CN110433285B - 一种个体化肿瘤抗原肽疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种个体化肿瘤抗原肽疫苗及其制备方法，所述制备的步骤包括：a)对所述肿瘤细胞进行基因组全外显子测序，得到所述患者的全外显子突变数据集；据此，预测并合成外显子突变所形成的一批免疫有效的新抗原肽；b)合成富CPG序列的硫化寡聚核苷酸作为疫苗佐剂；c)将筛选出的并已经合成的新抗原肽、富CPG序列的寡聚脱氧核苷酸伽马干扰素(γ‑干扰素)按一定剂量与比例混合反应，制备针对该患者的抗癌疫苗。d)取该患者外周血，分离淋巴细胞，培养DC细胞，分离和原代培养患者肿瘤细胞，验证该疫苗的抗癌效果。

Description

一种个体化肿瘤抗原肽疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于医学领域，涉及一种个体化肿瘤抗原肽疫苗及其制备方法

背景技术

抗原肽是诱发抗癌特异性免疫的主要抗原。肿瘤细胞内各种突变蛋白被降解成的各种新抗原肽以抗原肽-MHC递呈在细胞表面，活化T细胞(主要的特异性抗癌免疫)；这过程是MHC限制的，抗原肽不与MHC结合则不能活化T细胞。弱免疫性抗原可能形成T细胞免疫抑制或慢性、无效的T细胞激活；野生型同源抗原(即正常自身抗原)不能激活T细胞。个体化瘤苗为针对某种肿瘤的某个患者而研制的瘤苗，即使对同一肿瘤的其它患者也无效。近年研究发现个体化肿瘤疫苗(瘤苗)极具临床应用前景[1,2,3,4]。但是，肿瘤细胞基因突变能形成能够成功诱导有效的特异性T细胞免疫的有效新抗原很少；患者个体间出现完全相同新抗原的概率很低[5]。即使个体间出现完全相同的新抗原肽，制约新抗原免疫应答的MHC分子又高度“个体化”，这种新抗原肽在个体间通用的概率极低；因此，群体通用的肿瘤新抗原肽疫苗几乎是不存在的。针对错选漏选率高；有的错选抗原肽甚至还可能有免疫抑制作用，筛选成本大，费时、费力。在之前的研究中，我们研发了一种快速筛选高效的新抗原肽的方法，较好地解决了这个问题。

本发明预测并合成外显子突变所形成的一批免疫有效的新抗原肽；合成富CpG序列的硫代非甲基化寡聚核苷酸作为疫苗佐剂；将筛选出的并已经合成的新抗原肽、富CpG序列的硫代非甲基化寡聚脱氧核苷酸和伽马干扰素按一定比例混合反应，制备针对该患者的抗癌疫苗。取该患者外周血，分离淋巴细胞，培养DC细胞，验证该疫苗的抗癌效果。目前国内外尚无类似研究发明。

参考文献：

[1]Ott PA,Hu Z,Keskin DB,Wu CJ.et al An immunogenic personalneoantigen vaccine for patients with melanoma.Nature.2017Jul13；547(7662):217-221.

[2]Sahin U,Derhovanessian E,Miller M1,et al Personalized RNA mutanomevaccines mobilize poly-specific therapeutic immunityagainstcancer.Nature.2017Jul13；547(7662):222-226.

[3]Robbins PF,Lu YC,El-Gamil M,et al.Mining exomic sequencing data toidentify mutated antigens recognized by adoptively transferred tumor-reactiveT cells.Nat Med.2013；19(6):747-752.

[4]Carreno BM,Magrini V,Becker-Hapak M,et al.Cancer immunotherapy.Adendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanomaneoantigen-specific T cells.Science.2015；348(6236):803-8

[5]Tran E,Robbins PF,Lu YC,et al.T-Cell Transfer Therapy TargetingMutant KRAS in Cancer.N Engl J Med 2016；375:2255-62.

