CN111647563A - 靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种负载Survivin全抗原的DC细胞，其是将编码survivin全蛋白抗原的基因序列克隆至慢病毒载体上，用以转染可扩增树突状细胞，得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。本发明进一步将负载Survivin全抗原的DC细胞与自体来源的PBMC细胞混合培养，获得大量高活性CTL细胞。通过杀伤实验表明，此群CTL细胞可高效杀灭携带survivin抗原的靶细胞，且其杀伤作用与HLA分子的匹配程度成正相关。

Description

靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体而言，是关于一种靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。
背景技术
Survivin属于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族成员，具有抑制细胞凋亡和调控细胞有丝分裂的双重功能，它是调控细胞周期和细胞凋亡的重要分子。已知survivin蛋白在多种肿瘤组织内呈现高表达的状态。研究表明，survivin在泌尿系统恶性肿瘤（膀胱癌，前列腺癌，宫颈癌，肾癌）中，其表达量与肿瘤恶性程度呈正相关。同时，研究发现Survivin在结直肠癌组织中的表达阳性率均明显高于癌旁正常组织，且与淋巴结转移呈正相关。在腺癌组织中，survivin表达与肿瘤细胞的分化程度呈负相关。这些信息提示survivin出现在肿瘤细胞的恶性转化早期，并在癌症恶化中起着重要的促进作用。因在肿瘤发生发展中的作用以及在癌组织中的高表达状况，survivin成为肿瘤治疗的潜在靶点。
针对survivin蛋白的抗原多肽的研究目前主要集中在个别HLA位点限制性的几个多肽片段的研究，例如HLA-A2、HLA-A3、HLA-A1、HLA-A11、HLA-B35等位点与预测的多肽之间的研究。其基本的研发目标是寻找新的多肽-MHC位点，通过亲和力和杀伤活性的验证，将该多肽序列用于下一步的应用开发或将与多肽匹配的MHC克隆，应用于TCR-T等技术的开发。曾有学者通过腺病毒携带survivin全长序列转染DC细胞，然而并没有关于此技术survivin表达情况的现有技术报道。
鉴于上述方法在实际应用中效用不佳以及高额的经济支出、时间成本以及结果的不确定性，研发新的效用强且资金、时间消耗低的针对Survivn靶点的T细胞疗法十分有必要。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的针对Survivn靶点的细胞免疫治疗技术。
为达上述目的，本发明提供了一种靶向Survivin全蛋白抗原的DC细胞。
由此，本发明首先提供了一种靶向survivin整个蛋白抗原的方法，将survivin全长基因序列插入到慢病毒载体上，通过慢病毒转染的方式使DC细胞负载并呈递survivin的各种多肽片段。进一步，本发明使所得负载survivin的DC细胞与HLA部分匹配或完全匹配的PBMC细胞进行共培养，以得到survivin抗原特异性的T细胞群，该群T细胞是涵盖多个抗原肽位点的T细胞的组合物，经验证具有高效的杀伤作用。
本发明中，由于是将编码survivin蛋白全长的基因序列通过慢病毒转染负载于DC细胞，因此称转染后的DC细胞为负载survivin全抗原的DC细胞。
从而，一方面，本发明提供了一种负载Survivin全抗原的DC细胞（DC-Survivin细胞）。在本发明的具体实施方案中，其是将编码survivin全蛋白的基因序列克隆至慢病毒载体上转染DC细胞而得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的负载Survivin全抗原的DC细胞中，所述Survivin全蛋白包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。优选地，所述编码survivin全蛋白的基因序列包括SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供了所述的负载Survivin全抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：
构建含有编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，转染可扩增树突状细胞，得到呈递survivin全抗原的DC细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明中所用的慢病毒载体例如可以是pCDH系列、pLVX系列载体。
根据本发明的具体实施方案，本发明中所用的DC细胞为可扩增树突状细胞。可以采用商购的具有可扩增性能的DC细胞，也可以按照现有技术记载的方法自行制备具有可扩增性能的DC细胞，例如，可将PBMC经PHA刺激后，经STLV1-4病毒中任一病毒的Tax基因转导后筛选得到DC细胞，该DC细胞即可具有可扩增性能，可以进一步培养扩增。本发明中对DC细胞的其他性能无特殊要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明的负载Survivin全抗原的DC细胞的制备方法中，所述编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因为具有SEQ ID No. 1所示序列的多核苷酸。
