CN110914411A - 干扰素引发的浆细胞样树突细胞 - Google Patents

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Abstract

提供了一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，其中提供了造血干细胞和祖细胞(HSPC)并在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育，由此使所述HSPC分化为前体pDC，并且然后将干扰素(IFN)添加至所述第一培养基中以获得第二培养基，由此使所述前体pDC分化为pDC。此外，提供了一种通过以下方式产生遗传修饰的pDC的技术：首先使用包括电穿孔在内的转染方法递送sgRNA和Cas9蛋白来对HSPC进行遗传修饰。此外，提供了一种药物制剂和疫苗，其包含pDC或根据此方法获得的遗传修饰的pDC。

Description

干扰素引发的浆细胞样树突细胞
技术领域
本发明涉及用于产生干扰素引发的浆细胞样树突细胞、抗原呈递细胞和基因工程化浆细胞样树突细胞的方法，包含所述浆细胞样树突细胞或抗原呈递细胞的疫苗和药物制剂，以及用于治疗感染性疾病和/或癌症的方法。
背景技术
浆细胞样树突细胞(pDC)对于免疫能力至关重要，但其发育和功能仍然难以捉摸。pDC是细胞免疫的关键效应物，不仅能够启动免疫应答，而且还能够诱导对外源和内源抗原的耐受性(Swiecki,M.和M.Colonna,The multifaceted biology of plasmacytoiddendritic cells.Nat Rev Immunol,2015.15(8):页数471-85)。pDC与常规DC有所不同，因为它们的发育的最后阶段发生在骨髓中；它们的抗原通过受体介导的内吞作用被获取；它们表达高水平的干扰素调节因子7；并且它们主要通过toll样受体(TLR)7和9感知病原体(Swiecki,M.和M.Colonna,The multifaceted biology of plasmacytoid dendriticcells.Nat Rev Immunol,2015.15(8):页数471-85；以及Tang,M.,J.Diao,和M.S.Cattral,Molecular mechanisms involved in dendritic cell dysfunction in cancer.CellMol Life Sci,2016)。通过这些模式识别受体，病原体核酸可以激活pDC以产生高水平的I型干扰素(IFN)。因此，激活的pDC通过细胞因子产生连同抗原呈递细胞(APC)活性将先天性和适应性免疫系统连接在一起。此外，pDC功能对于在感染过程中实现抗病毒状态、在疫苗接种的情况下提供重要的佐剂活性、以及在激活后促进免疫原性抗肿瘤应答也至关重要(Swiecki,M.和M.Colonna,The multifaceted biology of plasmacytoid dendriticcells.Nat Rev Immunol,2015.15(8):页数471-85；Tovey,M.G.,C.Lallemand,和G.Thyphronitis,Adjuvant activity of type I interferons.Biol Chem,2008.389(5):页数541-5；以及Rajagopal,D.,C.Paturel,Y.Morel,S.Uematsu,S.Akira,和S.S.Diebold,Plasmacytoid dendritic cell-derived type I interferon is crucial for theadjuvant activity of Toll-like receptor 7agonists.Blood,2010.115(10):页数1949-57)。但是，必须保持微妙的平衡，因为pDC的过度激活与包括病毒感染、自身免疫性疾病和肿瘤发生在内的若干疾病的发病机理相关(Swiecki,M.和M.Colonna,Themultifaceted biology of plasmacytoid dendritic cells.Nat Rev Immunol,2015.15(8):页数471-85；以及Tang,M.,J.Diao,和M.S.Cattral,Molecular mechanisms involvedin dendritic cell dysfunction in cancer.Cell Mol Life Sci,2016)。总体而言，pDC在免疫系统中起着关键和多层面的作用，促使人们对其发育和功能进行深入研究。
然而，外周血中pDC的频率低(少于外周血单核细胞的0.1％)以及它们在细胞培养环境中的不良存活严重限制了对pDC生物学的理解(Ueda,Y.,M.Hagihara,A.Okamoto,A.Higuchi,A.Tanabe,K.Hirabayashi,S.Izumi,T.Makino,S.Kato,和T.Hotta,Frequencies of dendritic cells(myeloid DC and plasmacytoid DC)and their ratioreduced in pregnant women:comparison with umbilical cord blood and normalhealthy adults.Hum Immunol,2003.64(12):页数1144-51；以及Zhan,Y.,K.V.Chow,P.Soo,Z.Xu,J.L.Brady,K.E.Lawlor,S.L.Masters,M.O'Keeffe,K.Shortman,J.G.Zhang,和A.M.Lew,Plasmacytoid dendritic cells are short-lived:reappraising theinfluence of migration,genetic factors and activation on estimation oflifespan.Sci Rep,2016.6:页数25060)。因此，简单、灵活和可重现的pDC培养系统的可用性将有助于快速阐明pDC发育以及概括对于理解先天免疫系统中pDC生物学至关重要的免疫功能。关于pDC在免疫治疗方法(包括开发新药物，特别是疫苗)以及预防和/或治疗癌症和/或感染性疾病的方法中的用途，这也具有巨大潜力。因此，开发可恢复pDC功能并触发先天激活以产生I型IFN的疗法可能是诱导有效抗肿瘤免疫力的有价值的工具。
在现有技术中已经描述了pDC的产生。例如Demoulin等人(Exp Hematol.2012年4月；40(4):268-78)披露了在TPO、Flt3L以及细胞因子IL-3、IFN-β或PGE2之一的存在下，培养从脐血分离的人CD34+造血细胞。据报道，TPO、Flt3L和IL-3的组合产生高水平的pDC，呈CD304+、CD123+CD11c+。
Thordardottir等人(Stem Cells Dev.2014年5月1日；23(9):955-67)描述了在包含TPO、SCF、Tlt3L和IL-6的培养基中培养的源自脐带血的CD34+细胞。据报道，细胞分化为分泌高水平促炎细胞因子(例如INF-a、IL-12和TNF-a)的pDC。然而，没有响应于例如TLR7激动剂而分泌高水平促炎细胞因子(例如IFN-a、IL-12和TNF-a)的pDC的披露内容。Thordardottir等人(Oncoimmunology.2017年2月6日；6(3):e1285991)报道了在补充有SR1和Ftl3L、SCF和TPO的培养基中培养CD34+ HSPC，以产生能够激活NK细胞的pDC。Olivier等人(Blood.2006年4月1日；107(7):2694-701.电子出版于2005年12月15日)描述了培养脐带祖细胞以产生pDC，其呈CD303+、CD123+、CD4+、CD13c+。然而，主要的限制是此系统依赖于脐带祖细胞与癌基质细胞系的共培养以产生pDC，这不适用于治疗目的。此外，所述方法不能产生足够数量的pDC。FR 2848565描述了产生pDC细胞系的方法，所述pDC细胞系呈CD4+、HLADR+、CD123+、CD45RA+、CD11c-和CD13-。但是，此方法是基于源自具有特定HLA基因型的一个人的细胞系，这意味着接受此疗法的患者需要与此特定人的HLA匹配，以避免潜在的同种异体反应。现有技术中所有这些披露内容的主要局限性在于缺乏将所产生的细胞的细胞因子应答(例如TLR7和TLR9)与天然pDC(包括TLR7和TLR9应答)进行比较。通常，现有技术的披露内容另外未将产生的pDC在功能上和表型上与天然pDC进行比较。因此，在现有技术中尚未披露用于产生大量pDC的并伴随如下的方法：所产生的pDC在功能和表型上相似(即证明其真实相似性)的比较证据。
与现有技术的披露内容相比，本技术提供了一种从造血细胞产生大量pDC的方法，已经发现所述方法需要干扰素形式的额外因子以达到与天然pDC可比的功能，这是本公开文本的标志。而且，由于本技术是基于原代造血细胞干细胞，因此所述方法允许产生已经与患者的HLA匹配的pDC(患者特异性细胞)，这使得本技术对于治疗目的而言是优越的。另外，使用本技术产生的pDC适合于遗传修饰，从而允许产生遗传改变的pDC的独特产物以用于一般研究或治疗目的。
发明内容
本发明的诸位发明人已经开发了一种用于产生具有高活力的大量激活pDC的高效方法。诸位发明人已经发现激活的pDC表达杀伤受体TRAIL，认为所述杀伤受体TRAIL诱导杀死癌细胞。诸位发明人还已经发现激活的pDC发挥APC的作用，并且因此能够获取并呈递抗原，从而允许呈递给T细胞并触发其激活。更具体地，本发明涉及一种培养方法，通过所述培养方法造血祖细胞(HSPC)离体扩增，并且随后在存在干扰素的情况下分化为成熟pDC。因此，诸位发明人已经发现，包括干扰素治疗在内的第二种培养条件可以引发pDC前体而发育成具有与血液pDC极为相似的表型的成熟pDC。这种两步生成血液pDC的方法(HSPC在暴露于干扰素之前在含有细胞因子和生长因子的第一培养基中预培养)证明了在生成大量成熟pDC方面是高效的。实际上，就产生成熟pDC而言，所提供的方法高度优于一步法，在一步法中，前体细胞与细胞因子和/或生长因子以及干扰素一起孵育。为了比较，在下文参考实施例1。
此外，诸位发明人已经发现通过起初在产生pDC之前修饰HSPC，可以使pDC适合于进行遗传修饰，以允许产生具有增加的治疗潜力的pDC。
因此，本发明的方法提供了将人HSPC扩增和分化成pDC的强大策略，所述策略克服了在例如癌症治疗中对稳健的离体pDC培养物系统的巨大需求。此模型的强大之处在于其简单性、pDC存活率提高和细胞产率高。
因此，一方面，本发明涉及一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，所述方法包括
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–将干扰素(IFN)添加到所述第一培养基中以获得第二培养基由此使所述前体-pDC分化为pDC。
在相关方面，提供了一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，所述方法包括
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–在第一培养基中添加SCF和SR1，以获得高产量的前体pDC
–提供包含干扰素(IFN)的第二培养基
–将干扰素(IFN)添加到包含前体pDC的所述第一培养基中，由此使所述前体pDC转化成第二培养基，以获得高产率的完全激活和分化的pDC
由此使所述前体-pDC分化为pDC。