发明内容

本发明根据患者的肿瘤全外显子测序结果及其所预测的新抗原肽，制备了该患者的肿瘤新抗原肽疫苗，通过大量的人体外抗癌免疫学实验，成功摸索出有效的个体化瘤苗的组成及其制备方法。

个体化肿瘤抗原肽疫苗及其制备方法，所述制备的步骤包括：a)对所述肿瘤细胞进行基因组全外显子测序，得到所述患者的全外显子突变数据集并预测相应的新抗原肽，根据我们研发的快速筛选高效的新抗原肽的方法，筛选并合成一批免疫有效的新抗原肽；b)合成富CpG序列的非甲基化硫代寡聚核苷酸作为疫苗佐剂；c)将筛选出的并已经合成的新抗原肽、富CpG序列的非甲基化硫代寡聚脱氧核苷酸和伽马干扰素按一定比例混合反应，制备针对该患者的抗癌疫苗。d)取该患者外周血，分离淋巴细胞，培养DC细胞，验证该疫苗的抗癌效果。

本发明的技术关键点与专利保护点是：1)免疫有效的个体化瘤苗的新抗原肽最少种类数；2)每种新抗原肽的形成有效免疫的首次接种剂量，即首次接种瘤苗中每种新抗原肽的量(每种新抗原肽因免疫原性不同而剂量不同)；3)瘤苗的佐剂：富CpG的非甲基化硫代寡聚脱氧核苷酸及其剂量、γ-干扰素及其剂量；4)新抗原肽、寡聚核苷酸与伽马干扰素的组成比例：5)瘤苗所依据的研究数据结果和几个关系曲线图。

附图说明

图1为本发明研究技术路线图。

图2为DC细胞培养过程照片。

图3为ELISPOT反应图。

图4为一条新抗原肽的合成纯度报告。

图5为另一条新抗原肽的合成纯度报告。

图6为不同免疫原性新抗原肽首次接种剂量与其T细胞活性关系示意图。

图7为不同淋巴细胞存留度的新抗原肽首次接种剂量与其T细胞活性关系示意图。

图8为佐剂DNA合成检测报告。

图9为实施例9中ELISPOT反应图。

图10为实施例10中细胞杀伤活性示意图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

实施例1本发明的研发方案与技术路线

核心技术路线参见图1。具体方案参见实施例2-8。

实施例2肿瘤的二代基因测序与新抗原肽预测

1.病例样本采集

经病理确诊的中晚期恶性肿瘤12例患者的肿瘤组织标本(其中肺癌2例、胃癌2例、结肠癌4例、恶性黑色素瘤2例及子宫平滑肌肉瘤2例)，患者签署知情同意书并经杭州师范大学医学伦理委员会批准；每例患者取15张腊块切片或相应量的新鲜活检标本，同时取外周血3ml作为该患者正常组织对照。蜡块标本经脱蜡处理后提取DNA；新鲜活检标本和外周血分别按各自基因组DNA提取试剂盒要求提取DNA；-20℃保存，一周内使用。

2.病例外显子测序

针对12例患者中的每一位分别独立进行如下操作：三种来源提取的DNA送上海慧算生物科技公司，使用Hiseq2500测序系统(Ilumina公司)进行人类全外显子基因组高通量测序。全外显子组双向测序将产生数亿条测序片段，要求针对每一个测序样本的目标捕获区平均测序深度为300×，芯片对目标区域测序覆盖度为99.12％。患者肿瘤全外显子基因测序结果12例患者，记录临床资料。

3.病例新抗原肽库的构建

通过BWA 0.7.17软件比对某患者肿瘤细胞的基因(外显子)和正常细胞的外显子基因高通量测序的原始数据，得到两者差异的数据集；联合使用GATK4.1.2和VarScan2.4.0软件，处理两者差异的数据集，对照正常人群SNP数据库，进行分析、识别、判断哪些差异(变异)是真实的肿瘤特有的外显子突变：(1)针对每一个测序的外显子，筛选出蜡块标本与新鲜活检标本中都存在，且外周血中不存在的人类SNP，视为该患者肿瘤组织中突变产生的SNP，将相应核酸序列转变成多肽序列，得到新抗原肽库；(2)针对每一个测序的外显子，筛选出蜡块标本与新鲜活检标本中序列一致且相对于外周血中存在突变的外显子突变序列集合，将正常人群SNP数据作为背景数据，扣除后得到该患者肿瘤特异性外显子突变序列集合，将相应核酸序列转变成多肽序列，得到新抗原肽库。共12例患者。

