CN116063449A - 一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法。还公开了一种肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体地，所述方法包括：使用负载抗原肽的DC细胞与初级TILs细胞共培养；随后使用抗原特异性活化的标志物进行分选肿瘤抗原特异性T细胞，获得标志物阳性细胞；并扩增所述标志物阳性细胞。本发明提供的方法可以提供更强的共刺激信号，激活TILs中肿瘤抗原特异性T细胞；并且避免丢失有效的、具有抗肿瘤功能的细胞；适用于多种肿瘤特异性抗原，适用范围广。适用本发明提供的方法获得的终产品拥有更强的肿瘤杀伤能力。

Description

一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法。
背景技术
肿瘤过继免疫治疗(adoptive cell therapy，ACT)是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。
肿瘤组织周围及内部往往含有肿瘤浸润淋巴细胞群(tumor-infiltratinglymphocytes，TILs)，该细胞群中存在大量肿瘤抗原特异性T细胞。Rosenberg团队是首个将TILs用于ACT治疗的团队，其研究表明在IL-2的作用下，肿瘤组织中的TILs细胞可以高效扩增，同时保持对自体肿瘤的杀伤能力。
TILs产品中的细胞构成及表型与临床治疗效果显著相关。直接从肿瘤组织中扩增获得的TILs细胞构成复杂，除了肿瘤响应性的T细胞外，还含有大量的不具备抗肿瘤效果的bystander细胞。富集培养肿瘤响应性TILs可提高其抗肿瘤功能，并减少所需回输的细胞量。
有技术利用PD-1、LAG-3、TIM-3等分子标记物阳性T细胞群体中所含有的肿瘤响应性T细胞数量高于阴性群体的现象，对这些标记物阳性的TILs进行分选及培养。该方法所得PD-1阳性T细胞群体中抗原响应性T细胞含量只是相对提高，其肿瘤响应性T细胞含量仍不明确。
可作为免疫治疗靶标的肿瘤抗原可包括肿瘤相关病毒来源抗原、肿瘤相关抗原、癌睾抗原、肿瘤新生抗原等类型抗原。有研究报道了一个患者接受未经富集培养TILs(bulkTILs)治疗未响应，之后对其TILs进行ERBB2IP基因突变响应性的CD4细胞富集培养，终产品中突变响应T细胞含量高达95％。患者回输富集培养后的TILs后，观察到肝及肺部的转移灶快速缩小。该研究表明富集培养肿瘤抗原响应的TILs细胞可以有效提升TILs细胞的抗肿瘤能力。因此，分离TILs中的肿瘤抗原特异性T细胞进行富集培养有利于获得抗肿瘤功能更强的细胞产品。
常见的肿瘤抗原特异性T细胞分离策略根据是否需要事先对抗原特异性T细胞进行刺激可分为两类：(1)无需刺激直接分离，该方法主要使用肽段-MHC多聚复合物实现对抗原特异性T细胞的分选富集；(2)使用抗原进行特异性刺激，之后利用细胞表面上调的活化标记物捕获特异性T细胞群体。其中肽段-MHC多聚复合物制备时间成本较高，且仅特定分型MHC具有商品化试剂，不利于大规模应用。此外，大量研究表明TILs中的肿瘤抗原特异性CD4细胞也在抗肿瘤治疗中发挥重要的作用。而MHC II类分子的肽-MHC多聚物制备较为困难，应用该方法较难实施肿瘤抗原特异性CD4细胞分选(M.R.Parkhurst等Unique NeoantigensArise from Somatic Mutations in Patients with Gastrointestinal Cancers,CancerDiscov,9(2019)1022-1035。http://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-18-1494)。
使用抗原刺激后，利用表面活化标志物进行特异性细胞群体分离富集，方法的适用范围更广，但是技术流程中刺激物的选择、刺激物作用时间、分选产物的进一步扩增培养均会对最终产品的有效性产生较大的影响。树突状细胞(Dendritic cell，DC细胞)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞，可以有效激活抗原提呈细胞。CD137分子可响应抗原刺激，在CD8及CD4细胞表面上调表达，是一种可实现抗原特异性CD8和CD4的有效的细胞表面标志物。经过调研，目前已有较为成熟的制备工艺如下：
方案1：Jianjian Jin等人(J.Jin等Simplified method of the growth ofhuman tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable flasks to numbersneeded for patient treatment，J Immunother，35(2012)283-292.http://doi.org/10.1097/CJI.0b013e31824e801f)发表了一篇TILs制备的方法。该方法直接使用从肿瘤组织中初步培养获得的、未经分选的TILs进行大量扩增获得终产品。所得终产品中混杂有大量的非肿瘤响应性T细胞，甚至有可能不含肿瘤特异性T细胞，其有效成份含量不可控制。
方案2：公开号为CN104946589A的专利公开了一种肿瘤特异性TILs细胞的分离培养方法。该方案是利用PD-1、LAG-3、TIM-3等分子标记物阳性T细胞群体中所含有的肿瘤响应性T细胞数量高于阴性群体的现象，对这些标记物阳性的TILs进行分选及培养。该方案所得PD-1阳性T细胞群体中抗原响应性T细胞含量只是相对提高，其肿瘤响应性T细胞含量仍不明确。