在优选的实施方案中，所述第二培养基包含IFN-γ和/或IFN-β。在另一个实施方案中，所述第二培养基还包含IL-3。优选地，所述第二培养基包含IL-3、IFN-γ和IFN-β。
可以将前体pDC例如在所述第二培养基中孵育至少24小时。优选地，将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育24至72小时。
在一个实施方案中，所述第一培养基包含Flt3配体、血小板生成素和/或白细胞介素-3。在另一个实施方案中，所述第一培养基还包含干细胞因子和StemRegenin 1。在另一个实施方案中，所述第一培养基还包含干细胞因子和UM 171。在另一个实施方案中，所述第一培养基还包含补充有胎牛血清(FCS)的RPMI培养基。在另一个实施方案中，所述第一培养基包含无血清培养基(SFEM)。优选地，所述第一培养基包含Flt3配体、血小板生成素、白细胞介素-3和StemRegenin 1。
可以将HSPC例如在所述第一培养基中孵育21天。
在本发明的一个实施方案中，在所述第一培养基中孵育所述HSPC导致60至100个前体pDC/HSPC的平均产量。
在一个实施方案中，本文所述的方法还包括免疫磁性阴性选择以富集分化的pDC的步骤。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法还包括将所述pDC与至少一种抗原一起孵育导致形成抗原呈递细胞(APC)的步骤。
在一个实施方案中，所述抗原是癌症特异性抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原。在又另一个实施方案中，所述抗原是病毒-、细菌-或寄生虫-特异性抗原。
优选地，所述pDC表达TRAIL。在另一个实施方案中，所述pDC表达CD123、CD303、CD304、CD4和/或HLA-DR。在又另一个实施方案中，所述pDC表达I型IFN、II型IFN、III型IFN和/或促炎细胞因子。在另外的实施方案中，所述pDC表达IRF7、TLR7和/或TLR9。在一个实施方案中，所述pDC表达CD40、CD80、CD83和/或CD86。例如，所述pDC表达TRAIL、CD123、CD303、CD304、CD4、HLA-DR、I型IFN、II型IFN、III型IFN、IRF7、TLR7和/或TLR9。
在优选的实施方案中，所述pDC分泌IL-6。
本发明的另一方面涉及通过本文所述方法获得的pDC和/或APC群体。这些群体的pDC和/或APC是如本文所定义的。
本发明的另一方面涉及用于治疗感染性疾病或癌症的如本文所定义的pDC和/或APC群体。
本发明的另外的方面涉及药物制剂，所述药物制剂包含pDC和/或APC群体和药学上可接受的载体。
本发明还提供了包含免疫有效量的如本文所定义的pDC和/或APC群体的疫苗。
本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒包含如本文所定义的pDC和/或APC群体，以及与免疫学用途相关的元件。因此，在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种抗原。优选地，所述抗原是如本文其他地方所定义的。
本发明的另外的方面涉及治疗、预防和/或改善感染性疾病和/或癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予治疗有效量的通过本发明方法获得的pDC和/或APC群体。
所述感染性疾病可以例如是病毒感染或细菌感染。在一个实施方案中，所述癌症是TRAIL特异性癌症。
优选地，通过注射向有需要的个体给予所述pDC和/或APC。
本发明的另外的方面涉及产生pDC的方法，已经通过起初在pDC分化之前对HSPC进行遗传修饰来对所述pDC进行遗传修饰。在一个实施方案中，已将所述pDC遗传修饰为通过敲除包括PD-L1(CD274)或LILRA4(CD85g)的共抑制受体来增强抗肿瘤应答。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的pDC通过增加TRAIL的表达来增强抗肿瘤应答。
附图说明
图1.从造血干细胞产生pDC(HSPC-pDC)。a)从HSPC产生HSPC-pDC的图解说明。从人脐带血(UCB)中分离出CD34+ HSPC。简而言之，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心回收单核细胞。然后使用抗CD34免疫磁性珠粒分离CD34+ HSPC。接下来，在具有促进细胞扩增和分化的因子的情况下将2x105个CD34+ HSPC培养21天。在第21天，使用阴性选择对细胞悬浮液磁富集linnegCD11cneg pDC。b)在初始实验开始时(第1天)和连续培养天数(4、8、12、16、18和21)时，在具有指示因子的情况下测量的悬浮细胞总数。c)代表性的流式细胞术图，其显示了富集pDC之前和之后的谱系和CD11c标记物。d)在第21天从补充有指示生长因子的Flt3-L、TPO、IL-3培养物中磁富集后产生的HSPC-pDC的总数(上图)或百分收率(下图)。误差棒表示四个供体的±SEM。
图2.从HSC产生HSC-pDC。a)在CD34+细胞分离之前和之后，脐血来源的单核细胞(CBMC)上CD34表面表达的流式细胞术分析。b)以总数(左)或每毫升脐带血(右)计的CD34+HSC产量。数据为±SEM，并且每个点表示13个供体的单个供体。c)在富集HSC-pDC之前或之后，在第21天，对培养的细胞进行的May-Grünwald-Giemsa染色。
图3.HSPC-pDC引起前体pDC表型。a)在第21天使用流式细胞术对HSPC-pDC上的pDC相关标记物进行的表型分析。有关门控策略，参见补充图2a-b。b)与血液pDC相比，第21天富集的HSPC-pDC上pDC相关标记物的表面表达水平。c)去除HSPC-pDC的生长因子的图解说明。在第21天富集HSPC-pDC后，细胞中的生长因子(IL-3除外)被耗尽。24小时(第21+1天)后，将HSPC-pDC收获用于表型或功能分析。d)第21天的HSPC-pDC或第21+1天的HSPC-pDC的表型比较。e、f)在用TLR7或TLR9激动剂刺激后，第21天富集的HSPC-pDC细胞、第21+1IL-3天的HSPC-pDC或血液pDC的I型(e)或IL-6(f)的水平。显示的数据是三个供体的±SEM。
图4.HSC-pDC和血液pDC的门控策略。a)区分HSC-pDC的门控策略。b)CD123、CD303、CD304、HLA-DR和CD4的表型分析。首先基于FSC和SSC对细胞进行门控以排除碎片，并且然后就FSC-A和SSC-A排除双联体。接下来，活力染色剂-谱系染色剂(lin)和CD11c染色剂用于门控指示pDC相关标记物的活/linneg/CD11cneg细胞。荧光减一(FMO)对照用于设置阳性/阴性事件的门。c)与b)中确定的设门相同的情况下对血液pDC的表型分析。
图5.去除生长因子促进HSC-pDC上pDC特异性标记物的上调。对于所有测试的生长条件，在第21天或培养一天后在生长因子耗尽的培养基(第21+1IL-3天)中，HSC-pDC上CD123、CD303、CD304、HLA-DR或CD4的表达水平。将水平描绘为所有活细胞的百分比(a)或绝对MFI值(b)。c)代表性直方图，其显示了在第21天和第21+1IL-3天HSC-pDC上CD123、CD303、CD304、CD4和HLA的表达。数据为四个供体的±SEM。
图6.引发后，可以将HSPC-pDC调变为经典的pDC。a)HSPC-pDC引发的图解说明。富集后，在单独补充有IFN-β+γ或IL-3的培养基中引发HSPC-pDC。72小时(第21+3天)后，将引发细胞收获进行表型或功能分析。b)用IFN-β+γ引发72小时(第21+3IFNβ+γ天)后的HSPC-pDC以及血液pDC细胞上pDC相关标记物的表面表达水平。c、d)血液pDC、未引发或引发的HSPC-pDC细胞对TLR7和TLR9激动剂的I型IFN(c)或IL-6(d)应答。e)用TLR7激动剂R837刺激之前，用滴定浓度的IFN-β+γ引发的HSPC-pDC的I型IFN应答。显示的数据是三个供体的±SEM。
图7.HSC-pDC的引发上调了pDC相关标记物的表面表达。a)在指示的引发条件下，在第21+1天或第21+3天对HSC-pDC进行表型分析。b)第21天的HSC-pDC、第21+3天的由IFN-β+γ引发的HSC-pDC、和血液pDC的表型比较。c、d)HSC-pDC上不同引发条件的表型比较，描绘了阳性细胞的百分比(c)或绝对MFI值(d)。每个条显示五个供体的平均值±SEM。
图8.HSC-pDC的引发增加了I型IFN对TLR激动剂的功能应答。a、b)在第21+1天(a)和第21+3天(b)响应于TLR7和TLR9激动剂，引发的HSC-pDC产生的I型IFN。每个点表示单独的供体。数据是来自三个供体的一式三份的±SEM。
图9.引发后，HSC-pDC会引起IL-6应答。a、b)在第21+1天(a)和第21+3天(b)响应于TLR7和TLR9激动剂，引发的HSC-pDC产生的IL-6的水平。每个点表示单独的供体。数据是来自三个供体的一式三份的±SEM。
图10：在HSC-pDC上滴定干扰素。用浓度变化范围从1.95至500U/mL的IFN-β/γ引发HSC-pDC或未引发(0U/mL)。三天后，使用流式细胞术对细胞针对CD123和CD304的表达进行表型分析，或用R837刺激以进行I型IFN应答的功能验证。a、b)未引发的或用62.5U/mL、250U/mL或500U/mL IFN-β/γ引发的HSC-pDC的CD123(左)或CD304(右)的表型分析。c、d)在指示的引发条件下第21+3天的HSC-pDC的表型分析。柱状图显示CD123或CD304的百分比(c、d)。e)对于测试的每个供体，在第21+3天响应于TLR7激动剂R837，引发的HSC-pDC产生的I型IFN。每个点表示单独的供体。数据是三个供体的单次(a-d)或一式三份(e)的±SEM。
图11.引发和未引发HSC-pDC的基因的表达水平。HSC-pDC用IFN-β+γ引发或单独用IL-3未引发。一天(第21+1天)或三天(第21+3天)后，将细胞裂解，并使用qPCR评估IRF7(a)、TLR7(b)或TLR9(c)的基因表达水平。显示的数据是来自四个供体的生物学一式三份的±SEM，显示为单独(右)或集体(左)供体。
图12.HSC-pDC静息期后IFN-α2、IFN-α4和IFN-α16的表达水平。a)HSC-pDC静息的图解说明。细胞已引发或未引发。24小时(第21+1天)后，将细胞裂解或洗涤，并重悬于仅含IL-3的培养基中，再培养24小时(静息)，然后裂解。随后使用qPCR评价所选IFN-α基因的基础表达水平。b)IFN-α4和IFN-α16的基础表达水平。数据是来自两个供体的生物学一式三份的±SEM。
图13.与血液pDC相比，HSPC-pDC具有在刺激时采用抗原呈递表型的能力，并展示出延长的存活期。a)在用TLR7激动剂R837刺激后第21+3天，在引发/未引发的HSPC-pDC上所示成熟标记物的表达水平。b)将血液pDC或HSPC-pDC在补充有IL-3的培养基中培养1天、3天、5天、8天和12天。在每个时间点，通过流式细胞术评估活力。c)在不同测试条件下，HSPC-pDC和血液pDC的曲线下面积比较。显示的数据是三个(a)或四个(b-c)供体的±SEM。
图14.引发的HSC-pDC的TLR刺激上调了共刺激标记物。a)HSC-pDC成熟过程的图解说明。用IFN-β+γ引发细胞三天(第21+3天)或不引发(IL-3)。然后在表型表征之前，对细胞进行表型分析或用TLR7激动剂R837刺激另外的24小时。b)用R837刺激(下图)或未处理(UT)(上图)的未引发或引发的HSC-pDC的CD40、CD80、CD83、CD86和CD253的表型分析。
图15.延长的培养后，HSC-pDC和血液pDC的活力。a、b)将HSC-pDC和血液pDC在补充有IL-3或IL-3+IFN-β/γ的培养基中培养1天、3天、5天、8天和12天。在每个时间点，使用流式细胞术评估活细胞的数量。c、d)根据图(a)和(b)计算的随着延长培养的活细胞的百分比。e、f)根据(c)和(d)计算的曲线下面积。数据是每个时间点来自四个供体的生物学一式两份(对于血液pDC)或一式三份(对于HSC-pDC)的±SEM。
图16.HSPC-pDC能够呈递抗原并激活T细胞。a)针对HSPC-pDC的T细胞刺激能力的实验设置的图解说明。用源自CMV肽的肽混合物(CMV ProMix)冲击HSPC-pDC(由TLR7激动剂R837引发和激活)或保持未经处理(UT)。三小时后，将细胞洗涤并与从CMV血清反应阳性供体收获的PBMC共培养，随后在20小时后通过测量上清液中的IFN-γ水平评价T细胞活性。b)用CMV ProMix刺激后，由来自三个CMV血清反应阳性供体的PBMC产生的IFN-γ水平。c)在进行或不进行CMV ProMix的三小时冲击的情况下，由相同的三个PBMC供体(其与三个HSPC-pDC供体(IFN引发和TLR7激活)以10:1的比率混合)产生的IFN-γ水平。显示的数据是三个的±SEM(b-c)。
图17.可以使用无血清条件生成HSPC-pDC。a)使用无血清条件(SFEM II)或补充有FCS的RPMI培养基生成的HSPC-pDC的数量和百分比。b)在第21+3天引发和未引发的HSPC-pDC(活谱系-CD11c-细胞)的表型比较。上图显示了使用补充有FCS的RPMI培养基生成的HSPC-pDC，而下图显示了使用SFEM II生成的HSPC-pDC。c)响应于TLR7和TLR9激动剂，由在补充有FCS的SFEM II或RPMI培养基中培养的HSPC衍生的引发和未引发的HSPC-pDC产生的I型IFN。显示的数据来自三个供体(a)、两个供体(b)和两个供体-以生物学一式两份完成(c)。
图18.HSPC-pDC适合于遗传修饰。a)使用Cas9 RNP进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑的方案的图解说明。首先将CD34+ HSPC在低密度下在CD34+HSPC培养基中培养3天，然后用Cas9 RNP复合物电穿孔。3天的恢复阶段后，开始了pDC分化。b)在分化为HSPC-pDC的过程中扩增HSPC。c)在3天的恢复阶段后，对于针对MyD88、IFNAR1和CCR5(对照)的sgRNA，通过TIDE分析来定量Indel频率。d)第21天，对于基因编辑的HSPC-pDC，HSPC-pDC数量。e)显示在HSPC-pDC中MyD88敲低的Western印迹分析。Western印迹下方列出了对应靶标处的Indel频率。f-g)在引发和未引发的具有在MyD88、IFNAR1和CCR5处的基因编辑的HSPC-pDC中，CD123(f)和CD304(g)的表面表达水平(MFI)。h)在CCR5、MyD88或CCR5处经基因编辑的未引发和引发的HSPC-pDC中，用R837(TLR7)或CpG-A(TLR9)刺激后，I型IFN的功能水平。数据是五个(b-d)或三个(f)供体的±SEM。使用常规的双因素方差分析(a、c)进行统计分析，然后进行Bonferroni事后检验。
图19.在HSPC的培养和分化为HSPC-pDC的过程中保留了遗传修饰。a)用针对MyD88、IFNAR1和CCR5的sgRNA电穿孔后三天，HSPC的Indel频率。b)对于用sgRNA电穿孔的HSPC，在培养的第21天时，总细胞群体或HSPC-pDC富集部分的Indel频率。条形表示5个供体的平均Indel频率±SEM。
具体实施方式
产生pDC的方法
本发明的一方面提供了一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，所述方法包括
–提供造血干细胞和祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–将干扰素(IFN)添加到所述第一培养基中以获得第二培养基由此使所述前体-pDC分化为pDC。
另一方面涉及一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，所述方法包括
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–在第一培养基中添加SCF和SR1，以获得高产量的前体pDC
–提供包含干扰素(IFN)的第二培养基
–将所述第二培养基添加到包含前体pDC的所述第一培养基中，由此使所述前体pDC转化为激活且分化的pDC。
如本文所用，“造血干细胞”(HSC)是多能干细胞，其能够产生所有血细胞类型，包括骨髓谱系和淋巴谱系。骨髓谱系可以例如包括单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞，而淋巴谱系可以包括T细胞、B细胞和NK细胞。
在优选的实施方案中，HSC是造血干细胞和祖细胞(HSPC)。
HSC或HSPC位于人类的骨髓中，例如骨盆、股骨、和胸骨中。它们还存在于脐带血和外周血中。
可以使用针头和注射器从髂嵴的骨盆中取出干细胞和祖细胞。可以将细胞作为液体去除，例如进行涂片检查以查看细胞形态，或者可以通过核心活检来去除细胞，例如以维持细胞彼此之间以及与骨骼的结构或关系。
还可从外周血中收获HSC或HSPC。为了从循环的外周血中收获HSC或HSPC，可以向血液供体注射细胞因子，细胞因子诱导细胞离开骨髓并在血管中循环。细胞因子可以例如选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和环磷酰胺。通常将它们每天注射到皮下脂肪组织中，持续约4至6天。
也可以从骨髓收获或纯化HSC或HSPC。干细胞在骨髓中的浓度比在外周血中的浓度大10至100倍。髋骨(盆骨)含有体内最多的活性骨髓和大量的干细胞。从骨髓收获干细胞通常是在手术室进行的。
在另一个实施方案中，HSC或HSPC是从人脐带血(UCB)中纯化的。在此实施方案中，婴儿出生后不久便从脐带采集血液。每次捐赠收集的干细胞体积很小，因此这些细胞通常用于儿童或小成年人。
所述方法在某些实施方案中是体外方法。
在第一培养基中孵育HSC或HSPC，由此HSC或HSPC分化为前体pDC后，产生本文所用的前体pDC。
如本文所用，浆细胞样树突细胞(pDC)是在干扰素引发后产生的，并表现出与本文其他地方所述的血液pDC非常相似的表型。
在一个优选的实施方案中，HSC例如HSPC是遗传修饰的。优选在pDC分化之前，即在将它们在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育之前，对HSC或HSPC进行遗传修饰。
可以通过本领域中可用的任何方法来修饰HSC(例如HSPC)。在优选的方法中，通过使用电穿孔和/或转导递送单一指导RNA(sgRNA)和/或腺相关病毒对细胞进行遗传修饰。
优选的遗传修饰是敲除一种或多种共刺激标记物。因此，在优选的实施方案中，通过敲除选自IDO、CD85g和PD-L1的一种或多种共刺激因子，对HSC例如HSPC进行了遗传修饰。
第一培养基
第一培养基是分化培养基，其中HSC被分化成前体pDC。因此，第一培养基包含分化因子。
在将HSC分化为前体pDC之前，可以在不包含分化因子的培养基中培养HSC。所述培养基可以补充有常规细胞培养组分，例如血清(例如胎牛血清)、b-巯基乙醇、抗生素(例如青霉素和/或链霉素)、营养物和/或非必需氨基酸。常规的细胞培养组分也可以被补充有常规青霉素和/或链霉素的常规无血清培养基取代。
为了启动将HSC分化为前体pDC，将分化因子例如Flt3配体、血小板生成素和/或选自白细胞介素-3、IFN-b和PGE2的至少一种白细胞介素添加到培养基中。也可以使用SCF和/或SR1。
因此，在优选的实施方案中，所述第一培养基包含Flt3配体、血小板生成素和/或选自白细胞介素-3、IFN-b和PGE2的至少一种白细胞介素。更优选地，所述第一培养基包含Flt3配体、血小板生成素和/或白细胞介素-3。在另一个优选的实施方案中，第一培养基包含SCF和/或SR1。
血小板生成素的浓度可以例如在10至250ng/mL的范围内，例如在20至200ng/mL的范围内，例如在25至150ng/mL的范围内，例如在20至100ng/mL的范围内或例如在30至80ng/mL的范围内。在一个实施方案中，血小板生成素的浓度为50ng/mL。
Flt3配体的浓度可以例如在20至500ng/mL的范围内，例如在40至400ng/mL的范围内，例如在50至300ng/mL的范围内，例如在60至200ng/mL的范围内或例如在75至150ng/mL的范围内。在一个实施方案中，Flt3配体的浓度为100ng/mL。
白细胞介素3的浓度可以例如在5至100ng/mL的范围内，例如在10至80ng/mL的范围内，例如在10至60ng/mL的范围内，例如在15至50ng/mL的范围内或例如在15至40ng/mL的范围内。在一个实施方案中，白细胞介素3的浓度为20ng/mL。
在一个优选的实施方案中，所述第一培养基还包含选自干细胞因子、白细胞介素7和StemRegenin 1的至少一种细胞因子。更优选地，所述第一培养基包含干细胞因子和StemRegenin 1。
干细胞因子的浓度可以例如在20至500ng/mL的范围内，例如在40至400ng/mL的范围内，例如在50至300ng/mL的范围内，例如在60至200ng/mL的范围内或例如在75至150ng/mL的范围内。在一个实施方案中，干细胞因子的浓度为100ng/mL。
StemRegenin 1的浓度可以例如在0.1至5μM的范围内，例如在0.5至3μM的范围内，例如在0.5至2μM的范围内，例如在0.5至1μM的范围内，例如在0.8至3μM的范围内或例如在1至4μM的范围内。在一个特定的实施方案中，干细胞因子的浓度为1μM。
在另一个优选的实施方案中，第一培养基还包含UM171。UM171是一种嘧啶并吲哚衍生物，可改进原始造血细胞的扩增UM171的浓度例如在10至500nM的范围内，例如在10至300nM的范围内，例如在10至250nM的范围内，例如在15至50nM的范围内，例如在20至200nM的范围内或例如在40至150nM的范围内。
将HSPC在人细胞培养的典型条件和技术人员熟知的条件下在第一培养基中孵育。孵育细胞培养物的典型条件是，例如，37℃的温度，95％的湿度为，5％的CO2。
在一个实施方案中，将HSPC在所述第一培养基中孵育至少1天、例如至少2天、至少3天、例如至少4天、例如至少5天、至少6天、例如至少7天、例如至少8天、至少9天、例如至少10天、例如至少12天、至少14天。在更优选的实施方案中，将培养物在所述第一培养基中孵育至少16天、例如至少18天、至少20天或例如至少21天。
可以将HSC例如在所述第一培养基中孵育1周、2周、3周或4周。在优选的实施方案中，将HSPC在所述第一培养基中孵育21天。
在一个实施方案中，孵育期间更新第一培养基。例如，可以在孵育期间每两天、每三天或每四天更新一次培养基。优选地，将第一培养基用含有本文和上文所述的第一培养基的一种或多种组分的培养基更新。优选地，用包含细胞因子的培养基更新培养基。
在所述第一培养基中孵育所述HSC可导致60至100个前体pDC/HPC的平均产量。
第二培养基
在其中HSC分化为前体pDC的第一培养基中孵育HSPC之后，将IFN添加到第一培养基中，由此获得第二培养基。
可替代地，提供第二培养基，其包含IFN，例如I型IFN、II型IFN和/或III型IFN。
