CN105025924A - 经诱导树突细胞及其用途 - Google Patents

经诱导树突细胞及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105025924A
CN105025924A CN201480008074.8A CN201480008074A CN105025924A CN 105025924 A CN105025924 A CN 105025924A CN 201480008074 A CN201480008074 A CN 201480008074A CN 105025924 A CN105025924 A CN 105025924A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
mice
idc
smyledc
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480008074.8A
Other languages
English (en)
Inventor
雷娜塔·斯特里波克
古斯塔沃·萨尔格罗-洛佩兹
阿努萨拉·登塔那塞马克
阿诺德·甘泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medizinische Hochschule Hannover
Original Assignee
Medizinische Hochschule Hannover
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medizinische Hochschule Hannover filed Critical Medizinische Hochschule Hannover
Publication of CN105025924A publication Critical patent/CN105025924A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/47—Brain; Nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

本发明涉及被改造为表达至少一种细胞因子和至少一种抗原的细胞，所述至少一种细胞因子诱导树突细胞(DC)祖细胞自主分化为功能性抗原呈递性经诱导DC(iDC)。此外，公开了所述iDC用于在造血干细胞移植之后使免疫系统再生的治疗用途。所述iDC还可用于产生具有功能性内源再生人源化免疫系统的小鼠，所述免疫系统产生抗原特异性T细胞和B细胞应答，所述小鼠可用作研究人适应性免疫应答的动物模型。

Description

经诱导树突细胞及其用途
本发明涉及被改造为表达至少一种细胞因子和至少一种抗原的细胞，所述至少一种细胞因子诱导树突细胞(DC)祖细胞自主分化为功能性抗原呈递性经诱导DC(iDC)。此外，公开了所述iDC用于在造血干细胞移植之后使免疫系统再生的治疗用途。所述iDC还可用于产生具有功能性内源再生人源化免疫系统的小鼠，所述免疫系统产生抗原特异性T细胞和B细胞应答，所述小鼠可用作研究人适应性免疫应答的动物模型。
发明背景
造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)已经成为用于多种恶性造血病症的标准治疗方法，由于供体移植物的长期造血移植和移植物抗白血病作用，导致对于慢性髓样白血病(80％)和急性髓样白血病(65％)具有高的临床成功率。然而，HSCT后的对象在移植后最初100天遭遇严重的细胞免疫缺陷并且仅在HSCT后1年之后才达到完全的T细胞和B细胞重建。较长时期的细胞免疫缺陷与后续的机会性病毒(opportunistic viral)感染和真菌感染以及复发的风险增加(高达40％)相关(Seggewiss，R.，和H.Einsele，2010，“Immune reconstitutionafter allogeneic transplantation and expanding options forimmunomodulation：an update.”Blood 115：3861-3868；Roncarolo，M.G.等，2011，“Clinical tolerance in allogeneic hematopoietic stem celltransplantation.”Immunological reviews 241：145-163；Mori，T.，和J.Kato，2010，“Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem celltransplantation”International journal of hematology 91：588-595)。因此，需要加快具有广泛的T细胞和B细胞应答库(repertoire)之淋巴细胞库的恢复以及诱导在HSCT后移植对象中的优化病毒免疫的策略。
在过去十年中，已经开发了在基于被动免疫和主动免疫的免疫缺陷宿主中诱导免疫重建的新的先进治疗方法。然而，解决这样的疗法的效力和生物安全性之合适的体内实验模型仍处于开发阶段。为了在实验上重演在体内HSCT之后的人免疫重建，在亚致死全身辐照(TBI)之后将CD34+人造血干细胞(HSC)移植到缺乏通常的白介素-2受体γ链(IL2Rγ)的多种免疫缺陷小鼠品系(NOD-Rag1nullIL2Rγnull-NRG、NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull-NSG或NOD/SCID/IL2Rγnull-NOG)中，导致在CD34+细胞转移之后8周至10周的人造血系的重建(Ishikawa，F.等，2005，“Development of functional human blood and immune systems inNOD/SCID/IL2 receptorγchainnull mice.”Blood 106：1565-1573)。重要的是，无论HSC的来源和细胞移植的方法如何，人源化小鼠表现出亚最佳水平的T成熟淋巴细胞和B成熟淋巴细胞重建，缺乏抗原特异性细胞应答和体液应答以及总体的无反应性(Lepus，C.M.等，2009，“Comparison of Human Fetal Liver，Umbilical Cord Blood，and AdultBlood Hematopoietic Stem Cell Engraftment in NOD-scid/γc-/-，Balb/c-Rag1-/-γc-/-，and C.B-17-scid/bg Immunodeficient Mice.”Human immunology 70：790-802；Andre，M.C.等，2010，“Long-termhuman CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rgamma(null)mice show impaired CD8+ T cell maintenance and afunctional arrest of immatufe NK cells.”J Immunol 185：2710-2720)。决定人源化小鼠中的无效淋巴发育的因素包括不存在人组织相容性分子、受损的胸腺功能以及不良的人细胞因子环境。
最近已经描述了解决该问题的尝试，包括递送细胞因子(O′Connell，R.M.等，2010，“Lentiviral Vector Delivery of Human Interleukin-7(hIL-7)to Human Immune System(HIS)Mice Expands T LymphocytePopulations.”PLoS One 5；Chen，Q.等，2009，“Expression of humancytokines dramatically improves reconstitution of specific human-bloodlineage cells in humanized mice.”Proc Natl Acad Sci U S A 106：21783-21788)、移植胎儿淋巴组织以及HPC(Hu，Z.，和Y.G.Yahg，2012，“Human lymphohematopoietic reconstitution and immune function inimmunodeficient mice receiving cotransplantation of human thymic tissueand CD34+ cells”Cell Mol Immunol 9：232-236；Biswas，S.等，2011，“Humoral immune responses in humanized BLT mice immunized withWest Nile virus and HIV-1 envelope proteins are largely mediated viahuman CD5+ B cells.”Immunology134：419-433)以及使用组成型表达主要组织相容性分子(MHC)I型(Shultz，L.D.等，2010，“Generation offunctional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses inHLA class I expressing NOD/SCID/IL2rγnull humanized mice.”Proc NatlAcad Sci U S A 107：13022-13027)和HLA II型(Danner，R.等，2011，“Expression of HLA Class II Molecules in HumanizedNOD.Rag1KO.IL2RgcKO Mice Is Critical for Development and Functionof Human T and B Cells”PLoS One 6)或关键造血细胞因子(Willinger，T.等，2011，“Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolarmacrophage development and human immune responses in the lung”ProcNatl Acad Sci U S A 108：2390-2395)的转基因品系。这些策略允许针对人病毒攻击的B细胞和T细胞应答的有限改善。重要的是，只有少量报道描述了在HSC移植小鼠中的重建淋巴结构的存在(Singh，M.等，2012，“An Improved Protocol for Efficient Engraftment inNOD/LTSZ-SCIDIL-2RγNULL Mice Allows HIV Replication andDevelopment of Anti-HIV Immune Responses”PLoS One 7；Marodon，G.等，2009，“High diversity of the immune repertoire in humanizedNOD.SCID.gamma c-/- mice”European journal of immunology 39：2136-2145；Sun，Z.等，2007，“Intrarectal transmission，systemic infection，and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1”J ExpMed 204：705-714)。尽管使用了来自人脐带血或胎儿肝的高质量CD34+HPC，从而达到高效率的人细胞移植和合理水平的人淋巴细胞，但是几乎不能观察到淋巴结(LN)。这些数据表明淋巴器官再生的缺乏可能对人源化小鼠模型中观察到的不良的淋巴样细胞重建起主要作用。
DC在诱导适应性免疫应答中起着核心作用。重要的是，DC引起三级淋巴结构的再生和重构并且在主动免疫应答期间保持LN的功能中起着基本作用。
使用慢病毒(LV)介导的基因转移，已经开发出产生用于癌症免疫疗法之高度有活力和有效的DC的方法(Pincha，M.等，2011，“Lentiviralvectors for induction of self-difierentiation and conditional ablation ofdendritic cells”Gene therapy 18：750-764；Koya，R.C.等，2007“Lentiviralvector-mediated autonomous difierentiation of mouse bone marrow cellsinto immunologically potent dendritic cell vaccines”Molecular Therapy 15：971-980)。LV诱导的DC表现出高水平的移植和刺激抗原特异性应答并保护抵抗体内黑素瘤的有效能力。目前，证明了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素(IFN)-α向人单核细胞的整合酶缺陷(ID)LV基因递送导致自主分化的且高度有活力的树突细胞(Daenthanasanmak，A.等，2012，“Integrase-defective lentiviral vectorsencoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells andstimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo”Vaccine 30：5118-5131)。
因此，本发明要解决的问题可视为提供在造血干细胞移植之后改善免疫系统再生的手段和方法。
所述问题通过在权利要求和以下说明书中所述的实施方案来解决。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及被改造为表达以下的经诱导树突细胞(iDC)：
a)至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述经诱导树突细胞用作药物。
在另一个方面中，本发明涉及被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述iDC用于在HSC移植之后使免疫缺陷对象的免疫系统再生。
在又一个方面中，本发明涉及被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述iDC用作用于治疗淋巴性扩散(spreads lymphatically)的癌症或由嗜淋巴细胞病原体引起的疾病的药物。
在又一个方面中，本发明涉及用于使免疫缺陷对象中的免疫系统再生的方法，其包括以下步骤：
a)将造血干细胞移植到所述对象中；以及
b)向所述对象施用iDC，所述iDC被改造为表达至少一种抗原和至少一种诱导DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子。
在又一个方面中，本发明涉及具有由本发明的方法产生的功能性异种基因免疫系统的动物模型。
在又一个方面中，本发明涉及具有由本发明的方法产生的人源化免疫系统的小鼠用于研究人免疫系统或用于测试药物、植入物或装置在人中之使用的用途。
在又一个方面中，本发明涉及包含至少一种整合酶缺陷型慢病毒载体的iDC，其中所述载体介导以下的表达：
a)至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于产生iDC的方法，其包括以下步骤：
a)从来源于合适供体的样品中分离祖细胞；
b)将所述细胞改造以实现至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子和至少一种抗原的表达。
发明详述
在下文详细描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员的通常理解相同的含义。优选地，本文使用的术语如以下文献所述定义：″A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.andH.编辑.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)。
在整个该说明书和其后权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及变体如“包含”和“含有”将被理解为意指包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但是不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。
在整个该说明书的正文中引用了一些文件。每个本文所引用的文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明、GenBank登录号序列递交等)，无论在前还是在后，均通过引用以其整体并入本文。不应将本文的任何内容解释为承认：本发明没有权利由于在先发明而早于这些公开。
本发明的iDC的描述
本发明涉及被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原。
可用于以下在本申请中进一步描述的方法和用途的iDC是树突细胞，通过表达至少一种细胞因子和至少一种抗原来诱导所述树突细胞的自主分化。
术语树突细胞的“自主分化”是指树突细胞从合适的祖细胞发育，其通过内源表达至少一种细胞因子和至少一种抗原来刺激。术语“自主分化”并不排除在分化过程中向生长培养基添加细胞因子。然而，在该过程中需要内源表达诱导DC祖细胞自主分化为DC的至少一种细胞因子，即，如果未将iDC改造以实现至少一种细胞因子的表达，则不发生自主分化。优选地，iDC的改造是在体外进行的过程。
在一个优选的实施方案中，祖细胞分化为树突细胞所需的所有细胞因子和抗原均是由祖细胞和所得iDC内源表达的。
可分化为树突细胞的任何细胞均是根据本发明iDC的合适祖细胞。因此，术语“祖细胞”涵盖多潜能干细胞和造血干细胞。优选地，树突细胞的祖细胞是单核细胞，更优选为外周血单核细胞。优选地，所述单核细胞的特征在于在其细胞表面上存在CD14。为CD14+CD16-的人单核细胞被认为是典型的单核细胞，而CD14+CD16+细胞是非典型的单核细胞。这两种类型的单核细胞均是优选的。单核细胞表达GM-CSF、M-CSF、G-CSF的受体和趋化因子受体CCR1、CCR2和CCR5。因此，祖细胞是由至少一种选自以下的基因的表达来定义的：CD14、CD16、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、CCR1、CCR2和CCR5。更优选地，祖细胞的特征在于表达至少2个、3个或4个前述基因。此外，优选地，祖细胞并不表达CD3、CD19、CD20和CD56，因为它们是T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀伤细胞的标志物。可通过本领域已知的方法来确定受体或表面标志物的表达，所述方法包括使用与受体或表面标志物特异性结合的标记抗体以及对标记进行检测。可通过多种本领域已知的方法来检测和/或量化标记，所述方法包括共焦显微术或荧光激活的细胞分选(FACS)。
iDC的祖细胞优选地来源于选自灵长类动物、啮齿类动物、猫、狗、猪、牛和羊的有机体。灵长类动物优选为人、黑猩猩或猕猴，最优选为人。啮齿类动物优选为小鼠或大鼠，最优选为小鼠。
在一个特别优选的实施方案中，iDC来源于造血干细胞的供体。
优选地，合适的祖细胞通过选择在细胞表面上表达CD14的细胞而来源于骨髓或血液(外周血或脐带血)。
术语“改造”用于指导致表达一种或更多种细胞因子和/或一种或更多种抗原的过程，所述细胞因子和/或抗原不是被DC祖细胞或DC天然表达的或者不是在一定水平上天然表达的。在一个优选的实施方案中，通过引入包含编码一种或更多种细胞因子和/或一种或更多种抗原的核酸序列的载体来改造细胞。可将这些编码核酸序列包含在一个载体中或包含在分开的载体上，例如，将编码一种或更多种细胞因子的核酸序列包含在一个载体上而将编码一种或更多种抗原的核酸序列包含在另一个载体上。在另一个优选的实施方案中，将DC祖细胞或DC改造以表达细胞因子和/或抗原，所述细胞因子和/或抗原是在人类基因组中天然编码的但是其表达通常是沉默的或在DC祖细胞或DC中被抑制。这可通过本领域已知的方法来实现，所述方法包括将启动子和/或增强子序列引入编码各个细胞因子和/或抗原的基因附近。如果引入启动子，则优选的是以这些启动子指导内源细胞因子和/或抗原表达的方式将其引入各个基因的编码区的上游。优选地，引入强的组成型启动子如病毒启动子，例如，CMV立即早期启动子或SV40启动子或管家基因的启动子。在一个可替换的实施方案中，使用可调节的启动子系统，如果需要的话，其允许调整细胞因子和/或抗原的表达和表达水平。这样的可调节启动子系统包括，例如，Teton、Tetoff或lac阻遏物系统。此外，可将不同的启动子系统用于细胞因子和抗原，例如，用于细胞因子的可调节启动子和用于抗原的组成型启动子。可将使用载体的方法与引入异源启动子/增强子的方法组合，例如，可通过将合适的启动子/增强子引入各个细胞因子基因的附近来改造细胞以表达在人类基因组中被编码的一种或更多种细胞因子并且可用包含编码一种或更多种抗原的核酸序列的载体来转染所述细胞。
术语抗原的或细胞因子的“内源表达”是指通过树突细胞本身和/或其祖细胞来产生所述分子。所述内源表达可由编码所述细胞因子或抗原的细胞基因的上调或者通过如上所列的细胞因子或抗原的重组表达来介导。
优选地，在组织特异性、可诱导的或组成型启动子的控制下通过细胞基因的转录激活来实现细胞基因的上调。还优选的是，用可激活特定基因的转录的核酸或编码诸如转录因子之调节蛋白质的核酸来转染细胞，如果在细胞中表达所述转录因子，则其诱导内源细胞因子基因的转录。然而，使用细胞因子或抗原的重组表达通常是较容易的，并且因此是优选的。
术语“重组表达”是指在树突细胞或其祖细胞中的基因的表达，其中所述基因被包含在引入细胞中的核酸分子中。用于将外来核酸分子引入真核细胞的方法是本领域公知的。原则上，可使用任何这样的方法，只要其导致细胞期望地表达至少一种细胞因子和至少一种抗原而不损害树突细胞的发育或功能即可。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，诱导至少一种细胞因子和至少一种抗原表达之iDC的改造是将编码所述蛋白质的载体引入DC或其祖细胞中，所述至少一种细胞因子诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC。
载体
优选地，使用用于哺乳动物细胞中的表达载体来引入编码细胞因子和抗原的基因。这样的载体通常包含复制起点(如有必要的话，参见下述)、位于待表达基因前方的启动子、任选地在反向的增强子、以及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。然后，可将这样的表达载体用于介导至少一种抗原和至少一种细胞因子的表达。
在一个优选的实施方案中，本发明的表达载体包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：质粒；噬菌粒；噬菌体；黏粒；人工染色体，特别是人工哺乳动物染色体；敲除构建体或敲入构建体；病毒，特别是腺病毒、痘苗病毒、减毒痘苗病毒、金丝雀痘病毒、疱疹病毒(特别是单纯疱疹病毒)、逆转录病毒、腺相关病毒、鼻病毒、线状病毒以及上述病毒的改造形式；病毒体；“裸”DNA，脂质体；病毒样颗粒；以及核酸包被颗粒，特别是金球体(gold sphere)。逆转录病毒优选为慢病毒。
允许产生这样的重组病毒载体之质粒的实例包括pFastBac1(Invitrogen Corp.，Carlsbad CA)、pDCCMV(Wiznerowicz等，，，Double-copy bicistronic retroviral vector platform for gene therapy andtissue engineering：application to melanoma vaccine development.”GeneTher.1997 Oct；4(10)：1061-8.)和pShuttle-CMV(Q-biogene，Carlsbad，California)。特别优选的是病毒载体，如慢病毒载体(LV)、逆转录病毒载体、腺病毒载体。
LV提供这样的方法，通过其将有效、持久、非毒性和非免疫原性基因递送到单核细胞中并且可获得DC。慢病毒可感染非增殖性细胞，由于慢病毒预整合复合物的亲核性质，其允许被细胞核输入机器识别。LV可转导原代静止细胞、培养中生长停滞的细胞以及终末分化的细胞。慢病毒包装系统最初由Naldini等根据三联瞬时感染方案(Naldini L等，“In vivogene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviralvector”.Science.Apr 12 1996；272(5259)：263-267)开发，之后演变为“第二代”LV，其中从病毒包装系统中去除了4个HIV附加基因(vif、vpr、vpu和nef)而不影响病毒滴度或转导效率(Dull T等，“A third-generationlentivirus vector with a conditional packaging system”.J Virol.1998；72(11)：8463-8471)。因此，在该系统中唯一保留的辅助基因是rev，其与作为其同源结合序列的Rev应答元件(RRE)一起，是病毒产生期间将载体和包装构建体RNA从细胞核中有效地输出所需的。因此，在“第二代”LV中降低了毒性以及重组的可能性两者。在改进包装系统的同时，已经开发了自身灭活(SIN)LV设计，其通常包含在3’长末端重复(LTR)中的400个核苷酸缺失(Zufferey R等，“Self-inactivating lentivirusvector for safe and efficient in vivo gene delivery”.J Virol.Dec1998；72(12)：9873-9880.)。对于SIN载体，显著地降低了具有野生型病毒之载体移动的风险和能够复制之LV的后续产生。已经将具有tat-非依赖型启动子的自身灭活载体命名为“第三代”LV。在大多数情况下，LV是具有水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的假型(即，用异源包膜蛋白包被)，其是报道为与普遍存在的细胞表面磷脂相结合的弹状病毒包膜蛋白，从而实现广泛的宿主范围。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，慢病毒载体是第一代LV、第二代LV或第三代LV。在一个特别优选的实施方案中，LV是第三代，即，自身灭活LV，因为该类型的LV具有优良的安全特性。优选地，LV是具有来源于其他病毒的天然包膜的假型或者具有包含靶向特异性细胞感染的分子之经改造的包膜的假型。使用靶向特异性细胞感染的载体提高了安全性，避免非靶向细胞(非DC或非DC前体)感染，因此，是特别优选的。
一种特别优选的整合酶缺陷型慢病毒载体具有突变的整合酶，所述突变的整合酶具有如由SEQ ID NO：1所限定的核酸序列。
使用整合酶缺陷型慢病毒载体提高了iDC的安全性，因为整合事件可引起后果难以评估的插入诱变。出乎意料地，在本发明的研究中已经发现，即使载体可能在细胞分裂期间丢失并且不能自我复制，整合酶缺陷型载体也仍然允许抗原和细胞因子在分化的DC中稳定和持久地表达。
在其中将腺病毒用作表达载体的情况下，可将编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，后期启动子和三联前导序列。可通过体外或体内重组将目的基因插入到腺病毒的基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如，E1区、E3区或E4区)中的插入将导致有活力的并且能够在感染的细胞中表达各个超细胞因子(hypercytokine)的重组病毒。优选的是，修饰所使用的病毒载体以使其不能复制。
为了允许转基因的稳定表达，必须向表达载体提供复制起点，其允许独立于细胞基因组的复制，或者必须将表达载体整合到第一细胞和/或第二细胞的基因组中或者可作为非复制细胞细胞核中的附加体(episome)来使其保持稳定。在第一种情况下，将表达载体保持为附加体。合适的复制起点可来源于SV40或其他病毒(例如，Polyoma、Adeno、CMV、VSV、BPV)来源。在第二种情况下，如果将表达载体整合到基因组中，例如，染色体中，则不需要提供复制起点。在后一种情况下，附加体对应于包含逆转录病毒、慢病毒或更特别地HIV的双链DNA拷贝的预整合复合物。因此，在本发明的研究中已经出乎意料地发现，既没有附加体复制也未整合到iDC的基因组中的整合酶缺陷型慢病毒载体适于诱导iDC的自主分化，适于将其生存力保持数周并且适于在HSC移植之后的免疫缺陷型宿主中支持免疫系统的再生。因此，未整合到宿主细胞基因组中的不能复制的载体是特别优选的。
