CN113322233A - 一种改进的基于新生抗原反应性t细胞的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用，RNA疫苗的制备；DC细胞的培养和电转；DC细胞和T细胞的共孵育；41BB筛选T细胞，IL‑2、IL‑7、OKT3扩增T细胞。本发明使用pcDNA3.1+质粒，构建体外表达载体，相对于传统的多肽合成，制备周期短、成本低、制备成功率高；使用电转仪进行电转。相对于传统转染方式，重复性好，无试剂费用，电转率高；使用RNA疫苗电转DC细胞，相比于其他生物治疗，易在体外生产和纯化，生产工艺通用性强，安全性高；将电转后的DC细胞和T细胞共培养，使用41BB对T细胞进行筛选，获得的活化的NRT疫苗比例高，免疫原性强；IL‑2、IL‑7、OKT3扩增T细胞，获得的细胞数量多，培养效果好；整个过程不使用血清，获得的细胞安全性高。

Description

一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用。
背景技术
我国恶性肿瘤发病率整体呈现上升的态势,恶性肿瘤是我国居民第一大致死因素，2018年我国城市居民恶性肿瘤死亡率为163.18/10万，农村居民恶性肿瘤死亡率为158.61/10万。目前，临床上以手术、放疗、化疗为主的综合治疗效果并不理想，近年来分子靶向治疗的广泛应用虽显著改善了部分恶性肿瘤的预后，但靶向治疗主要针对EGFR、ALK等突变的人群，其获益人群少且最终均面临耐药性的问题。大多数恶性肿瘤患者并不存在这些致癌基因突变，治疗手段仍以传统放化疗为主，预后不佳。因此，新的恶性肿瘤治疗手段研究迫在眉睫。
随着肿瘤免疫学和临床免疫治疗应用的深入，肿瘤免疫治疗正成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗之后的一种常规治疗手段。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点。2013年，肿瘤的免疫治疗被《Science》杂志评为年度十大科学突破之首。2016年，美国临床肿瘤学会(ASCO)宣布免疫治疗为年度肿瘤研究的首要进展。肿瘤新生抗原(neoantigens)是肿瘤细胞由于基因变异而产生的特异存在于肿瘤细胞中的多肽或者蛋白，其上面载有的一些新生抗原表位能被免疫系统识别，从而精准地攻击肿瘤细胞。以肿瘤新生抗原为靶点的治疗，相较于传统的肿瘤相关抗原治疗具有特异性强、对正常组织伤害小、自身免疫概率低、可多靶点同时进行治疗等优点，能够特异性激活细胞毒性T细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤。
研究表明，基于肿瘤新生抗原的治疗通过激活和提高受试者体内新生抗原特异性T细胞的比例及活性，靶向杀伤受试者的肿瘤组织。2017年7月，《nature》上同日刊登两篇以新生抗原为靶点成功治疗晚期黑色素瘤的临床研究，力挺基于新生抗原的个体化肿瘤治疗模式。其中，Ugur Sahin的研究团队纳入13例晚期黑色素瘤受试者，经治疗后8人肿瘤完全消失；Patrick的研究团队纳入6名受试者，经治疗后4人肿瘤完全消失，在32个月内没有复发，另外两人在接受PD-1辅助治疗后肿瘤也完全消失。与此同时，基于新生抗原的精准免疫治疗在一些实体瘤如胆管癌和结直肠癌中也展现出惊人的疗效。
新生抗原反应性T细胞(Neoantigen Reactive T lymphocyte，NRT)是指对患者本人突变性新抗原表位有反应的特异性免疫细胞，其对表达相应新抗原的肿瘤细胞具有免疫杀伤效应。被誉为过继性T细胞治疗之父的Steve Rosenberg教授及其研究团队，在2013年率先采用外显子测序技术鉴别在患者中表达的突变蛋白，再使用计算机模拟等技术鉴别出在患者肿瘤细胞上表达，能被肿瘤浸润淋巴细胞识别的突变抗原表位。2014年，Rosenberg团队将该技术成功应用于临床，对一位肺、肝等多处癌转移且放化疗均告失败的晚期胆管癌受试者的肿瘤组织进行测序并鉴定出新生抗原，随后分离出新生抗原特异性T淋巴细胞回输入受试者体内，发现受试者在治疗的两年期间，肿瘤明显缩小，病情稳定(一般晚期胆管癌的平均生存期不超过10个月)。相关文章发表在当年的《SCIENCE》杂志上，引起了学术界的轰动。随后，《NEJM》又报道该研究团队利用同样的过继性T细胞疗法成功治疗了一位晚期转移性结直肠癌的受试者。2019年南京鼓楼医院的刘宝瑞教授及其团队有研究者在JCI发表了NRT治疗晚期胸腺瘤和晚期胰腺癌所取得的可喜成绩。
综上所述，基于受试者个体化肿瘤新生抗原的免疫治疗，是目前国际上最先进的精准靶向治疗恶性肿瘤的方案之一。在2014年，Steve Rosenberg的研究团队在《Science》杂志发表了关于采用新生抗原反应性T细胞治疗晚期胆管癌患者的文章。他们采集了患者肿瘤组织和外周血进行测序，对测序数据进行突变分析，从突变基因中筛选新生抗原，制备RNA疫苗，然后在体外与患者TIL细胞进行共培养，获得肿瘤新生抗原特异性的TIL细胞并进行大量扩增，随后回输进入患者体内。临床数据显示，患者肿瘤明显缩小，病情趋于稳定。该团队于2016年在《NEJM》杂志上又发表了一篇关于采用相同的T细胞疗法成功治疗一例转移性结直肠癌患者的文献。2019年，南京鼓楼医院的一项基于肿瘤新生抗原反应性T细胞的过继性疗法研究，采用肿瘤个性化疫苗和NRT细胞疗法联用的方式，对17例晚期癌症患者进行治疗。其中，一位转移性胸腺瘤患者在治疗后29个月内获得了完整而持续的免疫反应。在另一位转移性胰腺癌患者中观察到免疫相关的部分反应。其余4位患者实现了疾病的长期稳定，中位无进展生存期为8.6个月。
上述研究结果表明，基于新生抗原反应性T细胞的疗法具有一定的有效性，但是还是部分患者无法从NRT疗法中受益。
现有技术还存在明显的缺点与问题，具体缺点与问题如下：
制备的新生抗原反应性T细胞中，真正的新生抗原的反应性T细胞比例少，细胞扩增倍数不高，由于获得的细胞数量不够，纯度不高，安全性不高，这些细胞一方面为治疗带来不确定因素，另一方面影响治疗的效果。
发明内容
鉴于目前肺癌肿瘤新生抗原免疫治疗存在的上述不足，本发明提供一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用。本发明通过使用激动性抗体41BB筛选，获得的反应性T细胞(NRT)纯度高，扩增比例高，并且不使用血清，安全性高，为后续的细胞治疗成本、有效性方面做准备。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，包括以下步骤：
基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变；
根据基因突变分析肿瘤新生抗原；
根据新生抗原构建体外表达载体，制备RNA疫苗；
基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞；
由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞，诱导生成新生抗原反应性T细胞；
使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选，并将筛选后的细胞扩增培养，得到基于新生抗原反应性T细胞。
依照本发明的一个方面，所述基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变的步骤中，所述肿瘤基因突变是通过基因测序分析得到的。
依照本发明的一个方面，所述根据新生抗原构建体外表达载体，制备RNA疫苗的步骤中，所述表达载体依次进行质粒线性化和体外转录，制备RNA疫苗。
依照本发明的一个方面，所述基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞的步骤中，所述外周血单个核细胞经分离、培养和电转获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞。
依照本发明的一个方面，所述由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞，诱导生成新生抗原反应性T细胞的步骤中，所述电转RNA疫苗的DC细胞诱导T细胞的活化，制备新生抗原反应性T细胞。
依照本发明的一个方面，所述使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选，并将筛选后的细胞扩增培养，得到基于新生抗原反应性T细胞的步骤中，所述细胞扩增培养是采用IL-2、IL-7、OKT3进行扩增的。
依照本发明的一个方面，所述表达载体为pcDNATM6、pcDNATM5、pCEP4、pcDNA3.1的任意一种。
依照本发明的一个方面，所包括以下具体步骤：
包括以下具体步骤：
采集患者肿瘤组织和对照组织标本，依次进行基因测序和生信分析基因突变；
根据基因突变分析肿瘤新生抗原；
根据肿瘤新生抗原构建体外表达载体，所述表达载体依次进行质粒线性化、体外转录和纯化，制备RNA疫苗；