本发明的诸位发明人已经发现，培养基中IFN的存在增加了pDC的活力，并且还诱导了类似于血液pDC的表型和功能特征。因此，IFN治疗可以引发前体pDC采用血液pDC表型。未成熟的前体pDC由此发育成更成熟的表型。
在一个实施方案中，所述第二培养基包含IFN-α、IFN-γ和/或IFN-β。在一个优选的实施方案中，所述第二培养基包含IFN-γ和/或IFN-β。优选地，所述第二培养基包含IFN-γ和IFN-β。
在另一个优选的实施方案中，所述第二培养基包含白细胞介素3(IL-3)。在其中第一培养基包含IL-3的实施方案中，可以将IL-3例如与干扰素一起再次添加到培养基中。应理解，可以按任何顺序添加这三个组分。在特别优选的实施方案中，所述第二培养基包含IFN-γ、IFN-β和IL-3。
在一个实施方案中，IFN-γ的浓度在5至400U/mL的范围内。
IFN-γ的浓度可以例如在30至400U/mL的范围内，例如在30至300U/mL的范围内，或更优选地在30至250U/mL的范围内。
在另一个实施方案中，IFN-γ的浓度可以在50至400U/mL的范围内，例如在100至300U/mL的范围内，或更优选地在100至250U/mL的范围内。
IFN-γ的浓度可以例如在5至200U/mL的范围内，例如在5至100U/mL的范围内，例如在10至80U/mL的范围内，例如在15至60U/mL的范围内，或更优选地在20至40U/mL的范围内。
IFN-γ的浓度可以例如为至少30U/mL。
在一个实施方案中，IFN-β的浓度在5至400U/mL的范围内。
IFN-β的浓度可以例如在30至400U/mL的范围内，例如在30至300U/mL的范围内，或更优选地在30至250U/mL的范围内。
在另一个实施方案中，IFN-β的浓度可以在50至400U/mL的范围内，例如在100至300U/mL的范围内，或更优选地在100至250U/mL的范围内。
在一个优选的实施方案中，IFN-β的浓度为250U/mL。
IFN-β的浓度可以例如在5至200U/mL的范围内，例如在5至100U/mL的范围内，例如在10至80U/mL的范围内，例如在15至60U/mL的范围内，或更优选地在20至40U/mL的范围内。
IFN-β的浓度可以例如为至少30U/mL。
将前体pDC在人细胞培养的典型条件和技术人员熟知的条件下在第二培养基中孵育。孵育细胞培养物的典型条件是，例如，37℃的温度，95％的湿度为，5％的CO2。
在一个实施方案中，将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育至少1小时，例如至少5小时，例如至少10小时，例如至少15小时或例如至少20小时。在一个优选的实施方案中，将前体pDC在所述第二培养基中孵育至少24小时。
在另一个实施方案中，将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育至少1天，至少两天，至少三天或至少4天。
在又另一个实施方案中，将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育1至72小时，例如5至72小时，例如10至72小时，例如20至72小时，例如24至72小时或例如48至72小时。
在另一个实施方案中，将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育1至7天，例如1至6天，例如1至5天，例如1至4天，例如1至3天或例如1至2天。
pDC表型
在本发明的一个优选的实施方案中，pDC表达TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。TRAIL，也称为CD253，是在通过以下方式在杀死癌细胞中涉及的配体：其与癌细胞表面上的TRAIL受体(死亡受体5，DR5)相互作用，并且从而触发细胞凋亡。
通过在第二培养基中孵育而获得的pDC是具有非常类似于血液pDC的表面表型的成熟细胞。在优选的实施方案中，所述pDC表达CD123、CD303、CD304、CD4和/或HLA-DR。
在另一个优选的实施方案中，所述pDC表达I型IFN、II型IFN、III型IFN和/或促炎细胞因子。
在一个优选的实施方案中，pDC可以表达Toll样受体，例如Toll样受体7(TLR7)和/或Toll样受体9(TLR9)。
在又另一个优选的实施方案中，所述pDC表达干扰素调节因子7(IRF7)。
在另一个优选的实施方案中，所述pDC表达分化簇80(CD80)，所述分化簇80是在树突细胞、激活的B细胞和单核细胞上发现的蛋白质，其提供了T细胞激活和存活所必需的共刺激信号。
在优选的实施方案中，pDC还可以表达对抗原呈递细胞有特性的蛋白质，例如分化簇86(CD86)和/或分化簇40(CD40)。CD86是在抗原呈递细胞上表达的蛋白质，可提供T细胞激活和存活所必需的共刺激信号，而CD40是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，并且是抗原呈递细胞的激活所必需的。
优选地，所述pDC表达CD40、CD80、CD83和/或CD86。在另一个优选的实施方案中，所述pDC表达白细胞介素6(IL-6)。
pDC可以表达上述蛋白质的任何组合。
可以使用免疫磁性分离方法进一步富集pDC，所述免疫磁性分离方法是基于可磁化的小粒子通过抗体或凝集素与细胞附着。当细胞的混合群体被放置在磁场中，那些附接有珠粒的细胞将被吸引到磁铁上，并且因此可以与未标记的细胞分离。例如，包被顺磁珠粒的抗体可以结合存在于细胞表面的抗原，从而捕获细胞并促进珠粒附着细胞的浓缩。浓缩过程可以通过在试管侧面放置一块磁铁将珠粒带到其中来进行。
也可以使用“阴性分选”方法分离细胞，其中对不需要的细胞类型进行免疫磁性标记。这个过程可能需要抗体的混合物。标记程序与阳性分选相同，除了保留未标记的细胞群体部分并弃去标记的细胞。
因此，在一个实施方案中，本文上述的方法还包括免疫磁性阴性选择以富集分化的pDC的步骤。
遗传修饰的HSPC-pDC
一方面，对通过本文公开的方法提供的pDC进行遗传修饰。因此，本发明的一个方面涉及遗传修饰的pDC。
因此，可以对在本文公开的方法中用于产生pDC的HSC(例如HSPC)进行遗传修饰。优选在pDC分化之前，即在将它们在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育之前，对HSC或HSPC进行遗传修饰。
可以通过本领域中可用的任何方法来修饰HSC(例如HSPC)。在优选的方法中，通过使用电穿孔和/或转导递送单一指导RNA(sgRNA)和/或腺相关病毒对细胞进行遗传修饰。
优选的遗传修饰是敲除一种或多种共刺激标记物。因此，在优选的实施方案中，通过敲除选自IDO、CD85g和PD-L1的一种或多种共刺激因子，对HSC例如HSPC进行了遗传修饰。
因此，在本公开文本的一方面，提供了遗传修饰的pDC，其已被修饰以便使其更适合用于治疗用途，例如用作疫苗。此类遗传修饰的pDC的实施方案包括其中已敲除一种或多种共刺激因子的pDC，所述一种或多种共刺激因子例如为选自IDO、CD85g和PD-L1的共刺激因子。
此类遗传修饰的pDC可以通过以下方式产生
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–对所述HSPC进行遗传修饰，即，通过敲除选自IDO、CD85g和PD-L1的共刺激因子进行
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–在第一培养基中添加SCF和SR1，以获得高产量的前体pDC
–提供包含干扰素(IFN)的第二培养基
–将所述第二培养基添加到包含前体pDC的所述第一培养基中，由此使所述前体pDC转化为激活且分化的经遗传修饰的pDC。
一方面，本公开文本还涉及通过前述方法获得或可获得的经遗传修饰的pDC。
抗原呈递细胞
由于树突细胞(DC)是有力的抗原呈递细胞(APC)，因此它们被认为是递送激活免疫系统所必需的信号的强大工具。当树突细胞识别与病原体相关的分子模式时，抗原被吞噬，并且树突细胞被激活，从而上调了MHC II类分子的表达。它还上调了可与CD4+T细胞表面的CD28相互作用并诱导T细胞应答的若干种共刺激分子。
诸位发明人已经发现，由本文描述的方法提供的pDC能够获取抗原并将抗原呈递到其细胞表面上，参见实施例2。此外，pCD适合于遗传修饰，从而改进其治疗能力；参见实施例3和4。
因此，如上所述的方法可以进一步包括将所述pDC与至少一种抗原或新抗原一起孵育的步骤。将pDC与抗原或新抗原一起孵育会导致pDC负载抗原/新抗原，并形成抗原呈递细胞(APC)。在一个实施方案中，抗原是癌症特异性抗原或新抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原。在又另一个实施方案中，所述抗原是病毒-、细菌-或寄生虫-特异性抗原。
因此，本发明的实施方案涉及产生抗原/新抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括
–提供造血干细胞和祖细胞(HSPC)
–将所述HSPC暴露于包含细胞因子和生长因子的第一培养基中，以诱导HSPC分化为前体pDC
–在包含干扰素的第二培养基中培养所述前体pDC，以诱导前体pDC分化为成熟的pDC
–将pDC与至少一种抗原/新抗原一起孵育由此产生APC。
一个实施方案涉及一种产生抗原/新抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–在第一培养基中添加SCF和SR1，以获得高产量的前体pDC
–提供包含干扰素(IFN)的第二培养基
–将所述第二培养基添加到包含前体pDC的所述第一培养基中，由此使所述前体pDC转化为激活且分化的pDC，以及
–将所述pDC与至少一种抗原/新抗原一起孵育由此产生APC。
将HSPC、前体pDC和pDC在人细胞培养的典型条件和技术人员熟知的条件下孵育。孵育细胞培养物的典型条件是，例如，37℃的温度，95％的湿度为，5％的CO2。
如本文所用，APC是已经负载了抗原的pDC。APC可在其表面展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原；此过程称为抗原呈递。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。这些细胞加工抗原并将其呈递给T细胞。优选地，APC可以将抗原呈递给辅助T细胞和细胞毒性T细胞。APC也可能够交叉呈递，由此它们将MHC I类分子上的外源抗原呈递给细胞毒性T细胞。
优选地，APC在它们的细胞表面上表达MHC II类分子。T细胞识别APC表面上的抗原-II类MHC分子复合物并与之相互作用，从而导致T细胞激活。
辅助T细胞可以识别MHC II类上呈递的外源抗原，而细胞毒性T细胞可以识别MHCI类上呈递的内源抗原。因此，在一个实施方案中，APC可以诱导CD4+辅助T细胞应答。在另一个实施方案中，APC可以诱导CD8+细胞毒性T细胞应答。优选地，本发明的APC可以诱导CD4+辅助T细胞应答和CD8+细胞毒性T细胞应答。
如本文所用，术语“抗原”定义了被免疫系统的细胞识别并且能够触发免疫反应的分子。抗原可以是希望针对其产生免疫应答的任何蛋白质、肽或其片段。
本发明的抗原可以是天然或修饰的肿瘤、细菌或病毒抗原，例如肽、蛋白质、糖肽、糖蛋白或磷酸化蛋白质。
例如，抗原是可以从肿瘤或病毒起源的抗原蛋白获得的肽。
因此，在一个实施方案中，所述抗原是肿瘤特异性抗原。术语“肿瘤特异性”抗原涵盖任何癌性、转化性或恶性细胞以及来自实体肿瘤的抗原。
在另一个实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是病毒-、细菌-或寄生虫-特异性抗原。
