CN110093351B - 可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及其应用。所述核酸中包含有CD64序列SEQ ID NO:1、CD86序列SEQ ID NO:2、CD137L序列SEQ ID NO:3和CD256序列SEQ ID NO:4，所述CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列任意相连。根据该核酸得到了该核酸编码的多肽，含有该核酸的重组载体，含有重组载体的重组细胞以及在制药中的应用。本发明通过提供一种分离的核酸序列，用于T细胞的体外的大量扩增，可以大大降低扩增的成本，从而应用在CAR‑T治疗中。

Description

可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体设计一种可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及其应用。

背景技术

T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是，使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时，靶抗原需经过加工处理后才能和靶细胞表面的主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex，MHC)作用，也即“MHC限制性”。然而，肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面表达下降，破坏抗原加工过程，降低肽段免疫原性。这样长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。此外，人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少，并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原，使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除，数量进一步减少。因此，包括细胞因子诱导的杀伤细胞在内的T细胞过继性免疫治疗虽然在部分肿瘤的治疗中取得了一定的效果，但在大多数肿瘤中疗效尚不能令人满意。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA，是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分，它们在正常细胞上有微量表达，但在肿瘤细胞表达明显增高)的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immuno-receptor tyrosine-basedactivation motifs，ITAM，通常为CD3ζ或FcεRIγ)”在体外扩增后CAR-T细胞回输到患者体内，CAR-R细胞会在患者体内增殖，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性较常规应用的免疫细胞大幅提高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境，从而打破宿主免疫耐受状态，杀灭肿瘤细胞。

尽管CAR-T治疗具有广泛的应用前景，但CAR-T本身是一个个性化和定制化的治疗过程，成本高，制备周期较长，而短时间内无法扩增大量的T淋巴细胞，不仅使得制备成本加大，还会影响回输，耽误病人的病情。所以，如何低成本纯化和大量扩增T细胞成为CAR-T治疗需要解决的首要问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明通过将特定的白细胞抗原分子进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，也即CAR-T细胞，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性较常规应用的免疫细胞大幅提高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境，从而打破宿主免疫耐受状态，杀灭肿瘤细胞。

具体而言，本发明利用改造后的APC细胞刺激T淋巴细胞，使得T淋巴细胞快速增殖。与目前常用的免疫磁珠扩增的方法相比，不仅扩增效率大大提高，扩增所需要的成本也下降。

本发明旨在通过将含有的T细胞激活所需的共刺激细胞CD28的配体CD80或者CD86，共刺激分子CD137的配体质粒转染到K562细胞，使得改造后的K562细胞表达能够刺激T细胞增殖的相关配体，较短时间内获得大量T细胞，缩短制备周期，从而降低制备成本。

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

通过人工改造抗原提呈细胞(aAPC)，使其表达共刺激分子CD28配体和协同刺激分子4-1BB(CD137)配体等，可以持续活化和促进T细胞和快速增殖。在本文中我们通过构建携带CD64-CD86-137L-CD256基因序列的质粒载体，使其稳定转染到K562细胞系中，从而建立了人工改造的抗原提呈细胞aAPC(K562-CD64-CD86-CD137L-CD256)。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种可分离的核酸，所述核酸中包含有CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列，

其中所述CD64启动子序列为SEQ ID NO:1，所述CD86序列为SEQ ID NO:2，CD137L序列为SEQ ID NO:3，CD256序列为SEQ ID NO:4，

所述CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列任意相连。

本发明通过选取特定的抗原分子，CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列构建了一种可分离的核酸用于T细胞体外的大量扩增，其中CD64在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞中表达的分子，具有吞噬，激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用；CD86是CD28的配体，提供T细胞协同刺激信号，促进T细胞的活化和增殖；CD137L是CD137的配体，是个协同刺激分子，参与T细胞活化；CD256是CD267和CD269的配体，在体外能够刺激T细胞增殖。

根据本发明的一些实施例，所述CD64序列可以用CD16a和CD32序列替代。CD64、CD16a或者CD32均为IgG Fc的受体，扮演着相似的功能，均具有刺激吞噬、激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用。

根据本发明的一些实施例，所述CD86序列可以用CD80序列替代。CD86和CD80都是CD28的配体，能够提供T细胞协同刺激信号，促进T细胞的活化和增殖。

根据本发明的一些实施例，所述CD137L序列可以用CD58序列替代。CD137L和CD58均是T细胞协同刺激分子，可以参与T细胞的活化。

根据本发明的一些实施例，所述核酸为DNA。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种可分离的多肽，所述多肽由以上所述的核酸编码而成。

