CN110088272B - 用于将细胞重编程为树突状细胞或抗原呈递细胞的组合物、其方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于细胞诱导或将细胞重编程为树突状细胞状态或抗原呈递细胞状态的组合物、核酸构建体、其方法和试剂盒，其部分基于本文所述转录因子的新颖使用和组合的令人惊讶的效应，所述效应允许将已分化或未分化细胞诱导或重编程为树突状细胞或抗原呈递细胞。所述组合物、核酸构建体、方法和试剂盒可用于在体外、离体或在体内诱导树突状细胞，并且这些经诱导的树突状细胞或抗原呈递细胞可用于免疫疗法应用。

Description

用于将细胞重编程为树突状细胞或抗原呈递细胞的组合物、 其方法和用途
技术领域
本公开涉及通过引入并表达分离的转录因子，从已分化的多能性或多能干细胞制造树突状细胞或具有抗原呈递能力的抗原呈递细胞的方法的开发。更特别地，本公开提供通过令人惊讶地使用转录因子的组合的直接细胞重编程，将已分化的专能干细胞或多能干细胞重导向至树突状细胞或抗原呈递细胞状态的方法。
背景技术
细胞重编程依赖于将一种细胞状态的表观遗传学和转录网络重接到不同细胞类型的细胞状态。转录因子(TF)-转导实验已强调成人体细胞或已分化细胞的可塑性，从而提供生成任何所需细胞类型的新技术。通过TF的强制表达，可能将体细胞或已分化细胞重编程为与胚胎干细胞非常相似的诱导型多能干细胞(iPSC)(1、2)。或者，还可将体细胞转化为另一特化细胞类型(3)。已证实直接谱系转化使用TF特化靶细胞身份可成功重编程小鼠和人成纤维细胞为若干种细胞类型，例如神经元、心肌细胞和肝细胞(4)。还在造血系统中显示谱系转化，其中TF的强制表达诱导B细胞和成纤维细胞的巨噬细胞命运(5)，并且用Gata2、Gfi1b、cFos和Etv6实现将小鼠成纤维细胞直接重编程为克隆原造血祖细胞(6)。这四种TF诱导动态多阶段造血过程，其通过内皮样中间体进展，在体外重演发育血细胞生成(7)。
重编程的细胞对于再生医学是非常有前景的治疗工具，并且已在临床研究中测试通过iPSC分化获得的细胞。然而，对于造血再生，仍然缺少从iPSC生成成熟血细胞的方法。因此，需要备选策略来生成可用作血液产品的患者特异性的定型造血细胞。假定存在由TF介导的直接细胞重编程的机会，可设想生成免疫系统的抗原呈递细胞(APC)，例如树突状细胞(DC)。
DC是专门的APC，能通过显示与表面上的主要组织相容性复合物(MHC)复合的肽抗原，与所有所需的可溶和膜结合共刺激分子一起，激活T细胞反应。DC诱导初次免疫反应，增强先前已启动的T-淋巴细胞的效应子功能，并且协调先天性免疫与适应性免疫之间的通信。DC发现于大部分组织中，其中其连续从抗原环境取样，并使用若干种类型的受体监测侵入的病原体。在稳态中，以及在检测病原体时以增加的比率，非淋巴性组织中的岗哨DC移行至淋巴性器官，在此其将其已收集并加工的抗原呈递至T细胞。T细胞所获得的表型取决于DC呈递其抗原所处的背景。如果抗原衍生自病原体或受损的自身，则DC接收危险信号，被激活，并且T细胞随后受刺激变为效应子，这是提供保护性免疫所需的。
DC诱导适应性免疫的能力已促进关于针对细菌、病毒和寄生虫病原体的DC-疫苗策略以及癌症免疫疗法的研究。实际上，正在进行利用DC介导的免疫疗法治疗若干肿瘤类型(包括实体瘤和血液肿瘤)的临床试验(8)。然而，临床结果不一致，可能与在体外生成DC的可变效率有关：自体单核细胞起源于不有效的DC，并且造血祖细胞是以极低数目被分离。另外，这些前体细胞在患有癌症的患者中一般受损，导致生成功能失调的DC(8、9)。在基于DC的免疫疗法中，癌症逃避机制也可能是缺乏一致性治疗优势的基础。在肿瘤进展期间，癌细胞利用若干种免疫过程来逃脱免疫监督。这些适应与癌症抗原异质性一起，防治肿瘤抗原被免疫系统识别，并因此导致肿瘤细胞的免疫原性降低和当前的免疫疗法。
通过直接重编程生成APC为更好地理解DC规格和细胞身份提供新的机会，有助于使用自体工程化细胞更有效地控制免疫反应。
公开这些事实以说明本公开所解决的技术问题。
发明内容
本发明主题鉴别若干种分离的转录因子，其令人惊讶地在体外、离体或在体内将已分化细胞、多能性或多能干细胞重编程或诱导为树突状细胞。
令人惊讶地，如本公开中所述通过重编程生成的经诱导树突状细胞本质上比脾DC(天然DC)更成熟，并且较不依赖于用于抗原呈递的外源性激活刺激。
DC是遍布全身的专门的APC，作用于先天性与适应性免疫系统的界面处。DC能通过其捕获、加工和向T细胞呈递抗原，将抗原靶向至不同类型的免疫反应或耐受性的能力，来提供外部环境与适应性免疫系统之间的决定性联系。首先，DC必须通过I类主要组织相容性复合物(MHC)和II类MHC捕获抗原并加工抗原。在其激活后，DC能朝向局部引流淋巴结移行，启动多种B细胞和T细胞反应，这是适应性免疫的关键特征。早期保护效能主要通过诱导B淋巴细胞产生的抗原特异性抗体来赋予。针对具体抗原的长期保护需要特异性抗体的持久性和生成可在后来的抗原暴露后提供快速有效反应的免疫记忆。DC作为专门的APC能交叉呈递抗原，意味着除了其在II类MHC上呈递外源性抗原和在I类MHC上呈递内源性抗原的经典能力以外，其还能在I类MHC上呈递外源性抗原，这是生成细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)的关键步骤。
个体发育和/或DC定位于其中的微环境可导致DC表达不同的表面受体组合。例如，仅表型标准允许将小鼠DC分类为不同的子群。在这些子群中，传统上将淋巴组织中的常规DC(cDC)细分为cDC1和cDC2子群。人们争论，不同的DC子集可参与某些病原体的特异性识别和/或调节不同的免疫反应，例如Th1或Th2(免疫)或调节性T细胞(耐受性)。然而，DC的表型和功能性行为也受外部激活刺激物显著制约，表示显著可塑性。cDC1和cDC2子集在体内不同地启动Th1和Th2反应。癌症的免疫疗法依赖于使用DC来启动Th1或细胞毒性T淋巴细胞反应以促进肿瘤清除。
目前，基于DC的免疫疗法依赖于自体DC前体：单核细胞，其与较不有效的DC的产生有关，或造血祖细胞，其以极低数目分离。另外，这些前体细胞在患有癌症的患者中一般受损，导致生成功能失调的DC。相比之下，诸如成纤维细胞等非造血细胞类型通常不受影响。人真皮成纤维细胞(HDF)还展现其他竞争性优势，也就是易于从小型皮肤打孔活检获得，易于在体外扩增数代(在4周后1千5百万至2千万个细胞)并且可冷冻保藏并按需使用。考虑到DC作为APC作用于先天性与适应性免疫系统的界面处的基础作用，临床上仍需要找到备选策略来生成功能性DC以启动抗原特异性免疫反应。
本公开的一方面涉及组合物，其包含至少两种分离的转录因子的组合，所述转录因子由与来自由以下组成的列表的序列90％同一的序列编码：
BATF3(SEQ.ID.1或SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)；所述组合物作为选自由以下组成的列表的细胞的重编程或诱导因子：
干细胞或已分化细胞或其混合物，
在体外、离体或在体内将所述细胞重编程或诱导为树突状细胞或抗原呈递细胞。
在一些实施方案中，与由序列列表中提供的序列编码的参考多肽具有相同或相似活性的多肽变体或家族成员可用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中。通常，用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的编码DC诱导因子的特定多肽的变体将与所述特定参考多核苷酸或多肽具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高序列同一性，如通过本文所述并且为本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定。
用于对比的序列比对方法为本领域所熟知，所述方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J Mol Biol48：443-453)寻找两个序列的全面(在整个序列中)比对，其使匹配数最大化并使空位数最小化。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol215：403-10)计算序列同一性百分比并执行两个序列之间的相似性的统计学分析。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(National Centrefor Biotechnology Information)(NCBI)公开获得。也可使用MatGAT软件包中可获得的方法之一来确定相似性和同一性的全面百分比(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质或DNA序列生成相似性/同一性矩阵的应用)。可进行少量手动编辑以优化保守基序之间的比对，如本领域技术人员可了解。在本发明主题中作为百分比指示的序列同一性值是使用BLAST和默认参数在整个氨基酸序列上确定的。
在更佳结果的实施方案中，分离的转录因子的组合可以是：
BATF3(SEQ.ID.1或SEQ.ID.2)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)。
在实施方案中，本公开的分离的转录因子可用于兽医或人医学中，特别用于免疫疗法中，或用于神经变性疾病中，或用于癌症中，或用于传染病中。
在更佳结果的实施方案中，细胞可选自由以下组成的列表：多能干细胞、专能干细胞、已分化细胞、肿瘤细胞、癌细胞和其混合物。特别是哺乳动物细胞，更特别是小鼠或人细胞。
在更佳结果的实施方案中，本公开的分离的转录因子可用作将选自由以下组成的列表的细胞重编程或诱导为抗原呈递细胞的重编程或诱导因子：多能干细胞、或专能干细胞、或已分化细胞和其混合物树突状细胞。
在更佳结果的实施方案中，本公开的分离的转录因子可用作将选自由以下组成的列表的细胞重编程或诱导为抗原呈递细胞的重编程或诱导因子：肿瘤细胞、癌细胞和其混合物。
本公开的另一方面是至少两个序列的组合作为选自由干细胞或已分化细胞或其混合物组成的列表的细胞的重编程或诱导因子在体外、离体或在体内将所述细胞重编程或诱导为树突状细胞或抗原呈递细胞的用途，所述序列与来自由以下组成的列表的序列至少90％同一，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一：BATF3(SEQ.ID.1或SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和其混合物树突状细胞。
优选地，所述组合可选自由以下组成的列表：BATF3(SEQ.ID.1或SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和其混合物。更优选地，分离的转录物可包括以下组合：BATF3(SEQ.ID.1或SEQ.ID.2)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)。
本公开的另一方面涉及编码本发明主题中所述至少一种分离的转录因子的构建体或载体。
在更佳结果的实施方案中，构建体或载体可以是三种分离的转录因子的组合，所述转录因子从5′到3′呈以下序列顺序：PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)；或IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)。
在实施方案中，载体是病毒载体；特别是逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒或腺相关病毒载体。
在更佳结果的实施方案中，转导步骤进一步包括至少一种选自由以下组成的列表的载体：编码IL12的核酸序列；编码GM-CSF的核酸序列；编码IL-7的核酸序列；编码靶向IL-10 RNA的siRNA的核酸序列；和其混合物。
在更佳结果的实施方案中，转导步骤进一步包括至少一种载体，其包含编码免疫刺激性细胞因子的核酸。
本公开的另一方面涉及将干细胞或已分化细胞编程或诱导为树突状细胞或抗原呈递细胞的方法，其包括以下步骤：
用一种或多种载体转导选自由以下组成的列表的细胞：干细胞或已分化细胞和其混合物，
所述载体包括至少两个核酸序列，其编码与来自由以下组成的列表的序列至少90％同一的序列：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和其混合物；优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一；
在支持树突状细胞或抗原呈递细胞生长的细胞培养基中培养经转导体细胞。
对于更佳结果优选地，其中分离的转录因子的组合选自以下经编码组合：BATF3(SEQ.ID.1或SEQ.ID.2)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)；或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)和PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)。
在更佳结果的实施方案中，构建体或载体可以是至少三种分离的转录因子的组合，所述转录因子从5′到3′呈以下序列顺序：PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)；或IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)。
在更佳结果的实施方案中，细胞可经多种分离的转录因子诱导并在至少2天、优选地至少5天、更优选地至少8天、甚至更优选地9天期间培养。
在更佳结果的实施方案中，转导步骤可进一步包括至少一种选自由以下组成的列表的载体：编码IL-12的核酸序列；编码GM-CSF的核酸序列；编码IL-7的核酸序列；编码靶向IL-10RNA的siRNA的核酸序列；和其混合物。
在更佳结果的实施方案中，细胞可选自由以下组成的组：多能干细胞、或专能干细胞、已分化细胞和其混合物。特别是内胚层衍生的细胞、中胚层衍生的细胞或外胚层衍生的细胞、专能干细胞(包括间充质干细胞)、造血干细胞、肠干细胞、多能干细胞、肿瘤或癌细胞和细胞系。
在更佳结果的实施方案中，细胞可以是非人细胞，优选地小鼠或人细胞，更优选地细胞是人或小鼠成纤维细胞，或哺乳动物脐带血干细胞。
本公开的另一方面涉及通过本公开中所述的方法获得的经诱导树突状细胞或抗原呈递细胞。
本公开的另一方面涉及通过本公开中所述的方法获得的经诱导抗原呈递细胞。特别是能呈递癌症抗原、自体抗原、变应原、来自病原性和/或传染性生物体的抗原的经诱导抗原呈递细胞。
本公开的另一方面涉及组合物，其包含治疗有效量的至少一种如本公开中所述的分离的转录因子、或如本公开中所述的经诱导树突状细胞、或如本公开中所述的经诱导抗原呈递细胞、或其混合物，以及药学上可接受的赋形剂。
在优选实施方案中，组合物可用于兽医或人医学中，特别是用于免疫疗法中，或神经变性疾病中，或癌症中或传染病中。
在优选实施方案中，组合物可进一步包含抗病毒剂、止痛剂、消炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、抗生素、利尿剂或其混合物。
在优选实施方案中，组合物可进一步包含填充剂、粘合剂、崩解剂或润滑剂或其混合物。
在优选实施方案中，组合物可用于真皮内和经皮疗法。
在优选实施方案中，组合物可用作可注射制剂，特别是原位注射。
在优选实施方案中，组合物可用于兽医或人医学，特别是用于免疫疗法中，或神经变性疾病的治疗或疗法中，或癌症的治疗或疗法中，或传染病的治疗或疗法中。
在优选实施方案中，组合物可用于中枢和周围神经系统病症的治疗、疗法或诊断中。
在优选实施方案中，组合物可用于瘤，特别是癌症，也就是实体瘤或血液肿瘤的治疗、疗法或诊断中。
在优选实施方案中，组合物可用于以下疾病的治疗、诊断或疗法中：良性瘤、恶性瘤、早期癌症、基底细胞癌、宫颈发育不良、软组织肉瘤、胚细胞瘤、视网膜母细胞瘤、老年性黄斑变性、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、血癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、阴道癌、乳腺癌、鼻咽癌、气管癌、喉癌、支气管癌、细支气管癌、肺癌、中空器官癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、膀胱癌、输尿管癌、肾癌、肝癌、胆囊癌、脾癌、脑癌、淋巴系统癌症、骨癌、胰腺癌、白血病、皮肤癌或骨髓瘤。
