CN117402248B - 抗体组合物的应用、检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗体组合物的应用、检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法及试剂盒，属于过继性免疫细胞治疗技术领域。本发明使用CD3抗体和CD28抗体共同诱导免疫细胞，所述诱导过程接近免疫细胞在体内的活化过程，抗体组合物诱导免疫细胞表达PD‑1可以模拟T细胞在体内被诱导的情况，再通过检测T细胞PD‑1阳性率预判T细胞的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于过继性免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种由CD3和CD28组成的抗体组合物在检测免疫细胞抗肿瘤活性中的应用、检测方法及试剂盒。
背景技术
肿瘤免疫应答早期，循环免疫细胞T细胞可以识别、浸润继而清除某些癌细胞，对正常细胞却不损伤。然而，许多肿瘤通过高表达免疫检查点配体和分泌大量抑制性细胞因子等机制，形成免疫抑制微环境，导致T细胞活性丧失甚至诱导T细胞凋亡，从而产生肿瘤免疫逃逸。
PD-1分子属于B7家族成员，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1分子通常表达于活化的T细胞和B细胞，PD-1与其配体PD-L1相互作用后发挥免疫抑制作用，在机体免疫耐受维持和免疫应答调节中发挥重要作用。当机体感应到外来抗原时，会产生大量特异性T细胞；持续的抗原刺激则会诱导T细胞PD-1表达，从而导致免疫细胞功能丧失和凋亡耗竭。肿瘤细胞逃避T细胞攻击的一种重要途径是通过肿瘤细胞表面的PD-L1配体与T细胞表面的PD-1受体结合，抑制T细胞活化并诱导其凋亡。
PD-1/PD-L1抑制剂疗法是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的新型免疫疗法。阻断PD-1/PD-L1途径已成为肿瘤免疫治疗的新手段。研究表明，阻断PD-1后，肿瘤位点的T细胞数及IFN-γ分泌增加，高免疫抑制性的髓源性抑制细胞群百分比减少，肿瘤微环境中效应细胞与抑制细胞比例增加，从而对肿瘤微环境动态改变、肿瘤生长控制发挥重要作用。此外，研究表明T细胞表达PD-1蛋白，即使没有与PD-L1配体结合也会导致T细胞功能降低。
因此，T细胞表达PD-1蛋白是导致许多病人肿瘤细胞逃过免疫系统监视的罪魁祸首之一。基因编辑技术，为解除PD-1/PD-L1抑制提供了一种新型方法。基因编辑技术敲除PD-1基因后，T细胞则不会表达PD-1蛋白，因而可以在肿瘤微环境中保持更好的抗肿瘤活性，提升抗肿瘤疗效。目前，进行PD-1敲除以阻断PD-1表达的T细胞临床试验已经在全世界的多个国家开展。
体外检测T细胞PD-1编辑率是评价PD-1基因敲除后PD-1抑制信号通路解除的关键指标，也是预测基因编辑T细胞在体内或体外抗肿瘤活性的重要数据。现有的检测技术包括高通量测序检测PD-1基因编辑率、qPCR检测PD-1 mRNA转录水平以及流式细胞术检测T细胞表面的PD-1蛋白表达，而且由于在体外正常培养条件下，低效编辑PD-1基因的T细胞表达PD-1蛋白的比例仍然非常低，不能反应肿瘤微环境下T细胞PD-1蛋白强烈诱导后的表达水平。所以上述三种方法均不能真实反映T细胞在肿瘤微环境下PD-1蛋白表达的真实水平；其中，前两种只能从核酸水平推测PD-1表达情况，而直接的流式检测也不能反映肿瘤微环境下的T细胞状态。因此，亟需一种能够模拟体内肿瘤环境诱导T细胞PD-1表达的方法，可以更准确地预测T细胞抗肿瘤活性。
发明内容