方案3：Mark E.Dudley等人(M.E.Dudley等Generation of tumor-infiltratinglymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanomapatients,J Immunother，26(2003)332-342.http://doi.org/10.1097/00002371-200307000-00005)使用了一种挑选肿瘤特异性TILs进行扩增培养的方法。该方法利用自体肿瘤细胞与各TILs培养物共培养，选择阳性反应孔进行进一步扩增。该方案所选择的阳性孔仅是存在肿瘤响应性T细胞，其具体比例不明，且自体肿瘤体细胞外培养成功率不可控，不同的癌种限制因素高。
方案4：公开号为CN113106062A的专利公开了一种肿瘤抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞共培养方法。该方案对正常组织与肿瘤组织进行全外显子组测序，通过两组测序数据比较确定氨基酸突变，然后合成5条肿瘤特异性抗原肽N1-N5。之后将肿瘤组织消化，并通过密度梯度离心法收集淋巴细胞(TILs)层和肿瘤细胞层。该方案主要存在两方面的问题，其一是该方法直接使用抗原多肽激活TILs中的特异性细胞，激活效率有限，且这种激活的TILs细胞因为长期的抗原接触，容易导致激活后的凋亡和终末分化的现象；其二是该方案中新抗原特异性T细胞只是相对优势扩增，其余非特异性T细胞同样会大量增殖，最终所得产品中新抗原特异性TILs细胞含量有限。
方案5：公开号为CN113272419A的专利公开了制备治疗性T淋巴细胞的方法。该方案使用表达肿瘤新生抗原的串联基因(TMG)转染抗原呈递细胞(APC)，利用基因转染的抗原呈递细胞刺激TILs，通过T细胞表面活化标记实现对新生抗原特异性TILs细胞的分离，并在此基础上进行快速扩增获得最终产品。然而，TMG基因的构建及APC细胞基因转染流程工艺复杂，时间周期较长，不利于进行大规模制备生产。
方案6：公开号为CN109988748A的专利公开了一种从TILs筛选肿瘤特异性T细胞的方法。该方案使用MHC-肽段复合物作为从TILs中分离富集肿瘤新生抗原的方法。然而，MHC-肽段复合物制备成功率与肽段的亲和力存在较大的相关性，比较适用于固定的肽段，而在实际临床应用中，不同个体肿瘤新生抗原差异很大，且多为患者个体独有，很难提前制备且保证其有效性。目前仅有个别分型的MHC I分子具有商品化的试剂盒可用于制备四聚体，使得其所适用的人群范围受限。另外，MHC II类的MHC-肽复合物制备存在技术困难，较难制备成功，因此MHC-肽复合物只能实现对特定分型MHC个体中CD8细胞的分离富集，无法实现对肿瘤新生抗原特异性CD4细胞的分离富集。因此，MHC-肽段复合物多聚体法的大规模临床应用存在较大的制约。
发明内容
为了解决上述技术流程中刺激物的选择、刺激物作用时间、分选产物的进一步扩增培养均会对最终产品的有效性产生较大的影响的缺陷，本发明提供制备一种GMP级别肿瘤抗原特异性TILs(tumor-infiltrating lymphocytes，肿瘤浸润淋巴细胞群)的方法。本发明的方法培养扩增的最终T细胞产物里，肿瘤抗原特异性T细胞的产量和比例均有明显改进，且可同时获得肿瘤抗原特异性CD4及CD8细胞，最大程度提高所能获得的肿瘤响应性T细胞的多样性。此外，本发明整体培养时长不超过5周，扩增过程使用低剂量IL-2，所获得的TILs细胞为年轻态的TILs细胞，其在患者体内有更好的增殖能力，持续存在时长更久，有利于发挥其抗肿瘤能力。
本发明提供了一种高效的、可同时适用于CD8及CD4细胞的肿瘤抗原特异性TILs分离及扩增培养方案，以获得具有较高比例抗肿瘤活性T细胞含量的TILs治疗产品。该方案首先将DC细胞(树突状细胞，dendritic cell)与人工合成的肿瘤抗原肽进行共培养，使DC细胞负载肿瘤抗原肽，制备出活化的成熟DC细胞。将活化的成熟DC细胞与经过预扩增的TILs细胞共培养，通过活化的表面标记物(4-1BB/CD137)对肿瘤抗原特异性T细胞进行分离，然后使用feeder细胞、抗CD3单克隆抗体及IL-2对T细胞进行大量扩增。
本发明的技术关键点在于在使用负载肿瘤抗原肽的DC细胞对初步培养的TILs细胞进行刺激，随后使用抗原特异性活化的标志物CD137作为标记物，分选肿瘤抗原特异性TILs，培养时间不超过5周。使用扩增年轻态TILs的细胞因子组合，这一方法使得最终TILs产品中肿瘤抗原特异性T细胞的数量和比例显著提升，可在5周内获得治疗用年轻态的TILs产品，更适合临床使用，具有强的体内增殖和特异性抗肿瘤效果，该培养工艺流程简单、适用范围广、易于进行大规模生产。
为了解决现有技术的问题，本发明第一方面提供一种肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明第二方面提供一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
A)使用负载肿瘤抗原肽的DC细胞与初级TILs细胞共培养，获得共培养细胞；
B)随后使用抗原特异性活化的标志物进行分选肿瘤抗原特异性T细胞，获得标志物阳性细胞；并且
C)扩增所述标志物阳性细胞。
在某些实施例中，所述标志物为CD137或CD107a或CD134，例如为CD137。
在某些实施例中，所述DC细胞的制备过程包括以下步骤：
(1)将外周血单个核细胞的悬液过滤后离心，加入CD14磁珠孵育，分选后获得CD14阳性细胞；