根据本发明的具体实施方案显示，本发明的Survivin全抗原在DC细胞内的稳定、高效表达。区别于现有方法选择survivin蛋白内部一个或几个预测的可以和某一种HLA分子结合的多肽作为靶点，本法通过DC细胞自身表达、加工并形成的多肽-MHC的复合物，涵盖了该DC细胞所有HLA分子针对survivin蛋白的所有可能的多肽-MHC组合，最终使该DC疫苗或由其诱导生成的CTL细胞具备靶点多样性，有利于对癌细胞的彻底清除。
本发明的方法制备的DC-Survivin细胞，不仅可以用于自体T细胞的诱导，还可以用于诱导异体配型的T细胞。在本法中验证的是HLA-0201和HLA-A2402两种类型，其中HLA-A0201在中国人群中的占比为18-45%，HLA-2402在人群中的占比为25%，而同时表达HLAA0201和HLA-A240的人群约为11.5%。这些人群应用本法中的异体DC细胞理应取得一定的效果。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的携带survivin全抗原的DC细胞可制备为癌症治疗性疫苗，针对survivin阳性的各类癌症。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的携带survivin全抗原的DC细胞，在体外诱导的survivin特异性细胞毒T细胞，用于过继性T细胞治疗癌症。
另一方面，本发明还提供了所述的负载Survivin全抗原的DC细胞在制备Survivin蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种免疫细胞，其是由本发明的负载Survivin全抗原的DC细胞诱导产生的。
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫细胞包括CTL细胞；
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫细胞是由本发明所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养获得的。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合培养。优选地，可向培养体系中加入200~1000unit/ml的白介素2。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括：编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因或扩增该基因的引物，含有编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，和/或本发明所述的负载Survivin全抗原的DC细胞。所述试剂盒还可包括转染试剂或所属领域中的常规试剂等。本发明的试剂盒可用于制备所述的Survivin蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物。
综上所述，本发明提供了一种靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。区别于现有方法选择survivin蛋白内部一个或几个预测的可以和某一种HLA分子结合的多肽作为靶点，本发明的方法通过DC细胞自身表达、加工并形成的多肽-MHC的复合物，涵盖了该DC细胞所有HLA分子针对survivin蛋白的所有可能的多肽-MHC组合，最终使该DC疫苗或由其诱导生成的CTL细胞具备靶点多样性，有利于对癌细胞的彻底清除。本发明的方法在验证时，仅选择了两条HLA-A匹配的靶细胞，而DC-CTL全自体体系产生的CTL细胞，其能够发挥作用的还包括HLA-B、C等位点。因此，理论上说，所产生的杀伤效用会高于本法已经产生的效用。
附图说明
图1显示本发明的DC细胞负载并表达Survivin抗原检测结果。
图2显示DC-Survivin诱导产生的免疫细胞类型检测结果。
图3显示DC-Survivin诱导扩增免疫细胞数量的检测结果。
图4显示分选后的细胞免疫表型鉴定结果。
图5显示靶细胞流式分析实验结果。
图6显示靶细胞Survivin抗原表达检测结果。
图7显示DC-Survivin诱导产生的CTL细胞对靶细胞的杀伤作用的实验结果。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1、负载Survivin抗原的DC细胞和靶细胞
本实施例中按照以下操作制备了负载Survivin全抗原（氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示）的DC细胞和靶细胞。
1、设计引物，PCR克隆Survivin基因，构建慢病毒载体
（1）根据NCBI nucleotide内公布的Survivin核酸序列（SEQ ID No. 1），本发明中，设计引物并委托第三方进行合成。所设计的引物序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
Survivin核酸序列（SEQ ID No. 1）：
ATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGAATTTGAGGAAACTGCGAAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGGCTGCCATGGATTGA
Survivin氨基酸序列（SEQ ID No. 2）：
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD*