4.病例新抗原肽库的免疫原性分析

新抗原肽的预测基于抗原肽与MHC I分子抗原结合槽结合的属性---结合亲和力(用结合解离半衰期作为衡量亲和力的大小的指标)。使用美国NIH的BIMAS和NetCTL软件程序(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/)预测肿瘤抗原肽；其主要原理：获取与某一MHCI类分子结合的大量的多肽的结合解离半衰期，根据各多肽的半衰期长短建立多肽矩阵(肽池)，计算得出半衰期符合抗原肽标准的多肽；计算、比较各肽段的基于半衰期的预测分值，按得分高低列出所有可作CTL表位(可与TCR结合的)的多肽即新抗原肽库(其中绝大多数为低效或免疫抑制的)。

12例患者共计获得503种新抗原肽。每例患者的一组肿瘤新抗原肽，根据每种新抗原肽序列从网站(

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)查询各新抗原肽(来自肿瘤组织)的MHC I类分子亲和力得分；除以该抗原肽突变前的(来自同一患者外周血)，即野生型抗原肽的MHC I类分子亲和力得分，等于新抗原肽的MHC I类分子亲和力变化度得分(即：突变肽的亲和力/野生肽的亲和力)。

实施例3树突状细胞(DC)的制备

(一)分离外周血单个核细胞(PBMC)

分别针对每位患者进行操作，取患者的外周血，用EDTA采血管采血，每管约3ml。

1.取一支15ml离心管，加入3ml分离液(人全血单个核细胞分离液(FICOLL配置)，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号：LDS1075，下同)。

2.用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，400-650g，离心20-30min。

3.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴经细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

4.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向所得离心管中加入10ml PBS(磷酸缓冲盐溶液，GIBCO公司，货号：10010023，下同)，混匀细胞。

5.250g，离心10min。

6.弃上清。

7.用吸管以5ml PBS重悬所得细胞。

8.250g，离心10min。

9.重复6、7、8，弃上清后以1ml所配制的培养基(RPMI 1640培养液+10％胎牛血清+hGM—CSF 100ng/ml+hlL-4100ng/ml)重悬细胞。

10、调整细胞密度为3x10⁶/ml的PBMC，加入24孔板。

(二)配制培养基：RPMI 1640培养液+10％胎牛血清+hGM—CSF100ng/ml+hlL-4100ng/ml。

(三)培养过程：用所配培养基培养步骤(一)所得PBMC细胞于37℃、5％CO₂的培养箱中，设取血当天为D0天，约10小时候分离悬浮细胞和贴壁细胞分别继续培养，D3天时半量换液(可根据细胞状态调整换液时间)，约D5天时细胞分化为半悬浮状态时即为未成熟DC，根据培养板每孔DC等的数量，以每1x10⁴个DC分别加入：同一位患者的一种新抗原肽100μg相应加入非甲基化CpG佐剂(由上海生工合成)100μg及另一佐剂INF-γ50ng/ml，刺激未成熟DC，后继续培养24h，收获悬浮的成熟DC和全部PBMC作为混合DC。

制备过程的照片参见图2，其中，左图为去悬浮后贴壁单核细胞的照片，中图为呈簇生长的未成熟DC的照片，右图为悬浮生长的成熟DC的照片。

(四)混合DC刺激后收集全部细胞

取上述负载了抗原肽和不同佐剂的PBMC细胞1ⅹ10⁶个作为刺激细胞，即混合DC。在刺激细胞培养孔中加入上述新制备PBMC 5ⅹ10⁶个，以含80μg/L rhIL-2的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液继续培养。每7天应用混合DC重复刺激淋巴细胞1次，共培养14d。收集所有的细胞供后续的ELISPOT检测用。由新制备PBMC细胞作对照。采用同一患者的细胞。

实施例4ELISPOT法检测T细胞的活性

肿瘤疫苗治疗后，瘤苗中肿瘤新抗原(肽)在DC帮助下激活体内T淋巴细胞，后者活化形成特异性攻击含该抗原的肿瘤细胞的T淋巴细胞(CTL)，该T淋巴细胞的数量和功能状态(活性)常用ELISPOT法检测。

特异性CTL活性检测常用CTL表位检测法用胞内细胞因子染色和酶联免疫斑点法。酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunosPot assay,ELISPOT)是通过检测细胞因子来评价T淋巴细胞功能的特异性新方法，被广泛应用于监测肿瘤疫苗治疗前后抗原特异性T淋巴细胞的数量和功能状态。