(2)将所述CD14阳性细胞使用DC细胞培养基进行重悬，而后加入定向分化因子进行分化，加入成熟因子继续进行培养；
(3)加入如本发明第一方面所述的肿瘤抗原肽进行共孵育，即得负载肿瘤抗原肽的DC细胞。
在某些实施例中，步骤(1)中，所述外周血单个核细胞来自肿瘤患者的血细胞；和/或，
所述过滤的尺寸为35-45μm例如40μm；和/或，
所述离心的条件为300-500g、5-10min，例如500g、10min；和/或，
所述孵育的温度为2-4℃例如为4℃；
步骤(2)中，所述DC细胞培养基为含自体血清或HSA(人血清白蛋白，Human SerumAlbumin)的DC细胞培养基；和/或，
所述定向分化因子为rhGM-CSF(粒巨噬细胞集落刺激因子，Granulo-MacrophageColony Stimulating Factor)，rhIL-4中的一种或多种；和/或，
所述成熟因子为rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-1β、rhIL-6，rhTNF-α、PGE-2和Poly I:C中的一种或多种；和/或，
所述分化的时长为3-5天；和/或，
所述培养的时长为1-6天；
步骤(3)中，所述共孵育的时长为6天。本文中，“rh”代表“重组人”的意思，例如rhGM-CSF为重组人粒巨噬细胞集落刺激因子。
在某些实施例中，所述初级TILs细胞的制备过程包括：
(a)将肿瘤组织进行消化，获得单细胞悬液；所述肿瘤组织例如来自宫颈癌；
(b)将所述单细胞悬液和含500-6000IU/mL的IL-2的含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基A混合培养；
(c)使用所述HIPP培养基A进行换液，再培养后即得初级TILs细胞。
所述消化可使用gentleMACS Dissociator及肿瘤组织解离试剂盒。上述肿瘤组织解离试剂盒可为本领域常规使用的肿瘤组织解离试剂盒。
上述gentleMACS Dissociator及肿瘤组织解离试剂盒可以按照标准化的操作和流程将不同类型的肿瘤组织消化成单细胞。
在某些实施例中，步骤C)中，所述HIPP培养基A为含500IU/mL的IL-2的含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基；和/或，
所述换液为半量换液；和/或，
所述换液的频率为每2-3天进行一次；和/或，
所述再培养的总时长为1-3周，例如为2周。
在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：
步骤A)中，将所述DC细胞与所述初级TILs细胞按1:4-1:20的比例混合，重悬在含1-5％ HSA的HIPP培养基B中，并添加如本发明第一方面所述的肿瘤抗原肽、rhIL-21进行共培养，收集共培养细胞；
步骤B)中，利用CD137阳性细胞分选试剂，对肿瘤抗原特异性T细胞进行分离，即得标志物阳性细胞。
在某些实施例中，步骤A)中，所述比例为1:10；和/或，
所述HIPP培养基B为含2.5％ HSA的HIPP培养基；和/或，
所述肿瘤抗原肽的终浓度为1-20μg/mL，优选为10μg/mL；和/或，
所述rh IL-21的终浓度为30ng/mL；和/或，
所述共培养的时长为12-48h，优选为18h。
在某些实施例中，步骤C)中，所述扩增的步骤包括以下一种或多种条件：
(i)将经过辐射后的同种异体PBMC细胞和TILs细胞按1:20-1:100的比例进行混合，获得混合细胞；
(ii)将所述混合细胞在含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基1进行重悬，并加入抗CD3抗体、抗CD28抗体、rhIL-2、rhIL-7及rhIL-15中的一种或多种进行培养；
(iii)使用含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基2进行换液，例如半量换液；
(iv)继续培养，按0.5-2×106细胞/mL密度重悬在含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基，并添加细胞因子。
优选地，所述扩增的步骤还包括步骤：
(v)每隔2-3天补加所述细胞因子，重复2-5次。
在某些实施例中，步骤C)包括以下一种或多种条件：
步骤(i)中，所述辐射为X射线辐射，优选地，辐照剂量为200Gy，和/或，
所述比例为1:100；
步骤(ii)中，所述HIPP培养基1为含2.5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基，
所述抗CD3抗体的浓度为30-600ng/mL，例如为600ng/mL，
所述抗CD28抗体的浓度为30-600ng/mL，例如为600ng/mL，
所述rhIL-2的浓度为100-1000IU/mL，例如为200IU/mL，
所述rhIL-7的浓度为10-100ng/mL，例如为10ng/mL，
所述rhIL-15的浓度为10-100ng/mL，例如为10ng/mL，和/或，
所述培养的时长为4-6天；
步骤(iii)中，所述HIPP培养基2中添加了100-1000IU/mL例如200IU/mL IU/mL的rhIL-2、10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-7及10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-15，且含2％自体血浆或血清替代物，和/或，