引物序列：
5’-CGCGGATCCGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCC（SEQ ID No. 3）
3’-GGCTCTAGATCAATCCATGGCAGCCAGCTGCTC（SEQ ID No. 4）。
（2）TE缓冲液溶解引物，稀释至工作浓度备用。以癌细胞PANC-1的mRNA反转录后获得cDNA为模板，设置PCR体系，对survivin基因进行PCR。
（3）PCR产物与6×loading buffer混合，1%琼脂糖凝胶上样，130V，35min。切割目的条带并进行胶回收。
（4）分别用BamHI和XbaI位点对胶回收产物以及载体质粒进行双酶切，37℃，2h。
（5）将酶切后产物跑胶，分别切割PCR产物片段以及载体得大片段，胶回收，按照摩尔比载体：片段=1：3进行连接，常温静置2小时。
（6）连接产物加入到50μl stbl3感受态内混匀，冰上放置20min。42℃，热激90s。迅速放回冰上，静置2min。
（7）向EP管内加入500μl LB液体培养基，置于37℃摇床内，180rpm，30min。
（8）取出转化后感受态细胞，5000rpm，3min。弃大部分上清，留底部100μl LB培养基以重悬菌液。将菌液转移至LB固体培养基平板上，涂布均匀。
（9）37℃培养箱，培养过夜。
（10）次日，挑取单克隆摇菌。
（11）收集菌体，按照质粒小提试剂盒的说明书，提取质粒。
（12）所得质粒以及商业化pCDH慢病毒骨架载体，分别用BamH1和XbaI进行双酶切，跑胶验证。
（13）取条带位置正确的克隆质粒，送第三方测序。
（14）测序显示正确后，取目的质粒大提，备用。
2、Survivin抗原、荧光素酶（luciferase）、HLA等分子慢病毒包装及浓缩
（1）复苏293细胞，培养传代。
（2）转染前一天胰酶消化，按照5×106个细胞/皿接种于10cm培养皿内，37℃，培养过夜。
（3）转染：慢病毒包装质粒与目的基因载体按照1:1质量比混合，加入转染试剂，质量比:质粒=3:1，室温放置30min。
（4）用RPMI1640培养基替换培养皿内的培养基，将转染混合液轻轻加入培养皿内，轻柔混匀。
（5）4小时后，弃转染上清，替换成含FBS的培养基继续培养细胞。
（6）分别于24小时、48小时和72小时收集病毒。
（7）加入病毒浓缩液，混匀后4℃冰箱静置过夜。
（8）3000rpm，4℃，1小时，弃上清，按照原体积1/10的量加入新鲜培养基重悬病毒，分装后储存于-80℃冰箱。
3、靶细胞构建、DC细胞和靶细胞负载Survivin抗原
（1）NIH 3T3细胞按照5×105个细胞接种于6孔板内，贴壁3小时。配制500μl浓缩后的luciferase病毒液+500μl完全培养基+1μl 10mg/ml 聚凝胺（polybrene）混合液，加入到细胞内培养过夜；
（2）次日早上，更换新鲜培养基培养细胞。下午，再次替换培养基，继续用luciferase病毒混合液进行二次转染。
（3）按照（1）和（2）的步骤再次转染β2M病毒，得到3T3L细胞。
（4）消化并按照5×105个3T3L细胞接种于6孔板内，分别转入HLA-2402, HLA-0201以及HLA2402+HLA A0201病毒，各组细胞均转染3次，后经流式检测HLA分子表达情况。
（5）分别取2-5×106个DC细胞（CelArtics®–DC细胞）或5×105个靶细胞（3T3L、3T3L HLA-A2402、3T3L HLA-A0201 以及3T3L HLA-A224）接种于6孔板内。
（6）配制浓缩后的Survivin病毒液+1μl 10mg/ml polybrene混合液，加入到细胞内培养过夜。
（7）次日早上，更换新鲜培养基培养细胞。下午，再次替换培养基，继续用Survivin病毒混合液进行二次转染。
（8）重复步骤（6），培养细胞至足够数量。
（9）配制10% SDS PAGE胶备用。
（10）收集慢病毒转染后的靶细胞，同时收集转染Survivin前的3T3L细胞作为对照。
（11）根据细胞总量加入一定比例的蛋白裂解液，冰上裂解细胞。
（12）裂解后蛋白经95℃高温煮20min，备用。
（13）蛋白上样，80V，30min。120V，60min。
（14）转膜，300mA，60min。
（15）一抗孵育，置于4℃摇床上过夜。
（16）次日，PBST洗涤膜3次，孵二抗，室温，1小时。
（17）PBST细膜3次。加入ECL发光液，曝光。
（18）数据整理及分析。
本实施例中，为验证DC负载Survivin抗原后的表达情况，取部分原始DC细胞以及转入抗原的DC细胞，经裂解后通过western blot检测细胞内Survivin蛋白的表达情况。结果如图1所示，经慢病毒转染后第4天，可检测到DC细胞内Survivin蛋白的阳性表达，可用于后续验证。
靶细胞HLA分子表达的流式分析结果参见图5。NIH3T3先后放入Luciferase基因、β2M基因后，分别或联合放入HLA- A2402、HLA-A0201等基因，通过流式分析检测HLA-A2402和HLA-A0201的表达情况。由图可知，95%以上的NIH3T3细胞表面检测到HLA-A2402和HLA-A0201分子的表达。
为验证靶细胞Survivin抗原表达情况，取部分3T3L系列的靶细胞，经裂解后通过western blot检测各细胞内Survivin蛋白的表达情况。结果如图6所示，3T3L系列的每种靶细胞均表达Survivin蛋白，且表达水平相当，可用于后续验证。
实施例2、DC-Survivin诱导扩增免疫细胞
本实施中，采用DC-Survivin诱导扩增免疫细胞，制备过程主要包括：