为了指导至少一种细胞因子和至少一种抗原的表达，将编码其的基因有效地连接到由细胞的转录机器识别的内部启动子和/或增强子。合适的启动子可来源于哺乳动物细胞的基因组(例如，MHCII启动子、EF1α启动子)或者来源于哺乳动物病毒(例如，巨细胞病毒启动子、脾病灶形成病毒SFFV启动子)。特别优选的是能够使上述基因在树突细胞或其祖细胞中表达的启动子。
原则上，可将在抗原呈递细胞中转录激活的每个启动子用于构建能够在iDC或其祖细胞中表达抗原和细胞因子的慢病毒载体。因此，启动子优选地选自共刺激配体(B7.1/CD80、B7.2/CD86、CD70)、DC成熟标志物(CD83)和DC标志物(CD1c/BDCA-1、CD141/BDCA-3、CD209、CD40)。
用LV转导的小鼠骨髓祖细胞有效地诱导DC在体外和体内自主分化，所述LV表达由组成型早期巨细胞病毒(CMV)启动子或由抗原呈递细胞限制性主要组织相容性复合体II型(MHCII)启动子驱动的GM-CSF和IL-4(Pincha等，2011)(Pincha M等.Lentiviral vectors forinduction of self-differentiation and conditional ablation of dendritic cells.Gene Ther.2011，Aug；18(8)：750-764.)。因此，这两个启动子是特别优选的。此外，优选地将其他常用的组成型启动子(SV40、UBC、EF1α、PGK和CAGG)用于产生人iDC的LV设计。还可使用可被例如多西环素(doxycicline)或他莫昔芬诱导的启动子。
SV40病毒的早期启动子和晚期启动子是特别有用的，因为两者均易于作为还包含SV40病毒复制起点的片段从病毒中获得。还可使用较小或较大的SV40片段，只要其包含从HindIII位点向位于病毒复制起点的BglII位点延伸的约250bp序列即可。
如本文所使用的，“有效地连接”意指并入基因构建体以使得表达控制序列有效地控制目的编码序列的表达。
编码序列的有效翻译还可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。可能还需要提供包含ATG起始密码子的外源翻译控制信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并提供必需信号。众所周知，起始密码子必须为框内(或相内)，其与所期望的编码序列同处阅读框内以确保整个插入物的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的，包括天然的和合成的两者。
为了允许由哺乳动物细胞以单个多顺反子RNA共表达若干细胞因子和抗原，可使用包含“2A”元件的载体设计。2A样序列是高度保守的天然存在的病毒元件并且是包含共有基序(2A，Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly；2B，Pro)的短多肽序列(约20个氨基酸长)，导致2A甘氨酸与2B脯氨酸之间的切割。认为所述切割是通过核糖体“跳跃(skipping)”机制发生的，其中2A元件修饰核糖体活性以跳过甘氨酸与脯氨酸残基之间的多肽键形成，导致单独的多种蛋白质产物的释放(Donnelly ML等，“Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein′cleavage′mechanism indicates not a proteolytic reaction，but a noveltranslational effect：a putative ribosomal′skip′.”J Gen Virol.May2001；82(Pt 5)：1013-1025)。最近的研究利用2A样顺式作用水解酶元件(CHYSEL)来产生用于从单个开放阅读框(ORr)转录本作为单独的蛋白质来同时共表达多个基因的多顺反子载体(Chinnasamy D等，“Multicistronic lentiviral vectors containing the FMDV 2A cleavage factordemonstrate robust expression of encoded genes at limiting MOI”.Virol J.2006；3：14；Szymczak AL，Vignali DA.“Development of 2A peptide-basedstrategies in the design of multicistronic vectors”.Expert Opin Biol Ther.May 2005；5(5)：627-638)。2A系统在多顺反子载体构建中的一个特别优点是仅使用单个启动子的可行性。由于其的小尺寸，单个载体构建体可利用若干个2A元件来表达多种蛋白质。2A样元件允许多种蛋白质产物在高效切割下以等摩尔比表达(de Felipe P.等，“E unum pluribus：multipleproteins from a self-processing polyprotein”.Trends Biotechnol.Feb2006；24(2)：68-75)。载体中的异源性2A元件避免了同源重组，保持慢病毒载体的稳定性。可用于载体的不同类型的2A元件包括：口蹄疫病病毒(F2A)、马甲型鼻炎病毒(E2A)、Thosea asigna病毒(T2A)和猪捷申病毒-1(P2A)。
或者，可使用内部核糖体进入位点(IRES)。通常，在真核生物中，翻译只可在mRNA分子的5′端起始，因为翻译起始复合物的组装需要5’-帽识别。IRES是允许通过称为内部翻译起始的过程在信使RNA(mRNA)序列的中间来起始翻译的核苷酸序列。例如在小RNA病毒、肝炎病毒或脊髓灰质炎病毒中发现了病毒IRES。例如在编码成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子2(IGF-II)、C-myc、L-myc、Pim-1、蛋白激酶、p58PITSLRE或p53的mRNA中发现了细胞IRES。类似于2A元件，可将异源IRES组合到载体中用于将一个mRNA翻译为若干蛋白质产物。
因此，在编码多于一个多肽(例如抗原和细胞因子)的载体中，优选地通过2A元件或IRES来分离编码多肽的核酸序列。特别优选地用于本发明的2A元件是由SEQ ID NO：5和6进行限定的。
可通过包含适当的转录增强子元件和转录终止子来增强表达效率。在真核生物表达中，如果其不包含在原始克隆区段内，则人们通常还期望将适当的多腺苷酸位点(例如，5′-AATAAA-3′)并入到转录单位中。通常，在转录终止之前，将poly A添加位点置于蛋白质终止位点“下游”约30个至2000个核苷酸的位置处。
可在载体中包含自杀基因(例如HSV-TK)使得在施用前药(例如，更昔洛韦)时iDC在体内药理学消融(Pincha M等，Lentiviral vectors forinduction of self-differentiation and conditional ablation of dendritic cells.Gene Ther.2011，Aug；18(8)：750-764)，或者，可使用经修饰的人胱天蛋白酶9与人FK506结合蛋白(FKBP)融合以允许使用小分子药物的条件二聚化(Strathoof等，An inducible caspase 9safety switch for T-cell therapy，Blood.2005June 1；105(11)：4247-4254)，从而提高经改造的iDC在体内的安全性。因此，在一个优选的实施方案中，载体另外地编码自杀基因。所述基因优选为HSV-TK或者与人FK506结合蛋白融合的经修饰的人胱天蛋白酶9。
抗原
优选地，由iDC表达的抗原是可以诱导选自以下的细胞毒性免疫应答或体液免疫应答的抗原：异种反应性、同种异体反应性、新反应性(neo-reactivity)或自身免疫。
术语“异种反应性”是指诱发针对由来自另一个物种的生物体(优选为病原体)表达的蛋白质的免疫应答。
术语“同种异体反应性”是指诱发针对由来自相同物种的供体之移植的细胞或组织表达的蛋白质的免疫应答。
术语“新反应性”是指诱发针对接收iDC之对象的突变蛋白质的免疫应答。优选地，新反应性针对癌抗原。
术语“自身免疫”是指诱发针对在生物体机体中表达的蛋白质的免疫应答，其中介导所述免疫应答的免疫细胞来源于所述生物体机体。通常，自身免疫由排除免疫耐受机制所引起。优选地，自身免疫针对由癌细胞异常地过表达而没有被突变的蛋白质。
特别优选的诱导异种反应性的抗原选自pp65(来源于人巨细胞病毒)、NS3(来源于丙型肝炎病毒)以及gag和env(来源于人免疫缺陷病毒)。
特别优选的癌抗原，即，诱发新反应性或自身免疫的抗原，选自TRP2、MART1、WT1和酪氨酸酶(所有均来源于黑素瘤)以及WT1、Her2/neu和BRCA1/2(所有均来源于乳腺癌)。
特别优选的是使用由SEQ ID NO：2表示的核酸编码的pp65。应理解，遗传密码是简并的以使得不同的三联体编码相同氨基。因此，本发明还涉及编码与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列的所有核酸序列。因为编码相同氨基酸的不同三联体在不同物种中以不同效率进行翻译，所以本申请设想通过密码子优化来优化核酸序列。
特别优选的是使用实验性抗原鸡卵卵白蛋白，也称为OVA，作为全长蛋白或作为免疫原性肽表位。
此外，载体所包含的由核酸序列编码的至少一种抗原可以是与抗原免疫学相同的前述抗原之一的变体。
关于抗原的术语“变体”是指通过从抗原中缺失和/或替换至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个或20个氨基酸所得到的蛋白质。优选地，变体与抗原具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性。特别优选的是通过在C末端和/或N末端缺失至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个或20个氨基酸所得的变体。
此外，术语“变体”是指保留全长抗原的至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个或90个氨基酸的上述抗原的片段。
优选的是，抗原的所有变体或片段是与所述抗原免疫学相同的。如果两个或更多个抗原由相同的抗体T细胞或B细胞识别，则其是“免疫学相同的”。相同抗体T细胞或B细胞对两个或更多个免疫原性多肽的识别也称为所述抗体T细胞或B细胞的“交叉反应性”。优选地，相同抗体T细胞或B细胞对两个或更多个免疫学上相同的多肽的识别是由于在所有多肽中存在相同或相似的表位。相似表位共享可被相同抗体或B细胞受体的Fab区或被相同T细胞受体的V区结合的足够结构和/或电荷特性。抗体、T细胞受体或B细胞受体的结合特性优选地由受体与所讨论表位的结合亲和力来定义。如果具有较低亲和常数的多肽的亲和常数是具有较高亲和常数的多肽的亲和常数的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％，则如本申请所理解的，两个免疫原性多肽是“免疫学相同的”。用于确定多肽与受体的结合亲和力的方法，例如，平衡透析或酶联免疫吸附测定(ELISA)，是本领域公知的。优选地，两个或更多个“免疫学相同的”多肽包含至少一个相同的表位。
细胞因子
由iDC表达的细胞因子是任何细胞因子，其以其自身或与一个或更多个另外的细胞因子组合能够诱导祖细胞分化为树突细胞和/或刺激T细胞或B细胞发育、保持活力或增加适应性免疫应答。此外，需要的是，表达至少一种细胞因子和至少一种抗原的iDC适于在以下本申请中进一步示出的方法和用途。特别地，DC必须表达在干细胞移植之后支持免疫缺陷性宿主中的功能性免疫系统再生的所有细胞因子。
优选地，iDC表达至少一种选自以下的细胞因子：GM-CSF、IL-4、IFN-α、IL-15、TGF-B、TNF-α、FLT3L、IL-3和CD40L。
更优选地，iDC表达选自以下组合的细胞因子的组合：(i)FLT3L和IL-3；(ii)FLT3L和CD40L；(iii)FLT3L和IFNα；(iv)GM-CSF和IFN-α和IL-15；(v)GM-CSF和IFN-α和TNF-α；以及(vi)GM-CSF和IFN-α和TGF-B。
更优选地，iDC表达选自以下组合的细胞因子的组合：(i)GM-CSF和IFN-α；(ii)GM-CSF和IL-4；以及(iii)GM-CSF和IL-15。
在SEQ ID NO：3中给出了核酸序列GM-CSF并且在SEQ ID NO：4中给出了编码IFNα的核酸。应理解，遗传密码是简并的以使得不同的三联体编码相同的氨基。因此，本发明还涉及编码与由SEQ ID NO：3和4编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的所有核酸序列。因为编码相同氨基酸的不同三联体在不同物种中以不同效率进行翻译，所以本申请设想通过密码子优化来优化核酸序列。
iDC的产生
此外，本发明涉及用于产生iDC的方法，其包括以下步骤：
a)从来源于合适供体的样品中分离祖细胞；
b)将所述细胞改造以实现至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子和至少一种抗原的表达。
优选地，上述方法包括以下步骤：
a)从来源于合适供体的样品中分离祖细胞；
b)在增强基因转移法和/或刺激所述祖细胞发育为树突细胞的细胞因子的存在下，在合适的培养基中孵育所述祖细胞。
c)用至少一个载体转染或转导细胞，所述载体适于表达至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子和至少一种抗原。
上文给出的所有定义也适用于该实施方案。
增强基因转移法的细胞因子是这样的细胞因子，当在转染之前或转染期间添加到生长培养基时其提高摄取外来核酸的效率。为了该目的优选的是GM-CSF、IL-4或其组合。
可将通过该方法产生的iDC培养在合适的培养基中直到进一步使用为止。然而，还可将其冷冻储存直到将其施用至患者为止。用于低温保存活细胞的方法是本领域技术人员已知的。
在本发明的一个优选的实施方案中，祖细胞是表达来源于人供体的CD14的外周血单核细胞并且用GM-CSF和IL-4补充或者用GM-CSF和IFNα补充方法步骤a)中的培养基。该实施方案优选地涉及在步骤c)中用于表达前述细胞因子和至少一种抗原的整合酶缺陷型慢病毒载体的用途。优选地，抗原是pp65。在实施例部分更详细地描述了该实施方案。
本发明iDC的治疗用途
此外，本发明涉及如上所述的iDC，其用作药物。
而且，本发明涉及如上所述的iDC，其用于在造血干细胞(HSC)移植之后使免疫缺陷对象的免疫系统再生。
优选地，对象是选自灵长类动物、啮齿类动物、猫、狗、猪、牛和羊的生物体。灵长类动物优选为人、黑猩猩或猕猴，最优选为人。啮齿类动物优选为小鼠或大鼠，最优选为小鼠。
小鼠优选地属于选自以下的品系：NOD-Rag1nullIL2Rynull-NRG、NOD/LtSz-SCID/IL2Rynull-NSG和NOD/SCID/IL2Rynull-NOG。用于产生人源化小鼠的老龄小鼠品系(例如Balb/c-Rag1nullIL2Rynul；NOD-SCID、NOD-SCIDβ2mnull)也是优选的。此外，还可使用表达对于小鼠中人细胞发育关键的人MHCI或MHCII或者人细胞因子(例如，GM-CSF、IL-3、IL-7、IL-15)之较新的转基因或敲入小鼠品系。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，小鼠的特征在于：
(i)在Prkdc基因的两个等位基因中的突变；
(ii)在编码IL2受体γ链的基因的两个等位基因中的突变；以及
(iii)在编码KITt受体的基因中的突变。
突变(i)和(ii)优选为功能丧失突变，即，防止产生基因产物或引起非功能性基因产物产生的突变。突变(iii)优选地导致KIT受体的功能受限或者是在确定条件下抑制基因产物形成的条件性无效突变。用于产生条件性无效突变的方法是本领域技术人员公知的。
优选地，小鼠是NOD小鼠。更优选地，其携带NOD Sirpa等位基因。
还将该小鼠称为NSC小鼠并且在DE 10 2012 207 453中描述，其通过引用并入，并且涉及小鼠及其产生。
免疫缺陷
术语“免疫缺陷”是指对象的免疫系统的任何病症，其特征在于与在年龄、性别和通常生活条件(例如，营养状态)方面与所述对象相匹配的相同物种的平均个体相比，受损的免疫应答。所述免疫缺陷优选地由以下所定义的至少一个组的免疫细胞的数量减少或功能受损所引起，导致对象对由细菌、病毒、真菌或其他单细胞真核生物所引起的感染疾病的易感性提高或者提高对恶性肿瘤的易感性。
在本领域中，“免疫受损”与“免疫缺陷”患者之间是有区别的，其中，后者示出比前者更弱的免疫应答。然而，如本申请所使用的术语“免疫缺陷”涵盖免疫系统之可能失调的整个谱，所述谱从增加频率的轻度感染到如例如可在X-连锁重度联合免疫缺陷中所观察到的免疫系统的整个分支的几乎完全缺失。
免疫系统包括两个主要分支，适应性免疫系统和先天性免疫系统。
先天性免疫系统对病原体的应答不特异于给定的病原体。先天性免疫系统相当依赖于特异于大量病原体所共有的分子结构之模式识别受体。介导先天性免疫应答的细胞是肥大细胞、吞噬细胞(树突细胞、巨噬细胞和嗜中性粒白细胞)以及天然杀伤细胞。
适应性免疫系统的应答特异于给定的抗原，因此，也受限于该抗原。适应性免疫系统的细胞具有在其成熟期间以随机方式在各细胞中单独形成的抗原受体。因此，适应性免疫系统包含具有许多不同受体的大的细胞库。如果对象遇到病原体，则诱导携带特异于病原体抗原的受体之细胞的那些亚群的增殖。之后，一旦从机体中消除病原体，这些细胞中的一些就形成记忆细胞群，如果再次遇到病原体，则所述记忆细胞群使得免疫应答更快速建立。
适应性免疫应答由T淋巴细胞和B淋巴细胞来介导。
有两个主要的T淋巴细胞组：(i)T辅助细胞，其特征在于CD4受体在其表面上表达，一旦其受体与合适的抗原相结合，就产生多种细胞因子。该细胞因子激活免疫系统的其他细胞。特别地，刺激通过B淋巴细胞的巨噬细胞的杀微生物功能和抗体的分泌。(ii)细胞毒性T细胞(CTL)，其特征在于CD8受体在其表面上表达，识别并杀伤由病毒或其他病原体感染的细胞并且识别并杀伤肿瘤细胞。由T辅助细胞来促进针对由主要组织相容性复合物I(MHCI)呈递之抗原的CTL激活。
B淋巴细胞分泌特异于由其受体识别之抗原的抗体。
根据免疫缺陷的原因，其可以是永久的或暂时的。由先天遗传的畸变造成的原发性免疫缺陷通常是永久的。如果免疫缺陷由电离辐射或细胞毒性药物引起，则其持续时间取决于药物或辐射的剂量。如果剂量高到足以杀伤对象中所有造血干细胞，则免疫缺陷将是永久的。如果仅杀伤一部分造血干细胞，则一旦剩余的造血干细胞能够重新进入(repopulate)不同的造血系，免疫缺陷就消退。
优选地，对象的免疫缺陷是由选自以下的免疫缺陷引起的：由电离辐射引起的免疫缺陷、由施用至少一种细胞毒性药物引起的免疫缺陷、原发性免疫缺陷和由病原体引起的免疫缺陷。还设想在对象中可存在两种或更多种前述免疫缺陷。
由电离辐射所引起的免疫缺陷可由意外或故意暴露于所述辐射引起。通常，故意暴露于电离辐射因治疗癌症而发生。电离辐射主要杀伤快速分裂的那些细胞。因此，适于治疗多种癌症，因为在许多情况下，癌症细胞的特征在于快速增殖。然而，包括造血干细胞的免疫系统细胞也对电离辐射高度敏感。因此，其可能在癌症的放射治疗过程中受到损伤。该损伤可能是实体瘤的器官特异性或组织特异性辐照的不期望副作用。然而，特别地，在由免疫系统的干细胞退化所引起的白血病的情况下，所有造血干细胞的完全消除通常是最后的选择。在这种情况下，在辐照之后移植同种异体造血干细胞是患者存活所需的。
用于癌症的放射治疗之典型类型的电离辐射是X射线、电子束(能量为4MeV到20MeV)、粒子辐射(质子、中子、离子化核)和来源于诸如钴-60、镭-226、铯-137或铱-192来源的γ辐射。
原发性免疫缺陷由在对象中损害或完全抑制至少一种类型的免疫细胞发育的遗传缺陷引起。
优选地，原发性免疫缺陷选自X-连锁重度联合免疫缺陷(SCID)、腺苷脱氨酶缺陷和IL-7Rα链缺陷。优选地，X-连锁SCID由IL-2RG的突变引起。
应理解，由造血干细胞移植所治疗的免疫缺陷还可以是由电离辐射和/或施用至少一种细胞毒性药物所加重的原发性免疫缺陷。
由施用至少一种细胞毒性药物所引起的免疫缺陷通常也是癌症治疗的典型作用。用于癌症治疗的细胞毒性药物经常杀伤除了癌细胞之外的免疫细胞(包括造血干细胞)。以通常使用的细胞毒性药物剂量，免疫缺陷通常是暂时的，因为并非患者中的所有造血干细胞都被杀伤。然而，如果将造血干细胞移植设想为对该病症的治愈，则本发明的方法将是有帮助的。
在对其他类型的治疗不再有响应的某些癌症(例如，霍奇金淋巴瘤)的严重情况下，使用称为“高剂量化疗”的化疗类型。虽然为了使所产生的免疫缺陷最小化而选择在其他化疗方案中的细胞毒性药物剂量，但是对象免疫系统的完全破坏是高剂量化疗的有计划的作用。出于这一原因，在完成高剂量化疗之后对象接受自体或同种异体造血干细胞移植。
典型的细胞毒性药物包括拓扑异构酶I或II的任何抑制剂，例如，喜树碱(topo I)或依托泊苷(topo II)；嵌入(interchelate)DNA的任何化合物，例如，多柔比星。特别优选的是烷基化物质、抗代谢物、抗生素、埃博霉素、细胞核受体激动剂和拮抗剂、铂化合物、干扰素和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制剂、环加氧酶和/或脂加氧酶(lypoxygenase)的抑制剂、铂配位络合物、吖丙啶(Ethyleneimenes)、甲基三聚氰胺(methylmelamines)、三嗪、长春花生物碱类、嘧啶类似物、嘌呤类似物、烷基磺酸盐、叶酸类似物、蒽二酮(anthracendiones)、经取代的脲、甲基肼衍生物，特别是氨苯砜乙酸、阿柔比星、安巴腙、氨鲁米特、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、亚叶酸钙、卡铂、卡培他滨(carpecitabine)、卡莫司汀、塞来考昔、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素氨苯砜、柔红霉素、双溴丙脒、己烯雌酚(diethylstilbestrole)、多西紫杉醇、多柔比星、烯二炔类、表柔比星、埃博霉素B、埃博霉素D、雌黏蛋白磷酸盐(estramucinphosphate)、依托泊苷、黄酮吡醇(flavopiridol)、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺、己烯雌酚二磷酸酯、呋喃唑酮、吉西他滨、六甲蜜胺、氨甲酰羟基胺、呋喃咪醇酮(hydroxymethylnitrofurantoin)、己酸孕酮、羟基脲、伊达比星、碘苷、异环磷酰胺、伊立替康、亮丙瑞林(leuprolide)、洛莫司汀、勒托替康(lurtotecan)、磺胺米隆硫醇胺(mafenide sulfate olamide)、氮芥、醋酸甲地孕酮、美法仑、米帕林、巯嘌呤、甲氨蝶呤、甲硝唑、丝裂霉素C、足叶酸乙酰肼、米托坦、米托蒽醌、光辉霉素、萘啶酸、硝呋拉太、硝呋酚酰肼、呋喃三嗪、硝呋莫司、尼莫司汀、ninorazole、呋喃妥因、氮芥、oleomucin、奥索利酸、喷他脒、喷司他丁、非那吡啶、酞磺胺噻唑、哌泊溴烷、松龙苯芥、preussin、丙卡巴肼、乙胺嘧啶、雷替曲塞、雷帕霉素、罗芬昔布、罗格列酮、柳氮磺吡啶、scriflavinium氯化物、司莫司汀、链脲酶菌素(streptozocine)、磺胺脲、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺千里酰、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺异唑、磺胺脒、磺胺胍、磺胺胍诺(sulfaguanole)、磺胺甲二唑、磺胺甲唑、复方磺胺甲基异唑(co-trimoxazole)、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺二甲唑、氨苯磺胺、磺胺异甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺噻唑、磺胺索嘧啶、星形孢菌素(staurosporin)、他莫昔芬、紫杉醇、替尼泊苷、tertiposide、硫鸟嘌呤、塞替派、替硝唑、拓扑替康、三亚胺醌、苏消安(treosulfan)、甲氧苄啶、曲磷胺、UCN-01、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春碱、长春瑞滨、以及佐柔比星、或者其各自的衍生物或类似物。
由病原体引起的免疫缺陷通过用病毒或细菌感染对象而引起。如果所述病原体直接与免疫系统的细胞相互作用，例如通过使用所述细胞作为宿主细胞，或者通过间接方式作用，则所述病原体引起免疫缺陷。间接方式包括分泌调节免疫细胞活性的物质或者从其祖细胞产生成熟的免疫细胞。此外，病原体可诱导宿主生物体的细胞分泌这样的化合物。在本申请中提及的由病原体引起的免疫缺陷优选地通过人免疫缺陷病毒(HIV)感染来引起。
免疫系统的再生
术语“使免疫缺陷对象中的免疫系统再生”是指改善免疫缺陷对象的免疫系统的整体功能。
优选地，提高了至少一种类型的免疫细胞的数量和/或活性。更优选地，提高了适应性免疫系统或先天性免疫系统的活性。还优选地，提高了B淋巴细胞或T淋巴细胞的活性和/或数量。
甚至更优选地，提高了免疫系统的两个分支二者中的免疫细胞数量和/或活性。
最优选地，作为免疫系统再生的结果，在年龄、性别和营养状态匹配的健康个体的免疫系统与已经通过HSC移植和施用本发明的iDC再生的对象的免疫系统功能之间没有显著差异。因此，最优选地，免疫系统的再生完全治愈了免疫缺陷。
然而，设想的是，为了抑制残留的宿主免疫系统对移植的HSC的排斥或者为了对抗移植物抗宿主病，移植的HSC的接受者可能需要免疫抑制治疗。这样的免疫抑制治疗的必要性并没有使得免疫系统的再生不完全，因为如在本申请中所理解的，该术语仅仅是指来自移植的HSC的免疫系统的潜在功能。
HSC的移植
术语“移植造血干细胞”是指从一个对象(“供体”)取出包含造血干细胞(HSC)的材料并将包含HSC的制剂施用给相同或不同对象(“接受者”)的过程。
在最简单的情况下，将由供体产生的包含HSC的材料施用给接受者，而不需要进一步的处理步骤。可将来源于外周血、脐带血和骨髓的HSC制剂直接施用给对象而不需要富集或消耗(depletion)包含在其中的细胞类型。在这些情况下，包含HSC的制剂与取自供体的材料相同。
然而，优选的是，通过从来源于供体的材料消耗T淋巴细胞来产生施用于接受者的制剂。这可通过从由供体产生的材料中移除CD8阳性和/或CD3阳性的细胞来实现。还优选的是，在施用于对象的HSC制剂中富集CD34阳性的细胞。如果HSC来源于外周血，则优选的是，在向对象施用之前富集CD34阳性的细胞。用于消耗或富集携带特异性表面抗原之细胞的手段和方法是本领域中常规的，例如，在实施例部分所描述的。
可通过本领域已知的各种方法来产生向对象移植的HSC。通常，供体的骨髓是用于移植的HSC的来源。在该方法中，从供体的大骨中移出HSC。
然而，通过单采血液成分术从外周血中产生干细胞已经成为最常用的方法。在产生HSC之前，为了增加外周血中的HSC的量，供体接受粒细胞集落刺激因子。将单采血液成分术用于从全血中分离白细胞(包括HSC)。储存白细胞以用于移植，而将血浆和红细胞返回到供体的循环中。
HSC的另一个来源是脐带血。脐带血是在出生之后从胎盘和脐带中产生的。脐带血具有比在成年外周血中正常发现的更高浓度的HSC。
在本发明的上下文中，优选的是，干细胞来源于三种上述来源之一。
HSC的移植是自体的或同种异体的。
在自体干细胞移植中，HSC的供体和接受者是相同的，即，包含在施用给对象的制剂中的HSC来源于相同的对象。如果对象的免疫缺陷是由高剂量化疗引起的，则HSC的自体移植是优选的。在这种情况下，可在高剂量化疗进行之前从对象中产生包含HSC的材料并且可在高剂量化疗完成之后将包含HSC的制剂施用至对象。
HSC的同种异体移植包括从一个或更多个对象中产生包含HSC的材料并将第一个对象的包含HSC的制剂施用给不同的对象。因此，供体和接受者是不同的。HSC同种异体移植的一个特别情况是HSC的异种移植。在这种情况下，HSC的供体和接受者属于不同物种。例如，在实验上进行HSC的同种异体移植以在人源化小鼠中建立人免疫系统模型来进行。
如果对象患有白血病、骨髓瘤、重症联合免疫缺陷、再生障碍性贫血或先天性中性粒细胞减少，则通常进行HSC的异源移植。在这些情况下，供体选择与接受者共享尽可能多的免疫学性质的供体。特别重要的是相同的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR和HLA-DQB1基因。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，HSC的移植是同种异体移植，其中供体和接受者是人。
与造血干细胞的移植相关的一个显著风险是移植物抗宿主病(GVHD)。这种病症的特征在于移植的免疫细胞针对接受者组织的反应。GVHD有两个亚型，急性GVHD和慢性GVHD。
急性GVHD发生在移植之后最初3个月期间，而慢性GVHD较晚发作。两种类型的不同之处在于所涉及的免疫细胞类型和细胞因子形式。通常，急性GVHD比慢性GVHD更严重。急性GVHD可能需要抑制免疫系统的强力药物。因此，许多患有急性GVHD并治疗其的患者发展成威胁生命的感染。
GVHD影响若干组织和器官：皮肤、黏膜、胃肠道、肝和肺。慢性GVHD还可损害外分泌腺和结缔组织。GVHD可以是轻度(1级)、中度(2级)或重度(3级和4级)，取决于涉及器官的数量和程度。患有1级GVHD的患者通常不需要治疗，而其他等级需要药理学免疫抑制。
GVHD的风险随着供体与接受者之间的人白细胞抗原(HLA)错配的数量而提高。出于这个原因，仔细地使HSC移植物的供体与接受者的HLA类型匹配。遗憾的是，人HLA分子的高度可变性和对良好匹配的需求使得为给定接收者寻找合适的供体变得相当困难。在一些情况下，由于在待通过HSC移植治疗疾病之前不能找到合适的供体，所以疾病进程治愈希望不大。
最佳的供体是具有与接受者相同的人白细胞抗原(HLA)-A、人白细胞抗原(HLA)-B、人白细胞抗原(HLA)-C和人白细胞抗原(HLA)-DRB1的个体。然而，前述基因座之一的错配是可以容忍的，特别是在没有患低风险疾病的患者中。低风险疾病优选为在第一慢性期中的慢性粒细胞性白血病、在第一缓解期中的骨髓增生异常综合征亚型难治性贫血或急性白血病。如果分析了另外的HLA基因座，则HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DRB3、HLA-DRB4或HLA-DRB5的单个错配是可接受的，而在这些二级基因座处的多个错配降低了存活率(Spellman等，2012，“Aperspective on the selection of unrelated donors and cord blood units fortransplantation”，Blood 120：259-265)。
出乎意料的是，在本发明的研究中使用的小鼠在组织学检查时仅示出GVHD的轻度(1级)体征，而没有通过肉眼或临床观察(体重、活动性、皮毛质量)到临床体征。这些结果表明，即使HSC的移植是异种的，即，在供体(人)与接受者(小鼠)之间的HLA分子错配是巨大的(参见实施例4)，也没有观察到严重的GVHD。显然，本发明的iDC的存在提高了移植的免疫细胞对接受者组织的耐受。
因此，在本发明的另一个优选的实施方案中，HSC的移植是同种异体的，其中供体和接受者是人并且具有比本领域已知的HSC移植方法所需更低的HLA匹配。
特别地，选自以下的基因座的至少2个或3个错配是可接受的：HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1。也将该组称为HLA基因座的“初级组”。更优选地，在前述组中的2个或3个错配是可接受的。最优选地，前述HLA基因座的2个错配是可接受的。
优选地，就由HLA-DQ、HLA-DP、HLA-DRB3、HLA-DRB4和HLA-DRB5组成的组而言，至少2个、至少3个、至少4个或至少4个错配是可接受的。将该组称为HLA基因座的“次级组”。更优选地，2个或3个错配是可接受的。并且，最优选地，2个错配是可接受的。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，选自第一组的基因座的至少2个错配和选自第二组的基因座的至少2个错配是可接受的。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，选自第一组的基因座的至少2个错配和选自第二组的基因座的至少3个错配是可接受的。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，选自第一组的基因座的至少2个错配和选自第二组的基因座的至少4个错配是可接受的。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，选自第一组的基因座的至少3个错配和选自第二组的基因座的至少2个错配是可接受的。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，选自第一组的基因座的至少3个错配和选自第二组的基因座的至少3个错配是可接受的。
在本发明的又一个特别优选的实施方案中，选自第一组的基因座的至少3个错配和选自第二组的基因座的至少4个错配是可接受的。
在另一个优选的实施方案中，HSC的移植是异种的，其中供体是人而接受者是啮齿类动物，优选为具有原发性免疫缺陷的小鼠，最优选为重度联合免疫缺陷SCID，例如，X连锁SCID(具有在IL-2RG中的突变)或者在来源于重组激活基因(RAG-1和RAG-2)的酶中。
在异种HSC移植的一个优选的实施方案中，接受者是本申请上面所述的NRG小鼠并且HSC的供体是灵长类动物，更优选为人。
此外，本发明涉及如上所述的iDC，其能够在干细胞移植之后使调节性T细胞(Treg)内源再生。之前称作抑制性T细胞的Treg是调节免疫系统、保持对自身抗原耐受和消除自身免疫病的T细胞的亚群。小鼠模型已经表明Treg的调节可治疗自身免疫病，促进器官移植。小鼠研究已经揭示了具有在体外产生和操作的致耐原性DC的治疗性疫苗在抑制实验性自身免疫中的效率。在错配的骨髓移植模型中，供体来源的CD4(+)CD25(+)FOXP3(+)调节性T细胞(Treg)的过继转移保护小鼠免受移植物抗宿主病。通过一些组记录了来自探索类似策略的人中之第一临床试验的结果并且似乎证实了在同种异体干细胞移植之后，Treg预防严重并发症(例如，移植物抗宿主病)的效率。在人中，Treg可以是确定的免疫表型如CD4+/CD127-CD25hi或CD4+/CD127-CD25hiFOXP3+细胞。因此，可将本发明的iDC用于治疗由HSC移植物的接受者所经历的移植物抗宿主病。
此外，本发明涉及如上所述的iDC，其用作用于治疗淋巴性扩散的癌症或由嗜淋巴细胞病原体引起的疾病的药物。
本发明的iDC优先地经过淋巴管迁移至淋巴结。出于这个原因，其特别适于治疗涉及淋巴结的疾病。
癌症的一个标志是其在整个机体全身性地扩散从而导致转移形成的能力。一旦出现转移，原发性肿瘤的手术切除或辐照就不足以治愈疾病。如果转移很少，则可用手术和/或放射治疗来移除所述转移。然而，在大多数情况下，转移的数量太过散布(disseminated)以使得不可通过前述手段移除。在这一点上的癌症疾病，全身治疗(如化疗)是使其保留治愈机会的唯一治疗手段。然而，在许多情况下，化疗无法杀伤所有癌症细胞或者癌症获得针对药物的抗性。因此，至关重要的是防止癌细胞的全身扩散。
癌症的全身扩散存在两个主要途径：循环系统和淋巴系统。在后一种情况下，肿瘤细胞迁移至肿瘤位于其中的淋巴管引流区域中。然后，细胞迁移至局部淋巴结。这些淋巴结还被称为“警戒淋巴结”。淋巴结引流特定区域的分析是肿瘤的手术切除的常规部分，在警戒淋巴结中是否存在癌细胞是疾病阶段和选择适当治疗的重要参数。在警戒淋巴结中存在癌细胞与预后不良有关。
本发明的iDC具有介导杀伤存在于淋巴结中之癌细胞的潜力，从而进一步阻断疾病的淋巴扩散。就iDC的该用途而言，优选的是，其表达由所讨论的癌细胞所呈递的抗原。
优选的根据本发明来治疗的癌症选自黑素瘤和乳腺癌、恶性血液病(白血病、淋巴瘤)、神经系统恶性肿瘤(神经胶质瘤、胶质母细胞瘤)、前列腺癌、肺癌、结肠癌和肝癌。黑素瘤和乳腺癌的治疗是特别优选的。
优选地，用于治疗淋巴性扩散的癌症的iDC表达至少一种选自以下的抗原：TRP2、MART1、WT1和酪氨酸酶(所有均来源于黑素瘤)以及WT1、Her2/neu和BRCA1/2(所有均来源于乳腺癌)。
在淋巴系统中存在主要地或甚至唯一地发现的病原体。就在这样的疾病的治疗中的用途而言，iDC优选地表达至少一种还由各自的病原体表达的抗原。
病原体优选地选自病毒、细菌、真菌和单细胞真核生物。更优选地，其为病毒，最优选为HIV。优选地，用于治疗HIV的iDC表达抗原gag和env。
用于使免疫系统再生的方法
此外，本发明涉及用于使免疫缺陷对象中的免疫系统再生的方法，其包括以下步骤：
a)将造血干细胞移植到对象中；以及
b)向所述对象施用iDC，所述iDC被改造为表达至少一种抗原和至少一种诱导人DC祖细胞自主分化为DC的细胞因子。
上文给出的对于iDC的所有定义及其治疗用途也适用于该实施方案。
优选地，将上述方法用于产生具有人源化免疫系统的小鼠。因此，对象优选为小鼠。更优选地，小鼠属于选自以下的品系：NOD-Rag1nullIL2Rynull-NRG、NOD/LtSz-SCID/IL2Rynull-NSG和NOD/SCID/1L2Rynull-NOG。
优选地，HSC来源于人并且抗原是pp65。此外，优选的是，iDC表达抗原pp65和细胞因子(i)GM-CSF和(ii)干扰素-α或白介素-4或白介素-15。更优选地，该表达通过载体介导，并且最优选地，其通过整合酶缺陷型慢病毒载体介导。
与在HSC移植之前或移植之后没有接受本发明iDC的小鼠相比，通过该实施方案产生的小鼠具有功能改善的人源化免疫系统。
这种类型的异种HSC移植在啮齿类动物(优选小鼠)中建立了人免疫系统。这样的具有人免疫系统的动物是有价值的研究工具，其可用于某些因为伦理或逻辑原因不能在人中进行的实验。遗憾的是，该动物模型有一些缺点。在人HSC移植之后，淋巴组织仅仅很差地发育。出乎意料地，在人HSC移植之后，向小鼠施用本发明的人iDC导致在治疗的小鼠中改善了包含人T细胞和DC之淋巴结的重建，因此，使得这些小鼠成为人免疫系统的更好模型。
目前可用的基于人源化免疫系统(HIS)的小鼠模型表现出功能性T细胞，特别是功能性细胞毒性T细胞的发育不良，所述T细胞能够经过主要组织相容性复合物(MHC)识别和裂解呈递抗原表位的靶细胞。与此相反，根据本发明产生的具有人免疫系统的小鼠表现出增加的频率和改善的T淋巴细胞活性。此外，根据本发明产生的具有人免疫系统的小鼠表现出与人免疫球蛋白(例如，IgM、IgG)和抗原特异性人抗体的产生相关的成熟B细胞之频率的增加。此外，根据本发明产生的具有人免疫系统的小鼠表现出胸腺中的人T细胞之增强的发育和Treg的正常发育。
因此，本发明的另一个优选的实施方案涉及通过上述方法产生的具有人源化免疫系统的小鼠以及该小鼠用于研究人免疫系统或用于测试药物、植入物或装置在人中之使用的用途。一个优选的用途是用该小鼠模型研究人适应性免疫系统。
因为不期望植入物在人体中引起炎症，所以在本发明的人源化小鼠模型中的植入物测试是一个特别优选的用途。
附图说明
图1：Smyle/pp65产生和表征。(a)通过磁性选择来分离来自GCSF动员(mobilize)的健康供体的CD14+单核细胞并且对于Smyle/pp65用LV-GM-IFNα与LV-pp65或者对于常规DC(Con-IFN/pp65)产生单独使用LV-pp65来进行共转导。在重组细胞因子，即，GM-CSF和IFN-α的存在下，将Con-IFN/pp65 DC始终维持在培养物中。(b)在不同时间点(7天、14天和21天)在培养的Smyle/pp65或Con-IFN/pp65中评估由复苏(recovery)的平均百分比所表示的细胞生存力。在培养至多三周的Smyle/pp65和Con-IFN/pp65中通过流式细胞术来分析(c)CMV-pp65的表达和(d)树突细胞表型的稳定性。数据表示每个时间点的至少三个不同供体的平均值。＊p＜0.05
图2：在Smyle/pp65(未补充有重组细胞因子)和Con-IFN/pp65(补充有重组GM-CSF和IFN-α)细胞培养物上清液中累积的细胞因子。(a)在7天之后的细胞因子形式。(b)在14天之后的细胞因子形式。(c)在21天之后的细胞因子形式。
图3：Smyle/pp65免疫显著增强了在HIS-NRG小鼠的外周血中的人CD3+T细胞的频率。(a)HIS-NRG小鼠由人CD34+造血干细胞(HSC)的转移产生。在HSC重建之后第10周和第11周在右胁中向小鼠皮下注射Smyle/pp65或Con/pp65。(b)在HSCT之后第10周、第13周和第20周在对照HIS小鼠、经Smyle/pp65免疫的HIS小鼠或经Con-IFN/pp65免疫的HIS小鼠的外周血中之CD45+/CD3+人T细胞的频率。
图4：Smyle/pp65免疫显著增强了HIS-NRG小鼠中人CD3+T细胞和效应记忆细胞毒性T细胞的频率。(a)在获自HIS-NRG小鼠的脾的单核细胞中之人CD45+细胞和CD3+细胞的频率。(b)在HSCT之后20周在来自HIS小鼠的脾中之人CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的相对频率以及CD45RA+/CD62L+幼稚和效应记忆CD45RA-CD62L-亚群的对应频率。＊p＜0.05
图5：在用Smyle/pp65免疫HIS-NRG之后，淋巴结的肉眼检测。(a)在用Smyle/pp65细胞免疫的小鼠中的外周淋巴结(LN)的肉眼检测。(b)小鼠示出的在身体不同部分中的可检测之LN的频率。
图6：从野生型C57BL/6和经Smyle/pp65免疫的HIS小鼠中获得的LN的免疫荧光分析。人T细胞和DC填满了HIS-NRG小鼠免疫的小鼠中的LN原基(Anlage)。
图7：用于监测皮下(s.c.)施用到之前用SmyleDC/pp65免疫的HIS-NRG小鼠中之SmyleDC/pp65-flUC迁移的光学成像分析。(a)实验流程图。(b)检测HIS-NRG小鼠中的生物发光信号。(c)在其中注射SmyledC/pp65-fLUC的同侧相对于对侧上检测的量化的生物发光信号。
图8：在HIS-NRG免疫之后CMV特异性细胞毒性T细胞应答的表征。(a)从用Smyle/pp65免疫的HIS-NRG中复苏的LN中的人CD45+、CD3+和CD19+细胞的频率。(b)人CD4+和CD8+T细胞CD45RA+/CD62L+幼稚、效应记忆(EM)CD45RA-CD62L-、中枢记忆(CM)CD45RA-CD62L+和CD45RA+/CD62L-末端效应(TE)的相对频率。(c)从分离自经Smyle/pp65免疫的小鼠之LN中获得细胞并将其与自体Smyle/pp65或Smyle(没有抗原)共培养7天。通过用CMV-pp65重叠肽孵育过夜来进行再刺激并且对IFNγ斑点(spot)进行计数。(d)从获自在hIL-7和hIL-15的存在下用人抗CD2、CD3和CD28抗体活化72小时的对照、经Con-IFN/pp65免疫的HIS-NRG和经Smyle/pp65免疫的HIS-NRG之脾细胞中分选的人CD3+细胞。
图9：在HIS-NRG小鼠中的B细胞应答。在外周血(A)和脾(B)中的人B细胞的频率以及在HIS-NRG血清中的人免疫球蛋白G和M的检测。
图10：(A)从获自G-CSF动员的CD34+干细胞供体的单核细胞中产生ConvDC和SmyleDC的流程图。在该研究中，将这两种类型的DC用表达pp65抗原的慢病毒载体共转导。(B)人造血干细胞向NRG小鼠的移植、免疫和分析的时间表。(C)用于分析针对在经免疫的NRG小鼠中产生之pp65的人T细胞应答的方法。
图11：来自GCSF动员的供体的人常规(ConvDC)和SmyleDC的产生与分析。(A)将编码CMV-pp65蛋白质的单顺反子整合酶缺陷型LVLV-CMV-pp65单独用于产生ConvDC，而将LV-CMV-pp65加编码人GM-CSF和人IFN-α的双顺反子LV载体用于共转导单核细胞并产生SmyleDC。(B)在SmyleDC保持培养多至21天的上清液中每周测量人GM-CSF和IFN-α产生。(C)由每周复苏的活细胞百分比表示的ConvDC和SmyleDC的细胞生存力，持续至多21天。通过流式细胞术每周评估了(D)CMV-pp65、(E)CD14的表达以及(F)在DC培养物中的DC分化的稳定性(通过CD11c、HLA-DR、CD86、CD83和CD80的表达测量)。(G)通过DC1、DC2和趋化因子的细胞因子珠阵列分析了每周从ConvDC和SmyleDC获得的细胞上清液。数据表示来自至少三个不同供体的至少三次独立实验的平均值。＊p＜0.05
图12：在转导之后那天将由另外的用表达萤火虫荧光素酶的慢病毒载体进行的共转导产生的SmyleDC皮下注射入NRG小鼠。向小鼠(n＝6)腹膜内施用荧光素并且进行光学成像分析以定位生物发光信号。在SmyleDC/荧光素酶施用之后第14天、第30天和第45天测量在目的区域中检测到的生物发光并对每只小鼠进行绘图。
图13：SmyleDC免疫增加了血浆中的人细胞因子的检测和人T细胞的扩增。(A)在来自对照、经ConvDC免疫的HIS小鼠或经SmyleDC免疫的HIS小鼠的血浆中检测人细胞因子(在HCT之后第20周)。条表示细胞因子浓度(pg/mL)的平均值并且误差条表示SEM。(B)在初免(prime)/加强免疫之前(第10周)、在免疫之后2周(第13周)和在免疫之后8周(第20周)进行相对于对照、经ConvDC免疫的HIS小鼠或经SmyleDC免疫的HIS小鼠的外周血中之(C)CD3+、(D)CD19+、(E)CD4+和(F)CD8+细胞的表达之人CD45+、造血细胞和亚级分的移植物分析。数据表示对照(n＝10)、经ConvDC免疫的小鼠(n＝7)和经SmyleDC免疫的小鼠(n＝22)的分布。
图14：SmyleDC免疫之后在HIS-NRG中的引流淋巴结和淋巴流的再生以及存在于再生的LN中的人细胞的表征。(A)在最后一次SmyleDC免疫之后8周，腹股沟LN和腋窝LN的肉眼检测。用Axiocam荧光显微镜(Zeiss)在10倍放大下获得图像并使用Axiowert软件(Zeiss)进行分析。(B)在SmyleDC注射侧(IS，黑色条)的同侧或对侧(CL，空白条)处，具有再生的LN的小鼠的频率，证明了局部淋巴再生和全身性淋巴再生两者。(C)在从经SmyleDC免疫的小鼠中复苏的LN(n＝4)中(C)人CD45+、CD3+和CD19+细胞以及(D)CD4+和CD8+T细胞的平均频率。(E、F)在CD4+和CD8+LNT细胞(n＝4)中的CD45RA+/CD62L+幼稚、CD45RA-CD62L+中枢记忆和CD45RA-CD62L-效应记忆亚群的分别表征。(G)在获自经SmyleDC注射的HIS小鼠的混合LN(n＝8)中分析了在CD3中的滤泡T辅助细胞(表达CD4+CXCR5+hiPD-1+ICOS+)的频率，证实了在小鼠中的人T细胞的内源产生。使用人扁桃体细胞用作阳性对照。(H)在来自混合的人源化LN和人扁桃体细胞的CD19+细胞中的CD24hiCD38hi过渡(transitional)、IgD+CD24intCD38int成熟和CD27hiCD38hi成浆细胞的相对频率，示出在小鼠中的人B细胞的内源产生。
图15：SmyleDC/荧光素酶向邻近淋巴结和对侧淋巴结的迁移。随后，向移植有人CD34+细胞并用SmyleDC免疫的(第10周、第11周)NRG小鼠施用SmyleDC/荧光素酶(在第20周)。扩散到预形成的再生LN的生物发光信号(可通过外部成像或通过外植的LN分析检测)证明了SmyleDC的迁移能力以及在LN中细胞的高生存力(多至21天)。
图16：在小鼠脾中的人DC的检测。从移植有人CD34+细胞并用SmyleDC或ConvDC免疫的(第10周、第11周)或未免疫的对照并且在第20周处死的NRG小鼠收集脾。通过免疫染色和流式细胞术来分析脾细胞中骨髓DC(Lin-，HLA-DR+CD11c+)和类浆细胞DC(Lin-，HLA-DR+CD123+)的存在。数据示出在小鼠中内源地产生了人树突细胞。
图17：脾中人细胞群或HIS-NRG小鼠SmyleDC的绝对数量的扩增。(A)表示在HCT之后第20周，来自对照、经ConvDC免疫的小鼠和经SmyleDC免疫的小鼠之每个脾的人CD45+、CD3+和CD19+细胞的总细胞数的散点图。在(B)CD4+T细胞和(C)CD8+T细胞中来自总亚群、CD45RA+/CD62L+幼稚亚群和CD45RA-CD62L-效应记忆亚群之每个脾的细胞计数。来自对照、经ConvDC免疫的小鼠和经SmyleDC免疫的小鼠之每个脾中的(D)CD3+CD4+CXCR5+hiPD-1+ICOS+滤泡T辅助细胞的总细胞数以及(E)CD19+CD24hiCD38hi过渡细胞、CD19+IgD+CD24intCD38int成熟细胞和CD19+CD27hiCD38hi成浆细胞的总细胞计数。条和误差条分别表示平均值和SEM。＊表示p＜0.05。数据证明了SmyleDC在量上以及潜在地在量上扩增了(较广的T细胞受体和B细胞受体库)HIS-NRG小鼠中的成熟人T细胞和B细胞库。
图18：在SmyleDC免疫之后针对pp65 HIS-NRG的人T细胞应答和体液应答。(A)在免疫之后8周，从来自对照(n＝4)、经ConvDC免疫的HIS小鼠(n＝4)和经SmyleDC免疫的HIS小鼠(n＝6)的脾细胞中分选人CD3+细胞。在用SmyleDC离体扩增10天之后，在CMV-pp65重叠混合肽的存在(pp65pp)和不存在(无Ag(NoAg))下，在抗IFN-γ包被的板上进行过夜的再刺激。条表示2×104个细胞的IFN-γ阳性斑点(spot)的平均值。(B)用从获自经SmyleDC免疫的HIS-NRG(n＝4小鼠)的LN复苏的效应细胞来进行类似操作，其与获自CMV血清阳性人供体的PBMNC平行测定。数据表示在2×104个细胞中的平均IFN-γ阳性斑点。(C)在人CD19+细胞中表达CD27+CD38+IgG+的细胞的频率。在免疫之后8周，在来自对照和经DC免疫之小鼠的血浆中的(D)总免疫球蛋白(Ig)G和(E)IgM的量化。在免疫之后8周，在来自对照、经ConvDC注射的小鼠和经SmyleDC注射之小鼠的血浆中的(F)pp65特异性IgG和(G)pp65特异性IgM的量化。将来自系统性红斑狼疮(SLE)患者的血浆样品用作pp65特异性IgG和pp65特异性IgM两者的阳性对照。条和误差条分别表示平均值和SEM。“nd”代表未检出。＊表示p＜0.05。数据证明了在小鼠中的功能性人适应性抗原特异性T细胞和B细胞应答。
图19：通过重量和组织学分析监测移植物抗宿主病(GVHD)。(A)在重量增益的时间内监测移植有人CD34+细胞并用SmyleDC或ConvDC免疫的(在第10周、第11周)4周龄NRG小鼠或未经免疫的对照。未观察到显著差异。在处死之后，收获皮肤和结肠试样并分析GVHD的体征。(B)皮肤和结肠的组织学分析(400×H&E染色)分别示出在用SmyleDC免疫的4只小鼠中的2只和用SmyleDC免疫的4只小鼠中的3只为轻度1级GVHD。可检测到一些凋亡碎片，但是淋巴细胞的局灶(focal)和少量浸润表明没有炎症。该数据证明即使在小鼠中再生了完全适应性人异体移植免疫系统，也未观察到重度或中度的移植物抗宿主病。
图20：通过用缺乏抗原的双顺反子载体(IDLV-GMCSF-2A-IFNa)转导单核细胞来产生SmyleDC或者通过用共表达pp65抗原的三顺反子载体(IDLV-GMCSF-2A-IFNa-2A-pp65)转导单核细胞来产生SmyleDC/pp65的实验流程图。(A)SmyleDC/pp65产生的流程图。(B)免疫和分析的时间表。(C)对在经免疫的小鼠中产生的人T细胞应答的分析。
图21：SmyleDC和SmyleDC/pp65的产生。a)双顺反子和三顺反子慢病毒载体的示意图。b)活细胞的复苏：相对于在第0天的经转导单核细胞的输入之在第7天、第14天和第21天复苏的总活SmyleDC(灰色)和SmyleDC/pp65(黑色)(表示为百分比)。c)在第7天、第14天和第21天由CD86+/HLA-DR+细胞的FACS分析的DC表面抗原表达的稳定性。d)在第7天、第14天和第21天由SmyleDC/pp65的细胞内染色分析的pp65表达的持续性。e)在第7天的相关DC免疫表型标志物(CD14、HLA-DR、HLA-ABC、CD80、CD86、CD83、CD11c和CD123)的表达(表示为百分比)。f)使用细胞因子珠阵列在第7天于SmyleDC和SmyleDC/pp65上清液中可检测到的分泌的细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p70、IFN-γ、MCP-1、TNF-α)以及转基因细胞因子(GM-CSF和IFN-α)。用从三个不同供体获得的单核细胞作为独立的三份来进行所有分析。数据证明了全pp65抗原的共表达并未改变iDC的特性。
图22：使用从脐带血中获得的单核细胞来产生SmyleDC/pp65并进行免疫表型分析。(a)用第7天的SmyleDC/pp65进行流式细胞术分析的代表性实例。(b)免疫表型标志物阳性细胞(n＝4)的频率。数据证明了从用于干细胞移植的人脐带血材料中产生SmyleDC是可行的并且是可重现的。
图23：整合酶活性(integrase competent，IC)和整合酶缺陷型(integrase defective，ID)慢病毒载体的整合分析。a)在第10天、第20天和第30天收获的每个用IC-LV或ID-LV产生的SmyleDC/pp65之细胞的整合的LV拷贝数，并通过qPCR分析DNA。b)将LAM-PCR用于分析从基因+/-10kb分布的整合位点的频率。IC-LV(灰色)和ID-LV(黑色)。c)相对于在基因阅读框的任意上游的转录起始位点(TSS)之整合位点的频率。d)在基因座中可检测到的10个主要整合位点(灰色框表示回归的基因间或基因内分析)以及描述在每个基因中的相对插入频率的动力学分析。数据证明了对于ID-LV，很少观察到慢病毒整合，并且整合模式并未指示致癌发展的热点。
图24：用HCMV进行的慢病毒载体化DC的感染。a)通过从0d.p.i至10d.p.i的GFP表达示出HCMV感染(MOI＝1)动力学的流式细胞术分析。人成纤维细胞(HF)为阳性对照并且比较包括表达GMCSF/IL4的iDC(SmartDC)、表达GMCSF/IFNa的iDC(SmyleDC)或表达GMCSF/IFNa/pp65的iDC(SmyleDC/pp65)。b)示出在HCMV感染之后在若干d.p.i.处的CD80表达之改变的流式细胞术分析。百分比表示比较未感染的细胞(模拟，左图)与HCMV感染(右图)之CD80+细胞的分析。c)在细胞上清液中释放的HCMV病毒体的检测。在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天收集来自各感染细胞培养物的上清液并将其用于感染HF细胞。通过噬斑形成测定来确定新产生的病毒。在各时间点测定噬斑数并表示为pfu/ml。数据证明了由于在细胞中IFN-a的表达，SmyleDC并不扩散HCMV。
图25：用SmyleDC/pp65进行的T细胞体外刺激。a)不刺激从HCMV血清阳性供体(n＝3)获得的CD3+T细胞，将其用pp65肽或SmyleDC或SmyleDC/pp65在体外刺激16小时。CD4+和CD8+T细胞产生IFN-γ+的平均频率(n＝3)，＊p＜0.05并且示出了来自一个供体的代表性点印迹分析。b)在微量培养中的CD8+T细胞扩增。在IL-2、IL-7、IL-15细胞因子和经辐照的饲养细胞的存在下，以10∶1的比用APC(SmyleDC或SmyleDC/pp65)在体外刺激CD8+T细胞两个周期。将没有APC的T细胞用作对照。左边条形图：通过台盼蓝排除来测定各组中扩增的T细胞的绝对数量。右边条形图：用针对pp65表位反应的五聚物来染色扩增的T细胞(A＊0201-NLVPMVATA：白色/B＊07-TPRVTGGGAM：黑色)，＊p＜0.05。c)细胞毒性测定。将用SmyleDC或SmyleDC/pp65扩增的CD8+T细胞与靶细胞(表达HLA＊A2或HLA＊B7+/-pp65的K562)以不同的效应物∶靶标(E∶T)比接种并共培养4小时。通过测量偶联酶促测定来评估细胞上清液的LDH释放。数据证实了SmyleDC/pp65体外扩增对pp65有反应性的记忆T细胞的功能。
图26：免疫植入有来自G-CSF供体之CD34+HSC的NRG小鼠以评估pp65在SmyleDC/pp65中共表达的作用。a)实验流程图。在移植之后第10周和第11周用SmyleDC或者SmyleDC/pp65来免疫移植有G-CSF动员的干细胞的4周龄经辐照NRG小鼠。在第20周收集血液、血浆、脾和骨髓。b)在外周血中的人淋巴细胞扩增的动力学。在第10周、第13周和第20周，于DC免疫之前和之后测定血液中的人T辅助细胞(CD45+/CD4+)和CTL(CD45+/CD8+)的频率。c)在外周血中的人B细胞扩增的动力学。通过FACS分析在经免疫的NRG小鼠的血液中测定人B细胞(CD45+/CD19+)细胞的频率。d)左边条形图：通过FACS测定的在脾中的CD4+、CD8+和CD19+细胞的绝对数量；右边条形图：在从用SmyleDC(n＝5)和SmyleDC/pp65(n＝2)免疫的小鼠中复苏的CD4+和CD8+群中测定的T细胞亚群：幼稚(N，白色)、T中枢记忆(TCM，灰色)和T效应记忆(TEM，黑色)。数据表明SmyleDC/pp65产生内源再生的成熟辅助T细胞和细胞毒性T细胞的能力。
图27：植入有成年CD34+细胞并用SmyleDC/pp65免疫之NRG小鼠的功能性作用。a)在移植有成年HSC并用SmyleDC或SmyleDC/pp65免疫之NRG小鼠的血浆中可检测的人细胞因子(pg/ml)。b)将从移植有成年HSC并用SmyleDC/pp65免疫的小鼠(n＝3)中获得的混合并分选的CD4+或CD8+脾细胞用SmyleDC/pp65在体外扩增并用无关的肽库(TRP2)或用pp65肽库在IFN-γ ELISPOT板测定上进行脉冲。c)与获自人供体(n＝3)的血浆相比，在移植有成年HSC并用SmyleDC(n＝5)或SmyleDC/pp65(n＝5)免疫之NRG小鼠的血浆中可检测的人免疫球蛋白(ng/ml)：IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。e)通过ELISA测量的获自用SmyleDC(n＝3)或SmyleDC/pp65(n＝3)免疫之小鼠的小鼠血浆IgM和IgG对pp65的反应性。数据证明了需要pp65来再生功能性人免疫应答(细胞因子和免疫球蛋白)以及抗原特异性应答(T辅助细胞、CTL、IgG)。
图28：植入有UCB CD34+HSC的NRG小鼠的免疫。a)实验流程图。移植有UCB干细胞的4周龄经辐照的NRG小鼠对照(n＝7)、在移植之后在第10周和第11周用SmyleDC/pp65免疫两次(n＝8)或者在第6周、第7周、第10周和第11周免疫四次的4周龄经辐照的NRG小鼠(n＝4)。将未经免疫的小鼠用作对照。在第16周收集血液、血浆、脾和胸腺。b)在外周血中的人淋巴细胞重建的动力学。通过FACS分析在经免疫小鼠的血液中测定人T辅助细胞(CD45+/CD4+)、CTL(CD45+/CD8+)和B细胞(CD45+/CD19+)的频率。c)测定为人T辅助细胞或CTL的绝对数量之脾中的T细胞亚群的发育动力学：幼稚(N)、T中枢记忆(TCM)和T效应记忆(TEM)。d)在胸腺发育不同阶段的T细胞分析。DP：CD45+/CD4+/CD8+，CD4SP：CD45+/CD4+/CD8-，CD8SP：CD45+/CD4-/CD8+，CD3 lo ：CD45+/TCRαβ-/TCRγδ-，CD3αβ hi ：CD45+/TCRαβ+，CD3 γδ hi ：CD45+/TCRγδ+。f)在血液中作为CD4+/CD127-CD25hi或CD4+/CD127-CD25hiFOXP3+测定的Treg的频率。数据证明了SmyleDC免疫还刺激了来源于新生儿脐带血干细胞的免疫系统的再生。该作用包括在胸腺中的T细胞的早期发育并且不影响作为γδT细胞和Treg之耐受细胞的频率。
图29：植入有脐带血CD34+细胞并且用不同剂量的SmyleDC/pp65免疫之NRG小鼠的功能性作用。将获自移植有脐带血HSC并且未经免疫的(对照)、用SmyleDC/pp65免疫2次的(2×)或用SmyleDC/pp65免疫4次的(4×)小鼠(n＝2)之分选的CD3+脾细胞用SmyleDC/pp65在体外扩增并且不进行刺激或者用无关的肽库(TRP2)进行脉冲或者用pp65肽库进行脉冲。进行a)CD4+/IFN-γ+的细胞内分析和b)CD8+/IFN-γ+的细胞内分析以测定反应性T细胞的频率。c)与用SmyleDC/pp65免疫4次的经移植小鼠(n＝5)相比，在移植有脐带血HSC的对照NRG小鼠(n＝5)的血浆中可检测的人免疫球蛋白(ng/ml)：IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。d)通过ELISA测量的获自对照小鼠或用SmyleDC/pp65免疫4次的小鼠(n＝3)之小鼠血浆IgG对pp65的反应性。包括人血浆作为阳性对照。数据证明了可产生作为针对抗原的T细胞和B细胞应答两者之来源于脐带血干细胞的功能性人免疫系统的内源再生。
在第一方面，本发明涉及被改造为表达以下的经诱导树突细胞(iDC)：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述经诱导树突细胞用作药物。
在第二方面，本发明涉及被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述iDC用于在造血干细胞(HSC)移植之后使免疫缺陷对象的免疫系统再生。
在第三方面，本发明涉及根据第2方面所述的iDC，其中载体是慢病毒载体。
在第四方面，本发明涉及根据第3方面所述的iDC，其中所述慢病毒载体为整合酶缺陷型。
在第五方面，本发明涉及根据第2方面至第4方面中任一个所述的iDC，其中表达至少一种抗原的所述iDC表达至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子。
在第六方面，本发明涉及根据第5方面的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、IL-4、IFN-α、IL-15、TGF-B、TNF-α、FLT3L、IL-3和CD40L。
在第七方面，本发明涉及根据第6方面所述的iDC，其中所述iDC表达选自以下的细胞因子的组合：(i)FLT3L和IL-3；(ii)FLT3L和CD40L；(iii)FLT3L和IFNα；(iv)GM-CSF和IFN-α和IL-15；(v)GM-CSF和IFN-α和TNF-α；以及(vi)GM-CSF和IFN-α和TGF-B。
在第八方面，本发明涉及根据第2方面至第7方面中任一个所述的iDC，其中通过所述iDC来表达的一种抗原是可诱导选自以下的细胞毒性免疫应答或体液免疫应答的抗原：异种反应性、同种异体反应性、新反应性或自身免疫。
在第九方面，本发明涉及根据第2方面至第8方面中任一个所述的iDC，其中所述对象的免疫缺陷是选自以下的免疫缺陷：由电离辐射引起的免疫缺陷、由施用至少一种细胞毒性药物引起的免疫缺陷、原发性免疫缺陷和由病原体引起的免疫缺陷。
在第十方面，本发明涉及根据第2方面至第9方面中任一个所述的iDC，其中所述造血干细胞移植物是自体的。
在第十一方面，本发明涉及根据第2方面至第9方面中任一个所述的iDC，其中所述干细胞移植物是异源的。
在第十二方面，本发明涉及根据第2方面至第11方面中任一个所述的iDC，其中所述对象是人。
在第十三方面，本发明涉及被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述iDC用作用于治疗淋巴性扩散的癌症或由嗜淋巴细胞病原体引起的疾病的药物。
在第十四方面，本发明涉及包含至少一种整合酶缺陷型慢病毒载体的iDC，其中所述载体介导以下表达：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
在第十五方面，本发明涉及用于使免疫缺陷对象中的免疫系统再生的方法，其包括以下步骤：
a)将造血干细胞移植到所述对象中；以及
b)向所述对象施用经诱导树突细胞(iDC)，所述经诱导树突细胞被改造为表达至少一种抗原和至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子。
在第十六方面，本发明涉及根据第15方面所述的方法，其中所述对象是小鼠并且HSC来源于人。
在第十七方面，本发明涉及根据第16方面所述的方法，其中所述小鼠的特征在于存在内源T细胞和树突细胞的内源祖细胞。
在第十八方面，根据第16方面或第17方面所述的方法，其中所述小鼠品系具有导致适应性免疫系统(包括T细胞和B细胞)功能障碍或不存在的原发性免疫缺陷。
在第十九方面，本发明涉及根据第16方面至第18方面中任一个所述的方法，其中所述小鼠选自以下品系：NOD-Rag1nullIL2Rynull-NRG、NOD/LtSz-SCID/IL2Rynull-NSG和NOD/SCID/IL2Rynull-NOG。
在第二十方面，本发明涉及根据第15方面至第19方面中任一个所述的方法，其中所述载体介导抗原pp65和细胞因子(i)GM-CSF和(ii)干扰素-α和/或白介素-4的表达。
在第二十一方面，本发明涉及具有由根据第16方面至第20方面中任一个所述的方法产生之再生免疫系统的小鼠。
在第二十二方面，本发明涉及根据第21方面所述的小鼠用于研究所述人免疫系统或用于测试药物、植入物或装置在人之使用的用途。
以下实施例仅旨在说明本发明，其不以任何方式限制权利要求的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
慢病毒载体构建和整合酶缺陷型慢病毒产生
表达CMV-pp65和荧火虫荧光素酶LV-fLUC的自失活(SIN)慢病毒骨架载体和单顺反子载体此前已有描述(Salguero，G.，等，2011，“Preconditioning therapy with lentiviral vector-programmed dendriticcells accelerates the homeostatic expansion of antigen-reactive human Tcells in NOD.Rag1-/-.IL-2rgammac-/-mice.”Hum Gene Ther 22：1209-1224)。构建表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的双顺反子慢病毒载体和间隔有P2A元件(RRL-cPPT-CMV-hGMCSF-P2A-hIL4)的人干扰素α(LV-G2α)的构建体并按照先前所述对其进行广泛表征(Daenthanasanmak，A.等，2012，“Integrase-defective lentiviral vectorsencoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells andstimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo.”Vaccine 30：5118-5131)。通过对启动子和转基因进行限制性消化和测序分析来再确认所有构建体的结构完整性。如前所述通过瞬时共转染人胚肾293T细胞来进行大规模慢病毒生产(Stripecke，R.，2009，“Lentiviral vector-mediatedgenetic programming of mouse and human dendritic cells.”Methods MolBiol 506：139-158)。为了产生整合酶缺陷型慢病毒，在共转染中使用4种包装质粒：含有表达细胞因子之慢病毒载体的质粒、表达含有整合酶基因中D64V点突变之gag/pol的质粒(pcDNA3g/pD64V.4xCTE)、表达rev的质粒(pRSV-REV)和编码VSV-G包膜的质粒(pMD.G)。收集病毒上清液并通过超速离心浓缩，通过用酶联免疫吸附测定(ELISA)(CellBiolabs，Inc.San Diego，USA)评估p24抗原浓度来评价滴度。1μg的p24当量/ml对应于约1x107感染性病毒颗粒/ml。
人CD34阳性外周血干细胞分离
外周血单核细胞(PBMC)获自经受用G-CSF(Granocyte，ChugaiPharma)的造血干细胞动员方案之造血成年干细胞移植成年供体的白细胞单采(leukapheresis)。所有的研究都根据由汉诺威医学院伦理评价委员会(Hannover Medical School Ethics Review Board)批准的方案来进行。使用CD34磁性细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)通过MACS来阳性选择CD34+细胞。经历两轮的阳性磁性选择后，如通过流式细胞术所评价的，获得的细胞纯度高于97％并且CD3+T细胞的污染物低于0.2％。
人常规-IFNα和Smyle DC的产生
使用CD14分离珠(Miltenyi Biotech)使用自体CD34阴性PBMC级分来进一步阳性选择CD14+单核细胞。对于慢病毒基因转移，在转导之前使单核细胞在重组人GM-CSF和IL-4(分别为50ng/ml，Cellgenix，Freiburg，Germany)存在下在含有无血清Cellgro培养基的培养物中保持8小时。对于SmyleDC/pp65的产生，将5x106 CD14+单核细胞在5μg/ml硫酸鱼精蛋白(Valeant，Dusseldorf，Germany)存在下以及以5(相当于2.5μg/mL p24当量)的ID-LV-G2α感染复数(M.O.I.)转导16小时。在转导之后，将Smyle/pp65 DC用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并进一步维持在无血清Cellgro培养基的培养物中。对于常规IFN-α-DC的产生，将单核细胞如上文所述与ID-LV-pp65一起孵育。转导16小时后，将LV除去并使细胞在重组人GM-CSF(50ng/ml)和IFN-α(1000U/ml，PBLInterferonSource，New Jersey，USA)存在下维持在培养物中。每3天补充用于Con-IFN/pp65的细胞因子，同时将SmyleDC在不含细胞因子的情况下在培养基中孵育。培养7、14和21天后，收获iDC。对于小鼠免疫，在转导后第1天将Smyle/pp65重悬于PBS中或者在转导后的第7天将Con-IFN/pp65 DC重悬于PBS中，并用于皮下注射。采用台盼蓝排除来确定活细胞计数的数目。
使用人HSC进行小鼠移植
繁殖NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1wjl(NOD；Rag1-/-；IL-2rγ-/-，NRG)小鼠并将其在无病原体条件下维持在IVC系统中(BioZone，UnitedKingdom)。涉及小鼠的所有操作都经过Lower Saxony的审核和批准并且遵循汉诺威医学院动物研究室(Animal Facility at Hannover MedicalSchool)提供的指导方针。对于HSC移植，将4周龄的小鼠用137Cs柱辐照器(gammacell，company，country)以亚致死剂量(450cGy)辐照。向小鼠接受者的尾静脉中静脉内注射5x105人CD34+外周血HSC。在人HSC移植后，在不同的时间点(6、10和13)对小鼠采血以监测人造血细胞植入的状况并在第20周将小鼠处死以进行最后的分析。对于DC免疫，从培养板收集Smyle/pp65或Con-IFN/pp65 DC并将其以5x105细胞的浓度重悬于100μL PBS中。在HSC移植后第10和第11周，使用27号针头通过皮下注射到小鼠右后肢中来向HSC重建小鼠注射DC混悬液。
流式细胞术分析
使用下列小鼠抗人-抗体在外周血和脾中评价人HSC重建小鼠中人造血细胞的植入：PerCP抗-CD45、Alexa700抗-CD19、Pacific blue抗-CD4、APC抗-CD3、PE-Cy7抗-CD8、FITC抗-CD45RA、PE抗-CD62L(Biolegend)、PE抗-CD14、FITC抗-谱系阳性、APC抗-CD11c、PE抗-CD123(Becton Dickinson)。对于外周血分析，将血液如下裂解：将血液与红细胞裂解缓冲液(0.83％氯化铵/20mMHepes，pH 7.2)在室温下一起进行两轮的孵育，持续5分钟，之后用冷的磷酸缓冲盐水(PBS)稳定并以300g离心5分钟。将细胞与抗体在4℃下孵育30分钟。将收获的脾细胞用红细胞裂解缓冲液(0.83％氯化铵/20mMHepes，pH 7.2)处理5分钟、用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并与抗体一起在冰上孵育30分钟。在洗涤步骤之后，将细胞重悬于PBS中并用LSR流式细胞仪(BectonDickinson)获取。对于DC表型表征，使用下列抗人抗体：PE抗-CD80、PerCP抗-HLA-DR、APC抗-CD86、APC抗-CD83(Becton Dickinson)。对于DC染色，将细胞收集、用PBS洗涤一次并与小鼠IgG(50μg/mL)一起在冰上孵育15分钟，之后与抗体一起孵育。将细胞洗涤、重悬于细胞固定液(Becton Dickinson)中并使用FACSCalibur细胞仪进行进一步分析。使用FlowJo软件进行分析(Tree Star，Inc.)。
对人T细胞植入的组织学和免疫组织化学分析
从人HSC重建NRG或C57Bl6野生型小鼠收获LN并将其包埋在最佳切割温度复合物(O.C.T.Sakura Finetek，Torrance，CA，USA)中以冷冻保存。将冷冻切片(5μm)经丙酮固定并用单克隆抗-小鼠或人DC3(eBioscience，San Diego，CA，USA)、抗小鼠或人CD11c(eBioscience)、抗-小鼠LYVE-1(Dako)、抗-CD31小鼠(BD Bioscience)染色。在AXIOCAM荧光显微镜(Zeiss)中进行免疫荧光分析。
体内生物发光成像分析
在成像前5分钟，将小鼠用氯胺酮(100mg/kg，腹膜内)和甲苄噻嗪(10mg/kg，腹膜内)麻醉并注射d-荧光素(150mg/kg，腹膜内)的水溶液。将小鼠置于电荷耦合器件摄像机(IVIS 200，Xenogen，Cranbury，NJ，USA)的暗室中，并在弱照明下拍摄灰度体表参照图像(数码照片)。切断光源后，使用软件程序Living Image(Xenogen)作为Igor(Wavemetrics，Seattle，WA，USA)上的叠加在至多5分钟的限定时间内量化从动物体内的荧光素酶表达细胞发射并通过组织传输的光子。对于解剖学定位，在Living Image中生成表示光强度的伪彩色图像(蓝色，强度最小；红色，强度最大)并将其重叠在灰度参照图像上。量化的发光为动物表面上的平均光子辐射并将其表示为光子/秒/cm2/sr，其中sr＝球面度。
对从小鼠LN和脾复苏的pp65-CTL的功能分析
对于针对CMV-pp65的免疫应答的评价，收获每组的脾细胞、将其合并、用APC缀合的抗人CD3染色并用XDP细胞分选仪(BeckmanCoulter)分选。将人CD3+细胞以10.000细胞/孔的密度接种在抗人IFN-γ包被的96孔ELISPOT板中并在10μg/mL pp65重叠肽库(Miltenyi)存在下孵育过夜。使用对应于CMV、EB病毒(Epstein-Barr virus)和流感病毒表位(PANA Tecs GmbH，Tuebingen，Germany)的混合物的CEF回忆肽库(recall peptide pool)作为阳性对照。第二天，将细胞洗涤并将板进一步与生物素缀合的抗人IFN-γ抗体一起孵育，之后与碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素蛋白一起孵育。将板用NBT/BCIP液体底物显影并在AELVIS ELISPOT阅读器(AELVIS GmbH，Hannover，Germany)中进行分析。对于从LN获得的淋巴细胞的分析，将细胞在SmyleDC或SmyleDC/pp65存在下离体扩增7天并暴露于ELISPT板上的pp65重叠肽库，并且对IFN-γ斑点进行计数。
HSC-NRG小鼠中的免疫球蛋白产生
在重建后20周(在第二Smyle或IFN-conDC后8周)从HSC-NRG小鼠收获血浆，并如其他地方所述通过ELISA筛选总人IgM和总人IgG的存在(Becker，P.D.等，2010，“Generation of human antigen-specificmonoclonal IgM antibodies using vaccinated“human immunesystem”mice”PLoS One 5)。通过用AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgM(Fc5μ-特异性的，Jackson ImmunoResearch)或AffiniPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性的；Jackson ImmunoResearch)包被96孔板来进行总IgM和IgG的确定。使用IgM(0.8mg/ml)和IgG(10.4mg/ml)浓度已知的对照人血清蛋白校准物(Dako)作为标准物来与样品进行比较。在包被后，将板在ELISA洗涤缓冲液(PBS，0.5％Tween-20)中洗涤、用4％乳液封闭并进一步与连续稀释的小鼠血浆(以1∶5的稀释度开始)一起孵育。对于HRP缀合的抗-IgG，以1∶2500的稀释度添加酶缀合检测抗体，而对于HRP缀合的抗-IgM，以1∶5000的稀释度添加酶缀合检测抗体(两者均获自Jackson ImmunoResearch)。使用TMB底物/终止液(Biosource)来进行ELISA测定显影。
统计学分析
进行参数(t检验)和非参数(Kruskall-Wallis)统计学分析以比较组间在HIS-NRG小鼠中造血细胞系(hematopoietic lineage)植入方面的差异。在Graph prism第5版软件中进行分析。所有的测试都是双侧的并且认为P＜0.05是显著的。
结果
LV诱导的Smyle/pp65 DC产生和表征
最近，我们已示出用于促进人单核细胞中人GM-CSF和IFNα之组成型表达的整合酶缺陷型(ID)-LV体内诱导高度存活的具有高激活状态以及高生存力和植入特性的IFNα-DC(Daenthanasanmak，A.等，2012，“Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines inducedifferentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immuneresponses in vitro and in vivo”Vaccine 30：5118-5131)。可将这些LV诱导的DC(命名为“Smyle”(自主分化的、骨髓衍生的、慢病毒诱导的)DC)另外用ID-LV共转导以表达CMV被膜(tegument)病毒蛋白pp65。Smyle/pp65有效地刺激体外和体内抗CMV特异性CTL应答。在此，我们的目的是使用从GCSF动员的造血干细胞供体获得的白细胞单采测试Smyle/pp65 DC产生的可行性(图1A)。简言之，对于Smyle/pp65产生，通过对从GCSF动员的HSCT供体白细胞单采获得的PBMC进行磁性选择来分离CD14+细胞，并将其用GM-CSF和IL-4预处理，之后用表达GM-CSF和IFN-α的双顺反子LV和表达CMV-pp65的LV过夜LV共转导。在去除LV后，将Smyle/pp65维持在不含细胞因子补充物的培养物中。通过用LV-pp65以类似的方式转导单核细胞来产生表达pp65的常规IFNα_DC(Con-IFN/pp65)，并将其维持在培养物中，每隔两天补充重组人GM-CSF和IFNα。将细胞培养至多3周以确定其分化状态、生存力和表型稳定性。在培养的第7天，我们能够复苏可比较水平的Con-IFN/pp65和Smyle/pp65 DC(45％相对于35.6％，p＞0.05)(图1B)。重要的是，在培养的第14天，Smyle/pp65已示出比Con-IFN高3倍的复苏水平(35.4％相对于14.2％p＝0.021)。在培养DC后3周，Smyle/pp65和Con-IFN/pp65两者均显著丧失生存力，但与Con-IFN/pp65相比，Smyle/pp65仍示出较高的水平(17％相对于5％，p＜0.05)。我们还对Smyle/pp65和Con-IFN/5pp65在整个培养期间的分化状态进行了评价。通过细胞内染色和流式细胞术分析来确认pp65的共表达。与在Con-IFN/pp65 DC中相比，在Smyle/pp65中CMV-pp65的表达维持在较高的水平(55％相对于21.2％，p＝0.014)(图1C)。在培养的第7天，Smyle/pp65和Con-IFN/pp65两者都展现出典型的DC分化表型，该表型以CD11c、CD86和MHC-II(HLA-DR)的高表达水平为特征(图1D)。如CD80和CD83表达所示的，两种细胞类型都呈现出可比较的成熟状态。Smyle/pp65在14和21天的较长培养时期内维持免疫表型标志物的稳定表达。尽管在重组细胞因子存在下进行培养，Con-IFN/pp65 DC仍去分化，从而丧失分化和成熟标志物的表达。
Smyle/pp65和Con-IFN/pp65两者维持在培养物分泌的数种内源上调细胞因子中，这些细胞因子累积在培养物上清液中并可通过细胞因子阵列分析检测：IFN-g、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、MCP-1和TNF-α表现出总体增强的Con-IFN/pp65活化(图2)。Con-IFN/pp65培养物具有较高的IL-1β、4、6、8、12累积水平，这表明尽管这些细胞持续暴露于高水平的数种细胞因子，但是它们在维持相关免疫表型标志物表达方面的功能降低。
在人HSC移植后Smyle/pp65支持淋巴细胞区室的复苏
为了评价在HSC移植背景下Smyle/pp65诱导免疫重建的潜力，我们首先通过将人CD34+细胞转移到4周龄的经亚致死剂量辐照之NOD.Rag1-/-.IL2rγ-/-(NRG)小鼠中建立了人源化免疫系统模型(HIS)。在HSCT后6周，我们已在外周血中检测到CD3+人T细胞(0.35％)，在CD34+HSC转移后20周达到8.6％的平均频率(数据未示出)。可检测的人CD45+细胞中主要是人CD19+B细胞，其中其水平从84％(第6周)变化直至77％(第20周)(数据未示出)。在对HIS-NRG进行HSC重建后20周，人CD45+细胞对应于3.9％的总脾细胞并且人CD19+B细胞表示大部分的人细胞含量(84％)。人CD3+T淋巴细胞对应于7.8％的人CD45表达细胞并且含有1∶1比的CD4+和CD8+(数据未示出)。
接着，我们评价了Smyle/pp65免疫是否改善HIS-NRG小鼠中的免疫重建。我们采用了初免/加强(prime/boost)免疫方案，该方案包括在HSCT后的第10周注射一次DC，然后在1周后进行加强注射。通过皮下注射在LV转导后立即收获的Smyle/pp65或经7天培养的Con-IFN/pp65来进行免疫。如先前所述，将DC细胞混悬液(5x105)注射到右胁中(Salguero，G.等，2011，“Preconditioning therapy withlentiviral vector-programmed dendritic cells accelerates the homeostaticexpansion of antigen-reactive human T cells inNOD.Rag1-/-.IL-2rgammac-/-mice”Hum Gene Ther 22：1209-1224)。将未免疫的小鼠用作对照(图3A)。首先，我们评价了DC注射对外周血中人CD45+细胞之重建的作用。在第10周，在免疫之前人CD45+的频率在所有组中都相似。在初免/加强免疫后1周，与未免疫的对照相比，经Smyle/pp65免疫的小鼠表现出显著增强的人CD45+细胞水平(1.7％相对于0.64％，p＝0.01)。在经Con-IFN/pp65免疫的小鼠中CD45+细胞频率并不显著更高(与对照相比为1.6％，p＝0.09)。重要的是，与小鼠对照相比，在Smyle/pp65免疫后维持8周显著增强的CD45+水平(1.9％相对于0.2％，p＝0.03)。经Con-IFN/pp65疫苗接种的小鼠在血液中也表现出更高但不显著的CD45+细胞水平(1.3％相对于0.2％，p＝0.08)。接着，我们对DC免疫后的T细胞区室进行了分析。与对照小鼠相比，Smyle/pp65免疫导致外周血中的CD3+频率提前显著提高(0.16％相对于0.03％，p＜0.04)，并且与对照相比，在HSCT后20周支持人T细胞的长期植入(1.8％相对于0.03％，p＝0.04)(图3B)。明显地，Con-IFN/pp65-免疫不诱导HIS-NRG小鼠中的人CD3+T细胞水平提前或长期提高(0.15％，p＝0.26+1周；0.37％，p＝0.31+DC注射后8周，相比较于对照)。在DC免疫后8周对CD45+细胞中之人T淋巴细胞的相对频率进行分析，示出与对照(59.7％相对于8.6％，p＝0.0001)和Con-IFN/pp65(59.7％相对于21.7％，p＝0.001)相比，在经Smyle/pp65免疫的小鼠中CD3+区室的频率显著增强，并且证实通过在这些小鼠中人T细胞区室的扩增确定人CD45+细胞的长期植入。
在HSC重建后20周，我们进一步分析了经疫苗接种小鼠和对照小鼠的脾的细胞含量(图4)。与未免疫的小鼠(19.1％相对于3.1％，p＝0.007)和经Con-IFN/pp65免疫的小鼠(19.1％相对于5.9％，p＝0.01)相比，经Smyle/pp65免疫的小鼠表现出显著更高的人CD45+植入水平。因此，与对照小鼠相比，在经Smyle/pp65免疫的小鼠中观察到较高的人CD3+细胞频率(10.1％相对于0.31％，p＝0.007)，对应于40.8％的总人CD45+细胞(图4A)。Con-IFN/pp65免疫小鼠未能增强CD3+细胞的频率(0.17％，p＝0.5相对于对照)，对应于脾中仅3.9％的CD45+细胞。在重建的NRG小鼠脾中进一步分析了CD3+T细胞中淋巴细胞亚群的分布(图4B)。尽管我们在3组中没有观察到CD3+/CD8+细胞间具有显著的差异(对照，51；Con-IFN/pp65，40.9％；Smyle/pp65 44.2％，p＞0.05)，但是我们发现与未免疫的对照相比，经Smyle/pp65免疫的脾细胞中CD8+/CD45RA+/CD62L+幼稚细胞的水平显著降低(12.3％相对于37.49％，p＝0.03)。反之，Smyle/pp65中CD8+/CD45RA-CD62L-效应记忆T细胞的频率显著高于对照NRG小鼠(38.5％相对于19.5％，p＝0.04)。对于幼稚(14.5％)和效应记忆(24.7％)群，在注射有Con-IFN/pp65 DC的小鼠中发现相似但不显著的CD8+T细胞亚群分布。对CD3+/CD4+频率的分析并未显示小鼠组间在总CD4+T细胞方面具有统计学差异(对照，44.7％；Con-IFN/pp65 34.7％；Smyle/pp65 50％，p＞0.05)。尽管如此，还观察到与对照相比，由于Con-IFN/pp65和Smyle/pp65免疫，因此幼稚细胞减少而效应记忆T细胞增加，但并不显著。综合考虑这些数据，在HSCT后进行人Smyle/pp65免疫促进了T细胞区室迅速且持续的重建并显著有利于具有主要效应记忆表型之CD8+T-和CD4+(以较低的程度)的扩增。