所述继续培养的时长为2-5天，优选为2天；
所述HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基为含2％自体血浆的HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基，和/或，
所述细胞因子为100-1000IU/mL例如200IU/mL的rhIL-2、10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-7及10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-15。
本发明第三方面提供一种本发明第一方面所述的肿瘤抗原肽在制备肿瘤抗原特异性T细胞及含其的检测试剂盒中的应用。
本发明采用的技术方案为：一种制备GMP级别肿瘤抗原特异性TILs的方法，其特征在于，它按如下步骤制备：
1.肿瘤抗原预测及抗原肽合成
对肿瘤患者的外周血及肿瘤组织进行测序，其中外周血进行全外显子组测序，肿瘤组织进行全外显子组测序及转录组测序。通过将外周血及肿瘤组织外显子测序数据相比对，分析肿瘤细胞特有的变异及差异表达蛋白。在此基础上结合肿瘤组织转录组测序数据以及患者HLA分型数据，预测患者可能产生的肿瘤特异性抗原(含肿瘤新生抗原、肿瘤相关抗原、癌睾抗原及肿瘤相关病毒来源抗原肽等)，根据预测所得的可以与MHC I和/或MHC II的肿瘤特异性抗原肽序列合成肽段用于后续DC负载实验。
2.从肿瘤组织中通过体外培养获得初级TILs细胞(pre-TILs)；
2.1获取肿瘤组织，将肿瘤组织剪碎成1-4mm3大小的组织块；
本发明使用的肿瘤组织可为人肿瘤、小鼠肿瘤或脑肿瘤(可包括胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤)，例如人实体肿瘤(可包括乳腺癌，肺癌，结肠癌，黑色素瘤)。
2.2使用gentleMACS Dissociator及肿瘤组织解离试剂盒(德国美天旎，货号130-095-929)进行肿瘤组织消化，获得单细胞悬液；
2.3将1×107-4×107单细胞悬液加入到G-rex瓶中，加入含200-6000IU/mL IL-2的pre-TILs培养基(含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基)进行培养；
2.4第5天后，使用含200-6000IU/mL IL-2的pre-TILs培养基进行半量换液；
2.5之后每隔2-3天进行半量换液；
2.6总培养时长不超过3周，待pre-TILs细胞扩增细胞数量达到大于1×108个即用于肿瘤抗原特异性T细胞分离。
3.受试者自体DC培养
3.1将外周血或单采血混匀，离心收集下层血细胞。血细胞用DPBS稀释后，加于Ficoll(聚蔗糖)分离液中，离心分离。收集中间白膜层细胞，即为外周血单个核细胞(PBMC)。
3.2将PBMC悬液过40μm筛网，500g离心10min，加入CD14磁珠(Miltenyi Biotec)孵育，孵育时间为30min，孵育温度为4℃，孵育时间结束后，300g离心10min，重悬沉淀细胞。向LS分选柱正中央加入细胞悬液，完毕，猛推分选柱活塞，将管上细胞推至收集管中，收集CD14阳性细胞。
3.3将分选所得的CD14阳性细胞使用含自体血清或人血白蛋白(HSA)的DC细胞培养基重悬，加入rhGM-CSF，rhIL-4，定向分化。第3-5天加入成熟因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-1β、rhIL-6，rhTNF-α、PGE-2、Poly I:C，继续培养。第6-9天将肿瘤抗原肽与DC细胞共孵育，收集负载抗原肽的成熟的DC细胞。
4.肿瘤抗原肽特异性TILs细胞分离
取上述负载抗原肽的成熟的DC细胞与上述初级TILs细胞共培养，刺激肿瘤抗原特异性T细胞表面CD137上调表达，并通过CD137抗体对相应的T细胞进行分离，具体步骤如下：
4.1将负载有抗原肽的成熟的DC细胞与T细胞以1:4-1:20比例混合，重悬在含2.5％HSA的HIPP培养基中，并添加肿瘤抗原肽的肽段至终浓度1-20μg/mL，添加rhIL-21至30ng/mL；
4.2共培养12-48h后，收集过夜共培养的细胞；
4.3利用CD137阳性细胞分选试剂(Miltenyi Biotec)对肿瘤抗原特异性T细胞进行分离。
5.CD137阳性细胞快速大量扩增
5.1将同种异体PBMC经过X射线辐照后作为辅助细胞，将上述的CD137阳性细胞与辅助细胞按1:20-1：100进行混合。
5.2将细胞重悬在40mL含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基中，加入GREX培养瓶中，并加入30-600ng/mL抗CD3抗体、30-600ng/mL抗CD28抗体、100-1000IU/mL rhIL-2、10-100ng/mL rhIL-7及10-100ng/mL rhIL-15；
5.3培养4-6天后，使用添加了100-1000IU/mL rhIL-2、10-100ng/mL rhIL-7及10-100ng/mL rhIL-15的含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基进行半量换液；
5.4继续培养2天后，扩大培养体系，每瓶细胞按0.5-2×106cells/mL密度重悬在含1-5％自体血浆的HIPP培养基，终体积200-400mL，放入GREX培养瓶中并添加细胞因子；
5.5之后每隔2-3天补加细胞因子，培养至9-14天收集成品。