在优选实施方案中，组合物可用于真菌、病毒、衣原体、细菌、纳米细菌或寄生虫传染病的治疗、疗法或诊断中。
在优选实施方案中，组合物可用于以下疾病的疗法或诊断中：HIV、SARS冠状病毒、亚洲流感病毒、单纯疱疹、带状疱疹、肝炎或病毒性肝炎的传染。
在优选实施方案中，组合物可用于以下疾病的治疗、疗法或诊断中：淀粉样蛋白病(特别是淀粉样蛋白A(AA)淀粉样变性)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、轻链(AL)淀粉样变性、2型糖尿病、甲状腺管道样癌、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、多神经病或海绵状脑病(即克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease))。
本公开的另一方面涉及包括组合物的癌症疫苗，所述组合物包含至少一种如本公开中所述的分离的转录因子，或如本公开中所述的经诱导树突状细胞，或如本公开中所述的经诱导抗原呈递细胞，或其混合物。
一种试剂盒，其包括以下组分中的至少一种：包含至少一种如本公开中所述的分离的转录因子、或如本公开中所述的经诱导树突状细胞、或如本公开中所述的经诱导抗原呈递细胞的组合物，如本公开中所述的组合物，或如本公开中所述的载体，或如本公开中所述的构建体，或其混合物。
本公开的一方面涉及用于树突状细胞诱导或用于将细胞重编程为抗原呈递树突状细胞(DC)的组合物、方法和试剂盒。在一些实施方案中，组合物包含至少一种DC诱导因子。所述组合物、方法和试剂盒可用于如本文所述在体外、离体或在体内诱导树突状细胞，并且这些经诱导树突状细胞(iDC)可用于免疫疗法中。
本公开的用于树突状细胞诱导或用于将细胞重编程为树突状细胞的组合物、方法和试剂盒部分基于转录因子新颖组合的使用，其允许将已分化细胞直接重编程为树突状细胞状态。所述组合物、核酸构建体、方法和试剂盒可用于如本文所述在体外、离体或在体内诱导树突状细胞，并且这些经诱导树突状细胞可用于免疫疗法中。
在实施方案中，本公开涉及免疫系统的调节，并且特别涉及使用经重编程的树突状细胞启动针对靶抗原的免疫反应。
在实施方案中，所得树突状细胞是抗原呈递细胞，其激活针对I类MHC-抗原靶的T细胞。癌症、病毒、细菌和寄生虫感染都被经重编程的树突状细胞所改善。由于经重编程的树突状细胞能经过I类MHC路径交叉呈递细胞外抗原，其特别适合于生成细胞毒性T淋巴细胞反应。
在实施方案中，选自由以下组成的列表的分离的转录因子(或外源性转录因子)：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)和其混合物，在成纤维细胞中强制表达时，诱导Clec9a DC特异性报道分子、DC形态和常规DC1型(cDC1)转录程序的激活。经诱导树突状细胞(iDC)表达cDC1标志、在细胞表面处的主要组织相容性复合物(MHC)-I和II和共刺激分子CD80、CD86和CD40。iDC能吞噬颗粒并在用LPS或聚I：C激发后分泌炎症性细胞因子。iDC呈递抗原到CD4+T细胞并交叉呈递抗原到CD8+T细胞。
在实施方案中，选自由以下组成的列表的分离的转录因子(或外源性转录因子)：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)在成纤维细胞中强制表达时，诱导CLEC9A和HLA-DR、典型DC标志以及DC形态的表达。经诱导树突状细胞(iDC)能吞噬颗粒和可溶蛋白质。本公开提供癌症和细胞感染的有效新治疗，以及多种诊断性和细胞筛选测定。
在实施方案中，选自由以下组成的列表的分离的转录因子(或外源性转录因子)：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)在癌细胞系中强制表达时，诱导CLEC9A和在细胞表面处的MHC-II的表达。
在实施方案中，CLEC9A优先在树突状细胞的子集cDC1上表达。这是重要的细胞类型，因为其能加工衍生自细胞外的抗原并通过I类MHC分子将其呈递到T细胞。这与大多数抗原呈递细胞通过II类MHC分子呈递细胞外衍生抗原相反。因此，这种抗原呈递机制有时被称为“交叉呈递”。因此，这些细胞在CTL反应的生成和刺激中具有重要作用，所述CTL反应是针对细胞内病原体(例如病毒和癌症)的免疫反应的必需部分。
在实施方案中，通过iDC刺激的免疫反应涉及T细胞增殖，所述T细胞可以是CTL或辅助性T细胞。抗原呈递细胞(以及特别是iDC)可诱导CD8+T细胞和CD4+T细胞二者的增殖，并且可在任何给定免疫反应中刺激两种T细胞类型的增殖。
在实施方案中，iDC可参与至少Th1、Th2和Th17型免疫反应。因此，本发明方法可应用于刺激针对任何抗原的多种类型的免疫反应。然而，这些细胞被认为在CTL反应的生成中特别重要，因此要刺激的免疫反应优选地是CTL反应。所述方法可包括确定CTL的产生和/或增殖，其通常为表达CD8的T细胞并且能发挥针对在I类MHC分子背景中显示其同源抗原的细胞的细胞毒性活性。
因此将进一步理解，iDC可用于预防和/或治疗其中需要诱导CTL反应的任何病况，例如癌症或细胞内寄生虫或病原体的感染，例如病毒感染。
然而，如果经修饰，iDC可导致辅助性T细胞的增殖，而不是CTL。因此，所述方法可另外或替代地包括确定辅助性T细胞的产生和/或增殖。辅助性T细胞可以是CD4+T细胞，并且可以是Th1、Th2、Th17或Treg类型。
在某些条件下，相信iDC可以能够刺激调节性T细胞(Treg)增殖。Treg细胞的特征为Foxp3(叉头盒p3)转录因子的表达。大多数Treg细胞是CD4+和CD25+，并且可被视为辅助性T细胞的子集，但少数可以是CD8+。因此，要通过本公开方法刺激的免疫反应可包括响应抗原诱导Treg细胞的增殖。鉴于Treg细胞可能够以其他方式调节免疫系统中其他细胞针对抗原的反应，例如抑制或压制其活性，对免疫系统作为整体的效应可以是调节(例如压制或抑制)针对所述抗原的反应。因此，本发明的该方面的方法可同样称为调节(例如抑制或压制)针对抗原的免疫反应的方法。这在(例如)自体免疫疾病的治疗中可特别有用。
iDC将促进抗原特异性反应。抗原可以是可需要针对其产生免疫反应的蛋白质或其片段，所述免疫反应特别是CTL反应，也可以是Th17反应或Treg反应。这些可包括与细胞相关的、由细胞表达的、在细胞上显示的或由细胞分泌的抗原，需要针对其刺激CTL反应，所述细胞包括癌细胞和含有细胞内病原体或寄生虫的细胞。例如，抗原可以是或可包括表位肽，其来自细胞内病原体或寄生虫表达的蛋白质(例如病毒蛋白质)或来自癌症或肿瘤细胞表达的蛋白质。因此，抗原可以是肿瘤特异性抗原。术语“肿瘤特异性”抗原不应视为将其限制于来自实体瘤的抗原，而是涵盖由任何癌性、经转化或恶性细胞特异性表达的抗原。
因此，本发明提供已启动抗原呈递的细胞或其群体。“已启动”意指，细胞已与抗原接触，正在在MHC分子、优选地MHCI分子背景下呈递所述或其表位，并且能激活或刺激T细胞以在其反应中增殖并分化为效应子细胞。
术语“抗原”在本领域中已充分理解，并且包括免疫原性物质以及抗原性表位。应了解，设想使用任何抗原用于本发明，并且因此包括但不限于自体抗原(正常或疾病相关)、感染性抗原(例如，微生物抗原、病毒抗原等)，或一些其他外来抗原(例如，食物组分、花粉等)。用抗原加载抗原呈递细胞可利用标准方法来完成，例如脉冲调、转导、转染和/或电融合。可设想，抗原可以是核酸(DNA或RNA)、蛋白质、蛋白质裂解物、全细胞裂解物或与其他蛋白质相连的抗原蛋白质，即热休克蛋白质。抗原可从病原性微生物衍生或分离，例如病毒，包括HIV、流感、单纯疱疹、人乳头瘤病毒、B型肝炎、C型肝炎、EBV、巨细胞病毒(CMV)等。抗原可从病原性细菌衍生或分离，例如衣原体属(Chlamydia)、分枝杆菌(Mycobacteria)、军团菌属(Legionella)、脑膜炎球菌(Meningiococcus)、A组链球菌(Streptococcus)、沙门菌属(Salmonella)、利斯特菌属(Listeria)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)等。此外，抗原可从病原性酵母衍生或分离，包括曲霉菌属(Aspergillus)、侵入性念珠菌属(Candida)、诺尔卡菌属(Nocardia)、组织胞浆菌病(Histoplasmosis)、隐孢子虫属(Cryptosporidia)等。抗原可从病原性原生动物和病原性寄生虫衍生或分离，包括但不限于卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、椎虫属(Trypanosoma)、利士曼原虫属(Leishmania)、疟原虫属(Plasmodium)和弓形虫(Toxoplasma gondii)。在某些实施方案中，抗原包括与肿瘤前或增生状态相关的抗原。抗原也可与癌症相关或引起癌症。所述抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或组织特异性抗原、其表位和其表位激动剂。所述抗原包括但不限于癌胚抗原(CEA)和其表位，例如CAP-1、CAP-1-6D、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-1、MUC-2、点突变ras癌基因、正常和点突变p53癌基因、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、BRC-I、BRC-II、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-1、TAA和组织特异性抗原的修饰形式、TAA的剪接变体、表位激动剂等。
如本文所用的术语“药剂”意指任何化合物或物质，例如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“药剂”可以是任何化学物质、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白质性和非蛋白质性实体。在一些实施方案中，药剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体以及其修饰形式和组合等。在一些实施方案中，核酸是DNA或RNA，并且核酸类似物例如可以是PNA、pcPNA和LNA。核酸可以是单链或双链，并且可选自包括以下的组：编码目标蛋白质的核酸、寡核苷酸、PNA等。所述核酸序列包括例如但不限于编码用作转录阻遏因子的蛋白质的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。蛋白质和/或肽药剂或其片段可以是任何目标蛋白质，例如但不限于：突变蛋白质；治疗性蛋白质；截短蛋白质，其中蛋白质在细胞中通常不存在或以较低水平表达。目标蛋白质可选自包含以下的组：突变蛋白质、遗传工程化蛋白质、肽、合成肽、重组蛋白质、嵌合蛋白质、抗体、人源化蛋白质、人源化抗体、嵌合抗体、经修饰蛋白质和其片段。
如本文所用的术语“转录因子”或“TF”是指使用DNA结合结构域结合到DNA的具体部分的蛋白质，并且是控制遗传信息从DNA转录到RNA的系统的一部分。
如本文所用的术语“DC诱导因子”是指发育潜能改变因子，如所述术语在本文中所定义，例如蛋白质、RNA或小分子，其表达有助于细胞(例如体细胞)重编程为DC状态。DC诱导因子可以是例如可将细胞重编程为DC状态的转录因子，例如PU.1、IRF8、BATF3和TCF4等，包括可在体外制备iDC的方法中取代这些因子中的一种或多种的任何基因、蛋白质、RNA或小分子。在一些实施方案中，DC诱导因子的外源性表达诱导一种或多种DC诱导因子的内源性表达，使得将细胞稳定维持在iDC状态不再需要一种或多种DC诱导因子的外源性表达。
如本文所用的术语“抗原呈递细胞”(APC)是指在其表面上显示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞；这个过程被称为抗原呈递。T细胞可使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。这些细胞加工抗原并将其呈递至T细胞。
本文所用术语“体细胞”是指形成生物体的身体的任何生物细胞；也就是，在多细胞生物体中，除了配子、生殖细胞，配子母细胞或未分化干细胞以外的任何细胞。
内源性DC诱导因子的表达可通过使用DNA靶向系统来诱导，所述DNA靶向系统能在使用或不使用染色质修饰药物的情况下调节细胞中的哺乳动物基因表达。在一些实施方案中，DNA靶向系统可包括基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)9的系统(如WO2014197748 A2中所述)，其可包括与细胞接触的任何经修饰蛋白质、分离的多核苷酸或载体以及至少一种向导RNA，所述向导RNA靶向至少一个基因的启动子区，所述基因选自由PU.1、IRF8、BATF3和TCF4组成的组。DNA靶向系统可包括dCas9-VP64。在一些实施方案中，DNA靶向系统可包括两种或更多种转录激活因子类效应子转录因子(如US20140309177 A1中所述)，其结合到至少一个基因的不同靶区，所述基因选自由PU.1、IRF8、BATF3和TCF4组成的组。
在实施方案中，iDC可用作免疫疗法以在癌症患者中诱导特异性免疫反应，所述癌症尤其例如黑色素瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、急性髓样白血病。
在实施方案中，iDC还可用于治疗由病毒、细菌和寄生虫病原体引起的感染。
在实施方案中，iDC还可用作疫苗免疫原性测试的体外工具。
本公开中所用多能干细胞的获得无需再使用必须涉及破坏人胚胎的方法，也就是使用诱导型多能干细胞。诱导型多能干细胞(也称为iPS细胞或iPSC)是一类可通过细胞重编程从成人细胞直接生成的多能干细胞。
可通过这种方法获得的经诱导树突状细胞(iDC)表达在细胞表面处的MHC-I和II以及共刺激分子CD80、CD86和CD40。
在一些实施方案中，组合物可包含本发明主题中公开的分离的转录因子，其量将受试者中的免疫疗法有效提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少95.7％、至少98％或至少99％。
在一些实施方案中，组合物可包含本发明主题中公开的经诱导树突状细胞，其量可将受试者中的免疫疗法有效提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少95.7％、至少98％或至少99％。
本公开的DC诱导因子可经递送以在体外、离体或在体内诱导重编程。
本公开的已分化细胞可从有需要的受试者分离，可引入DC诱导因子以诱导重编程为iDC。可将所生成的iDC输注回患者。
或者，DC诱导因子可经递送以在体内诱导例如将癌细胞重编程为具有呈递癌症抗原的能力的iDC。
优选施用途径包括但不限于经口、非经肠、肌内、静脉内、原位注射、鼻内、舌下、气管内和吸入。
在一些实施方案中，将剂量或剂型一天一次、一天两次或一天三次施用给受试者。在其他实施方案中，将剂量一周一次、一个月一次、每两个月一次、一年四次、一年三次、一年两次或一年一次施用给受试者。
本发明的实施方案提供多种应用，用于研究用途的试剂盒以及用于生成可用于实施免疫病症的小分子筛选的细胞的方法。另外，本发明提供商业和医学上有用的产生自体树突状细胞并将其返回有需要的患者的方法。
例如，本文所述方法可用于产生树突状细胞以治疗疾病，包括过度增生疾病，其也可进一步定义为癌症。在其他实施方案中，癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、白血病、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈癌、舌癌、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、子宫癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、肉瘤或膀胱癌。癌症可包括由肿瘤细胞构成的肿瘤。例如，肿瘤细胞可包括但不限于黑色素瘤细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、睾丸癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、淋巴癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞或软组织癌细胞。在其他实施方案中，过度增生疾病是类风湿性关节炎、炎症性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、瘤前病变(例如腺瘤性增生和前列腺上皮内瘤)、原位癌、口腔毛状白斑或银屑病。
因此，在实施方案中，本文提供树突状细胞(DC)诱导组合物，其包含一种或多种表达载体，所述表达载体编码至少两种、三种、四种或更多种选自以下的DC诱导因子：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)或其混合物。在特定实施方案中，所述添加将效率提高至少8％。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，一种或多种表达载体是逆转录病毒载体。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，一种或多种表达载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是可诱导慢病毒载体。
在一些方面中，本文还提供树突状细胞(DC)诱导组合物，其包含经修饰mRNA序列，所述mRNA序列编码至少两种、三种、四种选自以下的DC诱导因子：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)或其混合物，其中每一所述经修饰mRNA序列的每一胞嘧啶是经修饰胞嘧啶，每一所述经修饰mRNA序列的每一尿嘧啶是经修饰尿嘧啶，或其组合。
在一些方面中，本文提供树突状细胞(DC)诱导组合物，其包含至少两个选自以下的序列：TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)或其混合物，其中每一所述经修饰mRNA序列的每一胞嘧啶是经修饰胞嘧啶，每一所述经修饰mRNA序列的每一尿嘧啶是经修饰尿嘧啶，或其组合。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，经修饰胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且经修饰尿嘧啶是假尿嘧啶。
在一些方面中，本文还提供从体细胞制备经诱导树突状细胞(iDC)的方法，所述方法包括：
用一种或多种载体转导体细胞，所述载体包括编码PU.1的核酸序列(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、编码IRF8的核酸序列(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)；编码BATF3的核酸序列(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)；其中每一所述核酸序列可操作连接到启动子；和
在支持树突状细胞生长的细胞培养基中培养经转导体细胞，由此制备iDC。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，转导步骤进一步包括一种或多种载体，其包括以下中的一个或多个：编码TCF4的核酸序列(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)；编码IL12的核酸序列；编码GM-CSF的核酸序列；编码IL-7的核酸序列；编码靶向IL-10RNA的siRNA的核酸序列。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，转导步骤进一步包括一种或多种载体，其包括编码免疫刺激性细胞因子的核酸。优选地，细胞因子是以下中的一种：白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子-β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt-3配体或试剂盒配体。这些细胞因子的氨基酸序列为本领域所熟知。在异二聚免疫刺激性细胞因子(例如，IL-12)的情形中，经诱导树突状细胞(iDC)应经遗传修饰以表达细胞因子分子的两个亚单元。
其他载体也可包括编码这些细胞因子的变体的核酸。例如，对于那些具有前体形式和成熟形式(例如，在信号肽裂解之前和之后，或在有限蛋白水解以产生活性片段之前和之后)二者的细胞因子，本发明的APC可经遗传修饰以表达前体形式或成熟形式。也可采用其他变体，例如细胞因子的活性片段与异源序列(例如，异源信号肽)之间的融合蛋白质。也可采用物种变体到其在人受试者中保留活性的程度。因此，例如，如果人细胞因子的鼠类、牛、马、羊、猫、犬、非人灵长类动物或其他哺乳动物变体保持与其人同系物基本类似的活性，则人APC可经遗传修饰以表达这些物种变体。
还可能需要施用其他免疫刺激剂以实现最大CTL刺激和增殖，和/或其他T细胞类型的刺激和增殖。这些免疫刺激剂可包括能激活树突状细胞并刺激其促进T细胞激活的能力的药剂。所述药剂可被称为佐剂。佐剂可包括CD40激动剂(例如可溶CD40配体，或对CD40具有特异性的激动剂抗体)、CD28、CD27或OX40的激动剂(例如对那些分子中之一具有特异性的激动剂抗体)、CTLA-4拮抗剂(例如对CTLA-4具有特异性的阻断抗体)，和/或Toll样受体(TLR)激动剂，和/或能诱导树突状细胞激活的任何其他药剂。TLR激动剂是激活Toll样受体的物质。优选地，TLR激动剂是TLR3、TLR4、TLR5、TLR7或TLR9的激活因子。适宜TLR激动剂是MPL(单磷酰脂质A)，其结合TLR4。其他可用TLR激动剂是LTA(脂磷壁酸，其结合TLR2；聚I：C(聚肌苷-聚胞苷酸)，其结合TLR3；鞭毛蛋白，其结合TLR5；咪喹莫特(imiquimod)或多聚URNA(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并(4，5-c)喹啉-4-胺)，其结合TLR7和CpG(DNA CpG基序)，其结合TLR9；或结合并激活TLR的任何其他组分。更多详情参见Reis e Sousa，Toll样受体和树突状细胞(Toll-like receptors and dendritic cells)。Seminars in Immunology16：27，2004。无法通过TLR发挥作用的佐剂包括5′三磷酸RNA、聚I：C和β-葡聚糖，例如可得兰多糖(curdlan)(β-1，3-葡聚糖)。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，培养步骤进一步包括使用支持树突状细胞或抗原呈递细胞生长的细胞培养基，所述培养基补充有至少一种选自由以下组成的组的免疫刺激性重组细胞因子：白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子-β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt-3配体或试剂盒配体。在异二聚免疫刺激性细胞因子(例如，IL-12)的情形中，经诱导树突状细胞(iDC)应该与细胞因子分子的两个亚单元一起培养。其他促炎性细胞因子也可用作佐剂。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，体细胞是成纤维细胞。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，体细胞是造血谱系细胞。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，造血谱系细胞选自前髓细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、网织红细胞、红细胞、肥大细胞、破骨细胞、原巨核细胞、血小板生成型巨核细胞、血小板、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、先天性淋巴细胞、专能造血干细胞和祖细胞、寡能造血祖细胞、谱系限制性造血祖细胞。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，造血谱系细胞选自专能祖细胞(MPP)、共同骨髓祖细胞(CMP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)、共同淋巴祖细胞(CLP)和前巨核细胞-红细胞祖细胞。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，造血谱系细胞选自巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)、原B细胞、前B细胞、前-原B细胞、原T细胞、双阴性T细胞、原NK细胞、前树突状细胞(前DC)、前粒细胞/巨噬细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)细胞和原肥大细胞(原MC)。
在一些方面中，本文还提供制备经诱导树突状细胞(iDC)的试剂盒，所述试剂盒包括任一DC诱导组合物，所述DC诱导组合物包括一种或多种本文所述的表达载体组分。
在一些方面中，本文提供制备经诱导树突状细胞(iDC)的试剂盒，所述试剂盒包括任一DC诱导组合物，所述DC诱导组合物包括本文所述的经修饰mRNA序列组分。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，一种或多种表达载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是可诱导慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是多顺反子可诱导慢病毒载体。在一些实施方案中，多顺反子可诱导慢病毒载体表达三个或更多个核酸序列。在一些实施方案中，多顺反子可诱导慢病毒载体的每一核酸序列相隔2A肽序列。
使用多顺反子病毒表达系统可增加体细胞到iDC的体内重编程效率。因此，在本文所述方面的一些实施方案中，使用多顺反子慢病毒载体。在所述实施方案中，从单一启动子表达编码两种或更多种本文所述DC诱导因子的序列作为多顺反子转录物。2A肽策略可用于制备多顺反子载体(参见，例如，Expert Opin Biol Ther.2005年5月；5(5)：627-38).多顺反子表达载体系统也可使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能绕过5′-甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。IRES元件可连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可一起转录，彼此由IRES隔开，由此产生多顺反子信息。由于IRES元件，核糖体可到达每一开放阅读框以进行有效翻译。多个基因可使用单一启动子/增强子转录单一信息来有效表达。参见，例如，美国专利第4,980,285号；第5,925,565号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号；第5,919,670号；和第5,935,819号；以及Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborPress(1989)。
附图说明
以下各图提供用于图解说明说明书的优选实施方案，并且不应被视为限制本发明的范围。
图1.造血分化的示意性表示。由于造血分化通常从造血干细胞(HSC)经限制性逐渐增强的祖细胞前进到已分化血液效应子细胞，例如树突状细胞(DC)(以虚线框突出显示)，本文所述结果旨在利用富含DC的转录因子将已分化体细胞从其他谱系重编程到具有抗原呈递能力的树突状细胞命运。专能祖细胞(MPP)、共同骨髓祖细胞(CMP)、共同淋巴祖细胞(CLP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)、前巨核细胞-红细胞(前MEG/E)祖细胞、巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)、集落形成单位-红细胞系(CFU-E)、巨核细胞祖细胞MkP、原肥大细胞(原MC)、单核细胞DC祖细胞(MDP)、共同树突状细胞前体(CDP)、前树突状细胞(前DC)、双阴性T谱系前体(DN1、DN2)。
图2.通过直接细胞重编程生成抗原呈递细胞。观察本发明主题中的TF组合公开内容对从小鼠和人成纤维细胞诱导树突状细胞(iDC)的效应。经诱导DC可在用细胞提取物或确定抗原加载后(经启动iDC)应用于生成个性化免疫疗法。DC在抗原呈递中特化为巨噬细胞T、B和NK细胞。经诱导DC刺激针对癌症、病毒、寄生虫或细菌感染的抗原特异性免疫反应。
图3.将癌细胞原位或离体直接重编程以刺激抗原特异性免疫反应。在将这种混合剂在体内或原位或离体或在体外直接引入癌细胞中时，TF组合(PIB)对诱导DC命运和抗原呈递能力的效应。这种策略使得肿瘤细胞能将其特异性抗原(肿瘤-APC)呈递到CD4+和CD8+T细胞，触发针对肿瘤的靶向免疫反应。
图4.用于DC直接重编程的18种TF候选物。(A)热图，显示多种小鼠组织中的18种候选因子的基因表达(GeneAtlas MOE430)。18种因子大多数在DC(黑框)中而非在其他组织(右侧)中特异性富集。(B)热图，显示与源自骨髓培养物的巨噬细胞(Mφ)相比，18种因子在小鼠DC中的基因表达增加(左图，GSE62361)。热图，显示18种TF在共同树突状细胞前体(CDP)、前常规DC(前cDC1和前cDC2)和常规DC(cDC1和cDC2)中的基因表达(右图，GSE66565)。基因表达数据是通过Cluster 3.0分析并通过Treeview显示。红色指示增加的表达，而蓝色指示相对于平均值减少的表达。(C)使用Enrichr对候选的18种TF进行基因本体论生物学过程(左侧)和小鼠功能丧失型突变体表型(右侧)富集分析(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)。列表显示最富集项(前19项)，并且左列显示相应的p值。最富集的生物过程是白细胞分化(p＝2.51E-12)、白细胞激活(p＝1.02E-11)、DC分化(p＝9.58E-12)和DC激活(p＝6.31E-11)，而突变体表型包括异常适应性免疫(p＝1.19E-04)和异常抗原呈递(p＝1.25E-03)。
图5.Clec9a的表达具体限制于常规DC-谱系。(A)Clec9a-Cre X R26-终止-Tomato双转基因小鼠使得能鉴别常规DC和其定型前体(CDP，共同树突状细胞前体)，但由于受限的tdTomato表达而无法鉴别其他白细胞。(B)Clec9a在DC和若干种造血细胞谱系中的表达谱，从可在免疫基因组计划(www.immgen.org)获得的数据得到。(C)在单细胞水平上，Clec9a基因在单核细胞DC祖细胞(MDP)和DC-定型前体(CDP和前DC)中的基因表达(GSE60783)。
图6.Clec9a在成熟cDC1中高表达。(A)Clec9a在DC前体(CDP、前DC1和前DC2)和成熟细胞(cDC1和cDC2)中的基因表达(GSE60782)。(B)从双转基因C9a-tdT动物分离的脾cDC1(MHC-II+CDllc+CD8+细胞)上的Clec9a-tdTomato的确认。包括不表达Clec9a的CD8+T细胞作为对照。
图7.分离并纯化Clec9a报道分子MEF以筛选候选TF。(A)在胚胎天数E13.5使用双转基因(Clec9a-Cre X R26-终止-Tomato)怀孕雌性来分离MEF。在移除头部、胎儿肝脏和内脏后，培养MEF直到汇合为止。分选MEF以移除残留CD45+和tdTomato+细胞，其可代表具有造血潜能的细胞。(B)用选通策略以移除残留的CD45+和tdTomato+细胞。分选双阴性MEF，占群体的约97％。(C)经分选群体的纯度确认。