单采机采集患者外周血单个核细胞，采用Ficoll-Histopaque分离外周血单个核细胞，贴壁一定时间，将T细胞冻存备用，DC细胞加入DC培养液，吸取DC培养液的上清液，经离心去除一半体积的培养基，加入相应体积的新鲜培养基、细胞因子和诱导试剂，诱导DC细胞成熟，收集诱导成熟的DC细胞，用RNA疫苗电转DC细胞，获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞；
复苏冻存的T细胞，将电转RNA疫苗的DC细胞洗涤并按比例加入到T细胞中，过夜孵育后加入41BB抗体，得到细胞混合液，将细胞混合液放入含有IL-2和IL-7的培养袋中诱导培养，在诱导培养后的细胞混合液中加入IL-2、IL-7和OKT3并更换孔板继续培养，进行二次诱导培养，得到基于新生抗原反应性T细胞。
本发明还公开了上述制备方法制备的基于新生抗原反应性T细胞。
本发明还公开了上述制备方法制备的基于新生抗原反应性T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用
本发明的有益效果：
(1)采用表达载体体外转录构建RNA疫苗，具有生产周期短，成本低，可大规模生产等优点；
(2)本发明使用pcDNA3.1+质粒，构建哺乳动物体外表达载体，相对于传统的多肽合成，制备周期短、成本低、制备成功率高；
(3)相对传统的DC转染，本申请使用RNA疫苗电转DC细胞，相比于其他生物治疗药物，易在体外生产和纯化，生产工艺通用性强，安全性高；
(4)将电转后的DC细胞和T细胞共培养，使用41BB抗体对新生抗原反应性T细胞进行筛选，获得的基于新生抗原反应性T细胞比例高，免疫原性强；
(5)IL-2、IL-7、OKT3扩增新生抗原反应性T细胞，获得的细胞数量多，培养效果好；
(6)相对于现有技术，整个制备过程不使用血清，获得的基于新生抗原反应性T细胞安全性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备流程图；
图2为实施例2新生抗原反应性T细胞的流式分析图；
图3为实施例2中不同条件下NRT扩增曲线对比图；
图4为实施例2中不同条件下免疫原性图-(IFN)γ水平对比图；
图5为实施例3中本申请制备的基于新生抗原反应性T细胞与未加41BB制备的新生抗原反应性T细胞在肺癌肿瘤免疫治疗中抗肿瘤效果对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，包括以下步骤：
基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变；其中，所述肿瘤基因突变是通过基因测序分析得到的。
根据基因突变分析肿瘤新生抗原；
根据新生抗原构建体外表达载体，制备RNA疫苗；其中，构建RNA疫苗包括直接合成和构建表达载体体外转录，本申请采用构建表达载体体外转录，其具有生产周期短，成本低，可大规模生产等优点；所述表达载体为pcDNATM6、pcDNATM5、pCEP4、pcDNA3.1的任意一种，本申请优选为pcDNA3.1，其具有可用于在多种哺乳动物细胞系中实现高水平、组成型表达等优点。
基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞；其中，所述外周血单个核细胞经分离、培养和电转获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞，电转RNA疫苗的DC细胞相比于其他生物治疗药物，易在体外生产和纯化，生产工艺通用性强，安全性高，电转采用的仪器可以是Eppendorf Eporator、BIO-RAD、ABI Neon、Lonza电转仪等的任意一种，本申请优选用Lonza电转仪。
由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞，诱导生成新生抗原反应性T细胞；其中，所述电转RNA疫苗的DC细胞诱导T细胞的活化，制备新生抗原反应性T细胞。
使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选，并将筛选后的细胞扩增培养，得到基于新生抗原反应性T细胞。其中，其中，所述电转RNA疫苗的DC细胞和T细胞按照比例1：(3～10)先进行共孵育，然后进行扩增培养，所述细胞扩增培养是采用IL-2、IL-7、OKT3进行扩增的。
实施例1
一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法
1、原料