Smyle/pp65免疫诱导外周淋巴结的重建
接下来，在HSC重建后20周，我们针对淋巴结(LN)的存在对注射有Smyle/pp65或Con-IFN/pp65 DC的小鼠进行了分析。我们在注射有Smyle/pp65的小鼠中检测到高频率的LN形成(65％)，而对照小鼠和注射有Con-IFN/pp65的小鼠表现出低LN结构发生(分别为11％和28％)(图5A)。对动物体不同区域中的LN频率的量化揭示了DC注射部位与在相应引流部位的LN形成之间具有强相关性(图5B)。在经Smyle/pp65免疫的小鼠中观察到腹股沟(57％)、髂骨(35％)和腋窝(56％)LN，相比之下对照小鼠中在同侧则完全不存在LN。重要的是，Con-IFN/pp65注射不诱导髂骨LN形成并且分别只在14％和28％的小鼠中诱导腹股沟和腋窝LN的形成。
接下来，我们对从经Smyle/pp65免疫的NRG小鼠获得的LN进行了免疫组织分析。与从野生型C57BL/6获得的正常野生型LN相比，重建NRG的LN中的LN结构显示缺乏B细胞滤泡(图6)。人源化LN主要由人CD3+T细胞构成，并且我们还观察到人DC(CD11c+)的存在。LN被对小鼠淋巴血管细胞(LYVE-1)呈阳性的细胞层和小鼠内皮血管CD31标志物包裹。重要的是，我们还观察到存在与高内皮小静脉(HEV)类似的结构，该结构对小鼠CD31呈阳性，表明形成中的LN中的原基血管组织过程。
接下来，我们对注射的Smyle/pp65 DC是否能够迁移至HIS-NRG小鼠中形成的重建LN进行了评价。将Smyle/pp65用表达萤火虫荧光素酶的LV(LV-fLUC)共转导，使得它们在暴露于荧光素后可产生生物发光。在右侧免疫后6周，将Smyle/pp65-fLUC注射到HSC-NRG小鼠的后肢中，其中更频繁地发现LN(图7)。作为DC迁移的对照，我们在对侧胁中注射了fLUC-Smyle/pp65。每周，在fLUC-Smyle/pp65植入和迁移后进行体内生物发光成像。与对侧胁中的相同位置相比，在DC注射后的第21天我们发现注射侧中的LN位置处有生物发光信号的累积。此外，当对小鼠实施安乐死并使LN暴露时，Smyle/pp65发光位于形成的腹股沟LN、同侧腋窝LN中而不位于腹内(例如肠系膜)LN中(图7)。该数据表明Smyle/pp65 DC能够迁移至区域性引流LN原基所在的部位并且触发LN形成。
Smyle/pp65诱导HIS-NRG小鼠中的特异性免疫应答
此前，我们已经证明了Smyle/pp65刺激外周血淋巴细胞(PBL)小鼠模型中的抗PP65特异性应答(Daenthanasanmak，A.等，2012，“Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines inducedifferentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immuneresponses in vitro and in vivo.”Vaccine 30：5118-5131)。在此，我们评价了Smyle/pp65免疫重建NRG小鼠是否可刺激针对CMV-pp65的特异性T细胞应答。由于我们观察到Smyle/pp65在LN形成中的显著作用，因此首先，我们希望测试这些发现是否与局部LN中对CMV-pp65的抗原特异性反应性增强有关。首先，我们通过流式细胞术对Smyle/pp65免疫后的重建LN细胞含量进行了评价。大部分的LN细胞是人CD45+(77％)，其中73％对应于CD3+T淋巴细胞，而3.8％对应于CD19+B细胞(图8A)。在人CD3+细胞中，我们发现42％是CD4+，而56％是CD8+，并且这两个T细胞亚群中主要是效应记忆表型(分别为80％和76％)(图8B)。为了测量CMV-pp65特异性应答，在免疫后8周，分离LN细胞并将其在Smyle/pp65 DC存在下离体扩增7天。将不表达CMV-pp65抗原的SmyleDC用作对照(图8C)。在DC共培养后，收集细胞并将其接种在IFN-γ包被的板中、用CMV-pp65重叠库肽再刺激并通过ELISPOT分析IFN-γ的产生。使用来自CMV反应性健康供体的PBMNC作为IFN-γ产生的阳性对照。明显地，与Smyle DC存在而无抗原的LN细胞相比，在离体扩增后LN细胞对CMV-pp65表现出显著的反应性(53相对于18.7个斑点，p＜0.021，n＝5个小鼠供体)(图8C)。此外，我们通过从对照、经Smyle/pp65免疫的NRG小鼠和经Con-IFN/pp65免疫的NRG小鼠复苏人CD3+T细胞而对针对CMV的全身特异性免疫应答进行了评价(图8D)。首先，我们如下促进T细胞增殖：将T细胞与人抗-CD2、抗-CD3和抗-CD28珠在人重组IL-7和IL-15存在下一起孵育48小时，之后再与Smyle/pp65 DC在1L7/IL15存在下一起共培养7天。将与缺乏CMV-pp65表达的Smyle DC共培养的细胞用作对照。与对照相比，从经Smyle/pp65免疫之HSC-NRG小鼠的脾复苏并进一步用Smyle/pp65进行扩增的T细胞表现出显著增加的平均阳性斑点(33.6个斑点相对于0.5，p＜0.05)(图8D)。反之，从经Conv-IFN/pp65注射之小鼠的脾复苏的T细胞具有减少的CMV-pp65(平均15.5个斑点，p＞0.05相对于Smyle/pp65)。
HSC-NRG小鼠中的免疫球蛋白产生
我们对免疫后的重建NRG小鼠DC中的B淋巴细胞区室进行了表征。之前的免疫，所有组的CD19+B淋巴细胞(这是相对早期的B细胞群)频率没有显著差异(对照、Con-IFN/pp65和Smyle/pp6分别为1.6％、4.5％和2％)(图9A)。在第二次DC免疫后1周，CD19+B细胞的总体水平下降，而与对照和经Con-IFN/pp65注射的小鼠相比，经Smyle/pp65注射的小鼠示出更高的B细胞频率(1.1％分别0相对于0.4％和0.9％，p＝0.02)。截止免疫后第8周，所有组中的B细胞总体频率均低于1％(对照0.18％；Con-IFN/pp65 0.1％；Smyle/pp65 0.37％)。我们在免疫后8周还能够在脾中复苏B细胞并且观察到对照(2.5％)、经Con-IFN/pp65免疫的NRG小鼠(5.1％)和经Smyle/pp65免疫的NRG小鼠(7.8％)中人CD19+细胞的不显著差异。为了评价重建小鼠中人B细胞的功能，在DC免疫后8周，我们进一步测量了NRG小鼠血浆中的免疫球蛋白(Ig)G和M浓度。明显地，我们发现对照小鼠(0.78μg/mL)和经Con-IFN/pp65免疫的小鼠中具有几乎不可检测的水平(0.047μg/mL)，而相比之下经Smyle/pp65注射的小鼠中具有显著更高的IgG水平(59.6μg/mL)。类似地，与对照和Con-IFN/pp65(分别为0.15μg/mL和0.01μg/mL)相比，经Smyle/pp65注射之小鼠的血浆中具有更高的IgM浓度(26.6％)。
讨论
DC在“组织”LN的发育方面具有关键作用，其是用于刺激适应性T和B细胞免疫应答的最有效位点。通过使用上述iDC形式(IDLV-SmyleDC/pp65)，我们对DC疫苗接种在移植有人HSC之免疫缺陷小鼠品系中的作用进行了评价。在世界范围内，已经开发了利用经移植的人造血干细胞前体/干细胞(例如CD34+细胞)的淋巴细胞减少小鼠模型以在小鼠中重建人免疫系统(Lepus CM等，“Comparison of HumanFetal Liver，Umbilical Cord Blood，and Adult Blood Hematopoietic StemCell Engraftment in NOD-scid/γc-/-，Balb/c-Rag1-/-γc-/-，andC.B-17-scid/bg Immunodeficient Mice”.Human immunology.Oct2009；70(10)：790-802)。经探索，这些模型遵循血液学重建的若干步骤，例如骨髓小环境(nich)中的HSC植入、动员、自我更新、一些谱系的分化。在HSCT后，对这些小鼠进行长期(16-20周)跟踪显示CD8+T细胞维持的普遍受损(Andre MC等，“Long-term human CD34+stemcell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2R gamma(null)mice showimpaired CD8+T cell maintenance and a functional arrest of immatureNK cells”.J Immunol.Sep 1 2010；185(5)：2710-2720)。移植有人HSC的小鼠没有发育含有活的功能性T细胞的再生LN。淋巴结是特化组织，其中引流的淋巴被“过滤”以用于免疫监督病原状况(例如感染物、癌症)。由于其特化的结构，淋巴结允许抗原被最佳呈递至T细胞以初免并放大适应性免疫应答。先前的可用方法还没有描述对人源化小鼠中由LN产生的抗原特异性CTL应答的证明，所述方法例如探索对适应性免疫应答具有关键作用的人细胞因子(例如IL-7、IL-15、GMCSF)的转基因表达或者通过单个人MHC I型或II型分子的转基因方法。另一方面，本文所述的iDC免疫方法将与由人干细胞移植物表达的MHC分子完美匹配的高度存活的人专职抗原呈递细胞一起带向免疫缺陷宿主，所述人干细胞移植物表达数种人细胞因子和高免疫原性抗原(已知刺激数种不同的MHC限制性免疫应答)的组合。因此，基于这些特性，SmyleDC/pp65免疫引起外周血中循环之人T细胞的绝对频率明显增加、产生针对pp65 CMV病毒抗原的CTL应答和血浆中的高人IgG水平，从而证明小鼠中已再生适应性人免疫应答。
此外，iDC能够在用人HSC重建的免疫缺陷小鼠中促进淋巴结再生同时刺激适应性T和B细胞免疫应答，表明iDC具有支持由经移植的人HSC普遍再生功能免疫系统的特性。因此，可将iDC用于移植有HSC的人患者中以加速全功能免疫系统的发育，由此在HSC移植后降低对感染性疾病的易感性或恶性肿瘤的复发。
实施例2
(基于实施例1但包含另外的数据和对结果的部分扩展分析)
材料和方法
慢病毒载体构建以及整合酶缺陷型慢病毒产生
表达CMV-pp65的自失活(SIN)慢病毒骨架载体和单顺反子载体此前已有描述(Sato，Caux等1993；Salguero，Sundarasetty等2011)。构建表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的双顺反子慢病毒载体和间隔有P2A元件(RRL-cPPT-CMV-hGMCSF-P2A-hIL4)的人干扰素(huIFN-α)(LV-G2α)的构建体并按照先前所述对其进行广泛表征(Daenthanasanmak，Salguero等2012)。通过对启动子和转基因进行限制性消化和测序分析来再确认所有构建体的结构完整性。如前所述通过瞬时共转染人胚肾293T细胞来进行大规模慢病毒生产(Stripecke 2009)。为了产生整合酶缺陷型慢病毒，在共转染中使用4种包装质粒：含有表达细胞因子之慢病毒载体的质粒、表达含有整合酶基因中D64V点突变之gag/pol的质粒(pcDNA3g/pD64V.4xCTE)、表达rev的质粒(pRSV-REV)和编码VSV-G包膜的质粒(pMD.G)。收集病毒上清液并通过超速离心浓缩，通过用酶联免疫吸附测定(ELISA)(Cell Biolabs，Inc.San Diego，USA)评估p24抗原浓度来评价滴度。1μg的p24当量/ml对应于约1x107感染性病毒颗粒/ml。
人CD34阳性外周血干细胞的分离
外周血单核细胞(PBMC)获自经受用G-CSF(Granocyte，ChugaiPharma)之造血干细胞动员方案的造血成年干细胞移植成年供体的白细胞单采。所有的研究都根据由汉诺威医学院伦理评价委员会批准的方案来进行。使用CD34磁性细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，Germany)通过MACS来阳性选择造血干细胞(HSC)CD34+细胞。经历两轮的阳性磁性选择后，如通过流式细胞术所评价的，获得的细胞纯度高于99％并且CD3+T细胞的污染物低于0.2％。
人常规和Smyle DC的产生
使用CD14分离珠(Miltenyi Biotech)使用自体CD34阴性PBMC级分来进一步阳性选择CD14+单核细胞。对于慢病毒基因转移，在转导之前使单核细胞在重组人GM-CSF和IL-4(分别为50ng/ml，Cellgenix，Freiburg，Germany)存在下在含有无血清Cellgro培养基的培养物中保持8小时。对于SmyleDC的产生，将5x106CD14+单核细胞在5μg/ml硫酸鱼精蛋白(Valeant，Dusseldorf，Germany)存在下用2.5μg/mL p24当量(感染复数，M.O.I.为5)的ID-LV-G2α和ID-LV-pp65两者转导。转导16小时之后，将Smyle用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并进一步维持在含有无血清Cellgro培养基的培养物中。对于常规(Conv)DC的产生，将单核细胞如上文所述与ID-LV-pp65一起孵育。转导16小时后，将LV除去并使细胞进一步在重组人GM-CSF(50ng/ml)和IFN-α(1000U/ml，PBL InterferonSource，New Jersey，USA)存在下在培养物中维持7天。每3天补充细胞因子。对于小鼠免疫，在转导后直接将SmyleDC重悬于PBS中或者在培养的第7天将ConvDC重悬于PBS中，并用于小鼠注射。培养7、14和21天后，评价Smyle或ConvDC的存活力、DC免疫表型和细胞因子释放。采用台盼蓝排除来确定活细胞计数的数目。
使用人HSC进行小鼠移植
繁殖NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl(NOD；Rag1-/-；IL-2rγ-/-，NRG)小鼠并将其在无病原体条件下维持在IVC系统中(BioZone，UnitedKingdom)。涉及小鼠的所有操作都经过Lower Saxony的审核和批准并且遵循汉诺威医学院动物研究室提供的指导方针。对于HSC移植，将4周龄的小鼠用137Cs柱辐照器(Gammacell 3000Elan，Canada)以亚致死剂量(450cGy)辐照。向小鼠接受者的尾静脉中静脉内注射5x105人CD34+细胞。在人HSC移植后，在不同的时间点(6、10和13)对小鼠采血以监测人造血细胞植入的状况并在第20周将小鼠处死以进行最后的分析。在HSC移植后10周进行DC注射，之后在第11周进行加强。简言之，从培养板收集Smyle或ConvDC，将其以5x105细胞的浓度重悬于100μLPBS中并用27号针头皮下注射到小鼠右后肢中。
流式细胞术分析
使用下列小鼠抗人抗体在外周血、脾和LN中评价人HSC重建小鼠中人造血细胞的植入：PerCP抗-CD45、Alexa700抗-CD19、Pacific blue(PB)抗-CD4、APC抗-CD3、PE-Cy7抗-CD8、FITC抗-CD45RA、PE抗-CD62L(Biolegend)、PE抗-CD14、FITC抗-谱系阳性、APC抗-CD11c、PE抗-CD123(Becton Dickinson)。至于对人B细胞亚群的表征，使用下列荧光染料缀合抗体：PB抗-CD45、Brilliant Violet 605抗-CD19、PE抗-CD27、PE-Cy7抗-CD38、FITC抗-IgD、Alexa700抗-IgG、APC抗-IgM、PerCP-Cy5.5抗-CD24和APC-C7抗-CD3。滤泡辅助性T细胞通过用下列抗体染色来表征：PB抗-CD45、Alexa700抗-CD14/CD19、FITC抗-CD3、APC-C7抗-CD4、PerCP-Cy5.5抗-CXCR5、APC抗-PD1和PE-Cy7抗-ICOS。对于外周血分析，如下裂解血液：将血液与红细胞裂解缓冲液(0.83％氯化铵/20mMHepes，pH 7.2)在室温下一起孵育5分钟，进行两轮，之后用冷的磷酸缓冲盐水(PBS)稳定并以300g离心5分钟。将细胞与抗体在4℃下孵育30分钟。将收获的脾细胞用红细胞裂解缓冲液(0.83％氯化铵/20mMHepes，pH 7.2)处理5分钟、用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤并与抗体一起在冰上孵育30分钟。在洗涤步骤之后，将细胞重悬于PBS中并用LSR-II或LSR Fortessa流式细胞仪(Becton Dickinson)获取。对于DC表型表征，使用下列抗人抗体：APC抗-CD11c，PE抗-CD14、APC抗-CD3、PE抗-CD80、PerCP抗-HLA-DR、APC抗-CD86、APC抗-CD83(Becton Dickinson)和FITC抗-CMVpp65(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)。对于DC染色，将细胞收集、用PBS洗涤一次并与小鼠IgG(50μg/mL)一起在冰上孵育15分钟，之后与抗体一起孵育。将细胞洗涤、重悬于细胞固定液(Becton Dickinson)中并用FACSCalibur细胞仪进行进一步分析。所有的分析都使用FlowJo(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)软件来进行。
淋巴结引流分析
对后肢淋巴引流的评价改编自先前所述的方法(Harrell，Iritani等2008)。简言之，对小鼠的右后肢中皮下注射20-30μL的5％埃文斯蓝。在注射后，允许淋巴管摄取染料30分钟。对小鼠实施安乐死并解剖以定位腹股沟并腋窝引流LN和淋巴管。
对从小鼠LN和脾复苏的pp65-CTL的功能分析
为了评价针对CMV-pp65的T细胞免疫应答，收获脾细胞、将其用APC缀合的抗人CD3染色并用XDP细胞分选仪(Beckman Coulter)分选。将人CD3+细胞通过人抗-CD2/CD3/CD28缀合的磁珠(MyltenyiBiotec)以1∶2的珠子/细胞比活化，并在200ng/mL人(IL)-2.5ng/mL人IL-7和5ng/mL IL-15存在下在X-Vivo培养基中培养。将T细胞通过与SmyleDC以1∶10的DC-T细胞比再共培养7天来进一步扩增。还收获LN细胞并如上所述直接将其与SmyleDC孵育。对于CMV特异性IFN-γ产生，将扩增的分离自CMV反应性健康供体之脾、LN或PBMC的T细胞(20.000细胞)接种在抗人IFN-γ包被的96孔ELISPOT板上并在10μg/mL pp65重叠肽库(Miltenyi Biotec)存在下或者在无肽的情况下孵育过夜。第二天，将细胞洗涤并将板进一步与生物素缀合的抗人IFN-γ抗体一起孵育，之后与碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素蛋白一起孵育。将板用NBT/BCIP液态底物显色并在AELVIS ELISPOT阅读器(AELVIS GmbH，Hannover，Germany)中进行分析。
对人造血细胞植入的组织学和免疫组织化学分析
收获人HSC重建NRG或C57BL/6野生型小鼠的LN并将其包埋在最佳切割温度复合物(O.C.T.Sakura Finetek，Torrance，CA，USA)中以冷冻保存。将冷冻切片(5μm)经丙酮固定并用单克隆抗-人CD3(eBioscience，San Diego，CA，USA)、抗-人Pe-Texas Red缀合的CD8、抗-人CD11c(eBioscience)、APC抗-人CD19(eBioscience)、抗-小鼠LYVE-1(Dako)、抗-小鼠CD31(BD Bioscience)染色。在Axiocam荧光显微镜(Zeiss)中进行免疫荧光分析并利用Axiowert软件(Zeiss)生成图像。
HSC-NRG小鼠中的免疫球蛋白产量
在重建后20周从HSC-NRG小鼠收获血浆，并如其他地方所述通过ELISA筛选总人IgM和总人IgG的存在(Becker，Legrand等2010)。通过用AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgM(Fc5μ-特异性的，JacksonImmunoResearch)或AffiniPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性的；Jackson ImmunoResearch)包被96孔板来进行总IgM和IgG的测定。使用IgM(0.8mg/ml)和IgG(10.4mg/ml)浓度已知的对照人血清蛋白校准物(Dako)作为标准来与样品进行比较。在包被后，将板在ELISA洗涤缓冲液(PBS，0.5％Tween-20)中洗涤、用4％乳液封闭并进一步与经连续稀释的小鼠血浆(以1∶5的稀释度起始)一起孵育。对于HRP缀合的抗-IgG，以1∶2500的稀释度添加酶缀合检测抗体，而对于HRP缀合的抗-IgM，以1∶5000的稀释度添加酶缀合检测抗体(两者均获自Jackson ImmunoResearch)。使用MB底物/终止液(Biosource)来显色ELISA测定。
人细胞因子分析：
根据生产商的方案(Millipore)通过基于荧光珠的14-plex Luminex测定来进行DC培养物上清液和小鼠血浆中人Th1/Th2细胞因子的检测。所述14-plex测定测量下列细胞因子：GM-CSF、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10、IL-1β、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-7、IL-2和IL-12(p70)。通过市售的ELISA试剂盒(Mabtech，Minneapolis，USA)来进行DC培养物上清液和小鼠血浆中IFN-α的检测。
体内生物发光成像分析
在成像前5分钟，将小鼠用氯胺酮(100mg/kg，腹膜内)和甲苄噻嗪(10mg/kg，腹膜内)麻醉并注射d-荧光素(150mg/kg，腹膜内)的水溶液。将小鼠置于电荷耦合器件摄像机(IVIS 200，Xenogen，Cranbury，NJ，USA)的暗室中，并在弱照明下拍摄灰度体表参照图像(数码照片)。切断光源后，使用软件程序Living Image(Xenogen)作为Igor(Wavemetrics，Seattle，WA，USA)上的叠加在至多5分钟的限定时间内量化从动物体内的荧光素酶表达细胞发射并通过组织传输的光子。对于解剖学定位，在Living Image中生成表示光强度的伪彩色图像(蓝色，强度最小；红色，强度最大)并将其叠加在灰度参照图像上。量化的发光为动物表面上的平均光子辐射亮度并表示为光子/秒/cm2/sr，其中sr＝球面度。
对组织中慢病毒拷贝数的实时PCR分析
使用QiaAmp DNA血液微型试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的使用说明来从脾和淋巴结(左和右胁)提取总基因组DNA。如先前所述通过定量实时PCR来确定载体来源的拷贝数(Maetzig T等，2010和Rothe M，等，2012)。将由上述步骤制备的100ng/2μL基因组DNA添加至13μL的RQ-PCR混合物，所述RQ-PCR混合物含有7.5μLSYBRTaq混合物与1μL引物混合物并用PCR级无核酸酶水将体积调至13μL，所述引物混合物针对wPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；wPRE正向：5’-GAGGAGTTGTGGCCCGTTGT(SEQ ID NO：9)，wPRE反向：5’-TGACAGGTGGTGGCAATGCC(SEQ ID NO：10)或PTBP2(多聚嘧啶序列结合蛋白2)；PTBP2正向：5’-TCTCCATTCCCTATGTTCAT GC(SEQ ID NO：11)，PTBP2反向：5-GTTCCCGCAGA ATGGTGAGG TG(SEQ ID NO：12)。将含有这两个扩增子的质粒载体(pCR4-TOPO，由汉诺威医学院实验血液学系(Department of Experimental Hematology，Hannover Medical School)的Michael Rothe慷慨提供)用于标准曲线，其中已知稀释度覆盖4-log。用StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)分析所有的样品。循环条件是95℃10分钟，40个循环：95℃15秒、56℃20秒和65℃30秒。如下量化结果：利用引物对特异性实时PCR效率并将样品的CT值与用质粒载体(pCR4-TOPO)产生的标准曲线进行比较。通过StepOnePlus软件(Applied Biosystems)分析数据。
对GVHD的组织学分析
收获皮肤和肠的代表性样品并对其进行常规的福尔马林固定和石蜡包埋。从块上切下2μm切片并用HE染色。有经验的血液病理学家在对处理组动物盲性的情况下检查载玻片。使用半定量得分(Lerner KG等Transplant Proc 19746：367-371之后的改良)来对组织学改变进行评分。GVHD 1级通过单个或多个凋亡特征(apoptotic figure)而无结构改变来限定。2级表示多个凋亡特征和隐窝或皮肤附属物脱落。3级表示另外的表面坏死和隐窝或皮肤附属物严重损失。
统计学分析
进行参数(t检验)和非参数(Kruskall-Wallis)统计学分析以比较组间在NRG小鼠中造血细胞系植入方面的差异。在Graph prism第5版软件中进行分析。所有的测试都是双侧的并且认为P＜0.05是显著的。
结果
SmyleDC产生和体外表征
使用ID-LV将huGM-CSF、huIFN-α和CMV-pp65病毒抗原基因转移到人单核细胞中在体外和体内产生长期持久的SmyleDC(Daenthanasanmak，Salguero等2012)。在这些条件下，使用绿色荧光蛋白(GFP)作为定量基因报道蛋白，我们观察到10％至50％的转导效率。我们使我们的方案适合由从获自G-CSF动员之HSC供体的PBMC复苏的CD34-级分产生DC(图10)。对照ConvDC通过用表达pp65的ID-LV载体转导单核细胞产生(图11A)并将其在重组huGM-CSF/huIFN-α存在下维持在培养物中。对于SmyleDC产生，将单核细胞另外用表达huGM-CSF/huIFN-α转基因的双顺反子ID-LV共转导(图11A)并在不存在细胞因子的情况下维持。在SmyleDC之长达21天的连续培养物中检测累积的人IFN-α(2.0ng/mL)和GM-CSF(0.3ng/mL)的水平(图11B)。与ConvDC相比，SmyleDC培养物展现出显著较高的细胞生存力(第7天，45％相对于36％，p＞0.05；第14天，35％相对于14％p＝0.021；第21天17％相对于5％，p＜0.05，图11C)和细胞内pp65表达(第14天的峰，55％相对于21％，p＝0.014，图11D)。尽管我们尚未证实pp65为DC中的定量基因报道蛋白，但是该数据与我们使用GFP作为标记基因的实验相关。培养21天后，两种DC型都丧失单核细胞标志物CD14+的表达(图11E)，而DC表面标志物CD11c、HLA-DR、CD86、CD83和CD80却在SmyleDC上持续表达(图11F)。对由ConvDC和SmyleDC分泌的细胞因子的分析揭示化学引诱蛋白MCP-1和IL-8以ng/ml水平高度稳定产生(图11G)。ConvDC还分泌高水平的DC2型白细胞介素IL-6和IL-4。对两种培养物还可检测到较低浓度的数种另外的细胞因子(IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-5和IFN-γ)，表明混合的DC1-和DC2-型细胞因子模式。
用SmyleDC/fLuc免疫NRG小鼠并且光学成像分析显示出高体内生存力
第2天，将经表达荧火虫荧光素酶之慢病毒载体标记的SmyleDC皮下注射到NRG小鼠(n＝7)中并在注射后第14、30和45天以非侵入方式测量生物发光信号。所有的小鼠在注射部位都表现出可检测的生物发光信号，直至45天(图12)。
将人CD34+细胞移植到NRG中随后进行SmyleDC免疫导致T细胞扩增增加