图8.筛选候选TF激活Clec9a报道分子MEF的能力的实验设计。用编码DC特异性TF的可诱导慢病毒载体的不同池转导经纯化MEF。在Dox存在下培养MEF以诱导TF的表达，并从第1天到第15天监测tdTomato表达。Clec9a启动子的激活诱导Cre重组酶的表达，其介导终止密码子的切除以及随后tdTomato的表达。
图9.候选DC诱导型TF的组合诱导Clec9a-tdTomato报道分子的激活。(A)在添加Dox后5天时，用M2rtTA(作为对照)、所有18种候选TF和3-4种TF的池转导MEF，并通过荧光显微术和流式细胞术分析。(B)用M2rtTA、所有18种TF或较小池转导后，在第8天对tdT+细胞的定量。平均值±SD，n＝2。(C)在第8天从4种TF的池移除个别TF或其个别表达后，tdT+细胞的定量。平均值±SD，n＝2。
图10.最小转录因子网络在小鼠成纤维细胞中激活Clec9a报道分子并诱导DC形态。(A)在添加Dox后5天时，用M2rtTA(作为对照)或PU.1、IRF8和BATF3(PIB-3种TF的混合物)转导MEF，并通过荧光显微术和流式细胞术分析。(B)通过流式细胞术分析的Clec9a-tdTomato报道分子激活的动力学。(C)在添加Dox后第5天时，在从PIB的池移除个别TF或其个别表达后，tdTomato+细胞的定量。(D)流式细胞术直方图，显示PIB转导细胞(在tdTomato+或总群体中选通)和M2rtTA转导细胞中的大小(FSC)和复杂性(SSC)。(E)在添加Dox后第5天时，tdTomato+细胞的形态。(F)在添加Dox后第8天时，F-肌动蛋白的免疫荧光。
图11.从第0天到第7天通过延时显微术分析的Clec9a报道分子激活的动力学。比例尺条代表200μm。
图12.最小转录因子网络诱导全造血标志CD45的表达。在第8天对CD45和tdTomato在PIB转导MEF中的表达的流式细胞术分析。
图13.TCF4增加Clec9a报道分子激活的效率。(A)用PU.1、IRF8和BATF3、PIB(黑色条形)或与来自18种候选物的个别TF组合的PIB(灰色条形)转导MEF。在第8天对tdTomato+细胞进行定量。包括M2rtTA转导作为对照。平均值±SD，n＝2-6。(B)用PIB(黑色条形)或与个别造血TF组合的PIB(灰色条形)转导MEF。在第8天对tdTomato+细胞进行定量。平均值±SD，n＝2-6。
图14.诱导Clec9a报道分子激活的最佳培养条件。(A)在添加Dox后第10天经PIB(PU.1、IRF8和BATF3)转导并在不同条件下培养的MEF中的tdTomato+细胞的定量。(B)在添加Dox后第10天经PIB(黑色条形)转导并与OP9和OP9-DL1细胞共培养的MEF中的tdTomato+细胞的绝对数目。包括OP9和OP9-DL1培养物作为对照。
图15.在单细胞水平下PU.1、IRF8、BATF3和TCF4的表达谱。PU.1、IRF8、BATF3和TCF4在单一单核细胞-树突状细胞前体(MDP)和受限DC前体细胞(CDP和前DC)中的基因表达(GSE60783)。基因表达水平是以每百万映射读取数中每千碱基外显子模型的读取数(RPKM)值来显示。
图16.对小鼠细胞/组织中PU.1、IRF8、BATF3因子表达的分析。(A)在96种组织和细胞类型中Pu.1+Ir8+Batf3的组合基因表达水平。来自不同小鼠组织和细胞类型的基因表达数据是从GeneAtlas MOE430数据库获得。书写“GPSforGenes”程序并用于将组织分类，其中TF组合最富集(最佳拟合＝1)。(B)Pu.1、Irf8和Batf3在DC前体(CDP、前DC1和前DC2)和成熟细胞(cDC1和cDC2)中的基因表达(GSE60782)。基因表达水平是以相对基因表达来显示。(C)热图，显示与其他DC子集和可在免疫基因组计划(www.immgen.org)中获得的若干种造血细胞谱系相比，Clec9a、PU.1、IRF8和BATF3在属于cDC1子集的CD103+DC(以红色突出显示)中的表达增加。基因表达数据是通过Cluster 3.0分析并通过Treeview显示。红色指示增加的表达，而蓝色指示相对于平均值减少的表达。
图17.经诱导DC表达在细胞表面处的cDC1标志。(A)在添加Dox后8天时，经PIB转导的MEF的表面表型的流式细胞术分析。对CD103、CD8a、CD4、C11b和B220在tdT+和tdT-群体中的表达的定量。(B)代表性流式细胞术曲线。
图18.经诱导DC表达在细胞表面处的抗原呈递机构。(A)在添加Dox后7天时，对MHC-II在经M2rtTA(作为对照)和PIB(PU.1、IRF8和BATF3)转导的MEF中的表达的流式细胞术分析。显示TdTomato+和tdTomato-群体。(B)在M2rtTA和PIB转导细胞中的MHC-II表面表达的动力学。在添加Dox后第1天到第15天通过流式细胞术分析MEF。(C)在添加Dox后第5天时，在从PIB的池移除个别TF后，在大型培养中以高和低水平表达MHC-II的细胞的百分比的定量。(D)在第5天，在tdTomato+群体内，在用4TF转导后或在其个别移除时，MHC-II+细胞的定量。
图19.经诱导DC表达在细胞表面处的MHC-I。在添加Dox后第7天，对MHC-I在经M2rtTA和PIB转导的MEF中的表达的流式细胞术分析。
图20.经诱导DC表达在细胞表面处的共刺激分子。在添加Dox后5天时，在PIB(PU.1、IRF8和BATF3)转导MEF中，对tdTomato+群体的在细胞表面处的共刺激分子(CD80和CD86)的流式细胞术分析。显示MHC-II+和MHC-II-群体。
图21.在LPS刺激时经诱导DC上调CD40表达。(A)在第8天，在PIB转导MEF中，对CD40在tdTomato-和tdTomato+群体中的表达的流式细胞术分析。(B)直方图显示在第13天，在过夜LPS刺激或没有过夜LPS刺激的情况下，CD40的表达。
图22.PIB因子诱导成纤维细胞中的全面树突状细胞基因表达程序。(A)Clec9a报道分子MEF经Pu.1(P)、Irf8(I)和Batf3(B)转导以生成iDC。经转导细胞通过FACS进行分选，并在第3天(d3，20个Clec9a-tdTomato+细胞)、第7天(d7，40个Clec9a-tdTomato+细胞)和第9天(d9，36个Clec9a-tdTomato+MHC-II+细胞)，使用全转录物单细胞RNA-seq使用FluidigmC1系统取样。使用从C57B1/6动物分离的第0天的未转导MEF(30个细胞)和脾DC(sDC，66个CD11c+MHC-II+CD8a+细胞)作为对照。(B)对全基因组转录组的t-分布随机线性嵌入(tSNE)分析，显示163个单细胞的簇。每个点代表个别细胞。每一样品组的细胞数绘示于括号内。(C)通过SC3聚类算法获得的共有矩阵的全连锁层次聚类。(D)热图，显示6525个最可变基因在5个不同的生物样品组(柱、MEF、d3、d7、d9和sDC)中的表达。显示基因的4个簇：簇I(3014个基因)、II(530个基因)、III(347个基因)和IV(2634个基因)。颜色方案是基于z得分分布，从-2(蓝色)到2(红色)。显示来自每一簇的基因的示例(右图)。(E)成纤维细胞基因的表达水平显示为普查计数中位值±95％置信区间。(F)簇II(Eea1、Aldh1a2、Ifit3)、簇III(H2-Pb、Ctsc、Cd74)和簇IV(Clec9a、Cd45、Cd11c、Tlr3、Ccr2、Nlrc5)中基因的表达水平，呈现为小提琴曲线(高度，基因表达；宽度，表达基因的细胞的丰度)。显示普查计数的对数值，水平线对应于中位值。
图23.PIB因子诱导DC转录调节因子的表达，包括内源性Pu.1、Irf8和Batf3。(A)小提琴曲线，显示DC转录调节因子Zbtb46、Bcl11a、Stat2、Irf7、Stat6和Stat1的表达水平。(B)Pu.l、Irf8和Batf3基因的表达水平显示为对数计数，呈现为箱形图，其中须线延伸至±1.5×四分位范围。显示总转录物(左图)和内源性转录物(右图)水平。
图24.在iDC重编程期间的逐步过渡的路径富集。(A)对于逐步iDC重编程的基因集富集分析(GSEA)是使用来自NetPath注释的信号传导路径的经注释基因集来进行。第3天是指在第3天相对于MEF上调的路径，第7天是指在第7天相对于第3天上调的路径，并且第9天是指在第9天相对于第7天上调的路径。将数据集根据标准化富集得分(NES)排序，并且显示假发现率(FDR)q值。底部图显示IL-4(第3天)和制瘤素M(第9天)基因集的富集曲线。
图25.在iDC重编程期间逐步过渡的转录网络。(A)在iDC重编程期间关于每一逐步过渡的转录因子协方差网络。显示具有多于5个边缘的转录调节因子，每一边缘反映所连接转录调节因子之间的关联度>0.35。转录因子PU.1、IRF8和BATF3是以红色突出显示。(B)热图，显示图A中所示转录调节因子在来自骨髓的DC前体(CDP和前DC1)和成熟细胞(cDC1)中的表达(GSE60782)。基因表达数据是通过Cluster 3.0分析并通过Treeview显示。红色指示增加的表达，而蓝色指示相对于平均值减少的表达。(C)在添加Dox后第3天、第5天、第7天、第10天和第25天测定PIB转导的MEF的造血集落形成(平均值±SD，n＝2)。包括经分选sDC1和未分选脾细胞以及骨髓细胞作为对照。
图26.PIB因子诱导朝向cDC1表达程序的转录重编程。cDC1和cDC2基因表达标记是通过分析来自Schlitzer等(11)的数据集来生成(GSE60783)。在重编程期间cDC1和cDC2基因标记的累积中值表达水平。
图27.单细胞重编程轨迹的重构。(A)用TSCAN软件(伪时间)对单细胞的全基因组转录组进行排序。显示未转导MEF、第3天(d3)、第7天(d7)的经诱导DC(iDC)Clec9a-tdTomato+、第9天(d9)的Clec9a-tdTomato+MHC-II+和脾DC(sDC，CD11c+MHC-II+CD8a+)的排序。每个点代表个别细胞。(B)根据预测轨迹，二维独立分量空间中的细胞表达谱。实心黑线显示通过Monocle2构建的伪时间排序。每一点代表个别细胞，根据生物样品组(左图)或细胞状态(右图)着色。每一样品组中分配到每一细胞状态的细胞数绘示于括号内。
图28.单细胞重编程轨迹的重构突出显示iDC的不同成熟状态。(A)通过BEAM鉴别的分支依赖性基因的5个动力学聚类。(B)细胞状态2与细胞状态3之间的基因集富集分析(GSEA)是使用存于免疫标记集合(4，872个基因集，FDR＜0.02或每个基因集最多200个基因)中的基因集来进行。根据标准化富集得分(NES)对基因集进行排序，并且显示假发现率(FDR)q值。黑线代表DC基因集。右图显示成熟刺激性DC、IFNγ刺激的DC和IFNα刺激的DC基因集(都富集于状态3中)的富集曲线。
图29.PIB因子诱导与DC成熟相关的基因的高表达水平。(A)第9天iDC和sDC1的GSEA，显示2个MSigDB基因集的富集(左侧)。小提琴曲线(右侧)显示第9天富集基因的表达分布。
图30.PIB因子诱导与DC成熟相关的基因的高表达水平。(A)Ciita、H2-Aa、H2-Ab1和H2-Eb1基因在来自以Monocle2(伪时间)排序的状态1、2和3的单细胞中的表达水平。每一点代表个别细胞的相对表达值。线条代表状态2(实线)和状态3(虚线)的分支动力学曲线。(B)小提琴曲线，显示Ciita、Acp5、Tnfrsf1a、Tapbp、Inpp5d、Traf6和Itga4基因的表达水平。显示普查计数的对数值，水平线对应于中位值。
图31.经诱导DC在TLR刺激时分泌炎症性细胞因子。(A)在TLR4(LPS)或TLR3(聚I：C)过夜刺激或没有所述刺激的情况下，经PIB(PU.1、IRF8和BATF3)或PIBT(PU.1、IRF8、BATF3和TCF4)转导的MEF的细胞因子分泌。在添加Dox后第10天收集经PIB或PIBT因子转导的MEF的上清液，并分析细胞因子浓度使用BD细胞计数珠粒阵列小鼠炎症试剂盒。显示未经处理的、100ng/mL LPS或25μg/mL聚I：C处理过夜的细胞的细胞因子水平；黑色或灰色条形分别代表PIB或PIBT转导的MEF。
图32.经诱导DC能吞噬小颗粒。将经PIB(PU.1、IRF8和BATF3)转导的MEF与FITC标记的胶乳珠粒(1μm)一起孵育过夜，并在添加Dox后第7天通过荧光显微术分析。
图33.经诱导DC能吞噬蛋白质和死细胞。(A)对PIB转导的MEF进行FACS分选，并在第11天将tdTomato-和tdTomato+(iDC)群体与AlexaFluor647标记的卵白蛋白(OVA-Alexa647)在37℃下一起孵育，并通过流式细胞术分析。将对照保持在冰上(4℃)。(B)将第11天的经分选tdTomato-和tdTomato+(iDC)群体与经CellVue Claret Far Red膜染色标记的死细胞一起孵育过夜，并通过流式细胞术来分析。(C、D)将第11天的iDC与经DAPI标记的死细胞一起孵育过夜，并通过荧光或(D)延时显微术来分析。
图34.经诱导DC表达TLR信号传导和胞吞路径中涉及的基因。调节(A)TLR信号传导和(B)抗原纳入的基因的小提琴曲线。
图35.经诱导DC捕获抗原并将其呈递至CD4+T细胞。(A)抗原呈递测定的示意性表示。将在添加Dox后第8天的iDC与从OT-II Rag2KO小鼠分离并经CFSE标记的OT-II CD4+T细胞在卵白蛋白(OVA)或OVA肽323-339存在下共培养。在7天后，通过CFSE稀释和T细胞激活标志CD44的表达来评估CD4+T细胞的激活。(B)CFSE标记的CD4+T细胞的流式细胞术曲线，所述CD4+T细胞与经PIB或PIB加TCF4转导的MEF在OVA存在下共培养，经或未经LPS刺激。包括与脾MHC-II+CDl1c+DC共培养的CD4+T细胞作为对照。灰色线对应于未接触的CD4+T细胞。(C)流式细胞术曲线，显示CFSE标记的CD4+T细胞的CD44表达，所述CD4+T细胞与经PIB转导的MEF在LPS和OVA或OVA肽存在下共培养。
图36.经诱导DC捕获抗原并将其呈递至CD4+T细胞。CFSE低CD4+T细胞的百分比的定量，所述T细胞与经PIB(iDC)转导的MEF在LPS和OVA或OVA肽存在下共培养。包括脾DC作为对照。
图37.经诱导DC有效排出胞吞负荷到细胞质中并表达交叉呈递基因。(A)用β-内酰胺酶的FRET敏感性细胞溶质底物CCF4加载第16天的iDC，之后与β-内酰胺酶一起孵育。通过流式细胞术根据CCF4裂解测量β-内酰胺酶排出到细胞溶质的动力学。(B)调节交叉呈递的基因的小提琴曲线。
图38经诱导DC捕获外源性抗原并将其交叉呈递到CD8+T细胞。(A)将第16天的iDC与B3Z T细胞杂交瘤一起共孵育16h，并且在LPS或聚I：C(PIC)刺激不存在(左图)或存在(右图)下增加可溶OVA蛋白质的浓度。根据B3Z中β-半乳糖苷酶表达的上调(由IL-2启动子驱动)测量T细胞激活，并使用比色法底物CPRG进行定量。(B)交叉呈递测定的示意性表示(左图)。将在添加Dox后第8天的iDC与从OT-I Rag2KO小鼠分离并经CFSE标记的OT-I CD8+T细胞在卵白蛋白(OVA)或OVA 257-264肽存在下共培养。在4天后，通过CFSE稀释和T细胞激活标志CD44的表达来评估CD4+T细胞的激活。流式细胞术曲线，显示CFSE标记的CD8+T细胞的CD44表达，所述CD8+T细胞与经PIB或PIB加TCF4转导的MEF在OVA存在下共培养。包括与脾MHC-II+CD11c+DC共培养的CD8+T细胞作为对照(中间图)，以及相应定量(右图)。
图39.PU.1、IRF8和BATF3诱导人成纤维细胞中的DC样形态。(A)将人真皮成纤维细胞(HDF)用PIB(PU.1、IRF8、BATF3)转导并在Dox存在下培养。(B)在添加Dox后第3天经PIB转导的HDF的明视野图像。白色箭头表示具有典型DC样形态的细胞。显示M2rtTA转导的HDF作为对照。(C)具有DC样形态的PIB转导的HDF的较高放大倍数的明视野图像。
图40.PU.1、IRF8和BATF3诱导HLA-DR和CLEC9A在人成纤维细胞中的表达。在添加Dox后第9天对HLA-DR和CLEC9A在PIB转导的人成纤维细胞中的表达的流式细胞术分析。