根据本发明的一些实施例，所述多肽同时表达CD64蛋白、CD86蛋白、CD137L蛋白和CD256蛋白。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体为含有以上所述的核酸的载体。

根据本发明的一些实施例，所述载体为质粒或者病毒载体。

根据本发明的一些实施例，所述病毒载体为逆转录病毒，所述病毒载体选自pHR-CMV-GFP、pBpLV或pBABE-puro中的一种。

根据本发明的一些实施例，所述质粒选自pcDNA3.1、pSF-PromMCS-FLuc、或pBR322中的一种。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述转基因细胞包含以上实施例所述的重组载体。

根据本发明的一些实施例，所述重组细胞为重组抗原提呈细胞。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种重组细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1)将以上实施例所述的核酸导入载体中，构建得到重组载体；

(2)将重组载体导入到受体细胞中，构建得到重组细胞；

根据本发明的一些实施例，以上重组细胞的构建方法中，所述受体细胞为抗原提呈细胞。

根据本发明的一些实施例，所述抗原提呈细胞包括DC细胞或永生化细胞系。

根据本发明的一些实施例，所述永生化细胞系选自K562细胞、U937细胞、NIH/3T3细胞、MEC-1细胞、K1735细胞、B16F10细胞、C3HBA细胞、A20细胞、Drosophila细胞、或SF9细胞中的一种。利用永生化细胞系作为抗原提呈细胞，经过改造后，可以持续活化和促进T细胞的快速增殖。

根据本发明的一些实施例，以上重组细胞的构建方法中，步骤(1)中重组载体的构建方法如下：

利用引物序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6扩增得到CD64序列，然后导入到目的载体中，得到第一重组载体；

利用引物序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8扩增得到CD86序列，然后将第一重组载体和CD86序列用相同的酶进行酶切，连接，得到同时含有CD64序列和CD86序列的第二重组载体；

利用引物序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10扩增CD137L序列，然后将第二重组载体和CD137L序列用相同的酶酶切，连接，得到同时含有CD64序列、CD86序列和CD137L序列的第三重组载体；

利用引物序列SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12扩增CD256序列，然后将第三重组载体和CD256序列用相同的酶酶切，连接，得到同时含有CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列的第四重组载体，即为得到所述重组载体。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种用于刺激T细胞体外增殖的方法，包括如下步骤：

将白细胞抗原分子核酸序列联合导入到载体中，构建得到重组载体；

将重组载体导入到抗原提呈细胞中，得到重组细胞；

将所述重组细胞与T细胞共培养，从而刺激T细胞的增殖；

其中白细胞抗原分子核酸序列选自A中的至少一种、B中的至少一种、C中的至少一种和CD256序列：

所述A为CD64序列、CD16a和CD32；

所述B为CD86序列、和CD80序列；

所述C为CD137L和CD58序列。

根据本发明的一些实施例，在将所述重组细胞与所述T细胞共培养之前，将所述重组细胞进行辐射或者药物处理，从而抑制所述重组细胞的增殖。

根据本发明的一些实施例，所述重组T细胞与所述T细胞共培养时数量比为(1～3)：(3～1)。

根据本发明的一些实施例，所述抗原提呈细胞包括DC细胞包括DC细胞或永生化细胞系。

根据本发明的一些实施例，所述永生化细胞系选自K562细胞、U937细胞、NIH/3T3细胞、MEC-1细胞、K1735细胞、B16F10细胞、C3HBA细胞、A20细胞、Drosophila细胞、或SF9细胞中的一种。

根据本发明的一些实施例，所述抗原提呈细胞为K562细胞。

根据本发明的第七方面，本发明提供了以上所述的可分离的核酸在制备药物领域中的用途，所述药物用于预防或者治疗肿瘤。

根据本发明的一些实施例，以上所述的用途中，

用于扩增所述CD64序列的引物序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

用于扩增所述CD86序列的引物序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

用于扩增所述CD137L序列的引物序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

用于扩增所述CD256序列的引物序列分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。

本发明所取得的有益效果为：通过本发明提供的核酸序列，构建得到含有本发明核酸序列的载体，进一步得到经过改造的人工抗原提呈细胞，然后利用人工改造的抗原提呈细胞aAPC能激活T细胞，促进T细胞的活化和增殖，使用aAPC体外培养T细胞，可以使T细胞的扩增提高2～3倍。从而可以根据本发明提供的核酸序列，用于T细胞的体外的大量扩增，可以大大降低扩增的成本，从而应用在CAR-T治疗中。

附图说明

图1为根据本发明实施例得到的不同时间点T细胞扩增倍数检测图。

图2为根据本发明实施例得到的T细胞分泌IFNγELISA检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

