026A1 (zh) | 基因修饰的间充质干细胞及其用于生产BsAb抗体的方法 | |
| CN113684226A (zh) | 基于非病毒载体的CD133特异性且自分泌PD1 scFv的CAR-T细胞的制备方法 | |
| US20230414665A1 (en) | Method for producing modified mesenchymal stromal stem cells with improved properties, modified cells obtained by this method, composition including such cells | |
| TW202239959A (zh) | 用於減少細胞中hla-a之組合物及方法 | |
| CN117794552A (zh) | 抗原特异性t细胞及其制备和使用方法 | |
| US11718827B2 (en) | LRFFT2 cell | |
| CN110157745B (zh) | 一种hafft1细胞的构建方法 | |
| CN114045309A (zh) | 一种通用的嵌合抗原受体调节t细胞制备方法及应用 | |
| CN113355283A (zh) | 基于rna疫苗的抗原反应性t细胞的制备方法及应用 | |
| CN109294997B (zh) | 一种lrfft1细胞 | |
| WO2020062794A1 (zh) | 一种mrfft1细胞 | |
| CN110093374B (zh) | 一种mrfft1细胞的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |