JP7290288B2 - 免疫不全及び自己免疫疾患を治療するための、造血幹細胞でfoxp3を発現するレンチウイルスベクター - Google Patents
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Description
本出願は、2017年8月22日に出願された米国特許出願第62/548,891号の利益及びその優先権を主張し、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される。
政府支援の声明
[該当なし]
実施形態1:組換えレンチウイルスベクター(LV)であって、
安全性を更に向上するために、各種実施形態では、本明細書に記載される、内因性プロモーターの制御下でヒトFoxP3タンパク質をコードする核酸を含むLVがTAT依存性自己不活性化(SIN)配位を含む。したがって、各種実施形態では、本明細書に記載されるLVにおいて、野生型LTRに対してプロモーター活性を低減したLTR領域を使用することが望ましい。バイオセイフティーの特徴を提供する効果的に「自己不活性化(SIN)」するコンストラクトを提供することができる。SINベクターは、形質導入された細胞における全長ベクターRNAの産生がかなり低減するか、または一斉に無効にするものである。この特徴により複製可能なリコンビナント(RCR)が吐き出されるリスクを最小化する。さらに、ベクター組込み部位に隣接する細胞のコード配列が異常に発現するリスクを減らす。
各種実施形態では、本明細書に記載されるベクターはパッケージングシグナルを含む。「パッケージングシグナル」、「パッケージング配列」または「プサイ配列」は、配列がパッケージングシグナルをレトロウイルス粒子に含む核酸のパッケージングに向けるのに十分な任意の核酸配列である。この用語は天然に存在するパッケージング配列、更にはその設計された変異体を含む。レンチウイルスを含む多くの異なるレトロウイルスのパッケージングシグナルは、当該技術分野において既知である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるLVはRev応答エレメント(RRE)を含み、スプライシングされていないRNAの核外移行を強化する。RREは当業者に周知である。例示的なRREはHIV NL4-3ゲノム(Genbankアクセッション番号AF003887)における位置7622~8459に存在するRRE、ならびにHIVまたは他のレトロウイルスの他の株からのRREを含むが、これらに限定されない。このような配列は、GenbankからまたはURL hiv-web.lanl.gov/content/indexのデータベースからすぐに利用できる。
各種実施形態では、本明細書に記載されるベクターはセントラルポリプリン配列を含む。レンチウイルス(例えば、HIV-1)ベクターコンストラクトにおけるセントラルポリプリン配列(cPPT)を含む断片の挿入は、報告によれば、セントラルDNAフラップを介してウイルスcDNAの核内移行を容易にすることにより、大幅に形質導入効率を向上することが知られている。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるLVは、転写物内の転写後調節エレメントの存在によりタンパク質量で異種核酸(例えば、ヒトFoxP3 cDNA)の発現を増加させる、様々な転写後調節エレメント(PRE)のいずれかを含み得る。特定の実施形態では、特にレンチウイルスコンストラクトが中程度のプロモーターに関連する実施形態では、PREが特に有用となり得る。
特定の実施形態では、バイオセイフティーを更に高めるために、インスレーターが本明細書に記載されるLVに挿入される。インスレーターは、ゲノムの全体にわたって存在するDNA配列エレメントである。インスレーターはクロマチンを修正し、局所の遺伝子発現を変更するタンパク質を結合する。本明細書に記載されベクターにおけるインスレーターの配置により、1)隣接の染色体による発現の位置効果の斑入りからのベクターの遮蔽(すなわち、バリア活性)及び2)ベクターによる遺伝子発現の挿入性トランス活性化からの隣接の染色体の遮蔽(エンハンサーブロッキング)を含む種々の可能な利点が得られる。したがって、インスレーターはゲノムまたは遺伝子コンテクストに埋め込まれた遺伝子または転写単位の発現が当該ゲノムまたは遺伝子コンテクスト内の調節シグナルに影響され得る、遺伝子または転写単位の独立機能を保存するのに役立てることができる(例えば、Burgess-Beusse et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:16433;and Zhan et al.(2001)Hum.Genet.,109:471を参照)。本コンテクストにおいて、インスレーターは組込み部位の効果からレンチウイルスを発現した配列の保護に寄与し得、これはゲノムDNAに存在するシス作用性エレメントによって媒介され、導入された配列のデレギュレーションした発現を導き得る。各種実施形態では、一方または両方のLTRあるいはインスレーター配列が細胞ゲノムに組み込まれるベクターの領域におけるそのほかの場所に挿入されるLVが提供される。
本明細書に記載される組換えLV及び得られるウイルスは、核酸(例えば、ヒトFoxP3タンパク質をコードする核酸)配列を哺乳類の細胞に導入することができる。細胞への送達のために、本発明のベクターは好適なパッケージング細胞株とともに使用されるか、または必要なレトロウイルス遺伝子(例えば、gag及びpol)を含む他のベクタープラスミドとともにin vitroで細胞に同時トランスフェクトし、本発明のベクターをパッケージして、細胞を感染することができる複製不全ウイルス粒子形成することが好ましい。
さらに他の実施形態では、本発明は造血幹細胞を含むヒト細胞の集団を前記レンチウイルスベクターの1つと、前記集団におけるヒト造血前駆細胞の形質導入をベクターにより引き起こす条件下で接触させることを含む、ヒト造血幹細胞に形質導入する方法に関する。幹細胞は最終的な用途に応じて、in vivoまたはin vitroで形質導入されてもよい。ヒト幹細胞の遺伝子治療などのヒト遺伝子治療との関係においても、幹細胞にin vivoで形質導入し、あるいはin vitroで形質導入し、その後、ヒトコントロールに形質導入された幹細胞を注入してもよい。この実施形態の一態様では、ヒト幹細胞は当業者に周知の方法を用いて、ヒト、例えば、ヒト患者から除去され、上記のように形質導入され得る。次に、形質導入された幹細胞を同一または異なるヒトに再導入する。
各種実施形態では、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞(HSC)の形質導入、骨髄、末梢血または臍帯血液から得られたいずれか、ならびにCD4+T細胞、末梢血BまたはTリンパ球細胞などの形質導入において特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的はCD34+細胞である。特定の実施形態では、好ましい標的はCD34+/CD38-細胞である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターの直接導入による対象の直接治療が検討される。レンチウイルス組成物は非経口で(例えば、静脈内)、皮内で、皮下で、経口で(例えば、吸入)、経皮で(局所的)、経粘膜で、直腸で及び膣を含むが、これらに限定されない任意の使用可能な経路で送達のために調製され得る。送達の一般的に用いられる経路は吸入、非経口及び経粘膜を含む。
pCCL-CNSp-FOXP3-3UTR-A2ベクターの評価
図6及び7は、内因性FoxP3プロモーター及びエンハンサー(CNS1、CNS2及びCNS3)の制御下でFoxP3をコードするレンチウイルスベクターの構造を示す。特に、図6はpCCL-CNSp-FOXP3-3UTR-A2ベクター(下表1にも示される配列番号1(接合マーカー由来の配列))の構造を示す。ヒトゲノム源の配列は、Tone et al.(2008)Nat.Immunol.9:194-202に記載の配列に基づくが、同一ではない最小の配列であるCNS1(237bp)、Kim and Leonard(2007)J.Exp.Med.204:1543-1551に記載されるCNS2(359bp)、Zheng et al.(2010)Nature,473:808-813に記載されるCNS3(217bp)、Kim and Leonard(2007)、上記に記載される配列から修飾されるFoxP3プロモーター(382bp)、ヒトゲノムNCBI参照配列ファイルNM_014009に基づく5’UTR(187bp)、ヒトゲノムNCBI参照配列ファイルNM_014009に基づくFoxP3 cDNA(1292bp)ヒトゲノムNCBI参照配列ファイルNM_014009に基づく3’UTR(875bp)を含む。
IPEX症候群のための造血幹細胞遺伝子治療
IPEX(免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、X連鎖性)症候群は、FOXP3、すなわち制御性T細胞(Treg)の発生及び機能に必要な系統決定転写因子における突然変異により生じる荒廃的な自己免疫疾患である。Tregは自己反応性T細胞応答の抑制に重要であるため、IPEX患者におけるその機能不全が重度の自己免疫に繋がる。同種造血幹細胞(HSC)移植は治効があり得るが、好適なドナーが利用不可能であることが多い。本実施例では、我々は自己由来HSC移植に対する手法及び内因性調節エレメントの制御下で発生的に適切なFoxP3発現を回復するためのレンチウイルスベクター(LV)を用いる遺伝子治療を実証する。マウス類遺伝子性移植モデル及びLV修飾HSCを移植したヒト化マウスは、CD4+CD25+FoxP3+Tregに制限される高レベルのLV発現を示す。scurfy(FoxP3null)HSCのLV形質導入はin vivoでT細胞増殖を抑制し、in vivoでscurfy自己免疫表現型を救済する機能的なFoxP3+Tregの発生を回復する。これらの所見から自己由来HSC移植によってIPEX患者の治療への道を整え、異なる供給源の自己免疫不全の患者の新規な治療に対する有益な洞察を提供することができる。
構成的に活性なプロモーターからの異所性FoxP3発現がHSPC機能を弱める
現在までに成功している多くのLVベースの遺伝子療法では、構成的に活性なプロモーターを利用して治療用タンパク質の高レベルの発現を引き起こす。構成的FoxP3発現がIPEX HSPC遺伝子治療に対する好適な手法であるかを決定するために、我々は最初にHSPC移植及び機能に関する異所性FoxP3発現の効果を判定することを試みた。ここで、我々は高レベルのFoxP3(MNDU3-FoxP3-IRES-GFP)を発現するLVを利用し、その効果を制御ベクター(MNDU3-GFP)と比較した。MNDU3-FoxP3-IRES-GFPが形質導入されたマウスLin細胞は、生存率への識別可能な効果が無しで成功しているLV形質導入及び発現(約30%GFP+細胞)を示した(図8、パネルA)。LV修飾細胞がマウスに移植された場合、循環CD45.1+(ドナー)GFP+細胞は移植後7日目に末梢血で容易に検出され(図8、パネルB)、細胞が初期移植が可能であったことを示唆している。しかし、初期の移植後期間(10~21日)は赤血球数の急速な減少、ならびに白血球及び血小板数を再構成しないことを特徴とし(図8、パネルC)、MNDU3-FoxP3-IRES-GFPを用いて修飾されたHSPCを受け取るマウスにおいて死亡率60%を得た(図8、パネルD)。ヒトHSPCへの構成的FoxP3発現の効果を決定するために、NSG新生児はMNDU3-GFPまたはMNDU3-FoxP3-IRES-GFPが形質導入された臍帯血CD34+HSPCでヒト化された。形質導入後3日目にGFP+細胞において細胞死が観察されなかった(図8、パネルE)が、MNDU3-FoxP3-IRES-GFPを形質導入されたHSPCを受け取るマウスにおいて、末梢血におけるhCD45+細胞のNSF移植が顕著に損なわれた(図8、パネルF)。まとめると、これらの結果からHSPCにおけるFoxP3の異所性発現が造血にネガティブに影響を及ぼすことが示唆されている。
異所性FoxP3発現を有する障害性造血の観察から、我々は発生的に適切なFoxP3発現を与えるLVを設計することを考えた。このタスクを達成するための主な課題は、LVゲノムサイズ8~10kbを超えない主要なFOXP3調節エレメントを含み、これを超えると、LVが低いタイター及び形質導入効率を呈する。内因性FoxP3発現を繰り返すために、我々はFOXP3遺伝子内に以前に特徴づけられた3つの保存された調節領域、保存された非コード配列(CNS)1、CNS2及びCNS3を利用した(図9A)。3つのCNSエレメントはFOXP3プロモーターから上流に加えられ、FOXP3 3’UTRは発現カセットの後に加えられた(図9B)。場合により、安全性を向上し、発現の位置斑入りを低減するために、ウイルス3’LTR領域に先に記述したエンハンサーブロッキングインスレーターエレメント(「A2」)を加え(Liu et al.2015)、このコンストラクトはVSV-G-偽型第3世代自己不活性化(SIN)LVにクローニングした(Dull et al.1998)。蛍光レポーターmStrawberryのみ(「CNS123p-mStrawberry」と称される)または2Aエレメント結合(「CNS123p-FoxP3-mStrawberry」)によるFOXP3cDNA及びmStrawberryの発現を起こすために、2つのLVはこのコンストラクトを使用して設計された。
我々は最初に異なる造血系統(K562[赤血球系、FoxP3-]、Jurkat[Tconv様、FoxP3-]及びMT-2[Treg様、FoxP3+]、図10、パネルA)由来のヒト細胞株におけるCNS123p-mStrawberryレポーターLVの特異性を評価した。フローサイトメトリーによる形質導入された細胞の分析では、非常に高いベクターコピー数(最大約25コピー/細胞)でさえ、FoxP3-細胞型における発現の低い固有「漏れやすさ」を有するFoxP3+MT-2細胞に制限されるmStrawberry発現が明らかになった(図10、パネルB)。高レベルのFoxP3を正常に発現するMT-2細胞において、mStrawberryの平均蛍光強度(MFI)はコピー数が増加すると比例的に増加した(図10、パネルB)。これらの結果からCNS123pエレメントがFoxP3+細胞の非常に特異的な遺伝子発現を与え、不適当な細胞型において基本の発現を欠いていることが示唆されている。