可分离的核酸

根据本发明的一方面，本发明提供了一种可分离的核酸，所述核酸中包含有CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列，其中所述CD64启动子序列为SEQ ID NO:1，所述CD86序列为SEQ ID NO:2，CD137L序列为SEQ ID NO:3，CD256序列为SEQ ID NO:4，所述CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列任意相连。

其中CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列可以直接相连，即SEQ ID NO:1序列的3’末端和SEQ ID NO:2序列的5’端直接连接，依次类推；也可以间接相连，例如CD64序列和CD86序列之间可以有其他的核酸序列，只要不影响CD64蛋白的表达和CD86蛋白的表达即可。而且CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列也可以以任何的顺序连接，即可以是CD64序列-CD86序列-CD137L序列-CD256序列的方式连接，也可以是CD256序列-CD86序列-CD64序列-CD137序列的方式连接。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。

在本文中，CD64也可以替换为CD16a或者CD32，因为CD64、CD16a或者CD32均为IgGFc的受体，扮演着相似的功能。CD86也可以替换为CD80，因为CD86和CD80都是CD28的配体，能够提供T细胞协同刺激信号，促进T细胞的活化和增殖。CD137L可以替换为CD2配体CD58，因为CD137L和CD58均是T细胞协同刺激分子，可以参与T细胞的活化。

重组载体

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种重组载体，重组载体含有以上所述的核酸。本发明中所使用的术语“重组载体”是指这样的一种遗传载体，包含特定的核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，重组载体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒和病毒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。病毒很容易转染到受体细胞中。本领域技术人员可以根据需要进行选择。对于用于构建重组细胞的重组载体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的具体实施例，以白细胞抗原分子CD64，CD86，CD137L和CD269为例，转入质粒载体pcDNA3.1中。首先构建质粒载体pcDNA-CD64-86-137L-CD256，再经G418药物筛选得到aAPC，即为稳定转染质粒载体pcDNA-CD64-86-137L-CD256的K562细胞，最后将aAPC和新鲜分离的T细胞共培养，使T细胞活化和扩增。

选取CD64、CD86、CD137L和CD256这四个分子的主要原因如下：

(1)CD64在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞中表达的分子，具有吞噬，激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用；

(2)CD86是CD28的配体，提供T细胞协同刺激信号，促进T细胞的活化和增殖；

(3)CD137L是CD137的配体，是个协同刺激分子，参与T细胞活化；

(4)CD256是CD267和CD269的配体，在体外能够刺激T细胞增殖。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

其中，本发明中所用到的试剂、仪器及其厂家如下：

抗CD3的单克隆抗体OKT3：上海微科公司。

抗CD28的单克隆抗体OKT28：北京同立海源公司。

K562细胞：购自上海中国科学院细胞库。

质粒载体pcDNA3.1：购自Clonetech公司。

人外周淋巴细胞分离液：天津灏洋公司。

DEPC(购自Sigma公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，RNA提取相关试剂(国药集团化学试剂有限公司)，ReverTra Ace qRCR RT Master Mix(购自TOYOBO公司)，Taq DNApolymerase(Bio Labs公司)，Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒(TaKaRa公司)。

Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒：日本同仁(DOJINDO)，货号：#CK04-1000。

实施例一CD64-CD86-CD137L-CD256串联体的构建

利用分子克隆的方法将CD64-CD86-CD137L-CD256连接到pcDNA3.1载体上。具体的制备步骤如下：

1.分离人外周血淋巴细胞

1)抽取2mL志愿者外周血，添加EDTA至终浓度1.2mg/mL抗凝。

2)加入等体积(2mL)PBS混匀，得到细胞悬液。

3)于15mL离心管中加入预先平衡至室温的人淋巴细胞分离液4ml，将细胞悬液缓慢加于等量人淋巴细胞分离液之上，动作轻柔，避免晃动，切勿破坏两者分界线。

4)以最低加速度离心，1800rpm 25min，离心结束后可见离心管内液体共分4层，由上至下分别是：清亮的缓冲液层，混浊云雾状淋巴细胞层，较清亮的淋巴细胞分离液层和红色的血细胞层；

5)将滴管轻柔伸入并旋转轻吸淋巴细胞层，转移到一个5ml离心管中，加满PBS，吹打混匀后，1800rpm离心5min，用滴管吸弃上清，收集细胞，即分离出淋巴细胞。