基于上述背景，本发明创建一种由抗体组合物构成的免疫细胞诱导体系，所述诱导体系接近免疫细胞在体内的活化过程，更准确的检测基因编辑的免疫细胞在体内的PD-1表达水平，从而预测抗肿瘤治疗效果。本发明预料不到的发现，采用固化的CD3抗体和CD28抗体在体外对免疫细胞进行刺激，再通过流式细胞术快速检测细胞表面PD-1表达情况，可以准确预测基因编辑的免疫细胞在体内PD-1可能被诱导的情况，进而评估基因编辑后的免疫细胞的抗肿瘤活性。
本发明包括如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种抗体组合物在以下（a）-（b）中任一项的应用：
（a）体外检测PD-1诱导后的免疫细胞的抗肿瘤活性；
（b）制备用于检测免疫细胞抗肿瘤活性的诊断试剂或试剂盒；
所述抗体组合物为CD3抗体与CD28抗体的组合。
优选的，所述免疫细胞是基因编辑的免疫细胞，具体的，所述基因编辑的免疫细胞为PD-1敲除的T细胞或PD-1低表达的T细胞。本领域技术人员可通过常规的基因编辑技术制备得到所述PD-1敲除的T细胞或PD-1低表达的T细胞。
第二方面，本发明提供一种检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与CD3抗体和CD28抗体共同孵育进行诱导，再通过流式细胞术检测细胞PD-1阳性率，根据PD-1阳性率评估免疫细胞的抗肿瘤活性。
所述诱导条件为37℃，5%CO2培养箱诱导4-24h。
在本发明的优选实施方式中，所述诱导时间为24h。
在诱导体系中，所述CD3抗体和CD28抗体为可溶性抗体溶液或固化至载体表面。
当CD3抗体和CD28抗体为可溶性抗体溶液时，CD3抗体和CD28抗体的终浓度为10-10000ng/ml；优选的，所述CD3抗体和CD28抗体的终浓度为500-10000ng/ml。
在本发明的优选实施方式中，所述CD3抗体和CD28抗体固化至载体表面。
本发明所述的固化方式是指本领域技术人员使用常规方法，例如通过包被、偶联等技术将所述抗体组合物固定至载体表面。
本发明所述的载体包括本领域常规使用的任何可固定蛋白质的固相载体，包括但不限于为细胞板、微球、乳胶颗粒等。
所述微球可选自磁性微球（磁珠）、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或生物大分子聚合物微球。
在本发明的优选实施方式中，所述载体选自细胞板或磁性微球。
在本发明给的具体实施方式中，所述载体为细胞板。
本发明通过如下方法将CD3抗体和CD28抗体固化至载体表面：
（1）使用缓冲液将CD3抗体和CD28抗体分别稀释至终浓度为10-10000ng/ml；
（2）将CD3抗体和CD28抗体溶液分别加入细胞板的孔中，加入体积分别是100-2000μl/孔；
（3）在4-37℃下孵育1-48h。
在本发明的具体实施方式中，所述步骤（3）的孵育方式为37℃下孵育1-2h；或者室温下孵育2-4h；或者4℃下孵育4-48h。
在本发明的最优选实施方式中，所述检测基因编辑的免疫细胞抗肿瘤活性的方法包括如下步骤：
S1：使用PBS将CD3抗体和CD28抗体分别稀释至终浓度为10-10000ng/ml；
S2：将CD3抗体和CD28抗体溶液分别加入细胞板的孔中，加入体积分别是100-2000μl/孔；
S3：37℃下孵育1-2h；或者室温下孵育2-4h；或者4℃下孵育4-48h，将抗体包被至细胞板上；
S4：将待检测免疫细胞加入细胞板孔中，细胞数量为0.1-10×106/孔，37℃，5%CO2培养箱中诱导4-24h；
S5：通过流式细胞术检测细胞PD-1阳性率。
本发明提供的免疫细胞与CD3抗体和CD28抗体共同孵育诱导的过程接近免疫细胞在体内的活化过程，抗体组合物诱导免疫细胞表达PD-1可以模拟所述T细胞在体内被诱导的情况，再通过检测细胞PD-1阳性率预判T细胞的抗肿瘤活性。具体的，检测PD-1阳性率高的，说明其抗肿瘤活性低；PD-1阳性率低的，说明抗肿瘤活性高，在分析大量的试验结果之后，本发明技术人员认为诱导之后的细胞PD-1阳性率不高于3%的免疫细胞具有较好的抗肿瘤活性。