我们将经两次阳性选择并且纯度高(＞99％)的成年CD34+HSC转移到经亚致死剂量辐照的4周龄NRG小鼠中。在移植CD34+细胞后10周，人造血重建达到平台期并且变得稳定(2％至5％的PBMC对应于人CD45+细胞)。在DC免疫之前，我们未观察到不同研究臂(arm)中的PBL中具有统计学上显著不同的人CD45+频率(数据未示出)。因此，在HCT后，将小鼠随机分配到不同的免疫组，并通过皮下注射到右后胁中来接受用同一HCT供体之单核细胞产生的DC(5x105细胞)的初免-加强免疫(图10B)。相对于经ConvDC免疫的小鼠和经用同一CD34+供体之单核细胞产生的SmyleDC免疫的小鼠，我们对未经免疫小鼠的长期(20周)造血和免疫重建进行了比较。在SmyleDC免疫后10周，在血浆中检测到＞10pg/ml水平的人GM-CSF、IL-5、MCP-1和IFN-γ以及较低水平的若干其他人因子(IL-12、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-8、IL-4、IL-13)，表明SmyleDC免疫具有持续效应(图13A)。在该时间点，经ConvDC免疫小鼠和对照的血浆中的人细胞因子水平急剧下降。在20周终点时，我们并未观察到对照组和ConvDC组之间在人CD45+、B(CD19+)和T细胞(CD3+)的频率方面具有显著差异(图13B)。然而，经SmyleDC免疫的小鼠具有显著较高的人CD45+细胞频率。值得注意的是，通过分析人CD45+细胞的含量，在SmyleDC接种后人T细胞的相对频率显著升高(升高至50％)，而人B细胞(限定为CD19+)的相对频率显著下降(在SmyleDC中下降至30％)(图13C-D，表1)。实际上，甚至在SmyleDC初免/加强免疫后1周(HCT后的第13周)，T细胞扩增就已显著升高。在HCT后的第20周，CD3+CD4+辅助性T细胞代表经SmyleDC免疫小鼠中频率最高的T细胞群(平均30％)并且可明显检测到CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(PBL中有平均20％的人T细胞)(图13E-F，表1)。
SmyleDC免疫后的淋巴结和淋巴流再生
验尸后分析的最惊人发现之一来自对经SmyleDC免疫的小鼠中外周淋巴结的检测：在腹股沟和腋窝部位可清楚地看到LN(图14A)。长久以来，知道缺乏表达常见细胞因子受体γ链的NRG小鼠表现出缺陷型淋巴样发育和失活的LN滤泡(Cao，Shores等1995)，甚至在人HCT后，也不能挽救外周LN的再生并且LN大部分是小的或者在尸体剖检时鉴定不到。经SmyleDC免疫的小鼠分别在多至90％和70％的群(cohort)中表现出显著的活性腋窝和腹股沟LN。ConvDC免疫导致频率较低的腋窝(66％)和腹股沟(33％)LN(图14B)。显著地，右侧的SmyleDC免疫与对应淋巴引流轴相同侧的LN形成之间存在强相关性。为了确认在HCT后20周发生从下躯干(腹股沟LN)引流到上躯干(远端腋窝引流LN)的功能性淋巴引流，我们在NRG小鼠中的SmyleDC免疫位点附近皮下注射了5％埃文斯蓝。墨水将邻近注射位点的引流腹股沟LN染色并且蓝色信号通过淋巴管迁移至远端腋窝LN。具有正常淋巴系统的免疫活性C57BL/6小鼠表现出类似的墨水引流模式，而未经免疫的小鼠或经ConvDC免疫的小鼠表现出受损的引流(数据未示出)。
再生的淋巴结含有处于不同分化阶段的人T和B细胞
对从经SmyleDC免疫小鼠外植的LN进行免疫组织分析揭示淋巴细胞大量浸润，但只有少数区域与在从野生型C57BL/6小鼠获得之正常发育LN中观察到的生发中心的解剖结构相似(数据未示出)。免疫荧光分析显示人CD3+T细胞具有明显的种群恢复(数据未示出)。人CD11c+DC在皮质中被检测到或者与小鼠淋巴内皮细胞共定位(LYVE-1)。我们还检测到对小鼠内皮CD31标志物呈阳性的脉管结构(最可能是高内皮小静脉)。对LN的流式细胞术分析揭示了人CD45+细胞(77％)、CD3+T淋巴细胞(73％)和仅3.8％的CD19+B细胞(图14C)。在人CD3+细胞中，56％是CD4+，42％是CD8+(图14D)。对两个T细胞亚群而言显著的是，我们观察到约80％CD45RA-CD62L-效应记忆细胞、10％至20％中枢记忆细胞和不到5％幼稚T细胞(图14E-F)。为了鉴定滤泡T辅助细胞(Tfh)，将从经SmyleDC免疫小鼠外植的LN合并，并针对CD4+CXCR5+hiPD-1+ICOS+细胞进行分析，其对应于4.2％的CD3+群(图14G)。人扁桃体显示出约8％的Tfh细胞频率(图14G)。我们还检测了合并LN中的B细胞亚群并将其与人扁桃体进行了比较(数据未示出)。CD24hiCD38hi过渡型B细胞对应于人源化LN(0.4％)和扁桃体(2.4％)中的总CD19+细胞的一小群(图14H)。与扁桃体中相比，人源化LN中具有较低的幼稚B细胞(IgD+CD24intCD38int)频率(5.9％相对于43.9％)。意外地，我们发现与扁桃体相比，人源化LN中具有显著更高的CD27hiCD38hi终末分化成浆细胞频率(49.1％相对于0.7％)(图14H)。
SmyleDC迁移至邻近和远端LN
对经SmyleDC免疫并随后注射有经荧光素酶基因标记之SmyleDC的小鼠的注射位点进行非侵入式光学成像分析揭示生物发光发射细胞迁移至邻近腹股沟LN的部位(图15)。从注射后的第7天至第21天，注射位点和LN区域中的生物发光信号增加。在SmyleDC/LUC注射后21天移植的局部和远端LN显示出生物发光信号。这些数据证明在免疫再生的HIS-NRG小鼠中，SmyleDC可迁移至局部和远端LN。这些结果证实，与ConvDC和对照中相比，在经SmyleDC免疫的小鼠中可以以较高的绝对细胞计数检测到人骨髓和类浆细胞DC(图16)。这潜在地表明SmyleDC在LN中具有刺激内源再生的DC前体在LN中分化成DC的旁分泌作用。此外，对邻近SmyleDC注射位点的LN进行灵敏实时PCR分析显示具有可检测拷贝的慢病毒载体(0.78+/-0.43拷贝/细胞)。在免疫侧对侧的LN(0.05+/-0.04拷贝/细胞)中以及脾(0.58+/-0.49拷贝/细胞)中也检测到LV拷贝，证实SmyleDC全身性地迁移至淋巴器官。
在经SmyleDC免疫之小鼠的脾中可检测到人成熟T和B细胞的绝对数增加
在HCT后20周，与未经免疫的小鼠相比，经SmyleDC免疫的小鼠显示其脾中的人CD3+T细胞绝对数(858,487)增加超过100倍(p＝0.0028)(图17A)。经ConvDC免疫的小鼠(6,394个细胞/脾，低132倍，p＝0.02相对于SmyleDC)和对照小鼠(4,459个细胞/脾，低192倍，p＝0.0007相对于SmyleDC)不能支持CD3+细胞高水平的扩增/CD3+细胞向脾的归巢(表1)。与此前在外周血中评估的较低相对频率相反，经SmyleDC免疫的小鼠(406,672个细胞/脾)比经ConvDC免疫的小鼠(82,065个细胞/脾，低5倍，p＝0.37)和对照小鼠(15,639个细胞/脾，低26倍，p＝0.0034))在脾中具有显著更高的CD19+B淋巴细胞绝对含量。在组织学上，发现人T和B细胞在类似于滤泡的簇内相互作用(数据未示出)。进一步对T淋巴细胞亚群的组成进行了分析。SmyleDC小鼠脾中Th和CTL细胞的平均数分别是370,086个细胞/脾和81,649个细胞/脾(图17B-C)。这显著高于在ConvDC免疫后(分别是13,976个和7,937个细胞/脾，相对于SmyleDCp＝0.0046和0.038)和在未经免疫的对照(CD4+，1,943；相对于SmyleDCp＝0.0035和CD8+，52；相对于SmyleDCp＝0.021)中发现的数目。幼稚和效应T辅助细胞两者以及CTL在绝对细胞数方面都有所增加(图17B-C)。在SmyleDC免疫后，以平均9,425个Tfh细胞/脾检测到在HIS-NRG小鼠的脾中很少观察到的滤泡T细胞(与对照组中的仅12个细胞/脾相比)(p＝0.0023)，而在ConvDC组中则未检测到Tfh群(图17D)。对脾中的B细胞亚群进行详细分析揭示过渡型B细胞的数目无显著差异(对照6,732个细胞/脾，ConvDC 29,028个细胞/脾和SmyleDC77,454个细胞/脾)(图17E)。然而，与其他组相比，SmyleDC免疫导致成熟B细胞(83,454个细胞/脾)和成浆细胞/浆细胞(91,522个细胞/脾)发生显著明显的扩增。
SmyleDC免疫诱导抗-pp65T细胞免疫应答
此前，我们已表明在进行过继性huPBL/T细胞转移之前用SmyleDC免疫小鼠增强体内抗-pp65特异性T应答(Daenthanasanmak，Salguero等2012)。在此，我们评价了SmyleDC是否可刺激对pp65具有HCT后反应性的内源发育的人T细胞。在HCT后20周，从脾或LN FACS-分选人CD3+细胞。为了获得足够用于进行免疫测定的T细胞数，将获自脾的T细胞在抗CD2/CD3/CD28缀合的珠子存在下扩增3天并进一步与SmyleDC加细胞因子((IL-2、IL-7、IL-15)一起共培养7天(图10C)。在不存在抗原刺激物(NoAg)或具有pp65重叠肽库(pp65pp)的情况下将T细胞接种在IFN-γ包被的板上过夜，并通过IFN-γ-ELISPOT进行分析。与经ConvDC免疫的小鼠(三次重复试验的平均值：33.6个斑点相对于15.5个斑点，p＝0.25)或对照小鼠(少于1个斑点，p＜0.05)相比，来自经SmyleDC免疫的小鼠的脾细胞显示出更高的pp65反应性T细胞频率。从经SmyleDC免疫之小鼠(n＝4)的单独LN分离并与SmyleDC加细胞因子一起培养7天的T细胞也与pp65肽反应(pp65：53个斑点相对于无抗原：18.7个斑点，p＝0.021)。使用来自CMV反应性供体的PBMC作为该测定的阳性对照(图18B)。
SmyleDC免疫诱导免疫球蛋白和pp65特异性体液应答
我们观察到：与对照组相比，在SmyleDC免疫后脾中的IgG记忆B细胞频率以及血浆IgM和IgG的产生均显著增加，其中免疫球蛋白水平接近检测界限(图18C-E)。使用从CMV血清阳性的系统性红斑狼疮(SLE)患者获得的血浆作为内部开发的ELISA系统的阳性对照来评估特异性针对pp65的Ig反应性。虽然在经ConvDC免疫的小鼠或对照小鼠的血浆中都没有可检测的信号，但是在4/22和11/22小鼠的血浆中分别发现了抗-pp65IgG和抗-pp65IgM(图18F-G)。显著地，不管这些功能性的抗原特异性人T和B细胞应答，我们在这些小鼠中并未检测到GVHD的任何体征，如通过从HCT后的第6周至第20周进行体重监测所评价的(图19A)。使经SmyleDC免疫的10只小鼠的组群在HCT后维持40周，并且我们并未观察到迟发型GVHD的临床体征或疾病的任何肉眼可见的临床体征。尽管如此，我们通过H&E染色和光学显微镜术在组织病理学上对一些小鼠(n＝4)之通常受影响的组织(例如皮肤和肠)中的GVHD体征进行了分析。我们在4只小鼠中2只的皮肤和4只小鼠中3只的肠中观察到仅为轻度的1级GVHD，与凋亡体检测相一致(图19B-C)。
通过PCR检测小鼠组织中SmyleDC
使用含有3个拷贝整合的LV序列的293T细胞系作为标准对照采用定量实时PCR方法来检测慢病毒载体中的WPRE元件。对SmyleDC的分析得到7.5拷贝载体/细胞。对从移植有CD34+细胞并经SmyleDC免疫的NGRG小鼠(n＝4)收集的脾的分析显示0.58+/-0.49拷贝/细胞。对从移植有CD34+细胞并经SmyleDC免疫的NRG小鼠(n＝4)收集的LN的分析显示邻近LN为0.78+/-0.43拷贝/细胞并且对侧LN为0.052+/-0.041拷贝/细胞。这些数据证实皮肤上注射的SmyleDC具有到局部和远端LN以及脾的迁移能力(表2)。
讨论
使用HIS-NRG模型来证明SmyleDC在人HCT背景下的效力的这项临床前确认研究超出我们的预期，因为观察到全范围的T和B细胞终末适应性免疫重建效应，包括外周淋巴结的发育。ConvDC和SmyleDC两者均可用从G-CSF动员HCT供体分离的单核细胞产生。与ConvDC相比，SmyleDC表现出较高的体外生存力并且持续自分泌活化相关免疫细胞表面标志物和细胞因子的表达。与经ConvDC免疫的小鼠或对照小鼠相比，HCT后10周的SmyleDC皮下施用和另外10周后的血浆分析揭示若干人细胞因子(GM-CSF、IL-5、MCP-1、IFN-γ、IL-13、TNF-α、IL-8、IL-4)具有显著较高的水平。这与显著较高的人T细胞频率、较高的效应记忆T细胞绝对数和在血液、脾和LN中检测到终末分化的血浆B细胞有关。HCT后20周的免疫监测显示这些细胞细胞效应伴随有pp65特异性T细胞和抗体应答。综合考虑这些数据，尽管与未经免疫的小鼠相比，表达pp65之ConvDC的免疫表现出一定程度的免疫调节，但是SmyleDC的效应明显更强烈。这些差异突出了对涉及有丝分裂后和非复制型抗原呈递细胞的细胞治疗在施用后持续足够久的需求，以有效传导信号、产生细胞因子和趋化因子、迁移、吸引以及与免疫系统中的其他细胞相互作用从而进行稳健的抗原呈递。
NRG小鼠中的这些新体内发现还可导致新的进步以改善具有功能免疫系统的人源化小鼠的产生。尽管在过去的十年内已对用于诱导免疫缺陷小鼠中免疫重建的数种转基因和疫苗接种方法进行了评价，但是仍缺乏解决人造血发育成终末和功能性分化T细胞和B细胞的合适体内实验模型。为了从实验上概述HCT后的体内人免疫重建，Schultz、Ishikawa及其同事开创了将CD34+HSC移植到缺乏共有白细胞介素-2受体γ链(IL2Rγ)的不同类型免疫缺陷小鼠品系中(NOD/Rag1null/IL2Rγnull-NRG、NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull-NSG或NOD/SCID/IL2Rγnull-NOG)，导致在CD34+细胞转移后8至10周人造血细胞系重建(Ishikawa，Yasukawa等2005；Shultz，Brehm等2012)。然而，不管HSC的来源和用于细胞移植的方法，人源化小鼠都表现出非最佳的淋巴细胞重建水平，缺乏或低水平的抗原特异性细胞和体液应答以及总体无反应性(Lepus，Gibson等2009；Andre，Erbacher等2010)。可能在HIS小鼠之低效率淋巴发育中产生影响的因素包括缺乏人组织相容性分子和差的人源化细胞因子环境。为了克服这一缺陷，最近已描述了这样的方法，所述方法包括递送重组细胞因子(Chen，Khoury等2009；O’Connell，Balazs等2010)、移植胎儿淋巴组织以及HPC(Biswas，Chang等2011；Hu和Yang 2012)或者使用组成型表达I型(Shultz，Saito等2010)或II型(Danner，Chaudhari等2011)主要组织相容性分子(MHC)或关键造血细胞因子(Willinger，Rongvaux等2011)的转基因品系。尽管有一些改善，但是这些策略有限地改善针对人病毒攻击的B和T细胞应答。与此前有关G-CSF动员成年造血干细胞之HCT移植的报道相一致，我们观察到未经免疫的对照小鼠中相对具有低的T淋巴细胞频率(即，低于20％)，这同样反映了用ConvDC免疫获得的结果。反之，也报道了，在对照小鼠中循环人B细胞(在此限定为CD19+细胞)的相对频率通常高于80％。SmyleDC/pp65免疫导致PBL中的相对B细胞频率降低，但是与脾和淋巴结中的绝对B细胞含量增加有关。值得注意的是，这些组织中T和B细胞的较高种群恢复率与成熟表型相关的免疫活化有关。重要的是，很少报道描述到HSC移植小鼠中存在重建的淋巴结构(Sun，Denton等2007；Marodon，Desjardins等2009；Singh，Singh等2012)。
尽管可通过使用人脐带血或胎儿肝来改善人CD34+HCT从而达到比我们研究(使用G-CSF动员成年血液)中更高的人细胞植入率(＞60％)，但是已报道的LN结构是无对照的或者需要非常长的观察时期(Lang，Kelly等2013)。这些数据表明HCT后可能需要功能性且长期持久的DC以再生外周淋巴结和淋巴流从而朝着人源化小鼠中的全免疫功能激活、动员并最终成熟淋巴细胞。因此，在人源化小鼠模型中加速功能DC的存在同时加速LN和淋巴发育可能是使用这些模型来预测地研究适应性免疫的必要条件。尽管早期的T细胞发育不是我们效力研究的焦点，但是我们预测在脾中发现的较高绝对幼稚和记忆/效应T细胞计数反映了这些人源化小鼠中真正较高的胸腺生成。最后，“人内源性再生全身淋巴结”(“HERS-LN”)的这种新形式将允许日后在体内对以下进行更详细的机制研究：人免疫系统的发育、抗原呈递、T和B细胞终末活化以及HCT方案、疫苗和免疫调节分子临床前测试的有用解释。
用于癌症免疫治疗的经单个三顺反子慢病毒载体产生的慢病毒诱导DC的安全性评价、规模扩大和临床发展是我们组的当前任务((Pincha，Sundarasetty等2012；Sundarasetty，Singh等2013)。正在将共表达pp65与单个三顺反子慢病毒载体之SmyleDC的产生转化成临床试验，以免疫接受来自CMV血清阴性供体的干细胞移植物或脐带血的移植患者(Daenthasanmak，Salguero等，“实施例3”中)。此外，日后还可将SmyleDC/pp65作为针对神经胶质瘤和乳腺癌的自体细胞免疫治疗产品进行研究，因为最近已表明HCMV可作为这些类型癌症的病毒靶标。
实施例3
实验目的
在本研究中，我们使用两种完全人源化的小鼠HCT模型对用临床前单个三顺反子整合酶缺陷型慢病毒载体产生的SmyleDC/pp65进行了验证。我们对一些效力和安全性参数进行了测试并且建立了移植有人CD34+干细胞(G-CSF动员的成年HSC相比较于新生UCB)的经辐照NRG小鼠中的效力证据。在这些预测性人源化HCT小鼠模型中，我们证明SmyleDC/pp65的适应性免疫作用促进内源发育的细胞毒性T细胞的扩增和针对HCMV pp65抗原的体液免疫反应性。
结果
三顺反子载体对树突细胞复苏、生存力和性质的影响
将三顺反子自失活慢病毒载体ID-LV-G20pp65(图21A)设计成具有异源间隔2A元件(由猪捷申病毒衍生的P2A和来自口蹄疫病病毒的F2A)。如(Daenthanasanmak等，2012)所述生产用水泡性口炎-G蛋白(VSV-G)假型化的第三代整合酶缺陷型慢病毒的大规模批次。通过测量p24衣壳蛋白的浓度来确定病毒滴度，从而产生在正常范围内的滴度(三顺反子：7μg/ml，n＝10；双顺反子：9.4μg/ml，n＝10)。通过western印记和免疫检测分析裂解物和细胞上清液来确认所有转基因GM-CSF、IFN-α和pp65在转导293T细胞中的表达。主要分泌GM-CSF和IFN-α并且其在细胞上清液中可检测。Western印记分析显示pp65蛋白排他的细胞内表达，这可通过细胞内染色和流式细胞计量术分析确认。将从健康供体获得的单核细胞与ID-LV-G2αpp65载体以5的感染复数(MOI)过夜暴露并随后在不存在重组细胞因子的情况下离体培养7天导致平均20％用于转导的单核细胞复苏(与对照双顺反子载体的32％相比)。我们观察到MOI对细胞复苏具有剂量效应，并且MOI＝5产生最一致的细胞复苏(数据未示出)。对于双顺反子和三顺反子载体转导，在进一步培养后，活细胞的数目可比较地降低(相对于第14天的8％输入和第21天的5％输入)，证明当与分化细胞因子以顺式提供在一个载体中时pp65无毒性或转化效应(图21b)。对SmyleDC/pp65中免疫表型标志物(HLA-DR+/CD86+)的稳定性和细胞内pp65表达的可检测水平分析至多21天的离体培养时期，因为细胞最终衰老并在培养约1个月后死亡(图21c、d)。在DC培养的第7天，对活化的单核细胞衍生DC的典型免疫表型DC标志物组(高频率的HLA-DR+、HLA-ABC+、CD11c+、CD80+、CD86+)进行另外的详细分析显示pp65抗原对免疫学相关标志物的表达无不利影响。观察到低频率的表达推定的单核细胞(＜10％CD14+)、类浆细胞DC(＜40％CD123+)和终末分化DC(＜10％CD83+)标志物的细胞(图21e)。pp65的共表达也不影响一些内源上调的细胞因子(低至中等水平达10pg/ml：IL-5、IL-12p、IL-10、IL-7、IL-6、IL-4和TNF-α；高水平1ng/ml至10ng/ml：IL-8和MCP-1)或在载体中共表达的转基因GM-CSF和IFN-α细胞因子的分泌，其可分别以平均约1.0ng/ml和4.6ng/ml检测(n＝3)(图21f)。总的来说，我们观察到载体中的顺式pp65共表达对SmyleDC/pp65的生存力或分化无不良影响。
由脐带血单核细胞产生SmyleDC/pp65
用来源于在汉诺威医学院产科诊所(Obstetrics Clinic)分娩之足月母亲(term mother)在知情同意的情况下捐赠的人脐带血的样品建立脐带血库。通过Ficoll分离来分离单核细胞并随后将其冷冻并储存或者进行CD34+造血干细胞富集。将每个供体样品的CD34阳性和阴性级分两者都冷冻保存。通过MACS从CD34阴性级分富集CD14+单核细胞。使用我们之前描述的方案用编码人GM-CSF-IFNa-pp65的病毒将这些单核细胞转导并施用于移植有来自同一供体之CD34+细胞的小鼠。将一部分的SmyleDC/pp65细胞在培养物中维持7天以用于分析DC分化免疫表型和pp65抗原表达。
ID-LV-G2αpp65在SmyleDC/pp65中的整合形式
尽管此前ID-LV序列的整合形式在输注有载体之小鼠的肝细胞中已经示出(Matrai等，2011)并且ID-LV已被探索用于体外转导小鼠和人DC(Negri等，2012)，但是之前并未针对所转导的单核细胞或DC对ID-LV的整合形式进行表征。尽管DC是有丝分裂后的非复制型细胞，但是潜在致瘤基因座中的偏向整合(biased integration)可易于引起基因毒性效应。为了评价骨架LV-G2αpp65载体的整合形式，将用整合酶活性(IC-LV)或整合酶缺陷型(ID-LV)载体产生的SmyleDC/pp65在培养物中保持10、20和30天，并比较所整合的载体拷贝。在第10天，与用ID-LV产生的SmyleDC/pp65(0.3拷贝/细胞)相比，用IC-LV产生的SmyleDC/pp65显示出四倍高的整合拷贝数/细胞(1.2拷贝/细胞)。对于这两种培养物，在进一步培养后(第20天)和当细胞达到衰老时(约30天；IC-LV：0.3拷贝/细胞；ID-LV：0.1拷贝/细胞)，整合拷贝数/细胞持续降低(图22a)。在慢病毒转导后，在时间点10、20和30天用高通量整合位点(IS)分析(Schmidt等，2007)监测经遗传修饰的单核细胞的克隆贡献。线性扩增介导(LAM)PCR和下一代测序检测到经IC-LV转导的单核细胞之映射为3.000个独特染色体位置的＞40.000个IS序列和经ID-LV转导的单核细胞之映射为＞1.500个独特染色体位置的＞14.000个IS序列。每条染色体的整合位点分布没有偏向，即整合位点的数目整体上与这两种载体类型之染色体的大小相关，即，在较大的1号染色体上检测到多于10个整合，而在21号染色体上检测到约1个整合。就基因或基因+/-10kb距离中的病毒整合数而言，这两种载体类型具有类似的分布：大多数的整合在基因之外(图22b)，特别是转录起始位点上游的至多5kb(图22c)。所有转导时间点的大多数IS远低于所得总读数的5％，而少数偶尔达到至多5％。显示插入的10个频率最高基因座对于每个时间点而言相当不同(图22d)。值得注意的是，经ID-LV转导的单核细胞在编码高尔基体蛋白抗原7(GOLGA7)之基因的基因座中出现反复插入。含有GOLGA7的基因座是ID-LV在所有时间点的最频繁IS，但是随着时间的变化频率下降。两种类型载体发生插入的另外常见基因座是WDR74(小鼠中胚泡形成所需的一种蛋白质)、锌指蛋白37A(ZNF37A)和具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶(TPTE)。所有这些蛋白质的RNA表达通常是普遍存在的并且可在人中致癌功能未知的白细胞中检测到。
SmyleDC/pp65的HCMV感染不允许体外病毒复制
已知单核细胞衍生的DC易受HCMV感染，并且在其分化成活化DC后，观察到病毒复制(Riegler等，2000)。因此，SmyleDC/pp65的一个重要安全性方面是这种细胞产物是否仍会允许HCMV扩散，例如如果从HCMV血清阳性供体产生的话。为了解决这一方面，对不同类型的慢病毒载体化DC进行了比较：表达GM-CSF和IFN-α的SmyleDC以及共表达GM-CSF和IL-4的SmartDC(Daenthanasanmak等，2012)。用表达GFP之经遗传修饰的毒株HCMV-TB40/E以2的MOI感染树突细胞。如先前所述，使用经感染的人成纤维细胞(HF)作为阳性对照(Sinzger 等，2008)。使用荧光显微术观察未染色的细胞。绿色荧光信号表示细胞受到感染。在该实验中，仅在第10天于不表达IFN-α的SmartDC中观察到荧光信号(图24a)。用FACS分析确认这些结果。感染后7天，约50％的HF细胞受到感染，通过流式细胞术分析显示为GFP+细胞。SmartDC培养物中约0.5％的细胞表现出HCMV感染，而SmyleDC和SmyleDC/pp65细胞显示出接近基线的GFP+细胞(＜0.06％)。为了避免由病毒携带而引起的可能人工假象，用1的MOI重复实验并在病毒感染后将细胞充分洗涤(5x)。对GFP表达的动力学分析显示从感染后的第2天至第10天经HCMV感染之HF的量逐渐增加(图24a)。对于SmartDC，GFP+细胞的频率最初为2％，在第4天降低至0.2％并且随后在第10天提高至0.6％。对于SmyleDC和SmyleDC/pp65，初始感染也为约2％，但是甚至在培养中的稍后时间点，GFP+细胞的频率低于0.06％。通过监测CD80来补充这些分析，CD80为在活化DC中上调但在HCMV感染后显示受到调节的相关共刺激标志物(Moutaftsi等，2002)。对于模拟感染的细胞，三种类型的DC具有可比较的CD80表达(可在50％的细胞中检测到)。另一方面，在HCMV感染后，SmartDC中的CD80表达下调(第10天可在20％的细胞中检测到)，但是在病毒感染后SmyleDC的CD80表达提高，特别是在SmyleDC/pp65中(第10天可在80％的细胞中检测到)(图24b)。为了评价细胞是否可释放新的病毒体，通过噬斑测定分析从每个时间点收集的上清液(图24c)。经感染的HF显示在第4天释放大量的病毒(1.4x106pfu/ml)并且在第10天逐渐减少(减少至1.35x106pfu/ml)，因为培养物中的大部分细胞被裂解。在DC培养的第0天仅可检测到残留量的病毒(120pfu/ml至300pfu/ml，可能反映出剩余的携带病毒附着在DC表面上并且随后被释放)(图24c)。对于所有的DC组，直到培养的第4天并未释放出可检测的病毒。在第6天，SmartDC开始释放病毒(5pfu/ml)，其在第10天逐渐增加(增加至35pfu/ml)。相比之下，在SmyleDC或SmyleDC/pp65细胞上清液中随后并未观察到病毒释放。因此，即使DC可能初始已被感染，但是与表达IL-4的SmartDC相比，SmyleDC和SmyleDC/pp65的IFN-α表达似乎能更好地控制HCMV感染和释放两者。
用自体SmyleDC/pp65体外刺激和扩增CTL
需要CD4+T辅助细胞和CD8+CTL两者来保护个体以控制原发性HCMV感染(Gamadia等，2003)和HCT后HCMV再活化(Einsele等， 2002)中的病毒复制。使用基于流式细胞术分析的16小时IFN-γ捕获测定来评价SmyleDC/pp65(收获于转导后的第7天)是否可活化从HCMV血清阳性HD(n＝3)获得的两种类型的T细胞(图25a)。作为对照臂，我们包括了不进行刺激、用pp65肽库刺激(该测定的标准阳性对照)和用不呈递pp65抗原的SmyleDC刺激。对于这些健康供体并且在短测定条件下，在用pp65肽刺激后，我们并未观察到IFN-γ产生CD4+或CD8+细胞的频率有所增加。与pp65肽刺激形成对比，经SmyleDC/pp65刺激的CD3+T导致IFN-γ产生CD4+T细胞(18倍，p＜0.05)和CD8+T细胞(5倍，p＜0.05)的频率显著增加。未负载pp65抗原的SmyleDC对IFN-γ产生CD4+和CD8+细胞表现出较低但一致的刺激，这可能归因于释放的IFN-α对活化T细胞以产生IFN-γ的直接刺激作用(Hervas-Stubbs等，2011)。
为了进一步定义pp65表达对活化抗原特异性CD8+效应细胞的影响，我们对从A＊02；B＊07供体(n＝3，HCMV血清阳性)获得的DC和T细胞进行了两次顺序微量培养以扩增足够数目的CTL从而用于进行进一步的功能测定(图25b)。与在刺激性重组细胞因子(IL-2、-7和-15)存在下维持T细胞相比，与经纯化的自体CD8+T细胞共培养的SmyleDC/pp65导致7倍高的T细胞扩增。值得注意的是，CTL与SmyleDC的共培养也导致较高的T细胞扩增(12倍)，表明刺激部分地归因于体内稳态作用并且不依赖于抗原。在将SmyleDC/pp65与CD3+T细胞共培养后，在微量培养系统中也观察到类似的扩增。尽管如此，只有在SmyleDC/pp65存在下扩增的CTL显示出高频率的pp65特异性T细胞，可通过五聚物染色对其进行分析(A＊02限制性表位pp65aa 495-503：平均值＝7.7％P值＜0.05；B＊07限制性表位pp65aa 417-426：平均值6.4％P值＜0.1)(图25b)。随后，对已经经SmyleDC或SmyleDC/pp65刺激之体外扩增CTL的细胞毒性功能进行评价。使用被遗传修饰成组成型表达A＊02(KA＊02)或B＊07(KB＊07)并经慢病毒转导以进行高水平pp65抗原表达的K562细胞作为靶标(图25c)。将CTL以不同的效应细胞∶靶标(E∶T)比共孵育4小时，并评价细胞上清液的乳酸脱氢酶(LDH)释放。当与KA＊02或KB＊07靶标共孵育时，用SmyleDC扩增的CTL表现出类似的细胞毒性效应，不管靶标中是否表达pp65抗原。相比之下，经SmyleDC/pp65刺激的CTL以剂量依赖性方式更有效地裂解表达pp65的K562靶细胞(图25c)。该数据证实了载体化DC中的pp65共表达具有产生pp65特异性T细胞刺激的体外作用。
移植有人成年CD34+细胞并经SmyleDC相对于SmyleDC/pp65免疫之NRG小鼠的造血重建