我々は、CNS123p-FoxP3-mStrawberry LVがscurfy(FoxP3欠損)HSCの生理的FoxP3発現の回復により機能的なTreg発生を可能にすることができるかどうかを判定した。scurfyマウスはFOXP3のフォークヘッド領域にフレームシフト突然変異を有し、自己免疫反応を抑制することができない非機能的(FoxP3-)Tregを産生する。治療がない場合、scurfyマウスは、出生後約21日で胎生期リンパ増殖性疾患に屈する。したがって、十分な数のscurfyHSCを得るために、新生児scurfyマウス(CD45.2)は出生時、WT脾細胞(CD45.1)の注入により救出され、成体期に生き残った。機能的なTreg発生の回復を評価するために、我々はCD45.2 HSPCの3つの異なる供給源である、(1)CNS123p-mStrawberryを形質導入したscurfyLin細胞、(2)CNS123p-FoxP3-mStrawberryを形質導入したscurfyLin細胞及び(3)CNS123p-mStrawberryを形質導入したWT FoxP3-GFPLin細胞のうちの1つを有するWT CD45.1レシピエントを移植した(図11、パネルA)。
Treg機能の最もストリンジェントな検定は、自己免疫のin vivoでの抑制による新生児scurfyマウスにおける臨床疾患サインを元に戻す能力である。このために、我々は最初にLV修正LinHSPCを新生児scurfyマウスに移植することを試みた。新生児scurfyマウスは500Radの全身放射(TBI)で条件づけし、WT HSPC、未修正Sf HSPCまたは修正Sf HSPCのいずれかを腹腔内に注入した。ドナー細胞の検出可能な(低いが)移植にもかかわらず、すべてのアームにおいて長期生存は低く、scurfyモデルの精製HSPC移植の低い有効性を示唆した(図15)。
この治療のIPEX患者への適用性を評価するために、我々はヒト化異種移植片モデルのCNS123p-mStrawberryレポーターLVの発現パターンを次に調査した。臍帯血から単離された健康なヒトCD34+HSPCにはCNS123p-mStrawberryを形質導入し、NSG新生児に移植した(図13、パネルA)。移植後12~16週目に移植されたhCD45+細胞を分析した。NSG BMにおける移植されたヒト細胞1個あたりのベクターコピーの平均±SD数は4.1±2.5であり、LVを用いたLT-HSCの効率的な修飾を示唆した。BMにおける移植されたヒトCD45+細胞はT細胞活性化から無症状移植片対宿主疾患及び潜在的人工産物の欠如を示すこのモデル系(59%のCD19+B細胞、10%のCD33+骨髄性細胞、2.5%のCD34+HSPC、3.3%のCD3+T細胞、図17)を代表する系統分布を呈した。
2001年におけるIPEX及びscurfyのための突然変異を有する原因となる遺伝子としてのFoxP3の遺伝子が特性決定されて(Wildin et al.2001b;Bennett et al.2001)以来、数多くの研究により、免疫寛容を維持する際、FoxP3+Tregにとっての重要な役割が更に明らかにされてきた。Tregが全くないことから生じる重度の自己免疫によりIPEXが非常に有益な疾患になり、ヒトTreg発生及び免疫寛容の機序の我々の理解が深まった。
レンチウイルスベクター
MNDU3-GFP(Logan et al.2004)及びUBC-mCitrine(Baldwin et al.2015)の構築が記載されている。MNDU3-FoxP3-IRES-GFPは、Dr.Gay Crooksからの親切な贈り物であった。CNS123p-mStrawberry及びCNS123p-FoxP3-mStrawberryレンチウイルスベクターは、空のCCL骨格にクローニングされた(Dull et al.1998)。NEBuilder(R)HiFi DNA組み立てキット(New England Biolabs)レンチウイルスベクターを用いてクローニングされる適合性のある端を有するgBlocks(登録商標)(Integrated DNA Technologies)として断片を合成した。VSV-Gシュードタイプを使用して、レンチウイルスベクターをパッケージ化し、濃縮し、記載されるようにタイターを測定した(Cooper et al.2011)。
MT2細胞は、Dr.Douglas RichmanからNIH AIDS Reagent Program,Division of AIDS,NIAID,NIH:MT-2 Cellsより入手した。(Haertle et al.1988;Harada,Koyanagi,and Yamamoto 1985)。Jurkat及びK562細胞はATCCから入手した。細胞は、R10(RPMI[Gibco]/10%のFBS[Gibco]/1xPenicillin/Streptomycin/Glutamine[PSG、Gemini Bio Products])で維持された。細胞を1E6細胞/mLで培養し、濃度(1E5 TU/mL~1E8 TU/mL、MOI 0.1~100)でCNS123p-mStrawberryを形質導入し、翌日、新しいR10に変えた。培養の10日後、細胞をmStrawberry発現についてフローサイトメトリーによって分析し、ゲノムDNAをベクターコピー数解析のために単離した。