本发明所使用的技术方案为使用肿瘤组织消化所得的单细胞悬液培养pre-TILs，之后使用DC负载肿瘤抗原肽对TILs细胞进行预刺激，而后使用CD137作为T细胞活化标记物，对肿瘤抗原特异性TILs细胞进行富集及扩增培养。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1)本发明使用自体DC作为抗原提呈细胞，可以提供更强的共刺激信号，激活TILs中肿瘤抗原特异性T细胞。
2)利用CD137活化标记物可同时实现对肿瘤抗原特异性CD4及CD8TILs细胞的分离，避免丢失有效的、具有抗肿瘤功能的细胞。
3)本发明中肿瘤抗原特异性T细胞分离策略不受限于患者的HLA分型，适用范围广。
4)本发明所得终产品中的肿瘤抗原特异性TILs细胞较现有方案得到极大的提升，终产品拥有更强的肿瘤杀伤能力。
5)本发明适用于多种肿瘤特异性抗原，如肿瘤相关病毒来源抗原、肿瘤相关抗原、癌睾抗原、肿瘤新生抗原等。
6)本发明整体培养时长5周左右，且扩增过程使用的是低剂量的rhIL-2，所获得的TILs细胞为一种年轻态的TILs细胞，更适宜在体内环境下持续存在并发挥杀伤功能。
7)本发明整体实验简便易于进行大规模培养，更适用于制备符合临床应用要求GMP级别的免疫治疗产品。
附图说明
图1为实施例2与实施例3中TILs对肿瘤抗原肽负载T2细胞免疫响应ELISPOT检测结果图。
图2为实施例2与实施例3杀伤肽段负载T2细胞的结果图。
图3为实施例2及实施例3抑制小鼠肿瘤生长的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1肿瘤抗原预测及肽段合成
对肿瘤患者的外周血及肿瘤组织进行测序，其中外周血进行全外显子组测序，肿瘤组织进行全外显子组测序及转录组测序。通过将外周血及肿瘤组织外显子测序数据相比对，分析肿瘤细胞特有的变异。通过肿瘤组织转录组测序数据，分析肿瘤特有的或差异表达蛋白、或肿瘤相关病毒蛋白表达情况。在此基础上结合患者HLA分型数据，预测患者可能产生的肿瘤特异性抗原，含肿瘤相关病毒来源抗原、肿瘤相关抗原、癌睾抗原和肿瘤新生抗原等。
表1预测的肿瘤特异性抗原肽序列
肽段名称 多肽序列 SEQ ID NO: HLA分型
肿瘤抗原肽 REFIPLPWL 1 B40:01
野生型肽 REFIPLPRL 2  
实施例2Bulk TILs细胞培养
1初级TILs细胞培养(pre-TILs)
获取宫颈癌肿瘤组织，将肿瘤组织剪碎成2-4mm3大小的组织块，之后使用gentleMACS Dissociator及肿瘤组织解离试剂盒(德国美天旎，货号130-095-929)进行肿瘤组织消化，获得单细胞悬液；1×107的单细胞悬液加入到Grex-10瓶中，加入30mL含500IU/mL rhIL-2的含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基(倍谙基，FG0103801)进行培养；第5天后，使用含500IU/mL rhIL-2的pre-TILs培养基进行半量换液；之后每隔2-3天进行半量换液；培养3周后收获pre-TILs细胞。
2.未分选pre-TILs快速扩增制备未分选TILs
将异体PBMC进行辐照后作为feeder细胞，将未经分选的pre-TILs细胞与feeder细胞按1:100进行混合。接着，将细胞重悬在40mL含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基中加入GREX培养瓶中，并加入600ng/mL抗CD3抗体、600ng/mL抗CD28抗体、200IU/mL IL-2、10ng/mL rhIL-7及10ng/mL rhIL-15；4-6天后，使用添加了200IU/mL IL-2、10ng/mL rhIL-7及10ng/mL rhIL-15的含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基进行半量换液；继续培养2天后，扩大培养体系，每瓶细胞按0.5-2×106cells/mL密度重悬在含2％自体血浆或血清替代物的HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基(倍谙基)，终体积200-400mL，放入GREX培养瓶中并添加细胞因子；之后每隔2-3天补加细胞因子，培养至10-14天收集细胞。细胞产量见表2。
实施例3肿瘤抗原肽特异性TILs细胞分离及快速扩增
1.受试者自体DC培养
采集患者外周血100mL，利用Ficoll分离液从患者血液中分离PBMC。使用CliniMACS CD14 Reagent(Miltenyi Biotec)分离PBMC中的CD14阳性细胞。具体地，将PBMC悬液过40μm筛网，500g离心10min，加入CD14磁珠(Miltenyi Biotec)孵育，孵育时间为30min，孵育温度为4℃，孵育时间结束后，300g离心10min，重悬沉淀细胞。向LS分选柱正中央加入细胞悬液，完毕，猛推分选柱活塞，将管上细胞推至收集管中，收集CD14阳性细胞。
分选得到的CD14+细胞，使用含自体血清或人血白蛋白(HSA)的DC细胞培养基(CellGenix，20801-0500)重悬，加入rh GM-CSF，终浓度50ng/ml，加入rh IL-4，终浓度100ng/ml，定向分化。第3-5天加入成熟因子rhGM-CSF，终浓度100ng/ml、rhIL-4终浓度100ng/ml、rhIL-1β终浓度10ng/ml、rhIL-6终浓度10ng/ml，rhTNF-α终浓度10ng/ml、PGE-2终浓度100ng/ml、Poly I:C终浓度5μg/ml，继续培养。第6天将肿瘤抗原肽与DC细胞共孵育，收集负载抗原肽的成熟的DC细胞。