因此，本发明的APC可以引发免疫系统攻击恶性细胞，例如被病毒或病原体或特别是癌细胞感染的细胞。
细胞群
本发明还提供了通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的pDC群体和/或APC群体。
本文描述的提及pDC的实施方案也可以指pDC群体。类似地，本文描述的提及APC的实施方案也可以指APC群体。
因此，pDC群体和/或APC群体表达如上文对于通过本发明的方法获得的pDC所定义的蛋白质。即，pDC群体和/或APC群体具有与对于通过本发明的方法获得的pDC和/或APC所描述的相同的表型特征。
因此，在优选的实施方案中，pDC群体和/或APC群体表达TRAIL。
在一个实施方案中，所述pDC群体和/或APC群体表达CD123、CD303、CD304、CD4和/或HLA-DR。在另一个实施方案中，所述pDC系表达I型IFN、II型IFN、III型IFN和/或促炎细胞因子。在又另一个实施方案中，所述pDC系和/或APC群体表达IRF7、TLR7和/或TLR9。在另外的实施方案中，所述pDC群体和/或所述APC系表达CD40、CD80、CD83和/或CD86。在一个实施方案中，所述pDC群体和/或所述APC系可表达IL-6。
pDC系和/或所述APC系可以表达上述蛋白质的任何组合。
疫苗
T细胞应答的诱导取决于与抗原呈递细胞(APC)，特别是树突细胞(DC)的相互作用，所述抗原呈递细胞呈递肿瘤特异性抗原，例如下面讨论的新抗原。因此，为了诱导T细胞应答，可以向癌症患者接种包含APC的疫苗如本文其他地方所示，根据本文提供的方法产生的pDC能够呈递特异性抗原和/或适合于遗传修饰。因此，pDC可用于诱导T细胞应答，这使得它们适合用作疫苗，特别是癌症疫苗。由此，获得了特异性靶向所鉴定的肿瘤抗原的个性化抗原疫苗。在癌症中，某些所谓的肿瘤新抗原可能是由于肿瘤基因组中的一种或多种突变导致相关蛋白质的氨基酸序列发生变化而产生的。由于这些突变在正常组织中不存在，因此针对肿瘤新抗原的免疫治疗不会产生针对肿瘤相关抗原的治疗的副作用。恶性黑素瘤的体细胞性肿瘤特异性非同义突变的平均数量在100与120之间。某些遗传改变可以被免疫系统识别，这代表理想的抗原。
动物模型已确认使用肿瘤新抗原免疫的实用性术语“肿瘤新抗原”用于与宿主的外显子组相比包含一个或多个突变的任何肿瘤特异性抗原，并与术语癌症新抗原同义使用。术语“肿瘤新表位”用于肿瘤抗原中的任何免疫原性突变，并且与术语癌症新表位同义使用。
一方面，本发明提供了一种疫苗，其包含免疫有效量的如上文所定义的APC。通过将在本文公开的方法中提供的pDC与至少一种抗原一起孵育来产生APC，所述至少一种抗原优选地是癌症特异性抗原/新抗原或感染微生物特有的抗原。
“免疫有效量”是指足以诱导免疫应答的量。
具体而言，疫苗被设计用于通过激活T细胞针对APC上呈递的特异性抗原来引起细胞介导的免疫应答。当表位/新表位经过加工并被呈递与MHC分子复合后，T细胞会识别所述表位/新表位，如下所述。
通常，疫苗用于预防或减轻例如感染性疾病或癌症的生理或临床病症的严重性。例如，疫苗可用于预防患者的癌症，或减少或破坏患者中已经存在的肿瘤细胞。
可以将疫苗以治疗有效量或预防有效量给予。上文中定义了治疗有效量和预防有效量。
药物制剂
尽管可以单独给予本发明的APC或pDC或疫苗，但优选以药物制剂的形式提供它们。
因此，本发明还提供了药物制剂，其包含本发明的pDC和/或APC和/或疫苗以及药学上可接受的载体。
合适的载体和此类药物的配制是本领域技术人员熟知的。
本发明的药物制剂可以被配制用于肠胃外给予，并且可以按单位剂型呈现于安瓿、预填充注射器、小体积输注中或多剂量容器中。所述制剂可以采取例如以下形式：在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，例如在水性聚乙二醇中的溶液。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)，并且可包括例如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的药剂。载体的其他例子包括磷酸盐缓冲的食盐溶液、水、湿润剂和/或无菌溶液。剂量要求将随所使用的特定组成、给药途径和所治疗的特定个体而变化。
因此，针对特定受试者或患者的合适剂量或治疗有效剂量水平将取决于多种因素，例如所治疗的障碍，障碍的严重程度，以及患者的年龄、体重、健康状况和性别。
合适的剂量优选由主治医生确定。在有任何禁忌症的情况下，剂量可由个体医生调整。剂量可以变化，并且可以每天给予一剂或多剂，持续一天或若干天。
理想地，要用本发明的制剂治疗的患者或受试者将以最大耐受剂量接受药学有效量或治疗有效量的制剂或细胞，所述最大耐受剂量通常不高于产生耐药性之前所需的剂量。
因此，优选以治疗有效量给予药物制剂。
本文的“治疗有效量”是指给予以产生治疗效果的剂量。确切剂量将取决于要治疗的临床病症或障碍，并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定。
在另外的实施方案中，可以按预防有效量给予药物制剂。预防有效量是有效预防疾病或病症的量。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种佐剂。
所述佐剂优选是免疫刺激剂，所述免疫刺激剂可以包括能够激活树突细胞并刺激其促进T细胞激活的能力的药剂。
在一个实施方案中，所述佐剂是CD40的激动剂(例如可溶性CD40配体)，或对CD40特异的激动剂抗体或CD40的拮抗剂，例如抗CD40抗体。
在另一个实施方案中，所述佐剂是CD28、CD27或OX40的激动剂，CTLA-4拮抗剂。
所述佐剂可以是例如激活Toll样受体的Toll样受体(TLR)激动剂。
给药
可以通过肠胃外给药来给予本发明的药物制剂。
肠胃外给药是非口服/肠内途径的任何给药途径，由此药物避免了肝脏中的首过降解。因此，肠胃外给药包括任何注射和输注，例如推注或连续输注，例如静脉内给药、肌内给药、皮下给药。
在优选的实施方案中，通过注射给予药物制剂。
在一个实施方案中，可以将本发明的药物制剂注射到作用部位，例如注射到患病组织中或注射到直通患病组织的末端动脉中。
特别地，可以将药物制剂直接肌内注射到淋巴结中或致瘤组织中。
治疗方法
本发明的另外的方面涉及用于治疗、预防和/或改善感染性疾病或癌症的如上文所定义的pDC和/或APC。其他方面涉及如上文所定义的药物制剂和/或药物制剂，其用于治疗感染性疾病或癌症。
一方面还涉及一种治疗、预防和/或改善感染性疾病和/或癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的pDC和/或APC。还提供了治疗、预防和/或改善感染性疾病和/或癌症的其他方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的如本文所定义的药物制剂和/或疫苗。
所述感染性疾病可以例如是细菌感染或病毒感染。所述病毒感染可以例如是由于流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、寨卡病毒、HPV或疱疹病毒引起的。
所述癌症可以例如是黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、脑癌、AML、膀胱癌、未知原发癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤、转移癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或病毒诱导的癌症。在优选的实施方案中，所述癌症是TRAIL特异性癌症。
如本文所用，术语“TRAIL特异性癌症”是指其中癌细胞表达TRAIL受体(包括TRAIL-R1和TRAIL-R2)的癌症。TRAIL受体在癌细胞表面表达。TRAIL受体的存在可以例如使用免疫学测定(例如ELISA或流式细胞术)以及分子生物学内的其他通常熟知的测定(例如PCR、qPCR或下一代测序)来检测。
优选地，所述受试者是个体，例如人。
治疗有效量在是在上文所定义的。
在一个实施方案中，所述感染性疾病是细菌感染或病毒感染。在优选的实施方案中，所述癌症是TRAIL特异性癌症。
优选地，所述方法包括给予治疗有效量的如上文所定义的药物组合物。
给药形式如上文所述。
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，其包含如上文所定义的pDC细胞系、以及与免疫学用途相关的元件。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种抗原。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含如上文所定义的APC系、以及与免疫学用途相关的元件。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种抗原。
实施例
材料与方法
从CD34+ HSPC离体生成pDC
从人脐带血(UCB)中纯化CD34+ HSPC。简而言之，通过标准的Ficoll-Hypaque(GEHealthcare)密度梯度离心回收单核细胞。然后按照制造商的说明(EasySepTM人脐带血CD34+阳性选择试剂盒，STEMCELL Technologies)，使用抗CD34免疫磁性珠粒(阳性选择)分离CD34+细胞。新鲜使用CD34+ HSPC，也可以将其冷冻保存直至将来使用。为了获得pDC的分化，将CD34+ HSPC铺板在RPMI-1640培养基(Lonza)中的48孔板中，所述培养基补充有10％热灭活的FCS
Figure BDA0002331100580000241
600μg/mL L-谷氨酰胺(Sigma)、200U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(
Figure BDA0002331100580000242
Life Technologies)。此外，添加了细胞因子Flt3-L、TPO和IL-3作为基线。除基线外，还单独或按组合以各种浓度测试了细胞因子SCF、IL-7和StemRegenin 1。将细胞在37℃、95％湿度、和5％CO2下培养21天。每4天用含有指定细胞因子的培养基更新一次培养基。使用细胞计数器Moxi ZTM(ORFLO Technologies)确定培养期间的总细胞数量。在第21天，根据制造商的方案(EasySepTM人类浆细胞样DC富集试剂盒，STEMCELL Technologies)，使用耗尽非pDC的阴性选择试剂盒富集HSPC-pDC。
从外周血中富集pDC
通过对正常健康献血者血沉棕黄层的Ficoll-Hypaque密度离心来制备外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商的说明(EasySepTM人浆细胞样DC富集试剂盒，STEMCELLTechnologies)，通过阴性选择来富集血液pDC。
HSPC-pDC的引发
将HSPC-pDC在RPMI-1640培养基中进行培养，所述培养基含有10％热灭活的FCS、600μg/mL L-谷氨酰胺、200U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，但耗尽用于培养过程的生长因子。如各个图注中所述，培养基中补充有IFN-β(PBL Assay Science)、IFN-γ(PeproTech)或同时两种细胞因子(IFN-β+γ)。24小时(第21+1天)或72小时(第21+3天)后，将细胞在温暖的培养基中洗涤，并在表型或功能上进行表征。