(一)使用ELISPOT试剂盒(R&D公司，货号：EL3094)检测T细胞的活性，ELISPOT排板设计(参见如下表1)，每个细胞悬液设置2个复孔，如下表所示。由某患者某种新抗原肽制备的混合DC加上该患者新制备的PBMC(详见实施例3)。

表1

(二)试剂准备(以下试剂均为ELISPOT试剂盒中所有)：

1、洗涤缓冲液：如果浓缩物中已形成晶体，则温热至室温并轻轻混合直至晶体完全溶解。要制备洗涤缓冲液，将50mL洗涤缓冲液浓缩液[Wash Buffer concentrate(Part895308)]加入到450mL去离子水中并充分混合。

2、检测抗体：将100μL检测抗体浓缩物[Detection Antibody Concentrate(Part893005)]转移到小瓶标记的Dilution Buffer 1(Part 895307)中并充分混合。为获得最佳性能，在使用前立即准备检测抗体。

3、链霉抗生物素蛋白-AP：将100μL链霉抗生物素蛋白-AP浓缩物A[Streptavidin-AP Concentrate A(Part 895358)]转移到小瓶标记的Dilution Buffer 2(Part 895354)中并充分混合。为获得最佳性能，在使用前立即制备链霉抗生物素蛋白-AP。

(三)具体步骤：

1.用200μL无菌培养基(RPMI 1640培养液+10％胎牛血清)填充微孔板中的所有孔，并在室温下孵育约20分钟。

2.细胞准备好接种时，从孔中吸出培养基。立即向每孔加入200μL约2×10⁵的细胞。

3.将细胞在37℃，5％CO₂恒温培养箱中孵育24小时。

4.吸出每个孔中的细胞并洗涤，重复该过程三次，总共洗涤四次。使用喷射瓶，歧管分配器或自动洗涤器，用洗涤缓冲液(250-300μl)填充每个孔进行清洗。在每个步骤完全去除液体对于良好的性能是必不可少的。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去任何剩余的洗涤缓冲液。翻转平板并用干净的纸巾擦干。注意：调整歧管分配器或自动装置的尖头高度，以防止损坏膜。

5.向每个孔中加入100μL稀释的检测抗体，并在2-8℃下孵育过夜。

6.重复步骤4。

7.向每个孔中加入100μL稀释的链霉抗生物素蛋白-AP并在室温下孵育2小时。

8.重复步骤4。

9.向每个孔中加入100μLBCIP/NBT色原并在室温下孵育1小时。避光操作。

10.从微孔板中弃去色原溶液，用去离子水冲洗微孔板。翻转微孔板并轻敲以除去多余的水。从微孔板底部取下柔性塑料排水管，用纸巾彻底擦拭底板，并在室温(60-90分钟)或37℃(15-30分钟)内完全干燥。

实施例5免疫有效新抗原肽的合成

免疫有效新抗原肽的合成委托相关生物公司(杭州丹港生物科技公司)完成，纯度达到大于99％。合成了12例患者中的6例病人的260种新抗原肽，个例情况参见图4和图5。

实施例6免疫有效新抗原肽的首次接种瘤苗中剂量的确定

通过本发明的对12例患者中的6例外周血淋巴细胞总数正常范围的病人的260种新抗原肽的免疫学实验研究，建立了各种新抗原肽在首次接种瘤苗中的剂量与其特异性抗癌免疫效应强度之间的关系以及每种新抗原肽的免疫原性强弱对其影响；以实施例4中ELISPOT检测的T细胞活性值代表特异性抗癌免疫效应。其中，新抗原肽接种活化的是同一患者的T细胞。

研究发现淋巴细胞存留度影响新抗原肽的最小首次接种剂量；对于外周血常规检测结果中淋巴细胞总数与其之前相比变化较小的患者，即淋巴细胞存留度(当前淋巴细胞总数/健康时淋巴细胞总数)为>50％时，各肽最小首次接种剂量范围为200--300微克，反之，淋巴细胞存留度为<50％时，各肽最小首次接种剂量范围为400--500微克。亚组分析还发现，预测的免疫原性较强组的最小首次接种剂量范围为200--300微克，较弱组的剂量范围为：400--500微克。