2.初级TILs细胞培养(pre-TILs)
获取宫颈癌肿瘤组织，将肿瘤组织剪碎成2mm3大小的组织块，之后使用gentleMACS Dissociator及肿瘤组织解离试剂盒(德国美天旎，货号130-095-929)进行肿瘤组织消化，获得单细胞悬液；将1×107的单细胞悬液加入到Grex-10瓶中，加入30mL含500IU/mL rhIL-2的含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基进行培养；第5天后，使用含500IU/mL rhIL-2的HIPP培养基进行半量换液；之后每隔2-3天进行半量换液；培养2周后收获初级TILs细胞。
3.使用CD137标记分离肿瘤抗原肽特异性T细胞
将上述负载有肿瘤抗原肽的DC细胞与上述初级TILs细胞以1:10比例混合，重悬在含2.5％ HSA的HIPP培养基中，并添加肿瘤抗原肽至终浓度10μg/mL，添加rhIL-21至30ng/mL。DC与T细胞共培养18h后，收集过夜共培养的细胞，使用CD137 Antibody,anti-human,Biotin(Miltenyi Biotec)及Anti-Biotin MicroBeads UltraPure(Miltenyi Biotec)分选共培养物中的CD137阳性细胞。
4.CD137阳性细胞快速扩增制备肿瘤抗原特异性TILs细胞
将同种异体PBMC进行X射线辐照(辐照剂量为200Gy)后作为辅助细胞，将上述的CD137阳性细胞与辅助细胞按1:100进行混合。接着，将细胞重悬在40mL含2.5％自体血浆的HIPP培养基中加入GREX培养瓶中，并加入600ng/mL抗CD3抗体、600ng/mL抗CD28抗体、200IU/mL IL-2、10ng/mL rhIL-7及10ng/mL rhIL-15；4-6天后，使用添加了上述同样浓度的细胞因子含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基进行半量换液；继续培养2天后，扩大培养体系，每瓶细胞按0.5-2×106细胞/mL密度重悬在含2％自体血浆或血清替代物的HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基，终体积200-400mL，放入GREX培养瓶中并添加细胞因子。之后每隔2-3天补加细胞因子，培养至10-14天收集细胞。细胞产量见表2。
表2TILs细胞产量
样品 起始扩增细胞数 最终获得细胞数
实施例2 <![CDATA[1×10<sup>7</sup>]]> <![CDATA[5.28×10<sup>10</sup>]]>
实施例3 <![CDATA[1×10<sup>7</sup>]]> <![CDATA[4.69×10<sup>10</sup>]]>
实施例4流式细胞分型检测实施例2及实施例3细胞中PD-1(CD279)阳性细胞比例
1.取6×105的实施例2或实施例3所得的细胞重悬在300μL含2％FBS的DPBS中，400g离心5min后弃上清，将细胞沉淀重悬在200μL含2％FBS的DPBS中。
2.取50μL细胞悬液置于分别置于2个1.5mL离心管中，分别作为对照组及实验组。其中对照组不处理，实验组加入2μL APC-CD279抗体，2μLAPC-Cy7-CD3抗体，2μL AlexaFlour@700-CD8抗体，将溶液混匀后，室温避光孵育20min。
4.染色结束后，向离心管中添加DPBS，混匀后400g离心5min，弃上清。弹散细胞沉淀，加入200μL DPBS重悬细胞，
5.每管加入5μL 7-ADD(Biolegend)染色液，室温避光孵育5min，然后用流式细胞仪(Beckman)进行检测。
6.首先选出7-ADD阴性细胞群，在7-ADD阴性细胞群中，再选出CD3+CD8双阳性群体，在该群体中分析PD-1表达情况。
检测结果见表3。
表3pre-TILs及富集培养后TILs中肿瘤抗原肽特异性T细胞肽检测结果
Figure BDA0003894494580000161
实施例5IFN-γELISPOTs检测实施例2及实施例3中TILs细胞对肿瘤抗原肽负载T2细胞的免疫反应
使用T2细胞负载肿瘤抗原肽作为刺激物，分别与实施例2及实施例3所得的细胞共培养，检测样品中可分泌IFN-γ的细胞数量。按照IFN-γELISPOT试剂盒说明书，将供试品细胞与负载肽段的T2细胞(测试组)于ELISPOT板孔共培养20h，之后按试剂说明书对IFN-γ分泌细胞进行染色检测。每组细胞阴性对照是将供试品细胞与未负载肽段的T2细胞共培养，阳性对照组为加入供试品细胞与PMA。检测结果见表4及图1。
表4实施例2及实施例3TILs细胞IFN-γELISPOT检测结果
样品 测试组斑点数 阴性对照组斑点数 阳性对照组斑点数
实施例2 156 15 824
实施例3 297 4 945
实施例6Tetramer检测实施例2及实施例3中肿瘤抗原肽特异性T细胞含量
1.取6×105的实施例2或实施例3所得的细胞重悬在300μL含2％FBS的DPBS中，400g离心5min后弃上清，将细胞沉淀重悬在200μL含2％FBS的DPBS中。
2.取50μL细胞悬液置于分别置于2个1.5mL离心管中，分别作为对照组及实验组。其中对照组不处理，实验组加入2μL肿瘤抗原肽制备的四聚体(APC-labelled)。
3.分别向2管中加入2μL PE anti-human CD8(Biolegend)染色液混匀，室温避光孵育20min。