実験に関連するすべての動物は、the Division of Laboratory Madicineのthe UCLA Animal Research Committeeにより承認されたプロトコルに従って世話をし、取り扱った。B6(CD45.2)、B6.SJL(CD45.1)、B6-FoxP3GFP(CD45.2)、B6-scurfy、NSG及びNSG-SGM3マウスは、Jackson labs coloniesから購入し、UCLAで維持した。以下の飼育方法はscurfyマウスに使用した。ヘテロ接合型雌のscurfyマウス(CD45.2、X/XSf、表現型が正常)を野生型B6(CD45.2)またはB6.SJL(CD45.1)雄と交配し、サブコロニーのCD45.2、CD45.1及びCD45.1/CD45.2scurfyマウスを産んだ。60×106個のWT脾細胞の腹腔内注入により雄のscurfy新生児(Xsf/Y)を救済し、ヘテロ接合型雌のscurfy(X/XSf)と再交配し、雌のscurfy(Xsf/Xsf)を得た。救出された雄のscurfy(Xsf/Y)及び雌のscurfy(Xsf/Xsf)マウスを交配し、すべての子がFoxP3欠損である同腹仔を得た。雄及び雌のscurfyマウスは識別不能な疾患の進展を示し、同じ意味で使用された。
骨髄細胞は、乳鉢及び乳棒で無菌に単離された大腿骨、脛骨、骨盤、脊椎及び上腕骨を破砕することによって得られた。系統除去キット(Miltenyi Biotec)を用い、製造業者の取扱説明書に従いLin細胞を得た。2×106個のLin細胞/mLでマウス形質導入媒体(Span SFEM[Stem Cell Technologies]、1x PSG[Gemini Bio Products]、100ng/mLのmTPO、10ng/ml mSCF[Peprotech]、5mg/mLのポリブレン[Sigma Aldrich])にLin細胞を再懸濁し、retronectin(Takara)コートウェル(RTで2時間、20ng/mL)で播種し、一晩、LVでインキュベートした。養子移入に修正Tregを生成するために用いられる移植において、1mg/mLのポロキサマーKP338(BASF)を添加し、遺伝子転写効率を向上させた。
PureLinkゲノムDNAキット(Invitroen)を用いて試料からゲノムDNAを抽出した。ddPCRを用いて平均VC/細胞を測定した。1×ddPCR Master Mix(Bio-Rad)、プライマー及びHIV-1Psi範囲に特異的なプローブ(当該プライマー及びプローブに対してそれぞれ400nM及び100nM)を含む容量22μL、DraI(40U;New England Biolabs)、ならびに1.1μLのゲノムDNAサンプルからなる反応混合物を調製した。QX100 Droplet Generator(Bio-Rad)を用いて、液滴を発生させた。熱サイクル条件は、95℃で10分間、94℃で30秒間及び60℃で1分間(55サイクル)、98℃で10分間(1サイクル)及び12℃保持からなる。QX200 Droplet Reader/Quantasoft V1.7(Bio-Rad)を用いて特定の増幅された部分の濃度を定量化し、常染色体ヒト遺伝子SDC4遺伝子に対するプライマーまたはマウス試料にuc378遺伝子を用いて正規化した。プライマー/プローブシーケンスは、表2に示される。
70μMメッシュフィルターによる無菌除去及び脾臓の穏やかな破壊によって、マウス脾細胞を得た。調整前塩化アンモニウム系溶解バッファー(BD Biosciences)を用いてRBC溶解が行われた。CD4単離キット(Miltenyi Biotec)を用いてCD4+細胞に対して脾細胞を濃縮した。簡単に述べると、脾細胞はCD4-細胞を標識しているビオチン化された抗体のカクテルを用いて標識され、抗ビオチン磁気ビーズを用いて標識した。CD4+細胞を貫流内で回収しながら、LSカラム(Miltenyi Biotec)上で分離した。scurfy新生児にCD45.2+CD4+細胞の養子移入を利用する実験において、抗CD45.1ビオチン化された抗体を初期の培養工程で添加し、任意の残存するレシピエントCD45.1細胞を除去した。