弱免疫原性新抗原肽首次接种量与其T细胞活性的关系参见表2与图6中的曲线1；强免疫原性新抗原肽首次接种量与其T细胞活性的关系参见表3和图6中的曲线2。

新抗原肽首次接种量与其T细胞活性的关系(n＝160，淋巴细胞存留度＞50％)参见表4和图7中曲线1；

新抗原肽首次接种量与T细胞活性的关系(n＝100，淋巴细胞存留度≤50％)参见表5和图7中曲线2。

表2弱免疫原性新抗原肽首次接种量与其激活的T细胞活性的关系(n＝200)

首次次接种剂量(微克)	T细胞活性
		50	5.0
100	10.0
		200	15.0
300	25.0
		400	62.0
500	65.5
		600	66.0
700	65.0
		800	60.0
1000	55.0

表3强免疫原性新抗原肽首次接种量与其激活的T细胞活性的关系(n＝60)

首次接种剂量(微克)	T细胞活性
		50	5.0
100	18.0
		200	76.0
300	85.0
		400	83.0
500	85.0
		600	81.0
700	78.0
		800	79.0
1000	80.0

表4新抗原肽首次接种量与其激活的T细胞活性的关系(n＝160，淋巴细胞存留度＞50％)

首次接种剂量(微克)	T细胞活性
		50	10
100	30
		200	71.0
300	76.0
		400	80.0
500	78.0
		600	80.0
700	76.0
		800	81.0
1000	82.0

表5新抗原肽首次接种量与其激活的T细胞活性的关系(n＝100，淋巴细胞存留度≤50％)

首次接种剂量(微克)	T细胞活性
		50	5.0
100	8.0
		200	12.0
300	15.0
		400	42.0
500	39.0
		600	40.0
700	38.0
		800	37.0
1000	37.0

从表2-5和图6-7可以看出，外周血淋巴细胞总数减少的患者，各新抗原肽的最小首次接种量增大；预测免疫原性较强的新抗原肽最小首次接种量较小。弱免疫原性新抗原肽首次接种量在300微克左右，T细胞活性将不随抗原肽增加而增强；强免疫原性新抗原肽首次接种量在400微克左右，T细胞活性将不随抗原肽增加而增强。

淋巴细胞存留度＞50％时，新抗原肽首次接种量在300微克左右，T细胞活性将不随抗原肽增加而增强；淋巴细胞存留度≤50％时，新抗原肽首次接种量在400微克左右，T细胞活性将不随抗原肽增加而增强。

实施例7个体化瘤苗的佐剂制备

选择TLR9的激动剂---富CpG的全硫代非甲基化寡聚脱氧核苷酸作为佐剂之一，设计出其分子式:5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT GGG G-3’(SEQ ID NO.1)。合成并全硫代修饰该非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸，一次合成20mg，约等于606OD。选择市售的人γ-干扰素也作为部分个体化瘤苗的佐剂之一，每次接种瘤苗中加1000单位。

实施例8个体化瘤苗的制备步骤

预实验发现，为避免结晶析出，瘤苗的容积又为患者实际接种所允许(一般不超过2毫升)，个体化瘤苗所含的新抗原肽种类数和每种肽剂量受到了限制，一般选取相对有效的新抗原肽不超过20种；为获得最大特异性抗癌免疫效应，又需按照我们前一专利中的有效抗原肽快速筛选原理，筛选尽可能多的新抗原肽制备瘤苗。每种新抗原肽采取最小有效接种量：即淋巴细胞存留度>50％时，各肽最小首次接种剂量范围为200--300微克，存留度为<50％时，各肽最小首次接种剂量范围为400--500微克。预测的免疫原性较强的新抗原肽最小首次接种剂量范围为200--300微克，较弱的新抗原肽剂量范围为：400--500微克。

采用实施例4中记载的ELISPOT法检测T细胞的活性的方法进行测试，每种新抗原肽根据其预测的免疫原性的强弱、患者淋巴细胞的存留度确定其首次接种量，例如，某患者淋巴存留度80％，全外显子测序预测的MHC I类分子递呈的新抗原共60种，从中筛选出拟作为瘤苗的新抗原肽15种，其中6种的免疫原性处于全部新抗原中前10％，这6种新抗原肽作为免疫原性较强组，每种肽200微克作为首次接种的该抗原肽量，其余为较弱组，每种肽400微克作为首次接种的该抗原肽量。将上述15种新抗原肽以各种肽首次接种量混合，在混合液中按每种肽加CpG佐剂100微克(共1500微克)，然后添加或不添加伽马干扰素1000单位，以生理盐水定容至1.5毫升，37度水浴30分钟后得到所述肿瘤个体化疫苗。室温保存备用2小时。