图41.PU.1、IRF8和BATF3诱导捕获人成纤维细胞中的珠粒和蛋白质的能力。(A)将经PIB转导的HDF与FITC标记的胶乳珠粒(1μm)一起孵育过夜，并在添加Dox后第7天通过荧光显微术分析。分别使用CellVue Claret Far Red和DAPI对细胞膜和细胞核进行染色。(B)在添加Dox后第7天，在37℃下与卵白蛋白-AlexaFluor647一起孵育20分钟后，对PIB转导的HDF的流式细胞术分析。将对照保持在冰上(4℃)。
图42.PIB因子诱导Clec9a和MHC-II在肺癌细胞中的表达。在添加Dox后第8天对Clec9a和MHC-II在PIB转导的3LL细胞中的表达的流式细胞术分析。包括M2rtTA转导的细胞作为对照。
图43.PIB因子诱导CLec9a和MHC-II在黑色素瘤细胞中的表达。在添加Dox后第8天对Clec9a和MHC-II在PIB转导的B16细胞中的表达的流式细胞术分析。包括M2rtTA转导的细胞作为对照。
图44.在多顺反子载体中递送PIB因子提高重编程效率。(A)编码由2A样序列间隔的PU.1、IRF8和BATF3(PIB)或Irf8、Pu.1和Batf3(IPB)的多顺反子区域的示意性表示。(B)在添加Dox后第7天对个别载体(右上图)或多顺反子载体(PIB和IPB)中经PU.1、IRF8和BATF3转导的MEF中的Clec9a报道分子激活的流式细胞术分析。包括M2rtTA转导的细胞作为对照。(C)在第7天，在个别或多顺反子载体中，在用PIB因子转导后，对tdTomato+细胞的定量。
具体实施方式
本公开涉及用于细胞诱导或将细胞重编程为树突状细胞状态或抗原呈递细胞状态的组合物、核酸构建体、其方法和试剂盒，其部分基于本文所述转录因子的新颖使用和组合的令人惊讶的效应，所述效应允许将已分化或未分化细胞诱导或重编程为树突状细胞或抗原呈递细胞。所述组合物、核酸构建体、方法和试剂盒可用于在体外、离体或在体内诱导树突状细胞，并且这些经诱导树突状细胞或抗原呈递细胞可用于免疫疗法应用。
天然DC是在所有组织中接种的骨髓衍生的细胞。DC已准备好对环境取样并将收集的信息发送到适应性免疫系统的细胞(T细胞和B细胞)。在抗原吞噬后，DC通过将呈肽-主要组织相容性复合物(MHC)分子复合物形式的经加工抗原呈递到淋巴组织中的初始(也就是，未经历过抗原的)T细胞来起始免疫反应。在激活后，除了分泌各种负责起始和/或增强多种T和B淋巴细胞反应的细胞因子(即，I型干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ、IL-12和IL-6)以外，DC通常过表达共刺激和MHC分子。因此，DC通常通过以下因素来鉴别：其主要组织相容性复合物II类分子(MHC-II)、共刺激分子(例如CD80/86和CD40)和整联蛋白CD11c的高表达，以及其分泌炎症性细胞因子和从非淋巴器官移行到淋巴性器官并刺激初始T细胞的优良能力。在小鼠和人中，不同DC子集可以通过表型、个体发育和功能可变地定义。其包括在小鼠淋巴性器官中发现的常规DC子集1(cDC1，还称为CD8α+DC子集)，以及非淋巴组织中的相关CD103+DC子集。最近已描述在人、人源化小鼠和绵羊中具有相似表型的细胞，指示cDC1家族的跨物种保守性。这个扩展家族具有独特的功能性质，最值得注意的是从死细胞或濒死细胞捕获材料以及加工用于在I类MHC上交叉呈递的外源性抗原的显著效率。这两个特征允许cDC1 DC交叉呈递细胞相关抗原并触发针对传染原或肿瘤的CTL反应。除了启动CD8+T细胞以外，cDC1+DC还参与建立对组织特异性细胞相关抗原的交叉耐受性。cDC1 DC针对细胞相关抗原交叉启动或交叉耐受化CD8+T细胞的能力暗示，其可解码其中其遇到死细胞的背景。DNGR-1也称为CLEC9A，是坏死细胞的受体，其有利于在小鼠中CTL针对死细胞相关抗原的交叉启动。DNGR-1是由小鼠cDC1 DC、CD103+DC和其人等同物以高水平选择性表达，负责识别在细胞死亡后暴露的细胞内配体。最近，显示Clec9a的表达允许鉴别定型到常规DC谱系的DC前体(CDP)和其在淋巴组织中的后代(10)。
如本文所述，对能将已分化细胞重编程为经诱导DC的DC诱导因子的成功鉴别可以多种方式增进我们对DC生物学的基础理解。这个工作将提供对DC最小转录网络的充分理解。另外，对DC诱导因子的鉴别为理解如何建立DC状态以及如何将关键调节性机构发挥功能提供前所未有的机会。
转录因子在发育期间所有细胞类型的特化中具有关键作用。使用转录因子介导的重编程的直接重编程策略的成功表明，使用所述因子引导多潜能ES/iPS细胞或专能干细胞分化为具体命运似乎同样是可能的。因此，可实现通过富含DC的转录因子的表达，使用本文所鉴别的DC诱导因子来引导ES/iPS细胞分化为定型DC命运。另外，可实现通过富含DC的转录因子的表达，使用本文所鉴别的DC诱导因子来引导专能造血干细胞和祖细胞分化为定型DC命运(强制沿图1中描绘的造血树来分化)。
通常，使用病毒载体或在不适用病毒载体的情况下，通过一次或重复转染，将编码DC诱导因子的核酸(例如DNA或RNA)或其构建体引入细胞中，并且基因产物的表达和/或RNA分子的翻译得到在形态上、生物化学上和功能上与DC相似的细胞，如本文所述。这些经诱导DC(iDC)在经足够抗原启动后具有捕获、加工所述抗原和将所述抗原呈递到免疫系统的效应子细胞(巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞)，引发针对癌症、病毒和寄生虫/细菌感染的抗原特异性免疫反应的能力(图2)。
本公开的一方面是TF的用途或TF组合在癌细胞(原位或离体)中的用途，用于迫使癌细胞将其自身抗原呈递到免疫细胞(图3)。这种方法代表增加抗癌免疫疗法的临床结果的可行策略，因为其绕过癌症逃避机制并提高肿瘤免疫原性。
在实施方案中，选择18种候选TF是因为其在DC中特异性富集的基因表达(图4A)，与巨噬细胞(其为较不有效的APC)相比(图4B，左图)(20)并且在DC个体发育期间(图4B，右图)，其在DC中富集。对18种TF的基因本体论(GO)富集分析突出显示其对白细胞和DC分化(分别地，p＝2.51E-12和p＝9.58E-12)和激活(p＝1.02E-11和p＝6.31E-11)的基础作用，同时小鼠突变体表型富集分析确认，那些基因中的遗传扰动主要引起造血表型，特别是异常适应性免疫(p＝1.19E-04)和异常抗原呈递(p＝1.25E-03)(图4C)。在重编程证实的多西环素(Dox)-可诱导慢病毒载体中克隆18种候选TF(6)。
在实施方案中，对于通过细胞重编程筛选新树突状细胞诱导TF和DC诱导TF组合的效应，其以具有DC特异性报道分子(Clec9a-Cre X R26-终止-tdTomato)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)开始，并使用报道分子的激活来显示DC诱导TF。在Clec9a-tomato报道分子小鼠中，tdTomato荧光蛋白质仅由CDP、前DC和cDC中表达(10)。培养中的巨噬细胞、其他免疫谱系或单核细胞衍生的DC不表达Clec9a和因此tdTomato蛋白质(图5A)。在免疫系统内，Clec9a基因表达选择性限制于CDP和其后代(前cDC和cDC)(图5B)。cDC和前体的基因表达分析的结果也强调，在CDP和前DC中定型到cDC谱系之后以及并非在单核细胞DC祖细胞(MDP)中之前，获得Clec9a表达(图5C)(11)。Clec9a是在CDP、前DC和cDC子集二者中表达，在cDC1子集中达到高水平(图6A)(21)。分析从Clec9a报道分子小鼠分离的脾细胞，确认98.8％的cDC1细胞(在MHC-II+CD11c+CD8a+中选通)表达tdTomato荧光蛋白质(图6B)。
双转基因Clec9a-tdTomato报道分子MEF是从E13.5胚胎分离，并且通过荧光激活细胞分选(FACS)从可已定型到造血谱系的任何污染性tdTomato+或CD45+细胞排除(图7A和7B)。用于筛选和以下实验中的MEF是具有99.8％纯度的tdTomato-CD45-(图7C)。
在实施方案中，PU.1、IRF8和BATF3足以用于Clec9a激活和强加树突状细胞形态。
在实施方案中，Clec9a报道分子MEF经候选TF的组合转导，并针对tdTomato表达加以评估(图8)。在经18种候选TF或4种TF的池之一转导后，在添加Dox后5天观察tdTomato+细胞的出现(图9A、图9B)。包括Pu.1、Irf4、Irf8和Batf3的池生成比18种TF更多的tdTomato+细胞(分别为2.36％与0.59％)，表明这个池内含有诱导报道分子激活所需的因子的最小组合。在用对照M2rtTA载体转导后未检测到TdTomato+细胞。然后个别移除每一因子(图9C)。PU.1、IRF8和BATF3(PIB)移除降低报道分子激活，而Irf4的移除无影响。这些结果表明，PIB为DC重编程所必需。
在实施方案中，在PU.1、IRF8或BATF3(PIB)的组合于MEF中表达时，Clec9-报道分子以增加的效率被激活(约3.96％，图10A)。在实施方案中，随后评估报道分子激活的动力学(图10B)。在第1天与第2天期间开始检测到TdTomato+细胞，并且在第5天与第7天之间达到峰值(图10B)。在实施方案中，PU.1、IRF8或BATF3的移除完全消除报道分子激活，而其个别表达不足以生成tdTomato+细胞(图10C)。这些数据表明，在这个实施方案中，PIB构成用于Clec9a激活和经诱导树突状细胞(iDC)生成的TF的最小组合。重要的是，tdTomato+细胞显示增加的大小和复杂性(图10D)，这与所观察到的星状形态以及DC的树突特征的建立一致(图10E、图10F)。已通过延时显微术确认报道分子激活进行约30小时，并且观察到tdTomato+细胞展现形态变化、移行能力和在6天内逐渐建立的树突(图11)。全造血标志CD45在约20％的PIB转导的MEF中表达，并且约6.6％的tdT+细胞包括于这个群体中(图12)。
在实施方案中，评估表达其他因子对PIB的影响。评价来自18种TF的候选池的每一TF(图13A)以及其他造血TF(图13B)的个别影响。从所测试的31种TF观察到，STAT3、IKZFl、IRF2、NFIL3、BCL6、L-MYC、RUNX1和KLF4对所生成的tdTomato+细胞数具有负面影响。添加TCF4和Gfi1b分别显示2.2倍和1.9倍的报道分子激活增加。
在优化用于iDC生成的培养条件的尝试中，测试在诱导期间添加细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt31)(图14A)，这是因为其在DC特化期间具有重要作用(12)。还测试添加脂多糖(LPS)、不同培养基组合物(RPMI、2-巯基乙醇(2-ME)和4mM L-谷氨酰胺(2xGlut))以及与基质细胞OP-9和OP9-DL1共培养(图14B)(13)。这些培养改良不增加经诱导tdTomato+细胞的数目。
在实施方案中，分析PIB和TCF4的体内表达模式。PU.l、IRF8、BATF3和TCF4转录物在单一DC前体细胞中表达(图15)。Pu.1在MDP、CDP和前DC中同等表达，而IRF8表达在CDP中显著增加并在前DC中维持。BATF3和TCF4只在前DC中在后期上调。此外，在96种细胞和组织中，PU.1+IRF8+BATF3的组合表达主要在CD8a+DC中富集(图16A)。重要的是，Pu.1水平在两个前DC阶段中较高，而Irf8和Batf3在前cDC1和cDC1子集中特异性富集(图16B)。在与其他DC子集和若干种造血细胞谱系相比时，Clec9a、PU.1、IRF8和BATF3在属于cDC1子集的CD103+DC中显示增加的表达(图16C)。
在实施方案中，评估C9a-tdTomato报道分子的激活是否反映于DC标志的表达中，例如用于区分常规cDC与pDC子集的典型表面标志(图17A、图17B)。有趣的是，与在tdTomato-细胞中不可检测的水平相比，cDC1标志CD103在25±13.65％的tdTomato+细胞中表达，表明非淋巴性移行性cDC1程序的特化。此外，可仅检测cDC2和pDC标志的残留表达(分别为0.41±0.58％CD4+，2.56±0.18％CD11b+，0.77+1.09％B220+细胞)。
在实施方案中，评估Clec9a-tdTomato报道分子的激活是否反映在细胞表面处的抗原呈递机构的关键组分的表达中。值得注意的是，观察到71.4％的tdTomato+细胞在第7天在表面表达MHC-II(图18A)，其为建立APC功能性的关键分子。MHC-II的表达是逐渐获得的，在第1天与第2天之间开始，并在第7天与第11天之间达到峰值(图18B)。MHC-II激活的动力学与Clec9a报道分子的激活相似(图10B)。在第7天，tdTomato-隔室含有较低百分比的MHC-II+细胞(14.2％)(图18A)。随后解决MHC-II的表达是否由PIB因子直接控制。通过个别排除每一因子观察到，PU.1表达而非IRF8或BATF3表达对MHC-II激活是重要的(图18C)，这与所述的Pu.1在调节II类反式激活因子(CIITA)中通过其启动子I(CIITApI)实现的作用一致(14、15)。已知CIITA作为II类MHC基因表达的主调节因子，通过CIITA启动子的差异性使用，确定MHC-II表达的细胞类型特异性、细胞因子诱导以及发育衍生的调节(16)。在常规DC中，CIITApI与对MHC-II基因的调节有关。
在实施方案中，由于所述IRF4通过与CIITA相互作用参与诱导MHC-II表达(17)，评估在tdTomato+群体内的MHC-II+细胞生成中，IRF4是否可补偿Pu.1。由此评价MHC-II在由4种TF(包括IRF4)生成的tdTomato+细胞中的表达或其个别排除(图18D)。池中包括IRF4未增加tdTomato+细胞上的MHC-II表达，并且IRF4无法取代Pu.1的损失。因此，发现IRF4和PU.1可在B细胞而非DC中通过CIITA启动子III协同促进MHC-II表达(17)。在重编程为iDC期间，未观察到与PU.1的协同作用，这是tdTomato+细胞中的MHC-II表达严格要求的。
在实施方案中，评估I类MHC分子的表达，其为建立APC功能性的关键分子。56.7％的tdTomato+细胞在第7天在表面处表达MHC-I(图19)。在第7天，tdT-隔室含有较低百分比的MHC-I+细胞(11.2％)(图19)。
在实施方案中，评估有效抗原呈递所需的共刺激分子CD80和CD86的表达(图20)。CD80和CD86在35.2％的tdTomato+MHC-II+细胞中表达，相比之下，仅在12.9％的tdTomato+MHC-II-细胞中表达。MHC-II、CD80和CD86在iDC细胞表面处的表达的此表征表明，tdTomato+MHC-II+细胞的群组可在抗原呈递中为感受态。另一共刺激分子CD40在16.1％的tdTomato+细胞中表达，相比之下，仅在2.8％的tdTomato-细胞中表达(图21A)。已描述休眠cDC、特别是cDC1子集响应微生物刺激，上调共刺激分子的表达并变为更有效的APC(25)。因此，tdTomato+细胞在Toll样受体TLR4刺激(LPS)后上调细胞表面处的CD40的表达(4倍增加)(图21B)。