2.提取制备人淋巴细胞cDNA

按照如下方法提取人淋巴细胞的RNA，并进行反转录得到的cDNA。注意提取RNA专用的枪头及EP管需预先用DEPC水处理，浸泡24小时以上。具体的步骤如下：

1)收集适量细胞至1.5ml EP管中，PBS洗涤1次，每管细胞加入1mL Trizol，吹打研磨，使细胞完全均浆。

2)加入0.2ml的三氯甲烷，上下震荡15秒充分混匀，室温静置10min后4℃离心，12000rpm离心15min。

3)将EP管小心取出，液体从上至下分为三层，依次为清澈水相层、浑浊蛋白层、粉色的酚/氯仿层。吸取上层水相转移至新的1.5ml离心管中。

4)加入0.5mL预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置10min后4℃离心，12000rpm离心15min。

5)小心弃上清，保留管底白色絮状沉淀，加入75％乙醇(75％的无水乙醇+25％DEPC水)1ml，轻柔混匀，4℃离心，12000rpm离心15min，洗涤RNA。

6)小心弃上清，将离心管置于通风橱中放置5-10min，至白色絮状沉淀变透明。

7)向离心管中加入10-30μl DEPC水，溶解RNA沉淀。用紫外分光光度计进行RNA浓度和吸光度测定，当OD260/OD280，在1.8-2.0之间时，说明RNA纯度良好，可以进行下游的反转录实验。提取的RNA有被RNA酶降解的风险，可置于-70℃保存，并在半年之内使用。

8)反转录

a)取RNA模板800ng，补加入去核酸酶的水(Nuclease-free Water)至16μL，在65℃条件下热变性5min，于冰上急冷。

b)在冰上，加入反转录混合物(ReverTra Ace qRCR RT Master Mix)4μL，将反应液轻轻混匀，并离心。

c)按如下程序进行

顶盖温度：LID＝104℃，

逆转录反应：37℃15min,50℃5min,

酶失活反应：98℃5min,

冷却至4℃。

d)反应完成后，得到的cDNA溶液于-20℃保存，并可直接或稀释后用于PCR扩增反应。

3.PCR扩增CD64、CD86、CD137L和CD256序列

先从单个核细胞cDNA中扩增出CD64、CD86、CD137L和CD256的蛋白编码区CDS，其中表1介绍了PCR扩增的引物。

表1 CD64、CD86、CD137L和CD256PCR扩增的引物

PCR扩增过程如下：

1)在PCR专用管中配置如下体系，充分离心、混匀

PCR反应体系如下(总体积为20.0μL)：

2)将样品置于实时定量PCR仪中，并按如下程序进行，

顶盖温度:LID＝104℃，

预变性：95℃30s

扩增循环：95℃30s，58℃30s，72℃30s根据引物效率，重复25-40个循环

酶失活反应：72℃5min

冷却至4℃。

3)PCR片段回收纯化：使用Axygen公司AxyPrep PCR清洁试剂盒，参照操作步骤完成PCR片段的回收纯化。

其中，利用表1中的引物按照如下方法扩增出来的CD64序列如下(SEQ ID NO:1)：

CTAGCTAGCgggttccagttgatgggcaagtggacaccacaaaggcagtgatcactttgcagcctccatgggtcagcgtgttccaagaggaaaccgtaaccttgcactgtgaggtgctccatctgcctgggagcagctctacacagtggtttctcaatggcacagccactcagacctcgacccccagctacagaatcacctctgccagtgtcaatgacagtggtgaatacaggtgccagagaggtctctcagggcgaagtgaccccatacagctggaaatccacagaggctggctactactgcaggtctccagcagagtcttcacggaaggagaacctctggccttgaggtgtcatgcgtggaaggataagctggtgtacaatgtgctttactatcgaaatggcaaagcctttaagtttttccactggaattctaacctcaccattctgaaaaccaacataagtcacaatggcacctaccattgctcaggcatgggaaagcatcgctacacatcagcaggaatatctgtcactgtgaaagagctatttccagctccagtgctgaatgcatctgtgacatccccactcctggaggggaatctggtcaccctgagctgtgaaacaaagttgctcttgcagaggcctggtttgcagctttacttctccttctacatgggcagcaagaccctgcgaggcaggaacacatcctctgaataccaaatactaactgctagaagagaagactctgggttatactggtgcgaggctgccacagaggatggaaatgtccttaagcgcagccctgagttggagcttcaagtgcttggcctccagttaccaactcctgtctggtttcatgtccttttctatctggcagtgggaataatgtttttagtgaacactgttctctgggtgacaatacgtaaagaactgaaaagaaagaaaaagtgggatttagaaatctctttggattctggtcatgagaagaaggtaatttccagccttcaagaagacagacatttagaagaagagctgaaatgtcaggaacaaaaagaagaacagctgcaggaaggggtgcaccggaaggagccccagggggccacgtagcagcggctcagtgggtggccatcgatctggaccgtcAAGCTTGGG