（1）取负载抗原的DC细胞和自体PBMC细胞，计数。
（2）用含5%人血清的X-VIVO培养基，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合DC细胞和PBMC细胞，静置培养过夜。
（3）次日，向培养体系内加入200~1000unit/ml的白介素2，混合后培养。
（4）根据细胞生长状况，添加适量的培养基和白介素2。
（5）第12-14天时，收集部分细胞进行流式分析。
（6）取1-5×105个细胞，2500rpm，离心5min。
（7）PBS洗涤2次，2500rpm，离心5min。
（8）向细胞内加入100μl 含BSA的封闭液，冰上封闭10-15min。
（9）将细胞分成两份，一份加入CD3+CD56抗体，另一份加入两个抗体的同型对照抗体，冰上孵育30min。
（10）PBS洗涤3次，2500rpm，5min。
（11）500μl PBS重悬细胞，过滤后上流式细胞仪检测。
（12）检测结果显示CD3-CD56-区域细胞少于3%时，收集部分细胞进行磁珠分选，另一部分细胞继续培养至21天，记录免疫细胞扩增倍数。
（13）根据细胞密度和CD3细胞比例，取足量的细胞置于15ml离心管内，1000rpm，3min。
（14）弃上清，PBS洗涤，1000rpm，3min。
（15）弃上清，500μl X-VIVO15培养基重悬细胞，加入100μl CD3磁珠，混匀。
（16）放置细胞悬液于摇床上，室温，低速运行15min。
（17）向细胞悬液内加入5mlPBS，充分颠倒混匀后置于磁力架上，静置2min。
（18）小心将上清转移至干净的15ml离心管内，将原离心管从磁力架上取下，加入5ml PBS，颠倒混匀以洗涤磁珠。
（19）重复（18）步骤1次。
（20）用含5% 人血清的X-VIVO15培养基重悬磁珠，加入500unit/ml IL2，置于6孔板内培养过夜。
（21）收集孔板内磁珠于离心管内，充分吹打磁珠，置于磁力加上以使T细胞和磁珠分离。
（22）收集并合并上清，1000rpm，5min。
（23）用含5% 人血清的X-VIVO15培养基继续培养细胞3-5天，用于后续研究。
本实施例中，检测了DC-Survivin诱导产生的免疫细胞类型。用DC-Survivin细胞（HLA-A0201+HLA-A2402）与自体PBMC细胞按照1:300比例共培养，培养基为含5%自体血浆的X-VIVO15，每日按照培养基总体积添加500 unit/ml IL2。分别于诱导后的第14天和第21天，取少量细胞进行流式分析，检测扩增的免疫细胞的类型。结果如图2所示，在第14天时，免疫细胞内包含CD3+的T细胞、CD56+ NK细胞以及部分CD3+CD56+细胞。在第21天时，NK细胞的比例显著增加，细胞状态良好。
本实施例中，将DC-Survivin细胞与自体PBMC细胞按照1：300比例进行共培养，培养基为含5%自体血浆的X-VIVO15，每日按照培养基总体积添加500 unit/ml IL2进行培养。实验结果参见图3，结果表明，在本培养体系下，免疫细胞增殖良好，细胞形态饱满，健康。第21天时，细胞扩增了1000倍以上。
本实施例中，在DC-Survivin与PBMC细胞按照1:300比例共培养，培养基为含5%自体血浆的X-VIVO15，每日按照培养基总体积添加500 unit/ml IL2。共培养至第11天时，取部分免疫细胞，用CD3磁珠进行分选以获取T细胞。分离磁珠上的T细胞并继续培养，于以经western blot的第14天时用流式检测分选出的T细胞的纯度。由图4可知，分选后，CD3+的细胞比例达95%，可用于后续研究。
实施例3、Survivin抗原特异性CTL细胞对靶细胞的杀伤作用
本实施例中，考察了Survivin抗原特异性CTL细胞对靶细胞的杀伤作用。相关方法包括如下操作：
（1）消化靶细胞3T3L/Survivin、3T3L/2402/Survivin、3T3L/224/Survivin，计数，按照5x104个细胞/孔接种于24孔板内，贴壁2-3小时；
（2）细胞计数，按照效应细胞：靶细胞分别为1:1,2:1,5:1和10:1的比例将效应细胞加入到靶细胞内，混合培养4小时；
（3）吸弃悬浮的T细胞，PBS轻柔洗涤1~3次以去除漂浮的死亡靶细胞，吸干孔内液体；
（4）每孔加入100μl的细胞裂解液，冰上裂解，使细胞释放出luciferase蛋白；
（5）转移裂解液至1.5ml EP管内，3000rpm，离心3min；
（6）取luciferase报告基因底物100μl加至酶标板内，分别取裂解液上清20μl加入底物中；
（7）样品上机检测，根据荧光强度计算靶细胞杀伤效率。
本发明的技术方案，3T3L细胞经Survivin和HLA A0201和HLA-A2402表达检测后，即可用于T细胞的杀伤效果检测。按照效靶比为1:1，2：1，5：1和10:1的条件进行三种靶细胞的杀伤测试，结果如图7所示，CTL细胞对于不表达HLA分子的3T3L/Survivin细胞杀伤作用较弱，效靶比10：1状况下的杀伤可能由CTL细胞中少量的NK细胞引起。CTL细胞展现出很强的针对表达HLA-A2402和survivin的靶细胞的杀伤作用，10：1比例下的杀伤作用达50%以上，杀伤效果强。并且，在靶细胞同时表达HLA-A2402和HLA-0201时（3T3L/A224/Survivin），可发现CTL细胞对靶细胞的杀伤作用更强，具有统计学差异。该结果说明， HLA分子匹配的数量越高，CTL细胞的杀伤作用越强。
序列表
<110> 北京翊博普惠生物科技发展有限公司
<120> 靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