在实施方案中，为了确定在iDC重编程期间转录变化的程度，在经PIB转导后测量全长单细胞转录组(图22A)。首先剖析来自未转导MEF的192个细胞，分选第3天Clec9a-tdTomato+、第7天Clec9a-tdTomato+、第9天Clec9-tdTomato+MHC-II+细胞和刚分离的CD11c+MHC-II+CD8a+脾DC(sDC)。根据这些，163个个别细胞通过质量控制过滤并用于分析。在比对个别基因座处的读取后，使用普查算法将相对RNAseq表达水平(每百万转录物，TPM)转化为相对转录物计数(普查计数)，无需实验加入对照和改良差异性表达分析的准确性。首先采用t-分布随机线性嵌入(tSNE)算法进行全基因组转录组的聚类分析(图22B)，并观察两个主要细胞聚类。第3天的iDC和大多数第7天细胞靠近MEF定位，而其余第7天和所有第9天iDC与sDC聚类在一起。使用单细胞共有聚类(SC3)进行无监督聚类，确认sDC与第9天组和一些第7天iDC的全面相似性(图22C)。此外，全面转录组重编程的定时与Clec9a-tdTomato+MHC-II+细胞在第7天和第15天的峰生成密切相关(图18B)。TdTomato+细胞显示早在第3天开始的时间依赖性转录变化；截至第9天iDC与真正DC显著类似。此分析表明，PIB因子诱导朝向DC命运的全面转录重编程。自数据集中提取出6525个最可变的基因，其在聚类后可分为4组(图22D)。簇I包括MEF中的高表达基因，其在DC重编程期间沉默。这些包括典型成纤维细胞标志，例如Col5a2、Grem1、Lox、Acta2和Thy1(图22E)。簇II包括在第3天和第7天富集的转录物，表明在重编程初始阶段期间激活。该簇包括与细胞内运输和代谢以及I型干扰素(IFN)信号传导(Ifit3)相关的基因，例如Eea1和Aldh1a2(图22F)。相比之下，簇III涵盖在第9天富集的基因(图22D)。有趣的是，MHC-II相关基因(例如H2-Pb)以及调节DC中的交叉呈递的基因(例如组织蛋白酶Ctsc和Cd74)在该簇中富集(图22F)。最后，簇IV包括在sDC1和重编程iDC中富集的基因(图22D)，例如全造血标志Cd45和通用DC标志Cd11c(图22F)。重要的是，cDC1限制的基因也有所上调，例如Clec9a基因和Tlr3(22)，以及抗原交叉呈递所需的I类MHC依赖性免疫反应的关键调节因子(Nlrc5)，其为cDC1的关键特征(23)。实际上，已检测到在与cDC2-标记基因相比时，在重编程过程期间cDC1-标记基因的稳健增加(图26)(11)。总之，这些数据表明完全DC重编程有利于cDC1子集。因此，GO分析显示，类别与抗原加工和呈递相关(p值＝3.34E-08、1.80E-06、3.53E-06、4.03E-06)，其中富集排名靠前的生物学过程和路径(表1)。排名靠前的细胞组分GO类别包括溶酶体(p值＝1.31E-07)和溶解性液泡(p值＝1.44E-07)，与溶酶体信号传导在配位抗原加工和DC移行中的所述作用一致(24)。微RNA(miRNA)靶预测分别显示已参与DC功能和特化的miR-155(p值＝1.41E-11)和miR-124(p值＝1.00E-10)靶的最高富集(表2)(25、26)。
表1.在簇I至IV中富集的前5个基因本体论生物学过程(左栏)和细胞组分(右栏)。
表2.对4个基因聚类进行基因本体论小鼠功能丧失型突变体表型(顶部组)、KEGG路径(中间组)和微RNA靶相互作用(底部组)富集分析，所述4个基因簇是使用5个样品组中6，525个最可变的基因来鉴别(相对于图22)。列表显示最富集项，并且右栏依照与最富集项相关的倍数变化显示相应p值。
该分析还揭示DC转录调节因子的激活，包括Zbtb46和Bcl11a，其最初包括于我们的候选TF列表中(图23A)。还鉴别干扰素-调节因子IFN和信号转导蛋白和转录激活因子(STAT)蛋白质家族的若干成员。例如，Stat2和Irf7分别是TLR-经诱导DC激活和I型IFN反应的关键介质，在第3天和第7提案以高水平检测到。Stat6也显示第3天和第7天的高中位表达值，而Stat1表达在第9天增加到比脾DC高128倍的水平。已报道DC成熟伴随从STAT6到STATl利用的变化，这表明PU.1、IRF8和BATF3过表达也可诱导DC成熟。在与sDC相比时，观察到PU.1、IRF8和BATF3在第3天、第7天和第9天的高水平表达，这与慢病毒介导的3种TF的表达一致(图23B，顶部图)。由于我们的慢病毒载体编码不含UTR的编码序列，使用在3′-和5′-UTR的读取对内源性转录物的表达水平进行定量。重要的是，观察到在第3天开始的内源性PU.1、IRF8和BATF3的表达(图23B，底部图)。在重编程的第9天，内源性表达水平与脾DC相当。
为了进一步表征转录重编程的动态性质，使用NetPath基因集进行基因集富集分析(GSEA)，以比较第0天、第3天、第7天和第9天之间的过渡(图24，顶部图)。观察到与MEF相比，若干个免疫相关基因集在第3天高度富集。有趣的是，用于DC的体外分化的IL-4被评为顶级(NES：1.97，FDRq值：0.02)(图24，底部左图)。一些基因集也在第7天富集，但NES值较小，表明在这个时期期间可发生微小过渡。相比之下，与第7天相比，若干个基因集在第9天高度富集，包括白介素路径和制瘤素M，先前与DC成熟相关(图24，底部右图)。
在实施方案中，评估在iDC重编程期间逐步过渡的转录网络(图25A)。观察到MEF过渡到第3天与致密TF网络的表达相关，所述TF网络与PIB重编程因子高度相关；第3天到第7天的过渡较软，特征为较不致密的TF网络，其不包括PIB因子；并且第7天到第9天的过渡的特征为致密TF网络，其可分为2个TF簇，一个较致密，包括cDC标志Zbtb46，并且另一个由较少TF组成，包括PIB因子。这支持了以下想法：在第3天与第7天之间可发生较微小的过渡，并且表明第9天iDC可已获得稳定细胞命运。重要的是，所有这些转录调节因子都富集于成熟DC中而不是DC祖细胞中，与激活日期无关，表明重编程过程不经过中间祖细胞状态(图25B)。此外，iDC重编程过程中不存在中间祖细胞通过在添加Dox后第3天、第5天、第7天、第10天和第25天用PIB转导的MEF进行造血集落形成测定来进一步验证，包括经分选sDC1和未经分选的脾细胞和骨髓细胞作为对照(图25C)。在iDC或sDC1培养中未观察到集落，而如所预期，培养中未经分选的脾细胞和骨髓细胞产生集落。这支持了以下想法：重编程过程是直接的并且不经中间祖细胞过渡。
在实施方案中，通过基于细胞转录组的逐渐过渡建立伪时间顺序开始重构DC重编程路径(图27A)。在单细胞RNA-seq分析(TSCAN)软件中使用伪时间重构，观察到顺序与时间重编程事件一致，其中MEF之后是第3天iDC，随后是大部分第7天iDC。有趣的是，4个个别的第7天iDC和一些第9天iDC定位与伪时间排序中的sDC一致，表明转录组重编程完成。然而，其余第9天iDC似乎比脾DC更远离初始时间点。为了确认这些结果的稳健性，使用Monocle2进行伪时间排序，其为描绘分化路径的替代性算法。该重构沿伪时间排序的3个分支定位生物样品组(图27B，左图)。MEF、d3iDC和26个第7天iDC沿第一分支放置，视为细胞状态1(图27B，右图)，其随后到达分支点并分为状态2和状态3。状态2包括82％的sDC以及3个第7天iDC和13个第9天iDC。然而，55％的第9天iDC以及11个sDC放置在状态3内，这与TSCAN结果一致。为了理解这2个状态之间的转录差异，使用差异性表达的基因进行GO富集分析(表3)，其显示，状态3中排名靠前的生物学过程和路径包括I型和II型(IFN-y)IFN信号传导，其为DC激活和成熟的已知炎症介质(38、39)。状态3富集基因的遗传扰动突出显示相应免疫表型，例如异常APC和异常免疫系统。一致地，BEAM分析揭示针对抗原呈递和其他免疫相关过程功能性富集的在状态3(簇2和4)中上调的分支依赖性基因的2个动力学簇(图28A和表4)。
表3.在状态2与状态3之间差异性表达的基因的前5个基因本体论生物学过程、小鼠表型和wiki路径富集分析。与图27相关。
表4.簇1至5中基因的前5个基因本体论生物学过程和小鼠功能丧失型突变体表型富集分析。与图28相关。
在实施方案中，GSEA还显示，在与状态2相比时，免疫标记的4705相对于167个基因集在状态3上调，例如成熟刺激性DC、IFNγ和IFNα刺激的DC基因集(图28B)。由于状态3含有大多数第9天iDC，寻求确认，在比较sDC1(初始)与第9天iDC时，观察到相似的成熟性状。GSEA显示，抗原加工和呈递以及DC成熟基因集在第9天iDC处富集(图29A)。有趣的是，与不成熟DC相关的Stat6在sDC1中上调，同时被描述为随着成熟而增加的Stat1在第9天iDC中上调(图23A)。
在实施方案中，鉴于先前观察到iDC表达高水平的据报道与DC成熟相关的MHC-II分子(图18)，寻求研究所观察到的伪时间轨迹是否指示不同的成熟状态。观察到，分支动力学曲线反映Ciita的连续上调，其为已知的MHC-II基因表达的主调节因子，以及若干个与状态2相比接近状态3的MHC-II基因(H2-Aa、H2-Ab1和H2-Eb1)(图30A)。一致地，Ciita和与小鼠(Tnfrs1a、Tapbp、Inpp5d和Traf6)和人(Acp5和Itag4)DC成熟相关的基因的表达在第9天iDC处富集(图30B)。这些数据表明，iDC在本质上比sDC更成熟，并且对于抗原呈递可较不依赖于外源性激活刺激。
在实施方案中，在公开内容的所有实施方案的一些方面中，虽然经诱导树突状细胞的功能性特征与天然存在的内源性树突状细胞相似，但其基因表达与天然存在的内源性树突状细胞不同(表5)。
表5.依照倍数变化排序，前500个在第9天iDC与sDC1细胞之间差异性表达的基因。
在实施方案中，除了膜相关共刺激分子以外，成熟DC表达具有促炎功能的细胞因子，其对于T细胞反应的发展很重要。这些反应可通过触发至少11种不同To11样受体(TLR)来起始，允许特异性识别不同的保守微生物或病毒结构。有人问在经TLR3(使用聚肌苷-聚胞苷酸(聚I：C))或TLR4(脂多糖(LPS))刺激激发时，iDC是否会将细胞因子分泌到培养基中(图31)。在iDC的LPS或聚I：C激发后，观察到IL-6的分泌增加(分别为14倍或10倍)。在LPS刺激或聚I：C后也分别观察到，肿瘤坏死因子TNF(7倍)和干扰素IFN-γ(2倍)的分泌增加。经PIB加TCF4(PIBT)转导的细胞等同地响应刺激，显示IL-6、TNF和IFN-γ的分泌增加。重要的是，在iDC的刺激后，未观察到抗炎性细胞因子IL-10的分泌增加。这些结果表明，iDC经历朝向促炎性特征的成熟。
在实施方案中，评估iDC作出抗原特异性免疫反应的能力。首先，通过与1μm FITC标记的胶乳珠粒一起孵育来评估iDC是否能吞噬颗粒。在孵育后，tdTomato+细胞在细胞质中含有多个荧光珠粒(图32)，表明iDC已建立对吞噬作用的感受态。
随后，评估iDC捕获可溶蛋白质的能力。显著地，在37℃下孵育20分钟后，13，8％的tdTomato+细胞能主动摄取可溶蛋白质，相比之下，在4℃下孵育时仅为5.6％(图33A)，进一步表明iDC已建立对吞噬作用/胞吞作用的感受态。相比之下，仅4.6％的tdTomato-细胞显示类似能力。之后，评估在体外iDC是否能内化死细胞材料(图33B-D)。已显示这种独特的能力与cDC1 DC亚型相关，以交叉呈递MHC-I上的细胞相关抗原(27)。在与经标记死细胞一起过夜孵育后，65.7％的经纯化tdTomato+细胞纳入死细胞材料，相比之下仅10.5％的tdTomato-纳入死细胞材料(图33B)。通过活体成像进一步分析死细胞的摄取，并且观察到，tdTomato+细胞在细胞质中积极地积累死细胞材料(图33C)。TdTomato+细胞主动移动并且在遇到死细胞后，伸出细胞突出部以纳入并吞噬所述死细胞(图33D)。
此外，已确认，iDC表达编码TLR(Tlr3和Tlr4)和其他TLR信号传导介质的基因，包括MyD88依赖性(TRAM(由Ticam2编码)和Traf6)和非依赖性(IKKε)路径(图34A)。同样，已确认，iDC表达受体介导的胞吞作用(Fcgr2b、Tfr2和Mrc1)和死细胞的巨胞饮(Axl、Lrp1和Scarf1)的关键介质，进一步表明iDC已获得感知并纳入抗原的能力(图34B)。
在实施方案中，评估iDC促进CD4T细胞的抗原特异性增殖的功能性能力(图35A)。为此，采用从OT-II Rag2KO小鼠的淋巴结和脾分离的II类MHC-限制的卵白蛋白特异性T细胞(OT-II细胞)(18)。在该模型中，当在DC的MHC-II背景中显示时，T细胞响应经加工抗原性肽(OVA 323-339)。因此，在给予卵白蛋白蛋白质(OVA)或预加工的抗原性肽(OVA 323-339)时，将OT-II CD4 T细胞与iDC共培养。在MHC-II背景中，功能性DC能捕获蛋白质，加工并呈递经加工抗原性肽。在共培养7天后，通过CFSE稀释和T细胞激活标志CD44的激活来测量经诱导CD4+T细胞增殖。显著地，在与PIB生成的iDC在OVA蛋白质存在下共培养时，56％的CD4+T细胞稀释CFSE(图35B)。在与经PIB+TCF4转导的MEF共培养时，38.2％的CD4+T细胞稀释CFSE内容物，这表明重编程池中包括TCF4不增加iDC的刺激能力。使用脾MHC-II+CD11c+DC作为对照并生成24.1％的增殖T细胞。重要的是，添加LPS刺激(其一般用于诱导DC“成熟”)增加经PIB(1.5倍)或PIB+TCF4(2倍)转导的MEF以及脾DC(3倍)的抗原特异性刺激能力(图35B和图36)。如所预期，在LPS刺激或没有LPS刺激的情况下，未经共培养的T细胞未增殖。为了进一步评价iDC的刺激能力，评估其是否能诱导T细胞激活标志(例如CD44)的表达。在给予预加工的抗原时，在与PIB生成的iDC和脾MHC-II+CD11c+DC二者共培养时，OT-II CD4T细胞稀释CFSE并上调CD44的表达(图35C)。重要的是，在给予OVA蛋白质时，iDC显示在与脾DC相比时相当的在OT-II T细胞中诱导CD44表达的能力(52.2％相对于63.8％)。该数据支持iDC纳入并加工OVA蛋白质，之后在细胞表面处的MHC-II复合物中呈递经加工卵白蛋白肽的功能性能力。总之，这些结果突出显示iDC的功能性能力，并支持使用直接重编程的成纤维细胞呈递抗原和诱导抗原特异性适应性免疫反应的可行性。
在实施方案中，评估iDC是否获得排出抗原到细胞溶质并表达交叉呈递能力必需的关键基因的能力。通过细胞溶质路径交叉呈递涉及从胞吞隔室到细胞溶质的抗原排出。因此，使用基于细胞荧光测定法的测定来评估iDC进行抗原排出的能力(图37A)。显著地，在与b-内酰胺酶一起孵育90分钟后，约80％的加载CCF4的iDC表达经裂解CCF4。因此，iDC能摄取b-内酰胺酶并将其有效排出到细胞质中，导致生成经裂解CCF4。还已确认，iDC表达交叉呈递路径中所涉及的基因，例如Cybb、Atg7、Tap1和Tap2(图37B)。
在实施方案中，评估iDC是否能交叉呈递抗原到CD8+T细胞。为此，通过将iDC与B3ZT细胞杂交瘤细胞共培养来评估在MHC-I分子处的OVA的交叉呈递，所述T细胞杂交瘤细胞在IL-2启动子控制下表达β-半乳糖苷酶(图38A，左图)。观察到iDC能以浓度依赖性方式诱导抗原特异性T细胞激活。此外，观察到在用聚I：C而非用LPS进行TLR3刺激后，B3Z T细胞的激活增加(图38A，右图)。因此，已描述用聚I：C使cDC1成熟促进MHC-I交叉呈递过程(28)。此外，还采用从OT-I Rag2 KO小鼠的淋巴结和脾分离的I类MHC限制的卵白蛋白特异性T细胞(OT-I细胞)来评估交叉呈递(19)。在这个模型中，当在DC的MHC-I的背景中显示时，T-细胞响应经加工抗原性肽(OVA257-264)。因此，将OT-I CD8T细胞与iDC在卵白蛋白蛋白质(OVA)和聚I：C刺激存在下共培养(图38B)。在MHC-I的背景中，功能性DC能捕获外源性蛋白质，加工抗原性肽并进行经加工抗原性肽的交叉呈递，从而诱导CD8+T细胞的激活。在共培养4天后，通过CFSE稀释和T细胞激活标志CD44的激活来测量经诱导CD8+T细胞增殖。显著地，在OVA蛋白质存在下，在与iDC共培养时，11.3±1.13％的CD8+T细胞分别稀释CFSE并上调CD44表达(图38B)。使用脾MHC-II+CD11c+DC作为对照并生成18.05±0.78％的增殖CD44+T细胞。
在实施方案中，用PIB转导人真皮成纤维细胞(HDF)(图39A)。重要的是，在HDF中引入PIB TF时，观察到形态变化。在转导后3天，观察到HDF失去特征性的双极性细长形状，并获得星状DC样形态(图39B和39C)。此外，评估典型DC表面标志的表达。经PIB转导的人包皮成纤维细胞BJ表达HLA-DR分子和CLEC9A，其为已知的特异性人DC标志(图40)，表明DC-诱导因子的PIB组合在小鼠与人之间是保守的，并且足以生成人iDC。
在实施方案中，通过与1μm FITC标记的胶乳珠粒一起孵育来评估人iDC是否能吞噬颗粒。在孵育后，PIB转导的HDF在细胞质中含有多个荧光珠粒(图41A)，表明iDC已建立对吞噬作用的感受态。另外，通过将iDC与AlexaFluor647标记的卵白蛋白一起孵育来评估纳入蛋白质的能力(图41B)。在37℃下孵育后，1.2％的PIB转导的HDF含有经标记蛋白质，表明iDC能主动吞噬蛋白质。
在实施方案中，评估在用PU.1、IRF8和BATF3转导后，癌细胞是否可获得DC表型性状。显著地，2.13％的PIB转导的肺癌细胞(3LL细胞系)表达MHC-I分子，并且在添加Dox后8天时，2.33％在细胞表面处共表达MHC-II和CLEC9A(图42)。类似地，26％的PIB转导的B16黑色素瘤癌细胞表达CLEC9A，同时1.04％的细胞共表达CLEC9A与MHC-II分子(图43)。这些结果表明，可能在癌细胞中使用PIB因子诱导DC表型。