细胞刺激
为了进行功能表征，将细胞接种在96孔板中。如表1所示，将细胞未经处理或用刺激物刺激。在刺激期间，将细胞保持在具有20ng/mL IL-3的培养基中。刺激后二十小时，将上清液收获并保持在-20℃下直到细胞因子定量。对于表型表征，将引发的细胞接种到48孔板中，并刺激24小时，然后通过流式细胞术进行表型分析。
表1：
激动剂 制造商 Cat.# 靶向PRR 浓度
R837-咪喹莫特 InvivoGen tlrI-imq TLR7 2,5μg/mL
R848-瑞喹莫德 InvivoGen tlrI-r848 TLR7,TLR8 0,5μg/mL
CpG ODN 2216(A类) InvivoGen tlrI-2216 TLR9 12μg/mL
CpG ODN 2006(B类) InvivoGen tlrI-bw006 TLR9 12μg/mL
功能性I型IFN的测量
使用报告细胞系HEK-BlueTM IFN-α/β(Invivogen)对上清液中的生物活性功能性I型IFN进行定量。将细胞系维持在补充有以下项的DMEM+GlutaMaxTM-I(
Figure BDA0002331100580000261
LifeTechnologies)中：10％热灭活的FCS、100μg/mL链霉素和200U/mL青霉素、100μg/mL新霉素(InvivoGen)、30μg/mL杀稻瘟素(InvivoGen)和100μg/mL博莱霉素(InvivoGen)。使用1x胰蛋白酶(
Figure BDA0002331100580000262
Life Technologies)进行细胞传代。为了确保最佳的I型IFN应答和编码hIRF9、hSTAT2和SEAP的质粒的稳定表达，细胞传代不超过20次。为了测量功能性类型IFN，将细胞以3x104个细胞/孔接种在96孔板中的150μL培养基中。细胞如前所述生长，但没有杀稻瘟素+博莱霉素。第二天，将来自刺激细胞或I型IFN标准品范围的50μL上清液添加到细胞中。孵育24小时后，随后将20μL来自HEK-Blue细胞的上清液添加到180μL QUANTI-BlueTM中。通过在酶标仪(ELx808，BioTEK)上测量620nm的光密度(OD)来评估SEAP活性。标准品范围是使用IFN-α(IFNa2 PBL Assay Science)确定的，范围为2至500U/mL。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
按照制造商的说明使用ELISA试剂盒(Biolegend)评价上清液中IL-6的蛋白水平。
细胞形态
为了检查在第21天细胞的形态，将细胞涂在载玻片上并用甲醇固定。May-GrünwaldGiemsa染色(Merck)是根据制造商的方案进行。使用Leica DFC295显微镜检查载玻片。
用流式细胞术进行表型分析
使用流式细胞术进行免疫表型分析。简而言之，将2x105个细胞离心下来并重悬于含0.5％BSA和0.09％NaN3的PBS中。将细胞在冰上封闭30min，然后用荧光色素缀合的抗体染色30min。三次洗涤步骤后，将细胞固定在0.9％甲醛中。在具有四种激光(405nm、488nm、561nm和640nm)和18个光电倍增管(PMT)检测器的LSR Fortessa流式细胞仪(BectonDickinson)上测量荧光强度。使用FACSDiva软件(Becton Dickinson)收集数据。对于一些些实验，使用配备有三种激光(405nm、488nm和640nm)和13个PMT检测器的NovoCyte分析仪(ACEA Biosciences,Inc)收集数据，并使用NovoExpress Flow收集数据。表2列出了用于确定细胞表型的抗体。使用FlowJo软件(第10版，Tree Star，Ashland，OR，美国)分析数据。图注中概述了各个门控策略。利用FMO对照来区分群体。
Figure BDA0002331100580000271
随着延长培养的活力
为了评估HSPC-pDC或血液pDC随着延长培养的活力，在每个时间点收集细胞，并且然后使用流式细胞术进行分析。用Zombie aqua作为活力染料对细胞染色，然后测量活细胞计数并将其针对计数珠粒(CytoCount珠粒，Dako)的固定数量归一化。
实时定量PCR
使用TaqMan检测系统通过实时PCR测定IFN-α2、IFN-α4、IFN-α16、IRF7、TLR7和TLR9的基因表达水平。将表达水平针对DAG1归一化，并将数据呈现为相对表达水平。使用了以下PCR引物：IFN-α2；Hs00265051_s1，IFN-α4；Hs01681284_sH，IFN-α16；Hs03005057_sH，TLR7；Hs01933259_s1，TLR9；Hs00370913_s1，DAG1；Hs00189308_m1。
抗原呈递
将富集的HSPC-pDC用IFN-β+γ引发72小时，并且然后用R837(2.5μg/mL)刺激。刺激24小时后，将HSPC-pDC用每个肽每毫升1μg的CMV(ProMixTM CMV肽库，ProImmune)冲击或不进行处理。3小时后，将细胞洗涤，并且随后与来自CMV血清反应阳性供体的PBMC共培养。作为对照，将来自相同供体的PBMC用每个肽每毫升1μg的CMV刺激或不进行处理。将PBMC和HSPC-pDC以10:1的细胞比率(105个PBMC和104个HSPC-pDC)在96孔板中一式两份共培养，所述板中200μL 10％RPMI补充有20ng/mL IL-3。孵育20小时后，将上清液收获，并通过测量IFN-γ的水平评价T细胞激活。
sgRNA的筛选
首先针对在永生化的K562细胞系(ATCC)中诱导插入或缺失(Indel)的能力筛选sgRNA。将K565(ATCC)维持在补充有以下项的RPMI 1640(Lonza)中：10％FCS
Figure BDA0002331100580000281
100μg/mL链霉素和200U/mL青霉素、和2mM L-谷氨酰胺。将带有sgRNA靶序列的两个退火寡核苷酸克隆到pX330(pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9由Feng Zhang赠予，Addgene质粒#42230)中。pX330质粒包含驱动sgRNA表达的人U6启动子和SpCas9表达盒(关于sgRNA序列，参见下表3)。
Figure BDA0002331100580000282
Figure BDA0002331100580000291
使用Lonza 4D-NucleofectorTM系统(程序FF-123)通过核穿孔将sgRNA-px330质粒递送至细胞。转染后三天，使用TIDE(通过分解追踪Indel)定量Indel频率；提取基因组DNA，并产生跨越sgRNA靶位点的PCR扩增子(关于引物，参见下表4)。
Figure BDA0002331100580000292
然后对纯化的PCR产物进行Sanger测序，并使用TIDE软件(http://tide.nki.nl)对Indel频率进行定量。参考序列(模拟物转染的样品)用作对照。
制作遗传修饰的HSPC-pDC
由Synthego或TriLink Technologies合成了针对MyD88、IFNAR1和CCR5的sgRNA，其两端的三个末端核苷酸均经2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯化学修饰[28]。将解冻的CD34+HSPC起初在CD34+ HSPC培养基(SFEM II培养基(STEMCELL Technologies)，其补充有20单位/mL青霉素、20mg/mL链霉素、Flt3-L(100ng/mL)、SCF(100ng/mL)、TPO(100ng/mL)、IL-6(100ng/mL)、SR1(0.75μM)和UM171(35nM))中低密度(105个细胞/mL)预培养3天，然后进行核穿孔。核糖核蛋白(RNP)复合物是通过在核穿孔前将Cas9蛋白(Integrated DNATechnologies)与sgRNA以1:2,5的摩尔比在25℃下孵育10min来制备的。使用Lonza 4D-NucleofectorTM系统(程序DZ100)进行核穿孔。在CD34+ HSPC扩增培养基中的3天恢复阶段后，将HSPC培养基更改为可促进pDC分化的培养基，如前所述。
供体
在奥尔胡斯Skejby医院妇产科进行足月剖腹产健康婴儿后，获得了未标识的脐带血(UCB)样本。
统计分析
所有数据均使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥)绘制。呈现的数据表示为平均值±平均值的标准误差(+/-SEM)。使用单因素方差分析或双因素方差分析进行统计分析，然后进行Bonferroni事后检验。Α＝0.05。
实施例1
产生Pdc
为了验证实验方法，重现了来自最佳实践的结果，并进行了直接比较[7-10](图1a)。作为基线条件，实施了先前报道的pDC分化方案，所述方案需要在含有细胞因子和生长因子Flt3配体(Flt3-L)、血小板生成素(TPO)和白细胞介素3的培养基中进行21天[7]。添加干细胞因子(SCF)和StemRegenin 1(SR1)导致祖细胞的扩增更多(240倍±42，而基线培养时为35倍±26；图1b)。血液来源的pDC缺乏谱系特异性表面标记物(即CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56)和常规DC标记物CD11c的表达[1]。因此，为了评估21天体外分化方案后定义为linnegCD11cneg细胞的推定pDC的数量，采用免疫磁性阴性选择来富集分化的pDC，以下称其为HSPC-pDC(图1c-d和图2a-c)。SCF和SR1被证明是实现HSPC-pDC群体高产量和高纯度的必不可少的添加物，每单个HSPC的平均产量为80(±20)个HSPC-pDC(对应于总共15x106个HSPC-pDC±4.2x106/0.2x106个HSPC)。这比基线条件下1.4(±0.8)个HSPC-pDC/HSPC高出57x。
接下来，检查生成的HSPC-pDC在表型和功能上是否等同于血液pDC(图3a)。血液pDC表征为linnegCD11cneg，而呈CD123(IL3Rα)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)、CD4和HLA-DR阳性[1，13-15]。在培养第21天，50％-70％的HSPC-pDC呈CD123、CD303、CD4和HLA-DR阳性，但仅约10％表达CD304(图3a和图4a-b)。此外，当与血液pDC相比时，HSPC-pDC的受体表面表达水平显著较低，这是由平均荧光强度(MFI)值确定的(图3b和图4b-c)。
为了测试分化培养基是否阻止了HSPC-pDC的发育，将HSPC-pDC在仅补充有IL-3(以支持存活)的培养基中再培养24小时(第21+1天)(图3c)。与第21天的细胞相比，生长因子的去除导致所有与pDC相关的标记物的表面表达显著增加，但是新出现的表型仍然不能完全重演血液pDC的表型(图3d和图5a-c)。接下来，测试了在第21天或第21+1天这些HSPC-pDC是否能够对经典pDC激活剂(例如TLR7和TLR9激动剂)做出响应。与血液pDC相比，发现两个细胞群体均产生显著更少的I型干扰素和IL-6(图3e-f)。结果表明，在第21天，HSPC-pDC是典型pDC的表型和功能前体，将其定义为未成熟的HSPC-pDC。