FACSソーティングの前に、CD4豊富脾細胞をCD4-APC(Clone RM4-5、BD)及びGhost 780バイアビリティー色素(Tonbo Biosciences)を用いて、標識した。抑制性機能の評価のために、生育可能なCD4+GFP+(WT Treg)またはCD4+mStrawberry+(scurfy Treg)をソートした。5μM Cell Traceバイオレット増殖色素(Thermo Fisher)を用いて、37℃で20分間、Tresp細胞(WT B6 CD4+細胞)を標識し、洗浄し、サイトカインなしでR10において1:1の比でソートされたTregと共培養した。実験は、96ウェルUボトムプレートの2.5E4~5E4個/ウェルのTresp細胞に及ぶ。マウスCD3/CD28 TActivator Dynabeads(ThermoFisher)を培養液にビーズ1個:Tresp細胞1個の比で添加した。細胞は3日間、培養し、増殖色素を希薄するためにFACS分析を行った。FlowJo V7.6.5(TreeStar)を用いて増殖指数を算出した。
scurfy新生児は、29ゲージインスリンシリンジを用いて、50uLのPBS内の精製CD4+細胞を腹膜内に注入された。CD4細胞の絶対数及び各集団の相対Treg含有量が図16に記載される。顎下穿刺によって21日齢scurfyマウスから血清分離管(RAM Scientific)に血液を回収し、10分間、500xgで遠心分離し、サイトカイン分析のために血漿を得た。Luminexプラットフォームを用いてUCLA Immune Assessment Coreによってサイトカインを分析した。
臍部のCBは膣及び帝王切開後、UCLA Medical Centerで得られた。得られたすべての試料は、IRB審査を免除されている匿名の医療廃棄物とみなされた。Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)密度遠心分離を用いて、回収の48時間内にNMCを単離し、製造業者の取扱説明書(Miltenyi Biotec)に従ってCD34濃縮を行った。単一コード由来のCD34+細胞を90%のFBS(Gibco)/10%のDMSO(Sigma Aldrich)においてクライオバイアル内で凍結し、後の使用のために保存した。融解しながら、CD34+細胞をヒト形質導入媒体(X-vivo-15[Lonza]、1x PSG[Gemini io Products]、50ng/mLのSCF、50ng/mLのTPO、50ng/mLのFlt3L[Peprotech])に再懸濁した。細胞を24時間、形質導入媒体で培養し、さらに24時間、LVでインキュベートした。形質導入後、CD34+細胞を回収し、PBSで洗浄し、氷上で30分間、OKT3(Tonbo Biosciences、1μg/100μL)でインキュベートし、GVHDがCD34+移植片に存在するT細胞を汚染することを防いだ(Wunderlich et al.2014)。移植直前に、137Cs源及び線量率100Rad/分を用いて線量125Radで1~3日齢新生児NSGマウスを照射した。各マウスは1~3×105個のCD34+細胞を受け取った。
BM由来の単一細胞懸濁液は、上述するように大腿骨を破砕することによって得られた。胸腺及び脾臓は、組織を70uMストレーナーにより破砕することによって調製された。試料は、以下の方法を用いてフローサイトメトリーのために準備した。50uLのFACSバッファー(リン酸緩衝食塩水[PBS、Corning]/0.5%のBovine Serum Albumin[BSA、Sigma])に再懸濁し、1μLの各抗体及び0.5μLのGhost 780バイアビリティー色素(Tonbo Biosciences)で4℃で20~30分間、細胞をインキュベートした。
Purelink Genomic DNAミニキット(Invitrogen)を用いて、ソートされたTreg(CD4+CD25+)及びTconv(CD4+CD25-)サブセットからゲノムDNAを抽出した。EpigenDxによってヒトFoxP3遺伝子のCNS2のCpGジヌクレオチドメチル化分析が行われ、RNase処理されたゲノムDNAの亜硫酸水素塩処理により判定され、PCR増幅及びパイロシークエンシング(EpigenDx分析ADS783-FS2)が行われた。ウイルス性CNS2を独自に認識する以下のプライマーを用いて、合成LV DNAからのFoxP3 CNS2のメチル化分析のためのEpigenDxによって、カスタム分析が行われた。FoxP3 CNS2 Viral F:TGGAGTTAGATTGTTTGGGA(配列番号11);FoxP3 CNS2 Viral R:CACCTATAAATCCAAATACCCCAC (配列番号12)。
Baldwin,Kismet,Fabrizia Urbinati,Zulema Romero,Beatriz Campo-Fernandez,Michael L Kaufman,Aaron R Cooper,Katelyn Masiuk,Roger P Hollis,and Donald B Kohn.2015.“Enrichment of Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Facilitates Transduction for Stem Cell Gene Therapy.”Stem Cells 33(5):1532-1542.