扩增出来的CD86序列(SEQ ID NO:2)如下：

GGGGTACCgagctacagtggacaggcatttgtgacagcactatgggactgagtaacattctctttgtgatggccttcctgctctctggtgctgctcctctgaagattcaagcttatttcaatgagactgcagacctgccatgccaatttgcaaactctcaaaaccaaagcctgagtgagctagtagtattttggcaggaccaggaaaacttggttctgaatgaggtatacttaggcaaagagaaatttgacagtgttcattccaagtatatgggccgcacaagttttgattcggacagttggaccctgagacttcacaatcttcagatcaaggacaagggcttgtatcaatgtatcatccatcacaaaaagcccacaggaatgattcgcatccaccagatgaattctgaactgtcagtgcttgctaacttcagtcaacctgaaatagtaccaatttctaatataacagaaaatgtgtacataaatttgacctgctcatctatacacggttacccagaacctaagaagatgagtgttttgctaagaaccaagaattcaactatcgagtatgatggtattatgcagaaatctcaagataatgtcacagaactgtacgacgtttccatcagcttgtctgtttcattccctgatgttacgagcaatatgaccatcttctgtattctggaaactgacaagacgcggcttttatcttcacctttctctatagagcttgaggaccctcagcctcccccagaccacattccttggattacagctgtacttccaacagttattatatgtgtgatggttttctgtctaattctatggaaatggaagaagaagaagcggcctcgcaactcttataaatgtggaaccaacacaatggagagggaagagagtgaacagaccaagaaaagagaaaaaatccatatacctgaaagatctgatgaagcccagcgtgtttttaaaagttcgaagacatcttcatgcgacaaaagtgatacatgtttttaattaaagagtaaagcccatacaagtattcattttttctaccctttcctttgtaagttcctgggcaacctttttgGGATCCCG

扩增出来的CD137L序列(SEQ ID NO:3)如下：

CGGGATCCcttcccgcagtctctcgtcatggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaataacgtccagcctgggtgcagcccacctggacagagtccgaatccGATATCATT

扩增出来的CD256序列(SEQ ID NO:4)如下：

AATGATATCcactgcccgtacccttacccgccccgccacctccttgctaccccactcttgaaaccacagctgttggcagggtccccagctcatgccagcctcatctcctttcttgctagcccccaaagggcctccaggcaacatggggggcccagtcagagagccggcactctcagttgccctctggttgagttggggggcagctctgggggccgtggcttgtgccatggctctgctgacccaacaaacagagctgcagagcctcaggagagaggtgagccggctgcaggggacaggaggcccctcccagaatggggaagggtatccctggcagagtctcccggagcagcagcactctgtcctgcacctggttcccattaacgccacctccaaggatgactccgatgtgacagaggtgatgtggcaaccagctcttaggcgtgggagaggcctacaggcccaaggatatggtgtccgaatccaggatgctggagtttatctgctgtatagccaggtcctgtttcaagacgtgactttcaccatgggtcaggtggtgtctcgagaaggccaaggaaggcaggagactctattccgatgtataagaagtatgccctcccacccggaccgggcctacaacagctgctatagcgcaggtgtcttccatttacaccaaggggatattctgagtgtcataattccccgggcaagggcgaaacttaacctctctccacatggaaccttcctggggtttgtgaaactgtgattgtgttataaaaagtggctcccagcttggaagaccagggtgggtacGCGGCCGCATTCTTAT

4.制备pcDNA-CD64-CD86-CD137L-CD256串联载体

将上述CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列依次串联，连接到pcDNA3.1载体上，其中按照基因表达顺序，从基因表达的上游到下游依次为CD64序列、CD86序列、CD137L序列和CD256序列，各序列之间可以直接通过3’端和另一序列的5’端相连，也可以不直接相连，从而得到CD64-CD86-CD137L-CD256串联体。具体的步骤如下：

利用pcDNA3.1载体上的多克隆位点，依次插入CD64(Nhe I/Hind III)、CD86(KpnI/BamH I)、CD137L(BamH I/EcoR V)和CD256(EcoR V/Not I)，获得pcDNA-CD64-CD86-CD137L-CD256串联载体。

(1)酶切体系

其中Kpn I/BamH I双酶切换用0.5×K buffer，BamH I/EcoR V双酶切换用Kbuffer，EcoR V/Not I双酶切换用H buffer+BSA。