4.染色结束后，向离心管中添加DPBS，混匀后400g离心5min，弃上清。弹散细胞沉淀，加入200μL DPBS重悬细胞。
5.每管加入5μL 7-ADD(Biolegend)染色液，室温避光孵育5min，然后用流式细胞仪(Beckman)进行检测。
6.首先选出7-ADD阴性细胞群，在7-ADD阴性细胞群中，再选出APC+/PE+双阳性细胞，其比例即为特异性T细胞比例。
检测结果见表5。
表5实施例2及实施例3中肿瘤抗原肽特异性T细胞肽-四聚体检测结果
实施例2 实施例3
肽-四聚体阳性细胞群体比例 3.4％ 48.9％
实施例7 CFSE和7-AAD双标记技术检测实施例2及实施例3细胞对负载抗原肽的T2细胞的杀伤能力
取对数生长期的T2细胞，分成负载肿瘤抗原肽组与野生型多肽组，于37℃、5％CO2培养箱培养过夜。将培养过夜的T2细胞洗涤，加入0.5μMCFSE溶液，在37℃处理20min。染色结束后立即取出，终止染色，使用DPBS洗涤2-3次，进行计数，重悬至2×105个/mL。将实施例2或实施例3所得的细胞按一定效靶比(见表6)与负载肿瘤抗原肽或野生型肽的T2混合共培养，于37℃，5％ CO2培养箱中孵育，20-22h后，将细胞混合物吹散重悬，全部取出，加入7-ADD，避光染色5min，用于标记死细胞，流式细胞仪上机检测杀伤率。CSFE(+)7-AAD(+)双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，CFSE(+)7ADD(-)细胞为未被杀伤的靶细胞，根据这些比例来计算靶细胞杀伤T2的杀伤活性。按相同方案检测野生肽特异性CD8(+T细胞的杀伤活性。杀伤率(％)＝(实验组靶细胞中死细胞比例-阴性对照组靶细胞中死细胞比例)/(1-阴性对照组靶细胞中死细胞比例)。结果见表6和图2。
表6细胞特异性识别并杀伤呈递实验多肽的靶细胞
Figure BDA0003894494580000181
实施例8实施例2与实施例3细胞静脉注射对肿瘤抗原肽稳转肿瘤细胞株荷瘤小鼠模型的药效学研究
对实施例2及实施例3制备的TILs细胞开展小鼠体内药效评估。采用64只7-9周龄的免疫缺陷NOG鼠和稳转肿瘤特异性抗原肽的肿瘤细胞株来构建皮下瘤模型，每只小鼠皮下接种2×106个宫颈癌siHa肿瘤细胞。接种后，定期观察小鼠的肿瘤生长情况并监测瘤体积大小，肿瘤长至50-100mm3后根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组，进行尾静脉给药。
总共分为8组：1)PBS组佐剂组，2)实施例2低剂量组，3)实施例2中剂量组，4)实施例2高剂量组，5)实施例3低剂量组，6)实施例3中剂量组，7)实施例3高剂量组，8)Mock-T细胞高剂量组，每组各8只。其中高剂量组细胞为2×107/剂量，中剂量组为7×106/剂量，低剂量组为2×106/剂量，共给药2次，第一次给药结束后，7天后进行第二次给药。同时联合IL-2(5万IU/剂，每天3剂)。
结果见图3。确定成瘤后(接种后5-8天)每2天对肿瘤长宽进行测量，并计算相对肿瘤抑制率(TGI)完成疗效评价。结果显示，成瘤后5天给药，到第32天时，实施例3低剂量，中剂量及高剂量组的TGI分别为88％，93％和99％，能显著抑制肿瘤在NOG小鼠体内的生长，且呈现一定的量效关系，实施例2低剂量，中剂量及高剂量组的TGI分别为47％，63％和79％，Mock-T组TGI为29％。
本发明使用负载肿瘤抗原肽的DC细胞对初步培养的TILs进行刺激，随后使用抗原特异性活化的标志物CD137作为标记物，分选肿瘤抗原特异性TILs，培养时间不超过5周，使用扩增年轻态TILs的细胞因子组合，这一方法使得最终TILs产品中肿瘤抗原特异性T细胞的数量和比例显著提升，可在5周内获得治疗用年轻态的TILs产品，更适合临床使用，具有强的体内增殖和特异性抗肿瘤效果，该培养工艺流程简单、适用范围广、易于进行大规模生产。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (12)

1.一种肿瘤抗原肽，其特征在于，所述肿瘤抗原肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
2.一种制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A)使用负载肿瘤抗原肽的DC细胞与初级TILs细胞共培养，获得共培养细胞；
B)随后使用抗原特异性活化的标志物进行分选肿瘤抗原特异性T细胞，获得标志物阳性细胞；并且，
C)扩增所述标志物阳性细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标志物为CD137或CD107a或CD134，例如为CD137。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DC细胞的制备过程包括以下步骤：
(1)将外周血单个核细胞的悬液过滤后离心，加入CD14磁珠孵育，分选后获得CD14阳性细胞；
(2)将上述CD14阳性细胞使用DC细胞培养基进行重悬，而后加入定向分化因子进行分化，加入成熟因子继续进行培养；
(3)加入如权利要求1所述的肿瘤抗原肽进行共孵育，即得负载肿瘤抗原肽的DC细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述外周血单个核细胞来自肿瘤患者的血细胞；和/或，
所述过滤的尺寸为35-45μm；和/或，
所述离心的条件为300-500g、5-10min；和/或，
所述孵育的温度为2-4℃；