实施例9疫苗的特异性免疫活性测试

取该患者外周血，分离淋巴细胞，培养DC细胞，验证该疫苗的抗癌效果，参见“实施例3树突状细胞(DC)的制备”；疫苗与单一抗原肽两者的特异性免疫活性测试法不同点在其中的“(三)培养过程”。疫苗的免疫活性测试的“(三)培养过程”应是如下：用所配培养基培养步骤(一)所得PBMC细胞于37℃、5％CO₂的培养箱中，设取血当天为D0天，约10小时候分离悬浮细胞和贴壁细胞分别继续培养，D3天时半量换液(可根据细胞状态调整换液时间)，约D5天时细胞分化为半悬浮状态时即为未成熟DC，根据培养板每孔DC等的数量，以每1x10⁴个DC分别加入同一位患者的制备好的个体化疫苗0.3毫升(参照单一抗原肽的检测所需最少的肽与CpG佐剂剂量，选择1/2、1/4、1/8疫苗首次接种量)，刺激未成熟DC，后继续培养24h，收获悬浮的成熟DC和全部PBMC作为混合DC细胞。混合DC细胞重复2次刺激新制备的PBMC后收集全部细胞，供后续ELISPOT检测疫苗激活的特异性细胞免疫活性，即T细胞免疫活性(详见实施例4)，和对肿瘤细胞的免疫抑杀作用的测试(详见实施例10)。同时，在同一培养检测体系中，按照实施例3和实施例4，检测该疫苗中每一种新抗原肽激活的特异性细胞免疫活性(T细胞活性)，详见表6、图9。

表6疫苗及其新抗原肽与其激活的T细胞活性(淋巴细胞存留度>50％)

疫苗或肽	1/2首量	1/4首量	1/8首量	肽1	肽2	肽3	肽4	肽5	肽6	肽7
											T细胞活性	196	111	47	78	77	76	73	72	76	74
疫苗或肽	肽8	肽9	肽10	肽11	肽12	肽13	肽14	肽15	佐剂	PBS
											T细胞活性	70	74	80	79	75	75	76	78	27	15

实施例10个体化瘤苗对肿瘤细胞的免疫抑杀作用

取同一患者的新鲜活体肿瘤组织，挑选活力较好的部位活检取肿瘤组织，置于平皿中，用Hank's液/PBS缓冲液洗涤3次，剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块(1-2mm)，再用Hank's液/PBS缓冲液洗涤3次，转移至50ml离心管中。加入5倍的0.25％胰酶液，37℃消化20-40min，每5min用吸管吹打1次，使细胞分离。加入2-5ml含血清RPMIl640培养基，以终止胰酶消化作用，静置2-3min，使未分散的组织块下沉，将悬液转移到新的离心管中。用200目尼龙网过滤悬液2次，1000rpm离心5-10min，弃上清液。加入Hank's液/PBS缓冲液5ml，冲散细胞，再次离心，弃上清液。加入l-2mlRPMIl640培养液将沉淀细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃培养。细胞贴壁密度大于90％

时，用胰酶消化，按1:5比例进行传代到新的培养瓶。用反复贴壁法去除成纤维细胞：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，结合使用不加血清营养液传代，使细胞悬液反复贴壁而分离两类细胞。

以此患者的活肿瘤细胞悬液作为靶细胞，以实施例9中的混合DC重复刺激新制PBMC后收集的全部细胞，作为效应细胞。按效、靶细胞比25:1和50:1混合后培养8h，收集上清液以乳酸脱氢酶释放法(LDH)测定效应细胞(主要CTL)对肿瘤细胞的免疫抑杀活性。细胞杀伤活性％