第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒用于检测免疫细胞抗肿瘤活性，所述试剂盒包括CD3和CD28抗体组合物及载体，CD3和CD28抗体组合物固化至所述载体表面。
本发明所述的固化方式是指本领域技术人员使用常规方法，例如包被、偶联等技术将所述抗体组合物固定至载体表面。
本发明所述的载体包括本领域常规使用的任何可固定蛋白质的固相载体，包括但不限于为细胞板、微球、乳胶颗粒等。
所述微球可选自磁性微球（磁珠）、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或生物大分子聚合物微球。
在本发明的优选实施方式中，所述载体选自细胞板或磁性微球。
在本发明给的具体实施方式中，所述载体为细胞板。
具体的，本发明通过如下方法将抗体组合物固化至载体表面：
（1）使用缓冲液将CD3抗体和CD28抗体分别稀释至终浓度为10-10000ng/ml；
（2）将CD3抗体和CD28抗体溶液分别加入细胞板的孔中，加入体积分别是100-2000μl/孔；
（3）在4-37℃下孵育1-48h 。
优选的，所述孵育方式为37℃下孵育1-2h；或者室温下孵育2-4h；或者4℃下孵育4-48h。
优选的，所述试剂盒中还包括流式细胞术需要的常规试剂。
本发明提供的使用CD3和CD28抗体组合物检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法具有如下优势：由CD3和CD28抗体组合物构成的T细胞诱导体系接近免疫细胞在体内的活化过程，所述抗体组合物刺激T细胞表达PD-1，模拟所述PD-1敲除的T细胞或低表达的T细胞在体内PD-1可能被诱导的情况，再通过检测T细胞PD-1阳性率来评估所述T细胞的抗肿瘤活性。
附图说明
图1 T7E1酶切后琼脂糖凝胶电泳图。
图2TA阳性克隆测序结果图。
图3固化抗体与可溶性抗体对T细胞PD-1诱导表达影响结果图。
图4诱导时间对T细胞PD-1诱导表达影响结果图。
图5固化抗体对基因编辑T细胞PD-1诱导表达结果图。
图6A549肺癌肿瘤细胞PD-L1表达流式结果图。
图7基因编辑T细胞的抗肿瘤活性结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对外周血单个核细胞进行PD-1基因编辑
1.外周血单个核细胞分离
采用Ficoll法分离外周单个核细胞，抗凝的外周血与PBS等体积混合后，缓慢加到密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液上，400g离心30分钟后取Ficoll和血浆中间的白膜层，再用1倍生盐水洗涤白膜层细胞，600g离心10分钟获得的细胞沉淀即为外周血单个核细胞（PBMC）。
2.编辑T细胞：Crispr/Cas9敲除PD-1基因
在人PD-1基因第2号外显子设计两条sgRNA（单链导向RNA），sgRNA1和sgRNA2均通过化学合成方式获得。具体序列见下表：
Cas9蛋白为商品化的化脓性链球菌(Sp)Cas9，所述sgRNA与Cas9蛋白结合形成的核糖核蛋白复合物（RNP）通过核电转方式进入细胞，完成对PD-1基因的敲除。将分离的PBMC分为三个实验组，分别为高效编辑组、低效编辑组和未编辑对照组，每个实验体系分别含有1×107个细胞和不同的RNP复合物，具体的RNP复合物组成如下表所示，三组实验的电转和细胞培养条件相同。
具体实验分组和步骤如下：
1）Cas9蛋白与sgRNA在电转缓冲液中按照上表所示的摩尔比例混合，室温孵育10分钟；