随后，在第21天将β-和/或γ干扰素(各30U/ml)与IL-3一起添加到培养基中持续长达72小时(第21+1IFN-β+γ天和第21+3IFN-β+γ天)(图6a)，并且发现干扰素引发的HSPC-pDC获得了非常类似于血液pDC的表面表型特征，CD303、CD304、CD4或HLA-DR的表达没有显著差异(图6b和图7a-d)。然而，CD123表达仍显著较低，据报道这是由于在培养pDC期间补充IL-3引起的[18]。值得注意的是，通过IFN-γ引发改进了CD303和CD304的表达水平，通过添加IFN-β进一步提高了CD303和CD304的表达水平(图7a-d)。接下来，检查了对引发的HSPC-pDC响应于TLR7和TLR9激动剂的功能性I型IFN和IL-6的水平，以测试I型干扰素和IL-6分泌是否达到与由血液pDC产生的水平相似的水平。单独地，IFN-γ主要促进IL-6的分泌，但是与IFN-β相比，在促进I型IFN应答方面效果较差(图8a-b和9a-b)。通过联合滴定外源性IFN-β和IFN-γ，表明使用低至各30U/ml的重组IFN-β+γ用于引发，HSPC-pDC能够获得血液pDC的表型和功能性状(图6c-e和图10a-e)。
通过qPCR检查IRF7、TLR7和TLR9的表达水平，并且结果表明干扰素引发可诱导IRF7和TLR7的表达显著升高(图11)。
为了测试HSPC-pDC的外源引发在何处开始自引发，在培养一天后从HSPC-pDC中去除IFN-β和IFN-γ，并且让细胞在仅含IL-3的培养基中再静置一天(图12a)。总体而言，HSPC-pDC的引发导致测试的两种IFN-αmRNA同种型(α4、α16)的表达增加。在静息期之后，HSPC-pDC仍表达IFN-α，表明培养物中的自引发能力(图12a-b)。
使用血液pDC的主要缺点之一是它们在培养中的寿命短，限制了实验用途的机会窗。因此，我们研究了HSPC-pDC的活力，以评价此模型在延长培养研究中的用途。我们比较了在含有IL-3和+/-IFN-β+γ的培养基中，培养21天后的HSPC-pDC和血液pDC在12天的延长培养中的存活率。发现所有血液pDC中有50％在分离后3天内死亡，而HSPC-pDC在此时间范围内展示出了优越的存活率(图13b和图15a-f)。培养5天后，HSPC-pDC的活力降至60％，与血液pDC相似。值得注意的是，在培养8天后，所有血液pDC均死亡，而60％的HSPC-pDC仍然存活(图13b-c和图15a-f)。培养12天后，HSPC-pDC仍展示出高于40％的存活率。
综上所述，我们的数据表明，在培养第21天用干扰素替代“干性维持”培养因子可促进pDC-前体细胞分化为具有强大I型干扰素产生和存活能力的真正pDC。
实施例2
产生APC用于治疗用途
除了产生I型IFN外，pDC还可以充当抗原呈递细胞(APC)。使用我们的技术的一种方法是抗肿瘤免疫疗法。首先从患者的血液样品中提取造血干细胞和祖细胞(HSPC)。然后在特定条件下培养HSPC，使其成为pDC(HSPC-pDC)。然后将HSPC-pDC引发以达到成熟。然后用无活性的病毒疫苗株FSME激活引发的HSPC-pDC，同时在其上负载肿瘤抗原。这将在HSPC-pDC中诱导抗原呈递表型。可以从癌细胞直接或间接获得肿瘤抗原，这取决于对特定癌症类型的了解。直接获取需要通过使用脂质体纳米载体将特定的已知肿瘤抗原负载到pDC上。间接负载涉及癌细胞分离以及将经辐射的癌细胞与FSME激活的pDC共培养，从而导致癌细胞膜附着在pDC的表面，然后可将癌细胞呈递给T细胞和B细胞。两种方法均将在HSPC-pDC中诱导抗原呈递表型。然后可以将激活并负载抗原的HSPC-pDC重新引入患者体内，从而导致：
1.通过杀伤性pDC活性直接抑制癌细胞生长并诱导癌细胞死亡。
2.激活肿瘤区域中的周围免疫细胞，包括自然杀伤细胞。
3.激活抗原特异性B细胞和细胞毒性T细胞。
总的来说，这将产生杀死癌细胞的级联反应，并在患者体内建立持久的抗肿瘤应答，从而避免肿瘤复发。
为了测试我们的经IFN引发的HSPC-pDC是否展现APC表型，我们评价了经典APC激活标记物(CD40、CD80、CD83和CD86)的表达。用TLR7激动剂处理的非引发以及IFN-β+γ引发的HSPC-pDC显示CD80和CD83的表达升高(图13a和图14a-b)。相比之下，和未引发的细胞相比，IFN-β+γ引发的细胞中CD40和CD86的表达显著更高。为了扩展我们的观察结果，我们研究了HSPC-pDC是否能够激活抗原特异性T细胞。为了确定这一点，我们用源自CMV的肽负载在经引发和TLR7激活的HSPC-pDC上，并且然后将其与来自CMV血清阳性供体的PBMC共培养。如通过IFN-γ应答所证明的，在负载有CMV的HSPC-pDC中，CMV+T细胞的激活高于没有外源蛋白的HSPC-pDC。同时，我们解释这些数据，以指示经引发和激活的HSPC-pDC有效地呈递并激活抗原特异性T细胞。
实施例3
产生经遗传修饰的HSPC-pDC
尽管目前尚无法对进行pDC遗传操作，但CRISPR/Cas9技术的研究进展已导致成功且高效地对CD34+ HSPC进行基因编辑。因此，我们推测可以通过初始修饰CD34+ HSPC并随后分化为pDC来成功产生基因编辑的pDC。我们采用了一种基因编辑策略，其中将化学修饰的合成sgRNA和重组Cas9蛋白(形成核糖核蛋白(RNP)复合物)通过电穿孔递送到CD34+ HSPC中(图18a)。sgRNA被设计用于靶向在IFNAR1(I型IFN受体的亚基)的第一个外显子内的开放阅读框和MyD88。之所以选择IFNAR1，是因为它在TLR介导的应答中发挥了作用，而包括MyD88是因为其在TLR介导的应答中已确立的作用。先前公开的靶向安全港基因CCR5的sgRNA被用作阴性对照。最初对针对MyD88和IFNAR1的一系列sgRNA筛选了它们通过在K562细胞中的质粒电穿孔进行插入和缺失(Indel)以诱导靶向基因破坏的能力。然后，将对每种靶标具有最高功效的三种sgRNA作为在两末端具有化学修饰的核苷酸的合成sgRNA进行测试，所述测试是通过对CD34+ HSPC的电穿孔而进行的Cas9RNP递送进行，从而为每种靶基因选择了单一有力的sgRNA，产生的针对MyD88和IFNAR1的Indel频率分别为73.4％±4.5％和86.7％±2.7％(图19a)。然后，将两种选择的sgRNA和CCR5对照sgRNA用于CD34+ HSPC中，它们在电穿孔后经过3天的恢复阶段被分化为pDC(图18a)。重要的是，在分化过程中未观察到增殖速率和总细胞产量的变化，并且在分化前和分化后均观察到高的Indel率(图18b-c)。当我们评价第21天的HSPC-pDC的总产量时，与先前的实验相比，我们发现产量降低了4倍。我们将其归因于核穿孔程序本身，因为模拟物电穿孔的细胞同样受到影响，或者归因于培养时间延长(图18d)。免疫磁性pDC富集后对Indel频率的分析证实，HSPC-pDC具有与未富集的总细胞群体相似的Indel水平(图19)，并且通过Western印迹测定的MyD88蛋白水平证实了有效的敲除(图18e)。接下来，分析了HSPC-pDC的两种pDC表型标记物(CD123和CD304)以及IFN引发后的功能。sgRNA靶向的细胞显示出两种表面标记物的高表型表达，并且随后在存在和不存在IFN引发的情况下，用TLR7/9激动剂刺激靶向IFNα受体1和MyD88的HSPC-pDC。在这两种情况下，KO细胞中都完全不存在I型IFN诱导(图18h)。有趣的是，当我们评价靶向IFNAR1基因的HSPC-pDC中对TLR激动剂的应答时，我们发现IFNAR1耗尽的细胞显示完全缺乏I型IFN诱导，支持了我们先前的发现，即I型IFN反馈是TLR7和TLR9依赖性I型IFN诱导的前提(图18h)。总而言之，我们证实了在分化为HSPC-pDC之前，可以通过起初修饰CD34+HSPC来产生基因编辑的HSPC-pDC。使用此系统，我们确认，虽然MyD88和IFNAR1显现与人类前pDC发育无关，但它们对通过TLR途径刺激后的功能性pDC免疫应答至关重要。
实施例4
产生具有改进治疗能力的经遗传修饰的HSPC-pDC
首先从患者的血液样品中提取造血干细胞和祖细胞(HSPC)。然后在特定条件下培养HSPC，以更易于进行基因编辑程序。对于基因编辑程序，使用电穿孔将由Cas9蛋白和靶向目标基因的sgRNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合物递送至HSPC。基因编辑程序完成后，在特定条件下培养HSPC，使其成为pDC(HSPC-pDC)。基因编辑程序的效率可以通过PCR(TIDE分析)以及通过测量表型应答和功能应答(例如使用Western印迹得出的蛋白质水平)来估算。总体而言，此程序将产生非同源末端连接(NHEJ)，从而导致目标基因的DNA断裂，从而产生HSPC-pDC，其中目标基因已被去除(敲除)。在另一个程序中，腺相关病毒(AAV)可用于将修复模板递送至HSPC，从而允许发生同源重组，从而导致产生了经过基因编辑的HSPC-pDC。总体而言，这些程序将允许：
1.通过去除目标基因研究pDC中的特定分子途径
2.通过以下方式提高HSPC-pDC的治疗潜力：
a.去除已知抑制癌症中pDC功能的受体，包括PD-L1和CD85g。
b.通过增加细胞表面上的TRAIL的水平来增加HSPC-pDC的抗肿瘤潜力
本发明提供了用于将人HSPC扩增和分化成pDC的强大策略，所述策略克服了对稳健的离体pDC培养系统的很大需求，从而获得了对pDC生物学的清晰见解。此模型的强大之处在于其简单性、提高的pDC存活率和高细胞产率，这意味着此方法容易适合于特定于研究的变量和修改。
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以下各项目表示本发明的优选实施方案。
项目
1.一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，所述方法包括
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体pDC
–将干扰素(IFN)添加到所述第一培养基中以获得第二培养基由此使所述前体-pDC分化为pDC。
2.根据项目1所述的方法，其中所述第二培养基包含IFN-γ和/或IFN-γ。
3.根据项目1和2中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含IL-3。
4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育至少24小时。
5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育24至72小时。
6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt3配体、血小板生成素和/或白细胞介素-3。
7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含干细胞因子和StemRegenin 1。
8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中将所述HSPC在所述第一培养基中孵育21天。
9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含UM171。
10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中在所述第一培养基中孵育所述HSPC导致60至100个前体pDC/HPC的平均产量。
11.根据前述项目中任一项所述的方法，其还包括免疫磁性阴性选择以富集分化的pDC的步骤。
12.根据前述项目中任一项所述的方法，其还包括将所述pDC与至少一种抗原一起孵育导致抗原呈递细胞(APC)的步骤。
13.根据项目12所述的方法，其中所述抗原是癌症特异性抗原。
14.根据项目12所述的方法，其中所述抗原是病原体特异性抗原。