此外，为了证明SmyleDC/pp65对CD8+扩增的体外作用并评价对B细胞和体液应答的可能适应性作用，在两轮的磁珠选择后，将从G-CSF动员的干细胞供体获得的CD34+细胞移植至经辐照的4周龄NRG小鼠(图26a)。HCT后10周，对于所有的小鼠，通过以可比较的水平分析外周血来确认人造血细胞的植入。在该时间点，人CD45+细胞相对于小鼠细胞的平均频率为约2.5％。正如我们此前在该HCT人源化小鼠模型中已观察到的(参见实施例3)，大多数的人细胞(80％-90％)是B细胞(限定为CD45+/CD19+细胞)。人T细胞的频率要低得多，并且明显地主要是T辅助细胞(限定为CD45+/CD4+细胞；1-6％)，而CTL以非常低的频率存在(限定为CD45+/CD4+细胞；至多3％)。因此，使用从同一HSC供体材料纯化的CD14+单核细胞来产生“自体”SmyleDC或SmyleDC/pp65，以评价对适应性造血重建(即T细胞和B细胞的扩增)的作用。在HCT后的第10周和第11周，以单个初免/加强进行DC疫苗接种。在于HCT后第13周中间物PBL分析后，在第20周将小鼠处死以进行肉眼病理学检查并收集组织。首先，我们对血液中可检测的人T细胞和B细胞进行了动力学分析。从第13周至第20周，经SmyleDC或SmyleDC/pp65免疫之小鼠示出人T辅助细胞(平均为50％)和CTL细胞(30％)两者的频率均明显增加(图26b)。来自之前使用该模型之组的结果显示未免疫的HCT对照在第20周与在第10周具有类似的人T辅助细胞和CTL水平(参见“实施例2”)。顺便提及，与最后一次免疫后两周(第13周)形成对比，在DC初免/加强后9周(第20周)观察到明显的效应。在该点，对这两个疫苗组而言，频率最高的人细胞是由约40％CD4+T细胞组成的T细胞，而我们在SmyleDC免疫中观察到平均17％的CD8+T细胞并且在SmyleDC/pp65中观察到平均30％(p＞0.5)(图26b)。这些结果表明SmyleDC/pp65对降低CD4/CD8比具有更明显的作用(SmyleDC为2.6，而SmyleDC/pp65为1.5，p＝0.07)，并且与我们证明pp65表达对CTL扩增之作用的体外T细胞刺激测定相一致。同时，与第10周的初始90％相比，在分析的第20周，两个免疫组中的B细胞频率均显著下降至约10％(图26c)。因此，这些结果表明在免疫后，载体化DC能够以某种方式将HSC的优先发育从B细胞转变成T细胞。我们还观察到脾人T细胞的明显种群恢复(37％Th、18％CTL和33％B细胞)。脾中约33％的细胞是人CD45+淋巴细胞，与PBL中相比产生3倍高的频率。在骨髓中也检测到类似高频率的人T淋巴细胞(约17％人细胞，来自那些35％Th、26％CTL和29％B cell)。脾细胞中表型T细胞标志物的分析仅对一个小鼠亚群是可行的(n＝5SmyleDC；和n＝2SmyleDC/pp65)。对经SmyleDC/pp65免疫小鼠分析的Th细胞表现出更明显的效应记忆表型和仅残余水平的幼稚细胞，这与SmyleDC免疫非常不同，其中幼稚、中枢记忆和效应记忆细胞更平衡(图26d)。同时，在SmyleDC/pp65免疫后，效应记忆CTL的频率也略高。因此，在免疫后，不仅B/T细胞区室被改变，而且T细胞活化水平也发生改变。我们针对移植物抗宿主病的任何体征对小鼠进行了监测。尽管T细胞频率和活化明显提高，但是仅在经SmyleDC/pp65免疫的16只小鼠中的一只观察到GVHD。PBL分析显示PBL、脾和骨髓中高频率的效应记忆Th和CTL细胞。
在HCT后SmyleDC/pp65的功能性人体内稳态、T和B细胞作用
除对重建不同造血细胞系的作用之外，我们还对经SmyleDC/pp65免疫HIS小鼠之与功能性免疫应答有关的一些特性进行了表征。移植有PBL-CD34+HSC并经SmyleDC/pp65免疫的小鼠示出在小鼠血浆中可检测的数种人细胞因子的水平明显提高(图27a)。这些细胞因子反映了无偏Th1/Th2模式，因为除IL-5(与嗜酸性粒细胞活化有关)和MCP1(调节单核细胞和巨噬细胞之迁移和浸润的趋化因子)之外，还检测到Th1(至多10pg/ml：IL-5、IL-β；高于10pg/ml：IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、IFN-α)和Th2(至多10pg/ml：IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-8；高于10pg/ml：IFN-γ)型细胞因子两者。明显地，在SmyleDC免疫后，除MCP1，在小鼠血浆中均检测不到这些细胞因子，表明DC的内源pp65抗原呈递具有稳定T细胞和B细胞免疫突触以及促进人细胞因子和趋化因子广泛产生的关键作用。
为了评价抗pp65特异性T细胞应答，将经SmyleDC/pp65免疫的小鼠的脾细胞合并，并且将经分选的人Th细胞和CTL用CD2/CD3/CD28珠非特异性活化并进一步用SmyleDC/pp65体外扩增以允许进一步的分析。使用ELISPOT测定来评估1周刺激后的抗-pp65应答。用pp65脉冲T细胞后，我们观察到以量化的IFN-γ阳性斑点测量的CD8+和CD4+T细胞反应性，但是显示，仅CD8+反应性对pp65具有特异性，因为未经pp65肽脉冲的CD4+也被活化(图27b)。
另一相关免疫监测参数是HCT和免疫后小鼠中的血清转化。值得注意的是，在SmyleDC/pp65免疫后可检测到数种类型的人免疫球蛋白(IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgGM)(图27c)。在SmyleDC疫苗中不存在抗原的情况下，我们仅可观察到IgM产生。因此，SmyleDC/pp65的抗原呈递在B细胞发育期间促进Ig转换。对pp65特异性的血浆免疫球蛋白反应性的分析示出可检测水平的IgM(图27d)。
移植有人脐带血CD34+细胞并经不同剂量的SmyleDC/pp65免疫之NRG小鼠的造血重建
UCB是处于非常不成熟分化阶段的HSC和祖细胞的丰富来源。因此，作为解决体外造血重建中慢病毒载体化DC之影响的更严格模型，我们使用从UCB分离的CD34+细胞作为HSC源。使用我们的标准方案来由UCB单核细胞产生SmyleDC/pp65是可行的。可将1.5x105剂量的细胞静脉内(i.v.)注射到经照射的4周龄小鼠中来再现地建立NRG小鼠中的CD34+UCBT(图28a)。如之前对PBL-CD34+模型所进行的，即在HCT后10和11周，我们将未免疫的小鼠与经SmyleDC/pp65免疫的小鼠进行了比较。此外，考虑到较不成熟的HSC状态和可能的较无反应性环境，在HCT后的第6周和第7周，我们另外施用了早期SmyleDC/pp65免疫(图28b)。在HCT后10周，未经免疫的小鼠对照示出60％至80％的循环中淋巴细胞来源于人，其中它们中的＞90％由B细胞组成，并且约10％是T细胞(图28b)。从HCT后的第10周至第16周，我们观察到血液中的Th细胞和CTL频率持续逐渐增加，峰为Th 20％，CTL 10％。在一次初免/加强SmyleDC/pp65疫苗接种后，CD4/CD8比并未改变(在第16周，对照3.1相对于经疫苗接种小鼠的2.6，p＝0.45)，但是在2次初免/加强SmyleDC/pp65疫苗接种后，在最晚16周的时间点观察到较低的CD4/CD8比(1.6，p＝0.09)。在SmyleDC/pp65免疫后，B细胞的频率未受影响(对于所有组，疫苗接种前约90％相对于第16周的约50％)。除这些发现之外，从HCT后10周的时间点直至16周，较强的SmyleDC/pp65免疫还显示出与较高频率效应记忆CTL有关的定量效应(分别是9％相对于29.5，p＝0.1，图28c)。在加强的4x SmyleDC/pp65免疫后，脾中的总CTL(2.7x106相对于对照小鼠的1.1x106，p＝0.18)、幼稚CTL(0.8x106相对于对照小鼠的0.3x106，p＝0.46)和EM CTL(1x106相对于对照小鼠的0.3x106，p＝0.18)的绝对计数增加(图28c)。
SmyleDC/pp65免疫增强胸腺T细胞发育
我们评价了来源于脐带血干细胞重建的成熟T细胞的扩增是否是一件外周胸腺外事件或者也可能是SmyleDC/pp65免疫增强胸腺中的T细胞发育的结果。我们在经SmyleDC/pp65免疫(2x)之小鼠的胸腺中观察到显著更高频率的双阳性CD4+/CD8+和CD3+lo；TCRαβ-T细胞前体(图28d)。这表明较高的逆转(turn-over)胸腺T细胞发育，其可导致较高数目的CTL，这些CTL随后可作为幼稚T细胞被动员至血液以在外周(LN和脾中)中进行后续的抗原刺激并发展成为成熟T细胞。
SmyleDC/pp65免疫增强胸腺T细胞发育
为了评价SmyleDC/pp65在T细胞系与耐受性相关方面的影响，我们检测了CD4+FoxP3+CD25+CD127-调节性T细胞(Treg)的频率。尽管SmyleDC/pp65免疫改善了UCBT后成熟和功能性人CTL的重建以及体液应答，但是也观察到调节性CD4+FoxP3+CD25+CD127-T细胞发生适度但值得注意的扩增。值得注意的是，4x SmyleDC/pp65免疫使其在血液中的频率增加(6.7％；4x SmyleDC/pp65相对于对照，p＝0.06，图28e)。效应和致耐原性细胞的平衡再生可潜在地赋予平衡移植物抗宿主病(GVHD)发生的致耐原性能力。值得注意的是，移植有获自UCB的HSC并保持观察达16周的小鼠没有发生GVHD。
重建的有功能性人免疫系统的NRG小鼠中无体征或轻微1级GVHD
当于异种移植造血干细胞后重建小鼠中的完全功能性人免疫系统时，小鼠的移植物抗宿主病是一个关注问题。毕竟，接受者中的HLA分子与供体中的HLA分子完全不匹配。出于该原因，对上述实施例中使用的动物的GVHD体征和症状进行评估。评估基于调节性免疫细胞的解剖学特征(例如肠的炎症)和频率来进行。解剖学评估由经验丰富的病理学家来进行。评估结果总结于表3中。
结果表明，重建的人免疫系统不会引起小鼠中的中度或重度GVHD体征，即使其在其他方面有功能性。因此，使用本发明的iDC来在造血干细胞移植后帮助在接受者中重建功能性免疫系统的用途具有诱导接受者的组织对移植的免疫系统具有耐受性的潜力。鉴于以下事实：小鼠与人之间白细胞抗原的差别不仅在于不同人中的HLA分子，使用本发明的iDC具有允许利用不满足匹配标准但目前被应用于在移植后最小化GVDH的供体进行同种异体HSC移植的潜力。iDC的这种用途具有显著拓宽给定患者之潜在供体范围并由此发现用于具有罕见HLA分子组合之接受者的供体的潜力。
讨论
移植同种异体HSC对患有高风险血液学恶性肿瘤的患者而言是一个经验证的治疗选择，但是HCMV感染会对存活造成显著危险。我们的结果表明，编码GM-CSF、IFN-γ和HCMV pp65抗原的三顺反子ID-LV在早期CMV启动子的控制之下可以以高效率重编程来自G-CSF动员供体之外周血和脐带血的人CD14+单核细胞。将单核细胞单独过夜暴露于ID-LV载体驱使其自主分化成DC，这些DC以高生存力，免疫学特性(表达MHC II、共刺激分子和炎性细胞因子)和GM-CSF、IFN-γ和pp65的组成型表达自体维持7天。尽管，此前已报道pp65的异位表达可抑制IFN信号传导(Browne和Shenk，2003)，但是我们并未观察到在三顺反子载体中顺式表达的pp65的不利作用，支持我们此前使用用于DC重编程的两种载体反式共表达pp65的研究(Daenthanasanmak等，2012；Salguero等，2011)。
用ID-LV以5的MOI转导单核细胞产生少于0.3拷贝载体/细胞，并且对整合形式的分析示出对前述原癌簇具有高多克隆性并且无偏向。ID-LV在GOLGA7簇区中的整合似乎是频率最高的“热点”，其可能反映出在活化的单核细胞分化成活化树突细胞过程中活化单核细胞中的活性转录区。GOLGA7是一种普遍表达的蛋白质并且用作用于将蛋白质从高尔基体穿梭到质膜的棕榈酰化酶(Ohta等，2003)。在活化的DC中，GOLGA7基因表达增加(Cuiffo和Ren，2010；Li等，2000)。在DC和B细胞活化期间，MHCII被从内部囊泡主动外部化至质膜并且GOLGA7在蛋白质穿梭通过高尔基体中可具有重要作用。GOLGA7位于与单核细胞性白血病中的三体镶嵌现象有关区域中的8号染色体上(Ripperger等， 2011)，但是已知其不是原癌性的。然而，需从机理上解释为什么IC-LV不显示相同优先整合位点，表明与IC-LV相比，ID-LV在活化单核细胞基因组中的重组和最终整合可更偏向高度转录的“开放”基因组区。尽管如此，这两种类型的慢病毒载体化DC都没有显示在于用于遗传修饰造血干细胞(KDM2A、PACS1和TNRC6C)之慢病毒载体的临床前研究中表征的最已知热点中的整合(Aiuti等，2013)。这反映出HIV-1整合到活跃转录的染色质区域中的行为，其依赖于细胞类型和活化刺激物。
作为潜在的安全考虑，我们检测了SmyleDC/pp65是否可扩散HCMV，因为据报道由CD34+和CD14+祖细胞体外衍生的树突细胞对HCMV的完整复制循环高度易感并且允许HCMV的完整复制循环(Hertel等，2003；Riegler等，2000)。我们使用内皮刺激性(endotheliotropic)株TB40/E-GFP的体外感染研究表明SmyleDC的高IFN-γ表达可抑制病毒复制，而表达IL-4的SmartDC对HCMV感染更加易感并且可引起HCMV扩散。值得注意的是，SmyleDC和SmyleDC/pp65体外暴露于HCMV导致共活化T细胞的关键共刺激分子CD80的上调，表明组成型IFN-γ还消除对这些DC的潜在HCMV免疫抑制作用。
在临床上，证明pp65特异性CD4+和CD8+T细胞在HCMV清除中具有关键作用。由我们的结果可知，我们观察到内源表达的pp65对用于体外刺激CD4+和CD8+T细胞应答的载体化DC具有清除作用，其可通过上调IFN-γ细胞内染色和用针对pp65免疫显性表位反应性TCR扩增T细胞来检测。此外，扩增的pp65特异性CD8+T细胞对表达pp65抗原的靶细胞表现出优异的细胞溶解活性。
除了强体外抗原刺激之外，SmyleDC/pp65加速HCT和UCBT人源化小鼠模型中的造血重建。与我们的体外结果类似，用于免疫之DC的pp65抗原表达在血液和脾中产生数量和/或质量更高频率的人效应CTL。在SmyleDC/pp65免疫后，在胸腺中从头发育并生物分布至数个组织的T细胞变成主要的记忆T细胞，而在不存在抗原的情况下(HCT后的SmyleDC免疫)，我们观察到幼稚CTL亚群在血液中的明显扩增。不清楚什么驱动了在SmyleDC疫苗接种之小鼠的脾中和骨髓中观察到的效应记忆CTL群的分化。它们可代表对小鼠异种抗原具有反应性的T细胞，如在PBL-HCT后在未经免疫的小鼠中同样观察到的(参见实施例2)。
在HCT后人源化模型的免疫重建中的局限之一是成熟B细胞的不良重建和缺乏Ig类型转换。明显地，在HCT后，在经SmyleDC/pp65免疫的小鼠中检测到高水平的IgM、IgG和IgA(但是经SmyleDC免疫则未检测到)，支持以下观点：pp65抗原可影响用于Ig类型转换的B细胞的成熟。人源化小鼠中的研究证明B细胞成熟与效应T细胞的发育有关(Lang等，2013)。因此，由SmyleDC/pp65组驱动的pp65特异性CD4+T细胞扩增可提供B细胞成熟、Ig类型转换和分泌抗原特异性抗体所需关键的成熟因子(例如CD40L)。已做出了一些努力来改善HIS小鼠中的适应性免疫应答，例如递送重组细胞因子(例如GM-CSF和IL-4)(Chen 等，2012)或者转基因表达I型或II型HLA(Jaiswal等，2012；Suzuki 等，2012)。SmyleDC/pp65可符合这些要求中的若干条，因为其与移植的HSC是完全HLA匹配的、表达多种细胞因子并且提供有效的抗原信号。
对于人类年轻患者，淋巴细胞缺失后的T细胞免疫重建可通过活性胸腺生成发生，但是对于年长的成年患者，其主要通过外周扩增的克隆的体内稳态增殖发生(Williams等，2007)。体内稳态增殖结果是外周T细胞库的迅速且显著的扩增，并且依赖于淋巴细胞减少后时期内的体内稳态细胞因子和抗原驱使的应答两者(Williams等，2007)。尽管目前正在临床试验中对针对HCMV的一些疫苗候选物进行评估，但是高活力、可潜在地被大规模生产并且提供抗原和体内稳态免疫重建的个性化载体化树突细胞疫苗是一项有前景的临床革新以降低HCT和UCBT后的死亡率和发病率。
增加的病理学和临床证据表明HCMV可能是恶性肿瘤(例如神经胶质瘤和乳腺癌)中的病原体(Soderberg-Naucler等，2013；Taher等，2013)。尽管尚未报道用HCMV感染恶性造血细胞，但是HCT接受者或供体的HCMV阳性血清状态对急性白血病患者(特别是急性成淋巴细胞白血病)的存活产生不利影响(Schmidt-Hieber等，2013b)。此外，HCT后早期HCMV再激活的急性髓性白血病患者表现出较低的复发风险，表明推定的“病毒抗白血病”效应(Elmaagacli，2013；Green等，2013)或者HCMV可能还是增加白血病复发的病原体。因此，还可用基本原理来探索HCT后控制HCMV的免疫以改善移植物抗白血病和降低白血病的复发率。因此，根据良好生产规范(good manufacturing practice，GMP)扩大病毒生产规模并确认SmyleDC/pp65产生是当前的发展以用于针对高风险急性白血病的未来免疫治疗临床试验。
材料和方法
质粒构建和整合酶缺陷型慢病毒载体(ID-LV)产生
慢病毒骨架载体RRL由Luigi Naldini教授(Univ.Milan)慷慨提供。载体RRL-cPPT-CMVp-GM-CSF-P2A-IFN-α(LV-G2α)和RRL-cPPT-CMVp-pp65(65kD)的构建如(Daenthanasanmak等，2012)所述。对于LV-GM-CSF-P2A-IFN-α-F2A-pp65(LV-G2α-pp65)的产生，使用人GM-CSF-IFN-α和pp65的cDNA作为模板进行重叠PCR，并用口蹄疫病病毒的2A元件(F2A)间隔。用F2A元件进行LV构建的策略此前已有描述(Szymczak和Vignali，2005)。用于在IFN-α与pp65之间产生间隔F2A元件的引物是：F2A/pp65正向5’-CCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCCATGGAGTCGCGCGGTCGCCGTTG-3’(SEQ ID NO：7)和F2A/IFN-α反向：5’-TGGGTTGGACTCCACGTCTCCCGCCAACTTGAGAAGGTCAAAATTCAAAGTCTGTTTCACCGGTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCA-3’(SEQ ID NO：8)。将PCR产物用限制性酶XbaI和ClaI消化并插入到RRL-cPPT-CMVp-MCS载体的多克隆位点中。通过限制性消化和测序分析来确认所有构建体的结构完整性。大规模慢病毒的生产如前所述通过瞬时共转染人胚肾293T细胞来进行(Stripecke，2009)。通过在共转染中使用具有下列包装质粒之骨架载体的组合来进行ID-LV的产生：表达含有D64V点突变之gag/pol的质粒(由汉诺威医学院的Axel Schambach教授慷慨提供)、表达rev的质粒和编码VSV-G包膜的质粒。
用ID-LV产生慢病毒载体化DC
根据由汉诺威医学院伦理评价委员会批准的研究方案来获得从HLA-A＊02.01/HLA-B＊07.02阳性HCMV反应性成年健康志愿者获得的外周血单核细胞(PBMC)、从G-CSF动员供体和脐带血获得的白细胞单采。由CD14+单核细胞来产生慢病毒诱导DC此前已有描述(Daenthanasanmak等，2012)。简言之，使用CD14分离珠(MiltenyiBiotech，Bergisch-Gladbach，Germany)来从PBMC分离CD14+。在转导之前，将单核细胞用重组人GM-CSF和IL-4(各50ng/ml，Cellgenix，Freiburg，Germany)预先处理8小时。使用2.5μg/mL p24当量的ID-LV-G2α/pp65在5μg/ml硫酸鱼精蛋白(Valeant，Dusseldorf，Germany)存在下以5的感染复数(MOI)转导5x106单核细胞16小时。转导后，将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并进一步维持在含有无血清X-vivo培养基(Lonza)的培养物中或者直接用于进行小鼠免疫。
对细胞因子和转基因表达的分析
通过Western印记分析(Bio-Rad，Munich，Germany)来确定293T细胞裂解物和上清液中HCMV pp65蛋白的检测。对于SmyleDC/pp65中的细胞内pp65表达，通过前述细胞内染色和流式细胞术来进行(Daenthanasanmak等，2012)。首先，用单克隆抗体抗-人CD14、HLA-DR、HLA-ABC、CD80、CD86、CD83、CD11c和CD123的组合针对DC表面抗原染色SmyleDC，之后用BD cytofix/cytoperm溶液(Becton Dickinson GmbH，Heidelberg，Germany)固定和透化并与针对HCMV-pp65的FITC缀合小鼠单克隆抗体(Pierce Biotechnology，Rockford，USA)一起孵育。用FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)利用CellQuest软件来进行分析。通过根据生产商的说明书使用的多重luminex珠试剂盒(Milliplex Milipore，Billerica，USA)来进行SmyleDC培养物之细胞上清液中细胞因子的检测。
整合分析
使用前述LAM-PCR方法根据病毒拷贝数和整合位点分析来评价由IC-LV和ID-LV产生并在培养物中保持10、20和30天的SmyleDC/pp65(Schmidt等，2007)。通过qPCR来量化所整合的LV拷贝数。
HCMV-TB40/E GFP感染和噬斑测定
如前所述繁殖HCMV TB40/E GFP毒株(Sinzger等，2008)，并且病毒滴度是1.75x107pfu/ml。对于每个时间点(感染后0、2、4、6、8和10天，d.p.i.)，将每种类型的靶DC以5x105细胞/孔接种在6孔中。使用人成纤维细胞(HF)作为阳性对照。用HCMV(以2和1的MOI)感染DC和HF细胞24小时。感染后，用PBS洗涤细胞并将其保持在含有补充有10％FBS以及1％青霉素和链霉素的DMEM的培养物中。在每个时间点，收获经感染的细胞以用于GFP分析并使用PE缀合的抗-人CD80来表面染色DC。在洗涤后，将细胞固定在1％多聚甲醛中并通过流式细胞术分析。对于噬斑形成测定，在每个时间点收集细胞上清液并将100μl未经稀释和经稀释(10倍连续稀释液中的20μl)的DC上清液添加至48孔板中接种的单层HF细胞。对于每份上清液和每个时间点，设置两个重复孔。在孵育2小时后，添加500μl的羧甲基纤维素以确保感染仅在细胞间是可能的。在感染后4至10天后分析噬斑的数目。在第10天，使用吉姆萨染色来染色噬斑以确认噬菌斑数目。由噬斑数目的平均值来计算滴度(pfu/ml)，而噬斑数目由重复孔x稀释因子/稀释体积(0.1ml)来计数。
对体外刺激的pp65反应性T细胞的分析
使用MACS系统根据生产商的方案(Miltenyi Biotec)从PBMC分离自体CD3+和CD8+T细胞。对于经10μg/ml PepTivator CMV-pp65重叠肽库(Miltenyi Biotec)或DC刺激16小时的T细胞的IFNγ细胞内染色分析，收获T细胞并将其用APC缀合的抗-人CD3、PB缀合的抗-人CD4和PCy7缀合的抗-人CD8抗体染色。在用Cyofix/perm(BD)于4℃下固定/透化20分钟并洗涤后，使用抗-人IFNγ(ebioscience)染色30分钟。获取细胞并使用LSRII(Beckman Coulter)通过流式细胞术分析。对于微量培养扩增系统，将SmyleDC或SmyleDC/pp65(第7天)与96孔板中分离的自体CD8+T细胞以1∶10的比(APC∶T细胞)在补充有5％人AB血清的X-vivo培养基中共培养。每个微量培养添加经γ辐照的自体CD8-饲养细胞(2x105)。3天后，隔日用IL-2(20IU/ml)(NovartisPharma GmbH，Germany)IL-7和IL-15(各5ng/ml，Cellgenix，Gladbach，Germany)补充细胞。对于7天后的再刺激，将经冷冻保存的DC解冻并以1∶10的比添加至T细胞。收获经再刺激的T细胞、计数并通过四聚物染色分析pp65反应性。使用PE缀合的四聚物(HLA-A＊0201-NLVPMVATV，pp65氨基酸(aa)495-503；HLA-B＊0702-TPRVTGGGAM，pp65aa 417-426；Beckman Coulter)、APC缀合的抗-人CD3、PB缀合的抗-人CD4和PCy7缀合的抗-人CD8。
将造血干细胞移植到免疫缺陷NRG小鼠中
繁殖NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl(NOD.Rag1-/-.IL-2rγ-/-，NRG)小鼠的繁殖对并将其在无病原体条件下维持在IVC系统(BioZone，UnitedKingdom)中。涉及小鼠的所有操作都经过Lower Saxony的审核和批准并且遵循汉诺威医学院动物研究室提供的指导方针。将5x105从G-CSF动员供体之MACS系统分离的人CD34+干细胞或1.5x105来自脐带血的CD34+细胞经尾静脉移植到经辐照的4周龄NRG小鼠中。在移植后的第6/7和10/11周，通过皮下注射在后胁上用5x105自体SmyleDC或SmyleDC/pp65以初免/加强方式疫苗接种小鼠。免疫前，在第10周从每只小鼠收集外周血以进行基线流式细胞术分析。在第20周，将小鼠处死以收集血液、血浆、脾和骨髓。将PBL样品用红细胞裂解缓冲液(0.83％氯化铵/20mMHepes，pH 7.2)处理两次，持续5分钟，用PBS洗涤并用下列人抗体染色：PB缀合的抗-CD45、APC缀合的抗-CD3、Alexa700缀合的抗-CD19、APHCy7缀合的抗-CD4、PCy7缀合的抗-CD8、FITC缀合的抗-CD45RA、PCy5缀合的抗-CD62L。通过对CD45RA+CD62L+呈阳性的细胞来定义T细胞亚群，其是幼稚细胞(N)、T中枢记忆(TCM，CD45RA-CD62L-)和T效应记忆(TEM，CD45RA-CD62L+)。在FACSLSRII流式细胞仪(Becton Dickinson)中使用Flowjo软件来进行分析。对于T细胞效应功能测定，用Moflo仪器(Becton Dickinson)从脾细胞分选人CD4+和CD8+T细胞；将从小鼠(n＝3)获得的分选CD4+或CD8+脾细胞合并，并在进行7天的体外SmyleDC/pp65刺激之前用CD2/CD3/CD28珠(T细胞活化试剂盒，Miltenyi Biotec)刺激48小时。收获50,000个T细胞，每孔接种在IFN-γ抗体包被的ELISPOT板上并用pp65肽库过夜脉冲。将板按照生产商(Mabtech，Germany)所述显影。使用未经肽脉冲的细胞作为对照。用珠阵列根据生产商的方案(MilliplexMilipore，Billerica，USA)来量化小鼠血浆中细胞因子和免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG1、IG2、IgG3和IgG4)的水平。对于Treg频率的分析，根据表面标志物将单核细胞用PB缀合的抗-CD45、FITC缀合的抗-CD3、Alexa700缀合的抗-CD4、APC缀合的抗-CD127、PCy7缀合的抗-CD25初始染色。在用Foxp3fix/perm缓冲液(ebioscience)于4℃下固定/透化30分钟并随后洗涤后，使用PE缀合的抗-Foxp3进行30分钟染色，随后洗涤并进一步进行细胞获取。
胸腺分析
收获胸腺并将单细胞混悬液随后用PB缀合的抗-CD45、FITC缀合的抗-CD3、A700缀合的抗-CD4、APC缀合的抗-CD3、FITC缀合的抗-TCRαβ和FITC缀合的抗-TCRγδ染色，随后洗涤并通过LSRII流式细胞计量术分析。对胸腺中不同发育阶段的T细胞的分析。使用FloJo(TreeStar Inc.，Ashland，OR)软件来进行DP：CD45+/CD4+/CD8+、CD4SP：CD45+/CD4+/CD8-、CD8SP：CD45+/CD4-/CD8+、CD3 lo ：CD45+/TCRαβ-/TCRγδ-、CD3αβ hi ：CD45+/TCRαβ+、CD3γδ hi ：CD45+/TCRγδ+分析。
统计学分析
使用非参数Man Whitney T检验统计学分析来确定统计学显著性。所有的测试都是一侧的并且认为P＜0.05是显著的。使用Graphpad prism5软件(San Diego，CA，USA)来分析数据。
参考文献
Aiuti，A.，Biasco，L.，Scaramuzza，S.，Ferrua，F.，Cicalese，M.P.，Baricordi，C.，Dionisio，F.，Calabria，A.，Giannelli，S.，Castiello，M.C.，et al.(2013).Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patientswith Wiskott-Aldrich syndrome.Science 341，1233151.