<130> GAI20CN3664
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 429
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(429)
<400> 1
atg ggt gcc ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt ctc aag gac 48
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
cac cgc atc tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc 96
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
tgc acc ccg gag cgg atg gcc gag gct ggc ttc atc cac tgc ccc act 144
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag ctg 192
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa aag cat 240
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
tcg tcc ggt tgc gct ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt gaa gaa tta 288
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga gcc aag aac aaa 336
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag gaa act gcg 384
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
aag aaa gtg cgc cgt gcc atc gag cag ctg gct gcc atg gat tga 429
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 3
cgcggatccg gtgccccgac gttgccccct gcc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggctctagat caatccatgg cagccagctg ctc 33

Claims (11)

1.一种负载Survivin全抗原的DC细胞，其是将编码survivin全蛋白的基因序列克隆至慢病毒载体上转染可扩增DC细胞而得到的呈递survivin全抗原的DC细胞。
2.根据权利要求1所述的负载Survivin全抗原的DC细胞，其中，所述Survivin全蛋白包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的负载Survivin全抗原的DC细胞，其中，所述编码survivin全蛋白的基因序列包括SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。
4.权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：
构建含有编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，转染可扩增DC细胞，得到呈递survivin全抗原的DC细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。
6.权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞在制备Survivin蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。
7.一种免疫细胞，其是由权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞诱导产生的，所述免疫细胞包括CTL细胞，其中CD3+的细胞比例达95%。
8.根据权利要求7所述的免疫细胞，该免疫细胞是由权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养获得的；
所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合培养。
9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其中，所述的负载Survivin全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，培养体系中加入200~1000unit/ml的白介素2进行混合培养。
10.权利要求7-9任一项所述的免疫细胞在制备具有杀灭携带Survivin抗原的靶细胞的试剂中的应用。
11.一种试剂盒，其包括：含有编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基因的慢病毒载体，和/或权利要求1-3任一项所述的负载Survivin全抗原的DC细胞。
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