2）T细胞电转：1×107个PBMC和RNP复合物在100µl电转液中混合，室温孵育10分钟，然后采用Lonza电转仪淋巴细胞电转程序进行。
3.T细胞培养
电转后的细胞用5ml GT-T551 H3培养基重悬，然后添加1000IU/mlIFN-γ、500ng/ml抗人CD3抗体、500ng/ml抗人CD28抗体、1000IU/ml IL-2和10%胎牛血清，最后置37℃、5%CO2培养箱中培养；后续培养，每隔3天用GT-T551培养基（含1000IU/ml IL-2和5% FBS血浆）调整细胞密度为1-2×106个/ml，持续培养两周时间。
TA克隆检测T细胞PD-1基因编辑率
1.T细胞基因组DNA提取
取2×106个PD-1基因编辑并培养14天的T细胞，400g 离心10min收集细胞；去上层液体，加入4℃预冷的PBS 1ml重悬并洗涤细胞一次，400g 离心10min收集细胞，去掉上层液体；加入200μl PBS重悬细胞，再加入25μl 蛋白酶溶液和220μl 裂解缓冲液，70℃反应10min；最后加入220μl 无水乙醇并采用柱式DNA回收试剂盒提取和纯化基因组DNA。
2.PD-1基因PCR、载体克隆以及测序分析
（1）设计PD-1基因扩增引物，如下表：
（2）PCR扩增PD-1基因：取前述步骤提取的T细胞基因组DNA，采用Premix Taq酶扩增PD-1基因，PCR反应体系25μl。具体反应条件：94℃5min，94℃30s，60℃60s，72℃60s，循环34次，72℃10min，4℃保存。PCR产物采用柱式PCR产物试剂盒回收。
（3）T7E1酶切鉴定PCR产物的PD-1基因编辑率
①T7E1酶切体系配置：取上述不同实验组PCR产物5μl，10×T7E1 Buffer 1.1μl，ddH2O 4.4μl，总体积10.5μl。
②退火：95℃5min；94℃2 sec，-0.1℃/cycle，200 times；75℃1 sec，-0.1℃/cycle，600 times；16℃2min；
③T7E1酶切：上述反应体系分别加入0.5μl T7E1酶，PCR仪：37℃30min；85℃5min；
④电泳检测：每管加入2μl 6× DNA Loading Buffer，吹打混匀，进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
T7E1 核酸内切酶可以识别并切割杂合双链DNA，将扩增的PCR产物在不匹配处切割成两条链。
（4）TA克隆及阳性克隆筛选
① 步骤（2）中PCR产物2μl与PEASY-T1克隆载体1μl轻轻混合，PCR仪上37℃反应5分钟，然后离心管置冰上冷却。
② 将连接产物转化至DH5α感受态细菌中，添加250μl LB培养基（不含Amp），在水平摇床中震摇培养1小时，培养条件为200转/分钟和37℃。
③ 取200μl震摇的菌液均匀涂布在含IPTG（500mM）、Amp（100ug/ml）和X-gal（20mg/ml）的琼脂糖平板上，37℃培养箱中过夜培养。
④ 从培养过夜的平板上挑取白色单个菌落分别加入500μl LB液体培养基，200转/分钟和37℃水平震摇12-16小时；
⑤ 菌液PCR阳性克隆筛选：
PCR反应体系为：总反应体系为25μl，含Premix Taq酶12.5μl、PD-1基因上下游引物（10μmol/μl）各1μl以及菌液1μl，ddH2O补足25μl；
PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，60℃60s，72℃60s，循环34次，72℃10min，最后4℃保存。
菌液PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，含有745bp电泳条带为阳性克隆。