肿瘤组织、外周血单个核细胞(PBMC)、DC细胞、T细胞、pcdna3.1+载体
2、一种基于新生抗原反应性T细胞的制备方法
2.1、RNA疫苗的制备
(1)采集患者肿瘤组织和对照组织标本，依次进行基因测序和生信分析基因突变，根据突变分析肿瘤新生抗原，根据新生抗原分析结果制备体外表达载体；
(2)在室温下，取一只200ul PCR管，依次加入15ul的双蒸水、2ul的10X缓冲液、1ug的pcDNA3.1+质粒(2ul)、1ul的XhoI酶，震荡混匀，37℃，温浴5min进行质粒线性化；线性化的质粒使用PCR纯化试剂盒(qiagen，28104)进行纯化回收；在室温下，加入1ug的线性化的质粒、10ul的T7转录预配液、1ul的T7 RNA聚合酶，补加双蒸水至20ul的体系，37℃，温浴1h，对质粒进行体外转录；体外转录好的RNA使用RNA纯化试剂盒(qiagen，74134)，进行纯化回收，得到RNA疫苗。
2.2、基于新生抗原反应性T细胞的制备
(1)第0天，单采机采集患者外周血单个核细胞80-100ml。采用Ficoll分离PBMC，并调整细胞密度0.5-1*107个/ml，贴壁2h，集非贴壁细胞冻存备用。贴壁细胞加入DC培养液，用于制备DC疫苗及共培养的DC细胞；第2天，吸取DC培养上清液，离心5min，去除一半体积的培养基，加入相应体积的新鲜培养基并补足细胞因子，维持细胞因子溶度1000U/ml的rhGM-CSF及500U/ml的IL-4；第4天，诱导DC成熟。加入TNF-α(1000U/ml)、IL-1b(10ng/ml)、IL-6(1000u/ml)、过夜诱导成熟；第5天，收集DC细胞，用电转仪电转RNA疫苗，得到电转RNA疫苗的DC细胞。
需要说明的是，采用电转相对于转染方式，重复性好，无试剂费用，电转率高。
(2)第4天，复苏冻存的非贴壁细胞；第6天，收集DC并洗涤,按1:10(电转RNA疫苗的DC细胞:T细胞)加入到非贴壁细胞中，调整T细胞密度0.5-1*106个/ml。(过夜孵育后8小时)加10ug/ml的41BB Ab；加入3000U/ml的IL-2+20ng/ml的IL-7，每3天调整细胞密度1*106个/ml，并补加细胞因子3000U/ml的IL-2、20ng/ml的IL-7；第9天，调整细胞密度1*106个/ml，加30ng/ml的OKT3，加补加细胞因子6000U/ml的IL-2、20ng/ml的IL-7，并更换12孔板继续培养。第13天，质检：细菌图片/真菌图片，内毒素/真菌葡聚糖，细菌培养/真菌培养。
实施例2
性能检测：
采用实施例1的制备方法分别采集三个患者的PBMC分别制备NRT，采用41BB进行分选并进行流式分析，其检测结果如图2所示，由图2的流式分析图可知，41BB分选后，41BB阳性新生抗原反应性T细胞浓度显著提高。
采用实施例1的制备方法分别采集三个患者的PBMC，分别制备NRT，对同1个患者制备的新生抗原反应性T细胞分别进行未使用41BB分选、41BB分选和使用41BB分选与胎牛血清扩增，由图3的新生抗原反应性T细胞扩增曲线可知，采用41BB进行分选的整个制备过程不使用血清进行扩增和使用血清进行扩增时，所得到的疫苗活性无明显差别，因采用血清进行扩增对获得的细胞安全性有影响，因此，本发明的制备过程不使用血清，获得的细胞活化性高且安全性高。其中，图3中的曲线1为未使用41BB分选；图3中的曲线2为41BB分选；图3中的曲线3为使用41BB分选与胎牛血清扩增。
采用实施例1的制备方法制备新生抗原反应性T细胞并进行免疫原性检测。实验组分3组，分别是现有技术制备的新生抗原反应性T细胞(对照组1)、本申请制备方法未进行电转的新生抗原反应性T细胞(对照组2)和本申请制备方法制备的新生抗原反应性T细胞，对3组疫苗使用ELISA检测
Figure BDA0003026088480000081
，结果如图4，由图4可知，经过41BB分选和电转染新抗原的DC共孵育的疫苗
Figure BDA0003026088480000082
水平显著上升。
实施例3
一种基于新生抗原反应性T细胞的在肺癌肿瘤免疫治疗中的应用：
选用三个非小细胞肺癌患者，分别使用上述实施例1的制备方法以及本申请制备方法不加41BB分选制得的的NRT，检测其抗肿瘤活性。将上述两组制备的NRT和自体的肿瘤细胞共培养，使用LDH检测其杀伤性，结果如图5所示，由图5可知，采用本申请的41BB分选获得的NRT比未采用41BB分选获得的NRT具有更好的抗肿瘤效应。