在实施方案中，将PU.1、IRF8和BATF3的编码区克隆到多顺反子可诱导慢病毒载体中，其表达各自由2A肽序列隔开的所述三个核酸序列(图44A)。3种TF是以不同顺序包括，PU.1、IRF8和BATF3(PIB)或IRF8、PU.1和BATF3(IPB)。令人印象深刻的是，在10.8％和6.6％的经多顺反子载体(分别对应于PIB和IPB)转导的MEF中观察到Clec9a报道分子激活。相比之下，在经编码个别因子的慢病毒载体转导的MEF中，仅观察到1.9％的tdTomato+细胞(图44B和44C)。如所预期，在多顺反子载体中递送PIB因子提高重编程效率最多6倍。
在实施方案中，将每一候选TF的编码区个别克隆到可诱导慢病毒pFUW-TetO载体中(6)，其中TF的表达是在四环素操纵子和最小CMV启动子的控制下。组合使用含有在组成型活性人泛素C启动子(FUW-M2rtTA)控制下的反向四环素反式激活因子M2rtTA的先前所述的慢病毒载体。用TF编码质粒、包装构建体与VSV-G包膜蛋白质的混合物转染人胚肾(HEK)293T细胞。在36、48和60小时后收获病毒上清液，过滤(0.45μm，Corning)并直接使用，或用Amicon超离心过滤器(Millipore)浓缩40倍。
在一些实施方案中，与序列列表中提供的序列编码的参考多肽具有相同或相似活性的多肽变体或家族成员可用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中。通常，如通过本文所述并且为本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定，用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的编码DC诱导因子的特定多肽的变体将与所述特定参考多核苷酸或多肽具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高序列同一性。
通过参考如本文所述的核酸，天然地还预期以覆盖智人(Homo sapiens)碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子(BATF3)、mRNA(SEQ.ID.1)以及经优化密码子或编码相同氨基酸的不同密码子。
通过参考如本文所述的核酸，自然地还预期以覆盖智人Spi-1原癌基因(PU.1)、mRNA(SEQ.ID.7)以及经优化密码子或编码相同氨基酸的不同密码子。
通过参考如本文所述的核酸，自然地还预期以覆盖智人干扰素调节因子8(IRF8)、mRNA(SEQ.ID.5)以及经优化密码子或编码相同氨基酸的不同密码子。
通过参考如本文所述的核酸，自然地还预期以覆盖智人转录因子4(TCF4)、mRNA(SEQ.ID.13)以及经优化密码子或编码相同氨基酸的不同密码子。
在本文所提供的组合物/方法和试剂盒的一些实施方案中，经使用或经选择以从起始体细胞(例如成纤维细胞或造血谱系细胞、专能干细胞、诱导型多能干细胞、癌细胞或肿瘤细胞)生成iDC的DC诱导因子数为至少3。在一些实施方案中，经使用或经选择的DC诱导因子数为至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少30、至少33、至少35、至少40或更多。
在组合物、方法和试剂盒的各个方面中，本文还提供分离的氨基酸序列，以及编码一种或多种用于制造iDC的DC诱导因子的分离的DNA或RNA核酸序列。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，使用标准分子生物学技术将编码DC诱导因子(例如PU.1、IRF8、BATF3和TCF4)的核酸序列或构建体插入或可操作连接到用于细胞转染的适宜表达载体中。如本文所用，“载体”是指核酸分子，例如dsDNA分子，其为插入的核苷酸序列(例如本文所述的核酸构建体或替代盒)提供有用的生物学或生物化学性质。示例包括质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和能在体外或在宿主细胞中复制或被复制，或能将所需核酸区段运送到宿主细胞内的所需位置的其他序列。载体可具有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点(I型、II型或IIs型)，序列可在所述位点以可确定的方式被切割而不损失载体的必需生物学功能，并且核酸片段可剪接或插入所述位点中，以引起其复制和克隆。载体还可包括一个或多个重组位点，所述重组位点允许两个核酸分子之间交换核酸序列。载体可进一步提供例如用于PCR的引物位点、转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、其他可选标志等。载体可进一步包括一个或多个适用于鉴别经载体转化的细胞的可选标志。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，表达载体是病毒载体。一些病毒介导的表达方法采用逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺相关病毒(AAV)载体，并且所述表达方法已用于基因递送中并且为本领域所熟知。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒。逆转录病毒提供用于基因递送的便捷平台。可使用本领域已知的技术将所选基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。随后可分离重组病毒并在体内或离体将其递送至受试者的靶细胞。已描述多种逆转录病毒系统。参见，例如，美国专利第5,219,740号；Miller和Rosman(1989)BioTechniques7：980-90；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等(1991)Virology 180：849-52；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-37；Boris-Lawrie和Temin(1993)Curr.Opin.Genet.Develop.3：102-09。在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，逆转录病毒具有复制缺陷。逆转录病毒载体系统利用以下事实：含有5′和3′LTR以及包装信号的最小载体足以允许载体包装、感染和整合到靶细胞中，前提是在包装细胞系中反向供应病毒结构蛋白质。用于基因转移的逆转录病毒载体的基本优势包括在大多数细胞类型中的有效感染和基因表达，单拷贝载体精确整合到靶细胞染色体DNA中，以及逆转录病毒基因组的易操作性。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，病毒载体是基于腺病毒的表达载体。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒存留在染色体外，由此使与插入诱变相关的风险降到最低(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Viro1.57：267-74；Bett等(1993)J.Virol.67：5911-21；Mittereder等(1994)Human Gene Therapy5：717-29；Seth等(1994)J.Virol.68：933-40；Barr等(1994)Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6：616-29；以及Rich等(1993)Human Gene Therapy 4：461-76)。腺病毒载体感染众多种细胞，具有宽宿主范围，展现高感染效率，以高水平引导异源基因的表达，并实现那些基因在体内的长期表达。病毒作为无细胞病毒体具有充分感染性，因此无需注射生产者细胞系。关于安全性，腺病毒与严重人病理学无关，并且可通过病毒基因组的早期区1(“E1”)中的缺失赋予衍生自病毒的重组载体复制缺陷。腺病毒也可相对容易地大量产生。用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的腺病毒载体可衍生自多种腺病毒血清型中的任一种，包括但不限于超过40种腺病毒血清型株系中的任一种，例如血清型2、5、12、40和41。本文所用腺病毒载体优选地具有复制缺陷，并含有可操作连接到适宜启动子的目标DC诱导因子。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，使用一种或多种可诱导慢病毒载体引入或递送编码DC诱导因子(例如PU.1、IRF8、BATF3和TCF4)的核酸序列。在一些实施方案中，可通过使具有在可诱导启动子控制下或与所述可诱导启动子可操作连接的表达载体中的至少一种DC诱导因子的细胞与调节剂(例如，多西环素)或其他诱导剂接触来实现对使用一种或多种可诱导慢病毒载体递送的DC诱导因子表达的控制。在使用一些类型的可诱导慢病毒载体时，使所述细胞与诱导剂接触诱导DC诱导因子的表达，而撤回调节剂抑制表达。在使用其他类型的可诱导慢病毒载体时，调节剂的存在抑制表达，而移除调节剂允许表达。如本文所用的术语“表达的诱导”是指基因(例如由可诱导病毒载体编码的DC诱导因子)例如在诱导剂存在下或在一种或多种引起所述基因在细胞中的内源性表达的试剂或因子的存在下的表达。
在本文所述方面的一些实施方案中，使用多西环素(Dox)可诱导慢病毒系统。与逆转录病毒不同，慢病毒能转导休眠细胞，使其适合于转导更多种造血细胞类型。例如，已显示pFUW-tetO慢病毒系统可以高效率转导初代造血祖细胞。
在本文所述方法的一些实施方案中，使用非整合载体(例如，腺病毒)引入或递送编码DC诱导因子(例如PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和/或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14))的核酸序列。虽然整合载体(例如逆转录病毒载体)纳入宿主细胞基因组中并且可潜在地破坏正常基因功能，但非整合载体通过染色体外转录控制基因产物的表达。由于非整合载体不成为宿主基因组的一部分，非整合载体往往在细胞群体中短暂表达核酸。这部分是由于以下事实所致：非整合载体经常被赋予复制缺陷。因此，非整合载体相对于逆转录病毒载体具有若干优势，包括但不限于：(1)不破坏宿主基因组，和(2)短暂表达，以及(3)没有残留的病毒整合产物。用于本文所述方法的非整合载体的一些非限制性示例包括腺病毒、杆状病毒、甲病毒、小RNA病毒和痘苗病毒。在本文所述方法的一些实施方案中，非整合病毒载体是腺病毒。非整合病毒载体的其他优势包括以高效价产生其的能力、其在体内的稳定性以及其对宿主细胞的有效感染。
在一些实施方案中，在本文所述的组合物、方法和试剂盒中用于生成iDC的核酸构建体和载体可进一步包括一种或多种编码用于细胞的正选择和负选择的选择标志的序列。在核酸构建体的引入不存在的情况下，所述选择标志序列通常可提供针对通常在细胞中不会发现的抗生素的抗性或敏感性的性质。可选标志可结合选择剂(例如抗生素)用于在培养中选择表达所插入核酸构建体的细胞。编码正选择标志的序列通常提供抗生素抗性，即当在细胞基因组中存在正选择标志序列时，细胞对抗生素或药剂敏感。编码负选择标志的序列通常提供对抗生素或药剂的敏感性，即当在细胞基因组中存在负选择标志时，细胞对抗生素或药剂敏感。
在一些实施方案中，用于在本文所述的组合物、方法和其试剂盒中制造iDC的核酸构建体和载体可进一步包括用于构建体或其他载体遗传元件的调节、表达、稳定化的其他核酸元件，例如启动子、增强子、TATA盒、核糖体结合位点、IRES，如本领域普通技术人员已知。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，DC诱导因子(例如PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)和/或TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14))是作为合成的经修饰RNA来提供，或作为合成的经修饰RNA引入或递送到细胞中，如美国专利公开2012-0046346-A1中所述，所述公开的内容以引用方式整体并入本文。在那些根据本文所述方法使用合成的经修饰RNA将细胞重编程为iDC的实施方案中，所述方法可涉及细胞的重复接触，或涉及编码DC诱导因子的合成经修饰RNA的重复转染，例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30或更多次转染。
除了一个或多个经修饰核苷以外，用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的经修饰mRNA可包括本领域技术人员已知并且如美国专利公开2012-0046346-A1和20120251618A1以及PCT公开WO 2012/019168中所述的任何其他修饰。所述其他组份包括例如5′帽(例如，抗反向帽类似物(ARCA)帽，其含有5′-5′-三磷酸鸟嘌呤-鸟嘌呤连接，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3′-O-甲基；使用重组痘苗病毒加帽酶和重组2′-O-甲基转移酶产生的帽，其可在mRNA的最5′核苷酸与鸟嘌呤核苷酸之间产生规范的5′-5′-三磷酸连接，其中鸟嘌呤含有N7甲基化，并且最后的5′-核苷酸含有2′-O-甲基，生成帽1结构)；聚(A)尾(例如，长度大于30个核苷酸、长度大于35个核苷酸、至少40个核苷酸、至少45个核苷酸、至少55个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、至少900个核苷酸、至少1000个核苷酸或更大的聚A尾)；Kozak序列；3′非翻译区(3′UTR)；5′非翻译区(5′UTR)；一个或多个能从核酸切除的内含子核苷酸序列，或其任一组合。
用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的经修饰mRNA可进一步包括内部核糖体进入位点(IRES)。IRES可用作唯一核糖体结合位点，或可用作mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的mRNA可编码若干种肽或多肽，例如本文所述的DC诱导因子，其独立地由核糖体翻译(“多顺反子mRNA”)。在核酸提供有IRES时，进一步任选地提供第二可翻译区。可根据本发明使用的IRES序列的示例包括但不限于来自以下的那些IRES序列：小RNA病毒(例如FMDV)、疫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、C型肝炎病毒(HCV)、古典猪瘟病毒(CSFV)、鼠类白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SW)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，合成的经修饰RNA分子包括至少一种经修饰核苷。在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，合成的经修饰RNA分子包括至少两种经修饰核苷。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，经修饰核苷选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶(5mC)、N6-甲基腺苷(m6A)、3，2′-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫尿苷(s2U)、2′氟尿苷、假尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、2′脱氧尿苷(2′dU)、4-硫尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2′-O-甲基腺苷(m6A)、N6，2′-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6，N6，2′-O-三甲基腺苷(m62Am)、2′-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鸟苷(m7G)、2′-O-甲基鸟苷(Gm)、N2，7-二甲基鸟苷(m2，7G)、N2，N2，7-三甲基鸟苷(m2，2，7G)和肌苷(I)。在一些实施方案中，经修饰核苷是5-甲基胞嘧啶(5mC)、假尿嘧啶或其组合。