Boeckh，M.，and Geballe，A.P.(2011).Cytomegalovirus：pathogen，paradigm，and puzzle.The Journal ofclinical investigation 121，1673-1680.
Boeckh，M.，and Nichols，W.G.(2004).The impact of cytomegalovirus serostatus of donor and recipientbefore hematopoietic stem cell transplantation in the era of antiviral prophylaxis and preemptive therapy.Blood 103，2003-2008.
Browne，E.P.，and Shenk，T.(2003).Human cytomegalovirus UL 83-coded pp65 virion protein inhibitsantiviral gene expression in infected cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 100，11439-11444.
Chen，Q.，He，F.，Kwang，J.，Chan，J.K.，and Chen，J.(2012).GM-CSF and IL-4 stimulate antibodyresponses in humanized mice by promoting T，B，and dendritic cell maturation.J Immunol 189，5223-5229.
Cuiffo，B.，and Ren，R.(2010).Palmitoylation of oncogenic NRAS is essential for leukemogenesis.Blood 115，3598-3605.
Daenthanasanmak，A.，Salguero，G.，Borchers，S.，Figueiredo，C.，Jacobs，R.，Sundarasetty，B.S.，Schneider，A.，Schambach，A.，Eiz-Vesper，B.，Blasczyk，R.，et al.(2012).Integrase-defective lentiviralvectors encoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells and stimulate multivalentimmune responses in vitro and in vivo.Vaccine 30，5118-5131.
Einsele，H.，Roosnek E.，Rufer，N.，Sinzger，C.，Riegler，S.，Loffler，J.，Grigoleit，U.，Moris，A.，Rammensee，H.G.，Kanz，L.，et al.(2002).Infusion of cytomegalovirus(CMV)-specific T cells for thetreatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.Blood 99，3916-3922.
Elmaagacli，A.H.(2013).CMV and relapse-What has conditioning to do with it？Biology of blood andmarrow transplantation：journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation.
Feuchtinger，T.，Opherk，K.，Bicanic，O.，Schumm，M.，Grigoleit，G.U.，Hamprecht，K.，Jahn，G.，Handgretinger，R.，and Lang，P.(2010).Dendritic cell vaccination in an allogeneic stem cell recipientreceiving a transplant from a human cytomegalovirus(HCMV)-seronegative donor：induction of aHCMV-specific T(helper)cell response.Cytotherapy 12，945-950.
Gamadia，L.E.，Remmerswaal，E.B.，Weel，J.F.，Bemelman，F.，van Lier，R.A.，and Ten Berge，I.J.(2003).Primary immune responses to human CMV：a critical role for IFN-gamma-producing CD4+Tcells in protection against CMV disease.Blood 101，2686-2692.
Gluckman，E.，Broxmeyer，H.A.，Auerbach，A.D.，Friedman，H.S.，Douglas G.W.，Devergie，A.，Esperou，H.，Thierry，D.，Socie，G.，Lehn，P.，et al.(1989).Hematopoietic reconstitution in a patient withFanconi′s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.The New Englandjournal of medicine 321，1174-1178.
Green，M.L.，Leisenring，W.M.，Xie，H.，Walter R.B.，Mielcarek，M.，Sandmaier，B.M.，Riddell，S.R.，and Boeckh，M.(2013).CMV reactivation after allogeneic HCT and relapse risk：evidence for earlyprotection in acute myeloid leukemia.Blood 122，1316-1324.
Griffiths，P.D.，Stanton，A.，McCarrell，E.，Smith，C.，Osman，M.，Harber，M.，Davenport，A.，Jones，G.，Wheeler，D.C.，O′Beirne，J..et al.(2011).Cytomegalovirus glycoprotein-B vaccine with MF59 adjuvantin transplant recipients：a phase 2 randomised placebo-controlled trial. Lancet 377，1256-1263.
Grigoleit，G.U.，Kapp，M.，Hebart，H.，Fick，K.，Beck，R.，Jahn，G.，and Einsele，H.(2007).Dendritic cellvaccination in allogeneic stem cell recipients：induction of human cytomegalovirus(HCMV)-specificcytotoxic T lymphocyte responses even in patients receiving a transplant from an HCMV-seronegativedonor.The Journal of infectious diseases 196，699-704.
Hertel，L.，Lacaille，V.G.，Strobl，H.，Mellins，E.D.，and Mocarski，E.S.(2003).Susceptibility ofimmature and mature Langerhans cell-type dendritic cells to infection and immunomodulation by humancytomegalovirus，Journal of virology 77，7563-7574.
Hervas-Stubbs，S.，Perez-Gracia，J.L.，Rouzaut，A.，Sanmamed，M.F.，Le Bon，A.，and Melero，I.(2011).Direct effects of type I interferons on cells of the immune system.Clinical cancer research：an officialjournal of the American Association for Cancer Research 17，2619-2627.
Jaiswal，S.，Pazoles，P.，Woda，M.，Shultz，L.D.，Greiner，D.L.，Brehm，M.A.，and Mathew，A.(2012).Enhanced humoral and HLA-A2-restricted dengue virus-specific T-cell responses in humanized BLTNSG mice.Immunology 136，334-343.
Kharfan-Dabaja，M.A.，Boeckh，M.，Wilck，M.B.，Langston，A.A.，Chu，A.H.，Wloch，M.K.，Guterwill，D.F.，Smith，L.R.，Rolland，A.P.，and Kenney R.T.(2012).A novel therapeutic cytomegalovirus DNAvaccine in allogeneic haemopoietic stem-cell transplantation：a randomised，double-blind，placebo-controlled，phase 2 trial.The Lancet infectious diseases 12，290-299.
Lang，J.，Kelly，M.，Freed，B.M.，McCarter，M.D.，Kedl，R.M.，Torres，R.M.，and Pelanda，R.(2013).Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells forhuman B cell maturation.J Immunol 190，2090-2101.
Li，N.，Huang，X.，Zhao，Z.，Chen，G.，Zhang，W.，and Cao，X.(2000).Identification and characterizationof a novel gene KE04 differentially expressed by activated human dendritic cells.Biochemical andbiophysical research communications 279，487-493.
Lilja，A.E.，and Mason，P.W.(2012).The next generation recombinant human cytomegalovirus vaccinecandidates-beyond gB.Vaccine 30，6980-6990.
Matrai，J.，Cantore，A.，Bartholomae C.C.，Annoni，A.，Wang，W.，Acosta-Sanchez，A.，Samara-Kuko，E.，De Waele，L.，Ma，L.，Genovese，P.，et al.(2011).Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.Hepatology 53，1696-1707.
McGoldrick，S.M.，Bleakley，M.E.，Guerrero，A.，Turtle，C.J.，Yamamoto，T.N.，Pereira，S.E.，Delaney，C.S.，and Riddell，S.R.(2013).Cytomegalovirus-specific T cells are primed early after cord bloodtransplant but fail to control virus in vivo.Blood 121，2796-2803.
Milano，F.，Pergam，S.A.，Xie，H.，Leisenring，W.M.，Gutman，J.A.，Riffkin，I.，Chow，V.，Boeckh，M.J.，and Delaney，C.(2011).Intensive strategy to prevent CMV disease in seropositive umbilical cord bloodtransplant recipients.Blood 118，5689-5696.
Moutaftsi，M.，Mehl，A.M.，Borysiewicz，L.K.，and Tabi，Z.(2002).Huaan cytomegalovirus inhibitsmaturation and impairs function of monocyte-derived dendritic cells.Blood 99，2913-2921.
Negri，D.R.，Rossi，A.，Blasi，M.，Michelini，Z.，Leone，P.，Chiantore M.V.，Baroncelli，S.，Perretta，G.，Cimarelli，A.，Klotman，M.E.，et al.(2012).Simian immunodeficiency virus-Vpx for improvingintegrase defective lentiviral vector-based vaccines.Retrovirology 9，69.
Ohta，E.，Misumi，Y.，Sohda，M.，Fujiwara，T.，Yano，A.，and Ikehara，Y.(2003).Identification andcharacterization of GCP16，a novel acylated Golgi protein that interacts with GCP170.The Journal ofbiological chemistry 278，51957-51967.
Riegler，S.，Hebart，H.，Einsele，H.，Brossart，P.，Jahn，G.，and Sinzger，C.(2000).Monocyte-deriveddendritic cells are permissive to the complete replicative cycle of human cytomegalovirus.The Journalof general virology 81，393-399.
Ripperger，T.，Tauscher，M.，Praulich，I.，Pabst，B.，Teigler-Schlegel，A.，Yeoh，A.，Gohring，G.，Schlegelberger，B.，Flotho，C.，Niemeyer，C.M.，et al.(2011).Constitutional trisomy 8p11.21-q11.21mosaicism：a germline altcration predisposing to myeloid leukaemia.British journal of haematology 155，209-217.
Salguero，G.，Sundarasetty，B.S.，Borchers，S.，Wedekind，D.，Eiz-Vesper，B.，Velaga，S.，Jirmo，A.C.，Behrens，G.，Warnecke，G.，Knofel A.K.，et al.(2011).Preconditioning therapy with lentiviral vector-programmed dendritic cells accelerates the homeostatic expansion of antigen-reactive human T cells inNOD.Rag1-/-.IL-2rgammac-/-mice.Human gene therapy 22，1209-1224.
Sanchez，V.，Greis，K.D.，Sztul，E.，and Britt，W.J.(2000).Accumulation of virion tegument andenvelope proteins in a stable cytoplasmic compartment during human cytomegalovirus replication：characterization of a potential site of virus assembly.Journal of virology 74，975-986.
Schmidt-Hieber，M.，Labopin，M.，Beelen，D.，Volin，L.，Ehninger，G.，Finke，J.，Socie，G.，Schwerdtfeger，R.，Kroger，N.，Ganser，A.，et al.(2013a).CMV serostatus has still an importantprognostic impact in de novo acute leukemia patients after allogeneic stem cell transplantation：a reportfrom the acute leukemia working party of EBMT.Blood.
Schmidt-Hieber.M.，Labopin，M.，Beelen，D.，Volin，L.，Ehninger，G.，Finke，J.，Socie，G.，Schwerdtfeger，R.，Kroger，N.，Ganser，A.，et al.(2013b).CMV serostatus still has an importantprognostic impact in de novo acute leukemia patients after allogeneic stem cell transplantation：a reportfrom the Acute Leukemia Working Party of EBMT.Blood 122，3359-3364.
Schmidt，M.，Schwarzwaelder，K.，Bartholomae，C.，Zaoui，.K.，Ball，C.，Pilz，I.，Braun，S.，Glimm，H.，and von Kalle，C.(2007).High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR(LAM-PCR).Nature methods 4，1051-1057.
Sinzger，C.，Hahn，G.，Digel，M.，Katona，R.，Sampaio，K.L.，Messerle，M.，Hengel，H.，Koszinowski，U.，Brune，W.，and Adler，B.(2008).Cloning and sequencing of a highly productive，endotheliotropic virusstrain derived from human cytomegalovirus TB40/E.The Journal of general virology 89，359-368.
Soderberg-Naucler，C.，Rahbar，A.，and Stragliotto，G.(2013).Survival in patients with glioblastomareceiving valganciclovir.The New England journal of medicine 369，985-986.
Steinman，R.M.(2012).Decisions about dendritic cells：past，present，and future.Annual review ofimmunology 30，1-22.
Stripecke，R.(2009).Lentiviral vector-mediated genetic programming of mouse and human dendriticcells.Methods Mol Biol 506，139-158.
Sung，H.，and Schleiss，M.R.(2010).Update on the current status of cytomegalovirus vaccines.Expertreview of vaccines 9，1303-1314.
Suzuki，M.，Takahashi，T.，Katano，I.，Ito，R.，lto，M.，Harigae，H.，Ishii，N.，and Sugamura，K.(2012).Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/gammacnull mouse.International immunology 24，243-252.
Szymczak，A.L.，and Vignali，D.A.(2005).Development of 2A peptide-based strategies in the design ofmulticistronic vectors.Expert opinion on biological therapy 5，627-638.
Taher，C.，de Boniface，J.，Mohammad，A.A.，Religa，P.，Hartman，J.，Yaiw，K.C.，Frisell，J.，Rahbar，A.，and Soderberg-Naucler，C.(2013).High prevalence of human cytomegalovirus proteins and nucleicacids in primary breast cancer and metastatic sentinel lymph nodes.PloS one 8.e56795.
Verdijk，P.，Aarntzen，E.H.，Lesterhuis，W.J.，Boullart，A.C.，Kok，E.，van Rossum，M.M.，Strijk，S.，Eijckeler，F.，Bonenkamp，J.J.，Jacobs，J.F.，et al.(2009).Limited amounts of dendritic cells migrate intothe T-cell area of lymph nodes but have high immune activating potential in melanoma patients.Clinicalcancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research 15，2531-2540.
Wendland，M.，Willenzon，S.，Kocks，J.，Davalos-Misslitz，A.C.，Hammerschmidt，S.L，Schumann，K.，Kremmer，E.，Sixt，M.，Hoffmeyer，A.，Pabst，O.，et al.(2011).Lymph node T cell homeostasis relies onsteady state homing of dendritic cells.Immunity 35，945-957.
Williams，K.M.，Hakim，F.T.，and Gress，R.E.(2007).T cell immume reconstitution followinglymphodepletion.Seminars in immunology 19，318-330.
表1：与经ConvDC免疫或未免疫的对照相比，经SmyleDC免疫之小鼠的血液和脾中的人T细胞频率显著增加
i.外周血
表3：对实施例2和3的GVHD分析的总结
总之，上述数据证明了：
1.常规人DC疫苗(其在体外或体内不具有高活力或免疫稳定性)与我们iDC(在数周内可在体外和体内存活并有效)之间的基本差异。
2.iDC一经皮下注射就具有向LN-“原基”运输的能力，从而导致募集CD4+和CD8+细胞(特别是由效应记忆和中枢记忆细胞所代表的)、滤泡T辅助细胞和成熟B细胞。
3.iDC施用产生作为针对CMV中所表达之蛋白质(pp65)的抗原特异性应答可测量的适应性CTL应答。
4.iDC免疫刺激小鼠中高水平IgG产生的作用和对pp65的反应性，证明在NRG中的人B细胞发育期间，发生免疫球蛋白类型转换。
5.安全性增强的整合酶缺陷型慢病毒在iDC重编程中的适用性，其通过降低插入诱变的风险来增强遗传编程的安全性。
6.对临床发展和iDC使用的实际看法，因为：1.慢病毒载体已被用于在临床基因治疗方案中进行离体基因转移，2.我们所采用的HSC源常规用于临床HSCT，3.所采用的pp65CMV抗原在于HSCT后刺激淋巴细胞减少宿主中的有效抗-CMV应答方面具有临床相关性。
7.只表达GM-CSF和IFN-α之SmyleDC与另外表达HCMV的pp65抗原之SmyleDC/pp65iDC之间的比较表明后一类型的iDC与接受者中较高人细胞因子水平和不同人免疫球蛋白类型显著相关并且引起B细胞和T细胞更快速扩增。
8.除血液和脾中观察到的成熟T细胞扩增之外，UCBT后的SmyleDC/pp65免疫证明胸腺中具有更高频率的T细胞前体。这反映出SmyleDC/pp65提供体内稳态和/抗原信号以增强胸腺生成的能力。还可能的是，SmyleDC/pp65免疫增强幼稚T细胞被动员至外周，从而允许胸腺中更加持久地产生T细胞前体。
9.不管小鼠中功能性适应性人免疫系统的有效重建，仅在58只小鼠中的一只小鼠中观察到重度移植物抗宿主病，这58只小鼠类似地移植有异种人干细胞并且被负载pp65免疫原的供体衍生SmyleDC免疫。在剩余的小鼠中未观察到临床GVHD体征。经验丰富的病理学家对4只小鼠的群进行组织病理学分析，显示小鼠亚群中发生仅轻微的1级GVHD。施用SmyleDC/pp65 4次的免疫适度地增加Treg的频率。因此，使用iDC可潜在地改善使用与目前临床方案所要求的接受者不完全匹配之供体的造血干细胞移植的结果。

Claims (24)

1.被改造为表达以下的经诱导树突细胞(iDC)：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述经诱导树突细胞用作药物。
2.被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述iDC用于在造血干细胞(HSC)移植之后使免疫缺陷对象的免疫系统再生。
3.根据权利要求2所述的iDC，其中载体是慢病毒载体。
4.根据权利要求3所述的iDC，其中所述慢病毒载体为整合酶缺陷型。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的iDC，其中表达至少一种抗原的所述iDC表达至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、IL-4、IFN-α、IL-15、TGF-B、TNF-α、FLT3L、IL-3和CD40L。
7.根据权利要求6所述的iDC，其中所述iDC表达选自以下的细胞因子的组合：(i)FLT3L和IL-3；(ii)FLT3L和CD40L；(iii)FLT3L和IFNα；(iv)GM-CSF和IFN-α和IL-15；(v)GM-CSF和IFN-α和TNF-α；以及(vi)GM-CSF和IFN-α和TGF-B。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的iDC，其中由所述iDC表达的一种抗原是可以诱导细胞毒性免疫应答或体液免疫应答的抗原，所述细胞毒性免疫应答或体液免疫应答选自异种反应性、同种异体反应性、新反应性或自身免疫。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的iDC，其中所述对象的免疫缺陷是选自以下的免疫缺陷：由电离辐射引起的免疫缺陷、由施用至少一种细胞毒性药物引起的免疫缺陷、原发性免疫缺陷和由病原体引起的免疫缺陷。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的iDC，其中所述造血干细胞移植物是自体的。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的iDC，其中所述对象是人。
12.根据权利要求2至9中任一项所述的iDC，其中所述干细胞移植物是异源的。
13.根据权利要求12所述的iDC，其中所述对象是人。
14.根据权利要求13所述的iDC，其中供体和接受者的不同之处在于至少两个初级HLA基因座和/或至少两个次级HLA基因座。
15.被改造为表达以下的iDC：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原；
所述iDC用作用于治疗淋巴性扩散的癌症或由嗜淋巴细胞病原体引起的疾病的药物。
16.包含至少一种整合酶缺陷型慢病毒载体的iDC，其中所述载体介导以下的表达：
a)至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子；和
b)至少一种抗原。
17.用于使免疫缺陷对象中的免疫系统再生的方法，其包括以下步骤：
a)将造血干细胞移植到所述对象中；以及
b)向所述对象施用经诱导树突细胞(iDC)，所述经诱导树突细胞被改造为表达至少一种抗原和至少一种诱导人树突细胞(DC)祖细胞自主分化为DC的细胞因子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述对象是小鼠并且HSC来源于人。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述小鼠的特征在于存在内源T细胞和树突细胞的内源祖细胞。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述小鼠品系具有导致适应性免疫系统(包括T细胞和B细胞)功能障碍或不存在的原发性免疫缺陷。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述小鼠选自以下品系：NOD-Rag1nullIL2Rynull-NRG、NOD/LtSz-SCID/IL2Rynull-NSG和NOD/SCID/IL2Rynull-NOG。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述载体介导抗原pp65以及细胞因子(i)GM-CSF和(ii)干扰素-α和/或白介素-4的表达。
23.小鼠，其具有通过根据权利要求18至22中任一项所述的方法产生的再生免疫系统。
24.根据权利要求23所述的小鼠用于研究人免疫系统或者用于测试药物、植入物或装置在人中之使用的用途。
CN201480008074.8A 2013-02-07 2014-01-24 经诱导树突细胞及其用途 Pending CN105025924A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP2013/052485 2013-02-07
PCT/EP2013/052485 WO2014121840A1 (en) 2013-02-07 2013-02-07 Induced dendritic cells and uses thereof
PCT/EP2014/051422 WO2014122035A2 (en) 2013-02-07 2014-01-24 Induced dendritic cells and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105025924A true CN105025924A (zh) 2015-11-04

Family

ID=47664310

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480008074.8A Pending CN105025924A (zh) 2013-02-07 2014-01-24 经诱导树突细胞及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10272111B2 (zh)
JP (1) JP6866988B2 (zh)
CN (1) CN105025924A (zh)
CA (1) CA2899786C (zh)
WO (2) WO2014121840A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039256A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 中政道和（北京）生物科技有限公司 一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法
CN109310709A (zh) * 2015-12-30 2019-02-05 细胞基因公司 T淋巴细胞生产方法和由此产生的t淋巴细胞
CN110337446A (zh) * 2016-12-21 2019-10-15 佛罗里达大学研究基金会 过继细胞疗法中ccr2+造血干细胞介导的t细胞激活
CN110914411A (zh) * 2017-05-10 2020-03-24 奥胡斯大学 干扰素引发的浆细胞样树突细胞
CN111647563A (zh) * 2020-08-06 2020-09-11 北京翊博普惠生物科技发展有限公司 靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
WO2024045890A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 浙江吉量科技有限公司 树突细胞祖细胞的制备方法及其培养基

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7290288B2 (ja) * 2017-08-22 2023-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 免疫不全及び自己免疫疾患を治療するための、造血幹細胞でｆｏｘｐ３を発現するレンチウイルスベクター
WO2020018413A1 (en) 2018-07-15 2020-01-23 Enochian BioPharma, Inc. Methods and compositions using recombinant dendritic cells for cancer therapy
US10980836B1 (en) * 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
WO2022108306A1 (ko) * 2020-11-17 2022-05-27 성균관대학교산학협력단 인터류킨-33을 처리하여 면역원성이 향상된 cd103+ fcgr3+ 수지상세포의 제조방법 및 상기 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물
CA3212398A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Daniel Getts Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
CN113881631B (zh) * 2021-10-11 2022-08-02 北京翊博普惠生物科技发展有限公司 一种扁桃体来源的Tγδ细胞及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012531896A (ja) * 2009-06-29 2012-12-13 チェン，チンフェン ヒト化非ヒト哺乳動物を製造する方法
DE102012207453B4 (de) 2012-05-04 2017-10-19 Technische Universität Dresden Humanisierte Mäuse ohne Konditionierung

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANUSARA DAENTHANASANMAK ET AL.: "Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo", 《VACCINE》 *
刘宁飞等: "大白鼠淋巴结移植—功能结构和细胞学的变化以及影响其再生的因素", 《中国修复重建外科杂志》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039256A (zh) * 2015-07-13 2015-11-11 中政道和（北京）生物科技有限公司 一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法
CN109310709A (zh) * 2015-12-30 2019-02-05 细胞基因公司 T淋巴细胞生产方法和由此产生的t淋巴细胞
US11834675B2 (en) 2015-12-30 2023-12-05 Celgene Corporation T lymphocyte production methods and t lymphocytes produced thereby
CN110337446A (zh) * 2016-12-21 2019-10-15 佛罗里达大学研究基金会 过继细胞疗法中ccr2+造血干细胞介导的t细胞激活
CN110337446B (zh) * 2016-12-21 2024-06-18 佛罗里达大学研究基金会 过继细胞疗法中ccr2+造血干细胞介导的t细胞激活
CN110914411A (zh) * 2017-05-10 2020-03-24 奥胡斯大学 干扰素引发的浆细胞样树突细胞
CN111647563A (zh) * 2020-08-06 2020-09-11 北京翊博普惠生物科技发展有限公司 靶向Survivin全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
WO2024045890A1 (zh) * 2022-08-30 2024-03-07 浙江吉量科技有限公司 树突细胞祖细胞的制备方法及其培养基

Also Published As

Publication number Publication date
US20160038541A1 (en) 2016-02-11
CA2899786A1 (en) 2014-08-14
WO2014121840A1 (en) 2014-08-14
US11413307B2 (en) 2022-08-16
JP6866988B2 (ja) 2021-04-28
WO2014122035A3 (en) 2014-10-23
WO2014122035A2 (en) 2014-08-14
CA2899786C (en) 2023-03-07
JP2016513953A (ja) 2016-05-19
US10272111B2 (en) 2019-04-30
US20190247430A1 (en) 2019-08-15
WO2014122035A9 (en) 2014-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11413307B2 (en) Induced dendritic cells and uses thereof
JP7351533B2 (ja) 改変キメラ抗原受容体（ｃａｒ）ｔ細胞のヒト応用
Yong et al. Humanized mice as unique tools for human-specific studies
Shultz et al. Humanized mice in translational biomedical research
Salguero et al. Dendritic cell–mediated immune humanization of mice: implications for allogeneic and xenogeneic stem cell transplantation
AU2022287548A1 (en) T Cells For Expression Of Chimeric Antigen Receptors And Other Receptors
Sun et al. Is there natural killer cell memory and can it be harnessed by vaccination? NK cell memory and immunization strategies against infectious diseases and cancer
ES2931530T3 (es) Método para generar progenitores de células T
Masiuk et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells
CN102725400A (zh) 制造人源化的非人类哺乳动物的方法
Kitchen et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice
Daenthanasanmak et al. Engineered dendritic cells from cord blood and adult blood accelerate effector T cell immune reconstitution against HCMV
Bonde et al. ES-cell derived hematopoietic cells induce transplantation tolerance
JP2019170176A (ja) ケモカインレセプターと細胞接着分子を発現するｃｄ３陰性細胞の集団、およびその利用
Salguero et al. Preconditioning therapy with lentiviral vector-programmed dendritic cells accelerates the homeostatic expansion of antigen-reactive human T cells in NOD. Rag1−/−. IL-2rγc−/− mice
Frecha et al. In vivo gene delivery into hCD34+ cells in a humanized mouse model
Kath et al. CAR NK-92 cell–mediated depletion of residual TCR+ cells for ultrapure allogeneic TCR-deleted CAR T-cell products
EP2953644B1 (en) Induced dendritic cells and uses thereof
Hoseini et al. Inducible T-cell receptor expression in precursor T cells for leukemia control
Berger et al. Feasibility of cord blood stem cell manipulation with high-energy shock waves: an in vitro and in vivo study
Macke et al. Dendritic Cell
Jackson et al. Induction of chimerism in mice using human MHC class I-mismatched Hoechst 33342 side population donor stem cells
RU2779844C2 (ru) Вето-клетки, полученные из т-клеток памяти
DUNCAN et al. INDUCTION OF TRANSPLANTATION TOLERANCE IN RATS BY SPLEEN ALLOGRAFTS III. THE ROLE OF T SUPPRESSOR CELLS IN THE INDUCTION OF SPECIFIC UNRESPONSIVENESS
Reddy Synthetic Biology Approaches to Understand and Engineer Immune Cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151104

RJ01 Rejection of invention patent application after publication