本申请的疫苗与通用疫苗不同，是根据不同患者不同癌种设计的个性化定制疫苗，以实现个性化的癌症治疗。此外，相对于传统的多肽合成，制备周期短、成本低、制备成功率高；使用电转仪进行电转。相对于传统转染方式，重复性好，无试剂费用，电转率高；使用RNA疫苗电转DC细胞，相比于其他生物治疗药物，易在体外生产和纯化，生产工艺通用性强，安全性高；将电转后的DC细胞和T细胞共培养，使用41BB对T细胞进行筛选，获得的活化的基于新生抗原反应性T细胞疫苗比例高，免疫原性强；IL-2、IL-7、OKT3扩增T细胞，获得的细胞数量多，培养效果好；整个过程不使用血清，获得的细胞安全性高。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变；
根据基因突变分析肿瘤新生抗原；
根据新生抗原构建体外表达载体，制备RNA疫苗；
基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞；
由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞，诱导生成新生抗原反应性T细胞；
使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选，并将筛选后的细胞扩增培养，得到基于新生抗原反应性T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变的步骤中，所述肿瘤基因突变是通过基因测序分析得到的。
3.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述根据新生抗原构建体外表达载体，制备RNA疫苗的步骤中，所述表达载体依次进行质粒线性化和体外转录，制备RNA疫苗。
4.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞的步骤中，所述外周血单个核细胞经分离、培养和电转获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞。
5.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞，诱导生成新生抗原反应性T细胞的步骤中，所述电转RNA疫苗的DC细胞诱导T细胞的活化，制备新生抗原反应性T细胞。
6.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选，并将筛选后的细胞扩增培养，得到基于新生抗原反应性T细胞的步骤中，所述细胞扩增培养是采用IL-2、IL-7、OKT3进行扩增的。
7.根据权利要求3所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pcDNATM6、pcDNATM5、pCEP4、pcDNA3.1的任意一种。
8.根据权利要求1至7任一所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
采集患者肿瘤组织和对照组织标本，依次进行基因测序和生信分析基因突变；
根据基因突变分析肿瘤新生抗原；
根据肿瘤新生抗原构建体外表达载体，所述表达载体依次进行质粒线性化、体外转录和纯化，制备RNA疫苗；
单采机采集患者外周血单个核细胞，采用Ficoll-Histopaque分离外周血单个核细胞，贴壁一定时间，将T细胞冻存备用，DC细胞加入DC培养液，吸取DC培养液的上清液，经离心去除一半体积的培养基，加入相应体积的新鲜培养基、细胞因子和诱导试剂，诱导DC细胞成熟，收集诱导成熟的DC细胞，用RNA疫苗电转DC细胞，获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞；
复苏冻存的T细胞，将电转RNA疫苗的DC细胞洗涤并按比例加入到T细胞中，过夜孵育后加入41BB抗体，得到细胞混合液，将细胞混合液放入含有IL-2和IL-7的培养袋中诱导培养，在诱导培养后的细胞混合液中加入IL-2、IL-7和OKT3并更换孔板继续培养，进行二次诱导培养，得到基于新生抗原反应性T细胞。
9.一种如权利要求1至8任一所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法制备的基于新生抗原反应性T细胞。
10.一种如权利要求9所述的一种基于新生抗原反应性T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。
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