载体DNA测序：挑选20个PCR鉴定阳性的菌液进行序列测定和PD-1基因序列分析。
结果显示：
T7E1酶切电泳图如图1所示，未编辑组所有细胞的PD-1基因没有受到编辑T7E1酶切未出现切割条带，低效编辑组仅少部分细胞的PD-1基因受到编辑因而出现较弱的酶切条带，高效编辑组大部分细胞PD-1基因受到编辑因而显示较强的酶切条带。
TA克隆测序结果如图2所示，PD-1基因编辑率随着RNP含量的减少而降低，高效编辑组PD-1基因敲除率很高，均为大片段敲除，PD-1基因编辑率达90%；而低编辑细胞率组效率较低，部分为点突变（1-2个碱基缺失），PD-1基因编辑率仅为25%。
CD3和CD28抗体诱导T细胞PD-1表达
固化抗体与可溶性抗体对未编辑T细胞PD-1诱导表达的影响
2021年12月，取14天后生长良好的未编辑T细胞进行实验，对比固化抗体组和游离抗体组对PD-1蛋白表达诱导的影响，同时设置不添加任何抗体刺激的对照组。
① 实验分组：
②T细胞诱导PD-1表达：去除过夜包被的抗体，用0.5ml PBS轻柔洗涤孔板一次；用1640培养基（含10%胎牛血清）将未编辑T细胞稀释至1×106个/ml，分别加0.5ml/孔的细胞悬液至24孔板中；可溶性抗体组按方案添加不同浓度的CD3和CD28抗体，而固化抗体组合对照组不再添加抗体。24孔板在37℃和5%CO2培养箱中刺激24小时，然后取孔板中细胞进行PD-1诱导的流式检测。
③T细胞PD-1流式检测：取诱导24小时的T细胞至2ml离心管中，400g离心5分钟，弃培养上清；再加入1 ml PBS洗涤一次，400g离心5分钟，弃上清；加入50µl PBS重悬细胞，再加入2 µl 抗人CD3-PC5.5抗体和2µl 抗人PD-1-PE抗体，充分混匀，室温避光孵育15分钟；孵育结束后，加入2 ml PBS洗涤，400g离心5分钟；去上清，用400 µl PBS重悬细胞，吹打混匀后上机进行流式检测。
结果如图3所示，结果显示固化抗体组能够更强烈的诱导细胞PD-1蛋白表达。具体的，固化抗体组T细胞的PD-1诱导表达率显著高于游离抗体实验组，高浓度包被的抗体可诱导高达40%以上的PD-1表达，而游离抗体实验组PD-1表达率均低于25%；随着包被抗体浓度的升高PD-1阳性率也逐渐上升，大于500ng/ml抗体包被浓度后PD-1阳性率达到峰值，峰值水平大于40%；而游离抗体实验组PD-1阳性率随浓度增加未见明显增加，PD-1阳性率均低于20%。
PD-1诱导时间对T细胞PD-1表达的影响
2022年7月，采用14天生长良好的未编辑T细胞进行实验，采用CD3/CD28抗体固化后进行PD-1蛋白诱导，CD3和CD28包被浓度为1μg/ml；在2h、4h和24h不同时间取诱导的T细胞进行PD-1表达的流式检测。
实验结果如图4所示：随着诱导时间的增加，未编辑T细胞PD-1蛋白表达逐渐增加，从初始状态的10.99%逐渐增加到60%以上；其中，4-24小时增加尤为显著。
CD3和CD28抗体诱导编辑的T细胞PD-1表达
取14天后生长良好的高效编辑组、低效编辑组和未编辑对照组的T细进行实验，CD3和CD28抗体采用1μg/ml浓度包被24孔板（0.5ml/孔），4℃孵育18小时； PD-1诱导和流式检测如上所述。
实验结果如图5所示，诱导前，未编辑T细胞PD-1表达率约为10.99%，而高效编辑和低效编辑组T细胞的PD-1细胞表达率差异较小，分别为1.80%和3.72%；而诱导后，高效编辑组T细胞PD-1表达水平仍然保持很低的水平（为1.53%），不会被诱导；而低效编辑组和未编辑对照组T细胞被诱导超过30%的PD-1高表达，与高效编辑组差异显著。
PD-1诱导后的T细胞体外抗肿瘤研究