(2)琼脂糖凝胶回收DNA片段

a)琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出所需的片段，置于1.5mL EP管中；

b)加入3个酶切体系体积的Buffer DE-A，混合均匀；

c)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；

d)吸取步骤(2)中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min，弃滤液；

e)置回2ml离心管，加500μL Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液；

f)将制备管置回2ml离心管，加700μL Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min(两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响)；

g)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min；

h)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μlElution buffer或去离子水，室温静置1min，12,000×g，离心1min洗脱DNA(将Elutionbuffer或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率)。

(3)连接

取5μL回收的片段(100～600ng)，加2μL回收的pcDNA3.1载体(20～200ng)，添加7μLTaKaRa快速连接试剂盒中的溶液Ⅰ，16℃连接120min。

(4)目的质粒转化

a)将目的质粒稀释至100ng/μL，取1μL加入到含30μL大肠杆菌感受态细胞悬液的EP管中(连接产物用5μL)，轻弹混匀，在冰上放置30min后，42℃热休克90s，再于冰上放置2min。

b)每管加800μL无抗生素的液体LB培养基，150rpm 37℃震荡箱震荡45min。

c)每个琼脂板中加入200-300μL菌液，用无菌弯头玻璃管将菌液均匀涂抹在含抗生素的琼脂板表面，37℃水平放置20min后，于37℃倒置12小时。

d)在无菌大试管中，加入5mL LB培养基，并根据细菌抗性，加入相应抗生素。

e)观察琼脂板表面的菌落，在其中选择独立饱满大小适中的克隆，用干净的小枪头挑取后，将小枪头放入相应大试管中，将试管放入气浴恒温震荡箱，牢固固定，200rpm37℃震荡12-14小时。

(5)质粒的提取

按照质粒小提试剂盒中的产品说明中离心法纯化质粒DNA的步骤进行，具体操作步骤如下：

a)根据菌液的混浊程度，取1-4mL上述大试管中的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。

b)加入250μL Buffer S1悬浮细菌沉淀，轻轻震荡，均匀悬浮，不应有小的菌块。

c)加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不应超过5min。

d)加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。

e)吸取步骤4中的离心上清并转移至制备管，12000g离心1min，弃滤液。

f)将制备管置回离心管中，加入500μL Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液。

g)将制备管置回离心管，加入700μL Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液；以同样的方法用700μL Buffer W2重复洗涤一次，弃滤液。

h)将制备管置回2mL离心管中，12000g离心1min。

i)将制备管移入新的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入预热至65℃的Eluent60-80μL，室温静置1min，12000g离心1min。

j)使用分光光度计测量质粒的浓度。

(5)重组质粒的酶切鉴定

按前述双酶切体系酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳，能切出连入片段的为正确重组质粒，-20℃保存用于后续实验。

反复进行以上步骤，直到将四基因编码序列均连接入载体中。

实施例二CD64-CD86-CD137L-CD256-K562细胞(aAPC改造的K562细胞)的构建

利用步骤(一)制备得到的CD64-CD86-CD137L-CD256串联体，转染K562细胞，经G418筛选，得到稳定表达的K562细胞(CD64-CD86-CD137L-CD256-K562)。具体的步骤如下：

(1)K562细胞按1：4传代。

(2)传代处理的第二天进行质粒的转染。

(3)DNA-Lipofectamine^TM 2000复合物的制备

①取一只1.5mLEP管向其中加入250μL无血清Opti-MEM并加入4μg纯化的质粒，之后轻柔混匀稀释。

②另取一支1.5mL EP管，加入250μL Opti-MEM，并将10μL Lipofectamine^TM 2000(使用前要轻柔混匀)与Opti-MEM轻柔混匀，室温下静置5min。

③室温孵育5min后，将稀释的质粒加入到稀释的Lipofectamine ^TM 2000中并轻柔混匀，在室温下孵育20min(此过程不应超过20min)。

(4)计数并吸取2×10⁵K562细胞，离心，用PBS洗细胞2次，加入2mlOpti-MEM培养液，之后将混合20min的DNA-脂质体Lipofectamine^TM 2000复合物加入细胞悬液，置于6孔板的一个孔中，37℃5％CO₂条件下培养6～8h，之后更换为常规培养基。

(5)细胞转染36～48h后，调整K562细胞密度为2×10⁵/mL，添加G418至终浓度为500μg/ml进行药物筛选，持续加药3～4周，之后对纯化的表达外源基因的K562细胞进行扩大培养。