步骤(2)中，所述DC细胞培养基为含自体血清或HSA的DC细胞培养基；和/或，
所述定向分化因子为rhGM-CSF，rhIL-4中的一种或多种；和/或，
所述成熟因子为rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-1β、rhIL-6，rhTNF-α、PGE-2和Poly I:C中的一种或多种；和/或，
所述分化的时长为3-5天；和/或，
所述培养的时长为1-6天；
步骤(3)中，所述共孵育的时长为6天。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述初级TILs细胞的制备过程包括：
(a)将肿瘤组织进行消化，获得单细胞悬液；
(b)将上述单细胞悬液和含500-6000IU/mL的IL-2的含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基A混合培养；
(c)使用所述HIPP培养基A进行换液，再培养后即得初级TILs细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述HIPP培养基A为含500IU/mL的IL-2的含2％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基；和/或，
所述换液为半量换液；和/或，
所述换液的频率为每2-3天进行一次；和/或，
所述再培养的总时长为1-3周，例如为2周。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤A)中，将所述DC细胞与所述初级TILs细胞按1:4-1:20的比例混合，重悬在含1-5％HSA的HIPP培养基B中，并添加如权利要求1所述的肿瘤抗原肽、rhIL-21进行共培养，收集共培养细胞；
步骤B)中，利用CD137阳性细胞分选试剂，对肿瘤抗原特异性T细胞进行分离，即得标志物阳性细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤A)中，所述比例为1:10；和/或，
所述HIPP培养基B为含2.5％HSA的HIPP培养基；和/或，
所述肿瘤抗原肽的终浓度为1-20μg/mL，优选为10μg/mL；和/或，
所述rh IL-21的终浓度为30ng/mL；和/或，
所述共培养的时长为12-48h，优选为18h。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤C)中，所述扩增包括以下一种或多种条件：
(i)将经过辐射后的同种异体PBMC细胞和TILs细胞按1:20-1:100的比例进行混合，获得混合细胞；
(ii)将所述混合细胞在含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基1进行重悬，并加入抗CD3抗体、抗CD28抗体、rhIL-2、rhIL-7及rhIL-15中的一种或多种进行培养；
(iii)使用含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基2进行换液，例如半量换液；
(iv)继续培养，按0.5-2×106细胞/mL密度重悬在含1-5％自体血浆或血清替代物的HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基，并添加细胞因子；
优选地，所述扩增还包括步骤：
(v)每隔2-3天补加所述细胞因子，重复2-5次。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤C)包括以下一种或多种条件：
步骤(i)中，所述辐射为X射线辐射，优选地，辐照剂量为200Gy，和/或，
所述比例为1:100；
步骤(ii)中，所述HIPP培养基1为含2.5％自体血浆或血清替代物的HIPP培养基，
所述抗CD3抗体的浓度为30-600ng/mL，例如为600ng/mL，
所述抗CD28抗体的浓度为30-600ng/mL，例如为600ng/mL，
所述rhIL-2的浓度为100-1000IU/mL，例如为200IU/mL，
所述rhIL-7的浓度为10-100ng/mL，例如为10ng/mL，
所述rhIL-15的浓度为10-100ng/mL，例如为10ng/mL，和/或，
所述培养的时长为4-6天；
步骤(iii)中，所述HIPP培养基2中添加了100-1000IU/mL例如200IU/mL IU/mL的rhIL-2、10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-7及10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-15，且含2％自体血浆或血清替代物，和/或，
步骤(iv)中，所述继续培养的时长为2-5天，优选为2天；
所述HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基为含2％自体血浆的HIPP-T009淋巴细胞无血清培养基，和/或，
所述细胞因子为100-1000IU/mL例如200IU/mL的rhIL-2、10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-7及10-100ng/mL例如10ng/mL的rhIL-15。
12.一种如权利要求1所述的肿瘤抗原肽在制备肿瘤抗原特异性T细胞及含其的检测试剂盒中的应用。
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