Claims (21)
- 内因性FoxP3プロモーターに動作可能に連結されるヒトFoxP3タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む発現カセットを含む組換えレンチウイルスベクター(LV)であって、
前記発現カセットがヒトFoxP3-CNS1配列、ヒトFoxP3-CNS2配列及びヒトFoxP3-CNS3配列からなるエンハンサーエレメントを前記プロモーターの上流に含み、
前記LVがTAT非依存性及び自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクターである、前記レンチウイルスベクター。 - 前記ヒトFoxP3タンパク質をコードするヌクレオチド配列がFoxP3 cDNAを含む、請求項1に記載のベクター。
- 前記ヒトFoxP3をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化される、請求項2に記載のベクター。
- 前記ベクターがFoxP3 3’UTRを含む;及び/又は
前記ベクターがΨ領域ベクターゲノムのパッケージングシグナルを含む;及び/又は
前記ベクターがCMVエンハンサー/プロモーターを含む5’LTRを含む;及び/又は
前記ベクターがReV応答性エレメント(RRE)を含む;及び/又は
前記ベクターがインスレーターエレメントを含む;及び/又は
前記ベクターがA2インスレーターを含むインスレーターエレメントを含む;及び/又は
前記ベクターがA2インスレーターを含むインスレーターエレメントをU3領域内に含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のベクター。 - 前記ベクターがPCCL骨格を含む、請求項4に記載のベクター。
- 前記ベクターでトランスフェクトされた細胞が適切な成熟リンパ球においてFoxP3の正常な生理的発現を再現する、請求項5に記載のベクター。
- 前記ベクターが配列番号1の核酸を含む、請求項1に記載のベクター。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のベクターでトランスフェクトされたパッケージング細胞。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のベクターによりコードされたレンチウイルス粒子。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクターによりコードされたレンチウイルス粒子に感染した宿主細胞。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が骨髄由来の幹細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が臍帯血由来の幹細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が末梢血幹細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がヒト造血前駆細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 前記ヒト造血前駆細胞がCD34+細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
- 前記ヒト造血前駆細胞がCD34+CD38-細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- ヒトFoxP3タンパク質を発現する核酸を含む、感染性のレンチウイルス粒子であって、
前記ウイルス粒子が請求項1~7のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクターを用いて産生される、レンチウイルス粒子。 - FoxP3発現が欠損した哺乳類における制御性T細胞(Treg)機能を回復する治療における使用のための医薬組成物であって、請求項1~7のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクター及び/または請求項18に記載のウイルス粒子を含む医薬組成物。
- 自己免疫障害の治療における使用のための医薬組成物であって、請求項1~7のいずれか1項に記載のレンチウイルスベクター及び/または請求項18に記載のウイルス粒子を含む医薬組成物。
- 重症筋無力症、多発性硬化症、IPEX(免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、X連鎖性)及び自己免疫性関節炎からなる群から選択される自己免疫障害の治療における使用のための、請求項20に記載の医薬組成物。
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