实施例三

(一)分离T细胞

利用人淋巴细胞分离液分离出外周血中或者脐带血中的淋巴细胞，用于后续实验，具体方法如下：

(1)无菌采集足月顺产胎儿断脐后的脐血一份(100-150mL)，枸橼酸纳/肝素抗凝。

(2)将脐血按1:1的比例与生理盐水混匀，再按4:1的比例与6.0％的羟乙基淀粉(HESpan)混匀，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明，沉淀红细胞，收集上层液体置50mL离心管中，最后约0.8cm处换用1mL吸管慢慢吸出。

(3)收集的液体1800转/分，离心15分钟，离心完毕，弃去上层液体。

(4)沉淀用生理盐水稀释至10mL，采用Ficoll(需提前放置室温)进行单个核细胞(MNC)分离。分别取人淋巴细胞分离液5mL，加入10mL离心管内，将待分离的血液缓缓沿着管壁加入到淋巴细胞分离液的上层，使血液与分离液体积比例约为1:1，1800转/分水平离心25-30分钟。

(5)离心后管内容物分为三层，吸取上中层液体界面层淋巴细胞(白色液体)，移入离心管中，用5倍以上生理盐水稀释，1800转/分，离心10分钟，吸弃上清，重复洗涤2次。

(6)末次离心后，吸尽上清，用培养基重新混悬细胞，取1滴细胞悬液计数，并调整细胞浓度为0.5～1×10⁶/mL；置37℃，5％CO₂培养箱培养。

T细胞的培养基的构成：X-VIVO 15TM无血清细胞培养基(Lonza)中，加入5％失活的人AB血清、2mM的L-谷氨酰胺、20mM的HEPES和50U/mL的rhIL-2。

(二)T细胞的体外培养

将实施例二aAPC改造过的K562细胞(K562-aAPC)用10,000rads单位量(100Gy)照射，使用PBS洗2次，室温下分别加入0.5μg/10⁶个细胞的抗CD3的单克隆抗体OKT3和抗CD28的单克隆抗体OKT28(clone 9.3)处理10min，再直接和T细胞混合培养(其中K562-aAPC和T细胞的比例为2:1)，T细胞的浓度维持在1.0×10⁶个/mL，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。第7-10天，再次加入K562-aAPC，重新刺激。

实施例四T细胞扩增检测

利用细胞计数和CCK-8检测的方法比较，aAPC和T细胞共培养对T细胞增殖的影响。其中CCK-8(Cell Counting Kit)试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒，其原理是在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比，然后使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，从而反映活细胞的数量。分别将T细胞和本发明制备的人工抗原提呈细胞(T细胞与人工抗原提呈细胞的数量比为1:1)共培养作为实验组，以不加入人工抗原提呈细胞的T细胞作为对照组，于培养0天、5天、7天以及14天后具体通过如下步骤测定本发明制备的aAPC和T细胞共培养后对于T细胞增殖的影响。

(1)离心收集细胞，将1×10³的细胞重悬于200μL新鲜培养基中，并将该悬液置于96孔板中，每个分组接种8个复孔，共重复4个96孔板。

(2)将细胞均匀混匀后，置于37℃，5％CO₂条件下静置培养。

(3)随机选择一组复孔，每孔加入20μl CCK-8溶液，轻轻振荡混匀。

(4)将孔板置于37℃，5％CO₂的培养条件下孵育1h。

(5)孵育结束后，将细胞置于振荡混合仪上振荡10min。

(6)使用酶联仪进行测量：测量的条件为OD值为450nm，参考波长为600nm时的光吸收值。

(7)每天在相同时间点进行酶联仪的检测。

(8)检测完成后，进行数据的统计和分析。

实验结果如图1所示，其中横坐标代表的是共培养的天数，纵坐标代表的是T细胞的扩增倍数，图例中-aAPC代表的是不添加本发明制备得到的人工改造的抗原提呈细胞(对照组)，+aAPC代表的是添加了本发明制备得到的人工改造的抗原提呈细胞(实验组)。从图1的结果可以看出，在培养相同的天数的情况下，与对照组相比，K562-aAPC能有效促进T细胞的增殖。

实施例五T细胞分泌IFNγ的检测

T细胞受刺激活化增殖后会分泌大量细胞因子，其中包括IFNγ，通过分析培养上清中IFNγ的浓度可以判断T细胞活化的水平。人IFNγELISA检测试剂盒(RAB0223)为Sigma-Aldrich公司产品。分别将T细胞和本发明制备的人工抗原提呈细胞(T细胞与人工抗原提呈细胞的数量比为1:1)共培养，以不加入人工抗原提呈细胞的T细胞作为对照，培养10天后，按照如下步骤测定IFNγ的水平：