＝100×(E—ES—TS)/(TM—TS)，E：杀伤检测孔OD值；ES：效应细胞酶自然释放孔；TS：靶细胞酶自然释放孔OD值；TM：靶细胞最大释放孔OD值。

细胞杀伤活性参见表7和图10。

表7细胞杀伤活性统计表

小结：

本发明公开一种个体化肿瘤抗原肽疫苗及其制备方法，所述制备的步骤包括：a)对所述肿瘤细胞进行基因组全外显子测序，得到所述患者的全外显子突变数据集；据此，预测并合成外显子突变所形成的一批免疫有效的新抗原肽；b)合成富CPG序列的硫化寡聚核苷酸作为疫苗佐剂；c)将筛选出的并已经合成的新抗原肽、富CPG序列的寡聚脱氧核苷酸和伽马干扰素按一定比例混合反应，制备针对该患者的抗癌疫苗。d)取该患者外周血，分离淋巴细胞，培养DC细胞，分离和原代培养患者肿瘤细胞，验证该疫苗的抗癌效果。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种个体化肿瘤抗原肽疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(i)对患者的肿瘤细胞与正常细胞分别进行全外显子测序，获得所述患者的肿瘤细胞中的新抗原肽；

(ii)选取所述新抗原肽的1-30中任意种作为混合抗原肽，添加免疫佐剂，形成个体化肿瘤抗原肽疫苗；

所述步骤(i)包括：

a)获取同一患者的肿瘤细胞与正常细胞；

b)对所述肿瘤细胞进行全外显子基因测序，得到所述患者的肿瘤全外显子数据集，对所述正常细胞进行全外显子基因测序，得到所述患者的正常全外显子数据集；

c)对比所述肿瘤全外显子数据集与所述正常全外显子数据集，得到所述患者的所述肿瘤全外显子数据集中特有的外显子数据，形成所述患者的突变全外显子数据集；将所述正常全外显子数据集与所述突变全外显子数据集对应的外显子的集合称作对照全外显子数据集；

d)对比所述突变全外显子数据集与正常人群SNP数据库，得到所述正常人群SNP数据库中不存在的所述突变全外显子数据集的子数据集，形成所述患者的突变外显子数据集；将所述突变外显子数据集翻译成肽，形成突变抗原肽数据集；将所述对照全外显子数据集中与所述突变外显子数据集对应的所有外显子翻译成肽，形成对照野生抗原肽数据集；

e)针对所述突变抗原肽数据集中每一条突变多肽，将所述对照野生抗原肽数据集中对应的多肽称作对照野生多肽，比较所述突变多肽的MHCI亲和力与所述对照野生多肽的MHCI亲和力，得到所述突变多肽的MHCI类分子亲和力变化度得分，得到亲和力变化度得分数据集；

f)计算所述患者外周血淋巴细胞存留度，依据淋巴细胞存留度与高T细胞活性的突变抗原肽MHCI亲和力变化度得分的关系，确定高T细胞活性的突变抗原肽的MHCI亲和力变化度区间，其中，患者外周血淋巴细胞存留度是通过健康和患病时淋巴细胞数对比计算得出的，新抗原肽激活的T细胞活性是通过ELISPOT方法进行的，当淋巴细胞存留度为100％时，MHCI亲和力变化度在0.4-4区间；

g)将所述患者处于所述变化度区间的突变抗原肽筛选为对所述患者免疫有效的突变抗原肽，称作新抗原肽，供个体化疫苗制备。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂为TLR9的激动剂和伽马干扰素。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：

当使用ELISPOT法检测T细胞的活性来评价所述新抗原肽免疫原性时，每孔使用所述新抗原肽200-400微克，所述TLR9的激动剂30-60微克，伽马干扰素700-1500单位。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述TLR9的激动剂为富CpG序列的硫化非甲基化寡聚脱氧核苷酸。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述筛选的步骤还包括：所述肿瘤选自肺癌、胃癌、结肠癌、恶黑及肉瘤。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)是通过BWA软件实现的；和/或

步骤d)是采用GATK和VarScan软件联合实现的；和/或

步骤e)中，基于抗原肽的MHCI分子结合属性与结合解离半衰期，用BIMAS程序和NetCTL软件预测抗原肽与MHCI分子结合的新抗原肽：通过肽池测序法获得大量的与某一MHCI类分子结合的多肽的解离半衰期，建立半衰期矩阵，比较各肽段的预测分值，按得分高低列出所有可能作为CTL表位的新抗原肽，即得新抗原肽库。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e)为：

根据多肽序列从网站查询各突变多肽的MHCI类分子亲和力分除以于所述突变多肽对应的对照多肽的MHCI类分子亲和力分，等于所述突变多肽的MHC I类分子亲和力变化度得分，网址为：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/。

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