15.根据项目12所述的方法，其中所述抗原是病毒-、细菌-或寄生虫-特异性抗原。
16.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述pDC表达TRAIL。
17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述pDC表达CD123、CD303、CD304、CD4和/或HLA-DR。
18.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述pDC表达I型IFN、II型IFN、III型IFN和/或促炎细胞因子。
19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述pDC表达IRF7、TLR7和/或TLR9。
20.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述pDC表达CD40、CD80、CD83和/或CD86。
21.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述pDC分泌IL-6。
22.通过根据前述项目中任一项所述的方法获得的pDC和/或APC群体。
23.根据项目22所述的pDC和/或APC群体，其中所述pDC和/或APC是根据项目16至21中任一项所定义的。
24.根据项目22至23中任一项所定义的pDC和/或APC群体，其用于治疗感染性疾病或癌症。
25.一种药物制剂，其包含根据项目22至23中任一项所述的pDC和/或APC群体和药学上可接受的载体。
26.一种疫苗，其包含免疫有效量的根据项目22至23中任一项所述的pDC或APC群体。
27.一种试剂盒，其包含根据项目22至23中任一项所述的pDC或APC群体、以及与免疫学用途相关的元件。
28.根据项目27所述的试剂盒，其还包含至少一种抗原。
29.根据项目28所述的试剂盒，其中所述抗原是根据项目13至15中任一项所定义的。
30.一种治疗、预防和/或改善感染性疾病和/或癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予治疗有效量的根据项目22至23中任一项所述的pDC或APC群体。
31.根据项目30所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒感染或细菌感染。
32.根据项目30所述的方法，其中所述癌症是TRAIL特异性癌症。
33.根据项目30至32中任一项所述的方法，其中通过注射向所述有需要的个体给予所述pDC和/或APC群体。
序列表
<110> Aarhus Universitet
<120> 干扰素引发的浆细胞样树突细胞
<130> P4502PC00
<160> 21
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gttcttgaac gtgcggacac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 2
gctgctctca acatgcgagt g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 3
actggaccgc gctggcggag c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 5
cgctgaggct ccaggaccgc 20
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 6
cctgtctctg ttcttgaacg c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 7
ctggctgctc tcaacatgcg c 21
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 8
gtgtctctgt tcttgaacgt g 21
<210> 9
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<212> DNA
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<400> 9
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 10
gggcgcgacg accctagtgc 20
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 11
gctcgtcgcc gtggcgccat 20
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<400> 12
tagtgctcgt cgccgtggcg c 21
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 14
gtgctcgtcg ccgtggcgcc a 21
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 15
gcagcatagt gagcccagaa 20
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 16
ctccgtggaa gaactgtggc 20
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 17
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<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 18
ggagtcgtcc tggaatgc 18
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 19
acctcgagaa ctgacaatta tgc 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 20
gcacagggtg gaacaagatg g 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 21
caccacccca aaggtgaccg t 21

Claims (28)

1.一种产生浆细胞样树突细胞(pDC)的方法，所述方法包括
–提供造血干祖细胞(HSPC)
–在包含细胞因子和生长因子的第一培养基中孵育所述HSPC，由此使所述HSPC分化为前体Pdc
–在第一培养基中添加SCF和SR1，以获得高产量的前体pDC
–提供包含干扰素(IFN)的第二培养基
–将所述第二培养基添加到包含前体pDC的所述第一培养基中，由此使所述前体pDC转化为激活且分化的pDC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二培养基包含IFN-γ和/或IFN-β。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含IL-3。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt3配体、血小板生成素和/或白细胞介素-3。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含干细胞因子和StemRegenin 1。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含UM 171。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述HSPC在所述第一培养基中孵育21天。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育至少24小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述前体pDC在所述第二培养基中孵育24至72小时。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HSPC是经遗传修饰的。
11.根据权利要求7所述的方法，其中通过使用电穿孔和/或转导递送单一指导RNA(sgRNA)和/或腺相关病毒对所述HSPC进行遗传修饰。
12.根据权利要求7或11所述的方法，其中已通过敲除一种或多种共刺激因子对所述HSPC进行遗传修饰。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种共刺激因子选自PGE2和TGF-β的受体，以及CD85g、IDO、ICOS-L和PD-L1。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述第一培养基中孵育所述HSPC导致60至100个前体pDC/HPC的平均产量。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括免疫磁性阴性选择以富集分化的pDC的步骤。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将所述pDC与至少一种抗原一起孵育导致形成抗原呈递细胞(APC)的步骤。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pDC表达TRAIL。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pDC表达CD123、CD303、CD304、CD4和/或HLA-DR。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pDC表达I型IFN、II型IFN、III型IFN和/或促炎细胞因子。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述pDC表达IRF7、TLR7和/或TLR9。
21.通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的pDC和/或APC群体。
22.一种药物制剂，其包含根据权利要求21所述的pDC和/或APC群体和药学上可接受的载体。
23.一种疫苗，其包含免疫有效量的根据权利要求21所述的pDC或APC群体。
24.用于治疗感染性疾病或癌症的根据权利要求21定义的pDC和/或APC群体和/或根据权利要求22定义的药物制剂和/或根据权利要求23定义的药物制剂。
25.一种治疗感染性疾病或癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求21定义的pDC和/或APC群体和/或根据权利要求22定义的药物制剂和/或根据权利要求23定义的疫苗。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒感染或细菌感染。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症是TRAIL特异性癌症。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中通过注射向所述有需要的个体给予所述pDC和/或APC群体。
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