(1)吸取培养的细胞悬液，离心去除T细胞，取100μL细胞培养上清。

(2)将标准品和样品分别加入试剂盒提供的96孔板中，每孔100μL，盖盖，室温孵育2.5小时。

(3)吸弃液体，用洗涤液洗涤4次。

(4)每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，室温孵育1小时。

(5)吸弃上清，洗涤4次。

(6)每孔加入100μL稀释好的HRP-链霉亲和素溶液，室温孵育45分钟。

(7)吸弃上清，洗涤4次。

(8)每孔加入100μl ELISA显色剂，室温暗处孵育30分钟。

(9)每孔加入50μL停止液，读取450nm处光吸收值。

实验结果如图2所示，其中纵坐标代表的是450nm下光吸收值，横坐标+APC代表的是添加了本发明制备的人工抗原提呈细胞K562-aAPC，-APC代表的是未添加本发明制备的人工抗原提呈细胞K562-aAPC，从图2的结果可以看出，T细胞与人工抗原提呈细胞K562-aAPC共同孵育后IFNγ产量显著提高，证明T细胞获得更好的活化。

因此，通过以上实施例构建的aAPC能激活T细胞，促进T细胞的活化和增殖，使用aAPC体外培养T细胞，可以使T细胞的扩增提高2～3倍。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南生物医药研究院，中国人民解放军军事科学院军事医学科学院

<120> 可分离的核酸、多肽、重组载体、重组细胞及应用

<130> PIDC3175504

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1151

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctagctagcg ggttccagtt gatgggcaag tggacaccac aaaggcagtg atcactttgc 60

agcctccatg ggtcagcgtg ttccaagagg aaaccgtaac cttgcactgt gaggtgctcc 120

atctgcctgg gagcagctct acacagtggt ttctcaatgg cacagccact cagacctcga 180

cccccagcta cagaatcacc tctgccagtg tcaatgacag tggtgaatac aggtgccaga 240

gaggtctctc agggcgaagt gaccccatac agctggaaat ccacagaggc tggctactac 300

tgcaggtctc cagcagagtc ttcacggaag gagaacctct ggccttgagg tgtcatgcgt 360

ggaaggataa gctggtgtac aatgtgcttt actatcgaaa tggcaaagcc tttaagtttt 420

tccactggaa ttctaacctc accattctga aaaccaacat aagtcacaat ggcacctacc 480

attgctcagg catgggaaag catcgctaca catcagcagg aatatctgtc actgtgaaag 540

agctatttcc agctccagtg ctgaatgcat ctgtgacatc cccactcctg gaggggaatc 600

tggtcaccct gagctgtgaa acaaagttgc tcttgcagag gcctggtttg cagctttact 660

tctccttcta catgggcagc aagaccctgc gaggcaggaa cacatcctct gaataccaaa 720

tactaactgc tagaagagaa gactctgggt tatactggtg cgaggctgcc acagaggatg 780

gaaatgtcct taagcgcagc cctgagttgg agcttcaagt gcttggcctc cagttaccaa 840

ctcctgtctg gtttcatgtc cttttctatc tggcagtggg aataatgttt ttagtgaaca 900

ctgttctctg ggtgacaata cgtaaagaac tgaaaagaaa gaaaaagtgg gatttagaaa 960

tctctttgga ttctggtcat gagaagaagg taatttccag ccttcaagaa gacagacatt 1020

tagaagaaga gctgaaatgt caggaacaaa aagaagaaca gctgcaggaa ggggtgcacc 1080

ggaaggagcc ccagggggcc acgtagcagc ggctcagtgg gtggccatcg atctggaccg 1140

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<212> DNA

<213> 人工序列

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att 843

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ataagaatgc ggccgcgtac ccaccctggt cttcca 36

Claims (2)

1.一种用于刺激T细胞体外增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将白细胞抗原分子核酸序列联合导入到载体中，构建得到重组载体；

将重组载体导入到抗原提呈细胞中，所述抗原提呈细胞为K562细胞，得到重组细胞；

将所述重组细胞与T细胞共培养，从而刺激T细胞的增殖；

其中，所述白细胞抗原分子核酸序列为：CD64-CD86-CD137L-CD256；

所述载体为质粒或者病毒载体；

所述质粒选自pcDNA3.1、pSF-PromMCS-FLuc或pBR322中的一种；

所述病毒载体选自pHR-CMV-GFP、pBpLV或pBABE-puro中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将所述重组细胞与所述T细胞共培养之前，将所述重组细胞进行辐射或者药物处理，从而抑制所述重组细胞的增殖；

所述重组细胞与所述T细胞共培养时数量比为(1～3)：(3～1)。

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