由于在体外正常培养条件下，低效编辑PD-1基因的T细胞表达PD-1蛋白的比例仍然非常低，不能反应肿瘤微环境细胞下T细胞PD-1蛋白强烈诱导后的表达水平，所以本发明采用PD-L1高表达的肺癌肿瘤细胞A549和经4小时PD-1诱导的不同基因编辑效率的T细胞体外抗肿瘤实验进行实验，对比不同水平PD-1表达的T细胞体外抗肿瘤的潜能。
具体实验步骤：
① 试验采用96孔细胞板，预先将A549肿瘤细胞分别进行24小时贴壁，接种细胞密度为3000个/孔；
② 再将培养至14天的高效编辑T细胞和低效编辑T细胞用CD3/CD28抗体预刺激4小时（CD3和CD28抗体包被浓度为1μg/ml）后按照1:1、5:1、10:1、20:1和40:1不同效靶比（E:T）加入肿瘤细胞孔；
③ 继续共培养 72 小时后采用 CCK8 法检测肿瘤细胞杀伤率。
结果：
如图6所示，流式显示A549肺癌肿瘤细胞高表达PD-L1蛋白；
如图7所示，不同PD-1基因编辑水平的T细胞（低效PD-1编辑T细胞以及高效PD-1编辑T细胞）由于诱导后PD-1表达水平差异较大，在体外抗肿瘤实验中PD-1/PD-L1通路的抑制T细胞杀伤的差异也非常明显。高效编辑组由于PD-1诱导表达水平较低，在低效靶比的水平（1:1和5:1）也能产生很强的抗肿瘤效果；而低效编辑组由于诱导后高表达PD-1蛋白，容易受到肿瘤细胞的PD-1/PD-L1抑制通路的影响，因而抗肿瘤效果较差（尤其在低效靶比水平）。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种抗体组合物在以下（a）-（b）中任一项的应用：
（a）体外检测免疫细胞的抗肿瘤活性，以非疾病诊断和治疗为目的；
（b）制备用于检测免疫细胞抗肿瘤活性的诊断试剂或试剂盒；
所述抗体组合物为CD3抗体与CD28抗体的组合，所述CD3抗体和CD28抗体固定至载体表面；
（a）和（b）中的免疫细胞是基因编辑的免疫细胞，所述基因编辑的免疫细胞为PD-1敲除的T细胞或基因编辑使PD-1低表达的T细胞，所述抗体组合物刺激所述免疫细胞表达PD-1，根据PD-1阳性率评估所述免疫细胞的抗肿瘤活性。
2.一种以非疾病诊断和治疗为目的检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与CD3抗体和CD28抗体共同孵育进行诱导，再通过流式细胞术检测所述免疫细胞PD-1阳性率，根据PD-1阳性率评估所述免疫细胞的抗肿瘤活性；所述CD3抗体和CD28抗体固定至载体表面，所述免疫细胞是基因编辑的免疫细胞，所述基因编辑的免疫细胞为PD-1敲除的T细胞或基因编辑使PD-1低表达的T细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导条件为37℃，5%CO2培养箱诱导4-24h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体选自细胞板、微球或乳胶颗粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法包括如下步骤：
S1：使用PBS将CD3抗体和CD28抗体分别稀释至终浓度为10-10000ng/ml；
S2：将CD3抗体和CD28抗体溶液分别加入细胞板的孔中，加入体积分别是100-2000μl/孔；
S3：在4-37℃下孵育1-48h，将抗体包被至细胞板上；
S4：将待检测免疫细胞加入细胞板孔中，细胞数量为0.1×106-10×106/孔，37℃，5%CO2培养箱中诱导4-24h；
S5：通过流式细胞术检测所述免疫细胞PD-1阳性率。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer;You Lu;《NatUre Medicine》;20200531;第26卷;第732-740页 * |
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