经修饰mRNA无需沿分子的整个长度均匀经修饰。在核酸中的不同位置可存在不同核苷酸修饰和/或主链结构。本领域普通技术人员将了解，核苷酸类似物或其他修饰可位于核酸中的任何位置，使得不显著降低核酸的功能。修饰还可以是5′或3′末端修饰。核酸可含有最少1个和最多100％的经修饰核苷酸，或任何中间百分比，例如至少50％经修饰核苷酸、至少80％经修饰核苷酸或至少90％经修饰核苷酸。
在一些实施方案中，优选地，但并非绝对需要地，分子中每次出现的给定核苷经修饰(例如，每一胞嘧啶是经修饰胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶，每一尿嘧啶是经修饰尿嘧啶，例如假尿嘧啶等)。例如，经修饰mRNA可包括经修饰嘧啶，例如尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶用经修饰尿嘧啶替代。还预期，在给定的合成经修饰RNA分子中，相同核苷在不同出现时可以不同方式经修饰。经修饰尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物替代，或可由多种具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的化合物替代。在一些实施方案中，核酸中至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶可用经修饰胞嘧啶替代。经修饰胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物替代，或可由多种具有不同结构(例如，2、3、4或更多种独特结构)的化合物替代(例如，一些胞嘧啶修饰为5mC，其他修饰为2′-O-甲基胞嘧啶或其他胞嘧啶类似物)。所述多修饰合成RNA分子可通过使用包括所有所需经修饰核苷的核糖核苷掺合物或混合物来产生，使得在合成RNA分子时，仅将所需的经修饰核苷纳入编码DC诱导因子的所得RNA分子中。
在某些实施方案中，例如如果需要蛋白质产生的精确定时，则可需要在细胞内降解引入细胞中的经修饰核酸。因此，在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，本文提供包括降解结构域的经修饰核酸，其能在细胞内以定向方式接受作用。
虽然应理解，iDC可通过递送呈核酸(DNA或RNA)或氨基酸序列形式的DC诱导因子来生成，但在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，iDC诱导可使用其他方法来诱导，例如通过用诱导一种或多种DC诱导因子表达的药剂(例如小分子或小分子混合剂)处理细胞来进行。
对使用本文所述的组合物、方法和试剂盒引入细胞中或在细胞群体中诱导的DC诱导因子的表达的检测，可通过本领域技术人员已知的若干种技术中的任一种来实现，包括例如蛋白质印迹(Western blot)分析、免疫细胞化学和荧光介导的检测。
为了区分DC诱导因子的给定组合是否已生成iDC，可测量一个或多个DC活性或参数，例如，在一些实施方案中，表面抗原的差异性表达。使用本文所述的组合物、方法和试剂盒生成经诱导DC优选地引起内源性DC的细胞表面表型特征的出现，例如CLEC9A、MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86、CD103。
DC最可靠地通过其功能性行为与其他免疫细胞相区分。DC表型的功能性方面或树突状细胞活性(例如树突状细胞诱导抗原特异性T细胞反应的能力)可容易地由本领域技术人员使用常规方法确定，所述常规方法为本领域中已知，并且如本文，例如在附图中，即图1-44中所述。在本文所述方面的一些实施方案中，可使用鉴别重编程因子的功能性测定。例如，在一些实施方案中，可使用抗原呈递和抗原交叉呈递测定来确认使用组合物、方法和其试剂盒生成的iDC的T细胞反应的抗原特异性诱导(抗原呈递潜力)。可使用细胞因子分泌来确认使用本文所述的组合物、方法和试剂盒生成的iDC的免疫调节性质。使用本文所述的组合物、方法和试剂盒生成的iDC的吞噬颗粒、蛋白质和死细胞的能力可通过分别在经标记珠粒、卵白蛋白或死细胞存在下培养经转导细胞，之后进行流式细胞术分析来评估。
如本文所用，“细胞参数”、“DC参数”或“抗原呈递活性”是指内源性或天然DC的可测量组分或特性，特别是可准确测量的组分。细胞参数可以是关于细胞的表型、功能或行为的任何可测量参数。所述细胞参数包括DC或DC群体的特征和标志的变化，包括但不限于以下各项的变化：生存力、细胞生长、一种或多种标志或标志组合(例如细胞表面决定子，例如受体、蛋白质(包括其构象或翻译后修饰)、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸(例如mRNA、DNA))的表达、全面基因表达模式等。所述细胞参数可使用本领域技术人员已知的多种测定中的任一种来测量。例如，生存力和细胞生长可通过诸如以下等测定来测量：锥虫蓝拒染、CFSE稀释和3H-胸苷纳入。蛋白质或多肽标志的表达可例如使用流式细胞测定、蛋白质印迹技术或显微术方法来测量。基因表达谱可例如使用RNA测序方法和定量或半定量实时PCR测定来测定。细胞参数也可是指功能性参数或功能性活性。虽然大多数细胞参数将提供定量读出，在一些情况中，半定量或定量结果可以是可接受的。读出可包括单一确定值，或可包括平均值、中位值或方差等。在特征上，对于来自大量相同测定的每一参数，可获得一系列参数读出值。差异性已有所预期，并且测试参数集合中每一者的一系列值将使用标准统计学方法获得，其中使用一般统计学方法提供单一值。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，可使用其他因子和药剂来促进iDC重编程。例如，可使用修改表观遗传学路径的因子和药剂来促进重编程为iDC。
可根据本文描述的组合物、方法和试剂盒，使用基本上任何初代体细胞类型用于产生iDC或将体细胞重编程为iDC。所述初代体细胞类型还包括其他干细胞类型，包括多能干细胞，例如诱导型多能干细胞(iPS细胞)；其他专能干细胞；寡能干细胞；和(5)单能干细胞。可用于本文所述方法的多个方面和实施方案中的初代体细胞的一些非限制性示例包括但不限于成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元细胞、脂肪细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、造血或免疫细胞、肝细胞、脾细胞、肺细胞、循环血细胞、胃肠细胞、肾细胞、骨髓细胞和胰腺细胞，以及从其衍生出上述细胞的干细胞。细胞可以是从任何体细胞组织分离的初代细胞，所述体细胞组织包括但不限于脾、骨髓、血液、脑、肝、肺、肠、胃、肠、脂肪、肌肉、子宫、皮肤、脾、内分泌器官、骨等。在一些实施方案中，术语“体细胞”进一步涵盖在培养中生长的初代细胞，前提是所述体细胞未经永生化。如果将细胞维持在体外条件下，则可使用常规组织培养条件和方法，并且是本领域技术人员已知的。多种初代体细胞的分离和培养方法为本领域技术人员熟练掌握。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，体细胞是成纤维细胞。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，体细胞可以是造血谱系细胞。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，体细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。
在本文所述的组合物、方法和试剂盒的一些实施方案中，待重编程或变为iDC细胞的体细胞是造血来源的细胞。如本文所用的术语“造血衍生的细胞”、“造血衍生的已分化细胞”、“造血谱系细胞”和“造血来源的细胞”是指从专能造血干细胞(HSC)衍生或分化的细胞。因此，用于本文所述的组合物、方法和试剂盒的造血谱系细胞包括专能、寡能性和谱系受限的造血祖细胞、粒细胞(例如，前髓细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，原巨核细胞、血小板生成型巨核细胞、血小板)、单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)、树突状细胞和淋巴细胞(例如，T-淋巴细胞，其携载T细胞受体(TCR)；B淋巴细胞或B细胞，其表达免疫球蛋白并产生抗体；NK细胞、NKT细胞和先天性淋巴细胞)。如本文所用的术语“造血祖细胞”是指能分化为造血系统的两个或更多个细胞类型的专能、寡能性和谱系受限的造血细胞，包括但不限于粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞以及淋巴细胞B细胞和T细胞。造血祖细胞涵盖专能祖细胞(MPP)、共同骨髓祖细胞(CMP)、共同淋巴祖细胞(CLP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)和前巨核细胞-红细胞祖细胞。谱系受限的造血祖细胞包括巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)、原B细胞、前B细胞、前-原B细胞、原T细胞、双阴性T细胞、原NK细胞、前粒细胞/巨噬细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)细胞和原肥大细胞(原MC)。造血谱系的分化图提供于图1中。
用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的造血来源的细胞可从已知包括这些细胞的任何来源获得，例如胎儿组织、脐带血、骨髓、末梢血、动员末梢血、脾、肝、胸腺、淋巴等。在用于本文所述制造iDC的组合物、方法和试剂盒中之前，从这些来源获得的细胞可使用本领域技术人员可接受的任何方法离体扩增。例如，可对细胞进行分选、分级分离、处理以移除具体细胞类型，或使用本领域技术人员可接受的任何程序以其他方式操作以获得用于本文所述方法中的细胞群体。单核淋巴细胞可例如如美国专利第4,690,915号中所述通过使用连续流动细胞分离器重复淋巴细胞清除法来收集，或使用CLP方法的亲和纯化步骤来分离，例如使用细胞计数器的流式细胞术、磁性分离、使用抗体或蛋白质涂布的珠粒、亲和色谱、或固体支持的亲和分离(其中根据细胞的具体蛋白质或蛋白质类型的表达或表达的缺乏，将细胞保持在衬底上)、或使用针对由目标细胞类型特异性表达的一种或多种表面抗原的一种或多种抗体的分批纯化。造血来源的细胞也可从末梢血获得。在从末梢血收获细胞前，可用细胞因子(例如，粒细胞集落刺激因子)处理受试者，以促进细胞从骨髓移行到血液隔室和/或促进目标群体的激活和/或增殖。适于鉴别表面蛋白质的任何方法例如可用于从异质性群体分离造血来源的细胞。在一些实施方案中，获得造血来源的细胞的克隆群体，例如淋巴细胞。在一些实施方案中，造血来源的细胞并非克隆群体。
此外，关于本文所述的组合物、方法和试剂盒的各个方面和实施方案，体细胞可从任何哺乳动物物种获得，其非限制性示例包括鼠类、牛、猿猴、猪、马、羊或人细胞。在一些实施方案中，体细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞来自非人生物体，例如非人哺乳动物。
通常，用于制造本文所述iDC的方法涉及在本领域普通技术人员可获得并且熟知的任何培养基中培养或扩增体细胞，例如造血来源的细胞。所述培养基包括但不限于达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(DMEM)、DMEM F12伊格尔最低必需F-12K伊斯科夫改良达尔伯克培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)RPMI-1640培养基和用于培养和扩增DC的无血清培养基。多种培养基也可作为含有或不含钠的低葡萄糖配方来获得。在一些实施方案中，用于本文所述方法的培养基可补充有一种或多种免疫刺激性细胞因子。一般使用的生长因子包括但不限于G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-4、Flt-3配体和试剂盒配体。另外，在优选实施方案中，免疫刺激性细胞因子选自由以下组成的组：白介素(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-18、IL-19、IL-20)、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子-β(TGF-β)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt-3配体和试剂盒配体。
例如，培养中的细胞可维持在悬浮液中或附着到固体载体，例如细胞外基质组分或平铺在饲养细胞上。在一些实施方案中，用于本文所述方法中的细胞可能需要促进其附着到固体载体的其他因子，例如I型和II型胶原、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白”和纤连蛋白样聚合物、明胶、聚-D-赖氨酸和聚-L-赖氨酸、血小板反应蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，细胞适于在悬浮培养中生长。悬浮感受态宿主细胞通常为单分散或在无显著聚集的情况下在松散聚集体中生长。悬浮感受态宿主细胞包括适于不经适应或操作即用于悬浮培养的细胞(例如，造血来源的细胞，例如淋巴样细胞)，和已通过附着依赖性细胞的修饰或适应而成为悬浮感受态的细胞(例如，上皮细胞、成纤维细胞)。
在这些方面和本文所述所有所述方面的一些实施方案中，分离的经诱导树突状细胞(iDC)进一步包含用于施用给有需要的受试者的药学上可接受的载剂。
在一些方面中，本文还提供治疗需要治疗的受试者以诱导抗原特异性免疫反应以消除癌细胞或传染原的方法，其是使用本文所述DC诱导组合物和制备iDC的方法，或使用利用本文所述DC诱导因子的任何组合、DC诱导组合物或制备iDC的方法产生的分离的经诱导树突状细胞(iDC)和其细胞克隆来进行。在所述治疗方法中，可首先从受试者分离体细胞(例如成纤维细胞或造血谱系细胞)，并且如本文所述分别用包括表达载体或合成mRNA的DC诱导组合物转导或转染分离的细胞。随后可将使用本文所述DC诱导因子的任何组合、DC诱导组合物或制备iDC的方法产生的分离的经诱导树突状细胞(iDC)施用给受试者，例如通过向受试者全身注射iDC来进行。
在一些方面中，本文还提供治疗需要治疗的受试者以诱导抗原特异性免疫反应以消除癌细胞或传染原的方法，其是使用本文所述的DC诱导组合物和DC诱导因子的任何组合来进行。在所述治疗方法中，如本文所述用包含表达载体的DC诱导组合物转导癌细胞。癌细胞可首先从受试者分离，用包含表达载体的DC诱导组合物转导，并且之后施用给受试者，例如通过全身注射来施用。或者可用包含病毒表达载体的DC诱导组合物在原位或在体内转导癌细胞。经修饰癌细胞获得抗原呈递能力，将其肿瘤抗原呈递到T细胞并引发针对其自身的细胞毒性反应。
在本文所述治疗方法的一些实施方案中，使用本文所述的组合物、方法和试剂盒生成的重编程的iDC可直接使用或施用给需要免疫疗法的受试者。因此，本文所述方法的多个实施方案涉及将有效量的使用本文所述的组合物、方法和试剂盒中的任一者生成的iDC或iDC群体施用给需要细胞疗法的个体或受试者。所施用的细胞或细胞群体可以是自体群体，或衍生自一种或多种异源来源。此外，所述iDC可以允许其移行到淋巴结并激活效应子T细胞的方式来施用。
多种将细胞施用给受试者的方式为本领域技术人员已知。所述方法可包括全身注射，例如静脉内注射，或将细胞植入受试者的靶位点中。可将细胞插入有利于通过注射或植入引入受试者中的递送装置中。所述递送装置可包括用于将细胞和流体注射到受体受试者的体内的管，例如导管。在一个优选实施方案中，管另外具有针，例如，可经过所述针将细胞在所需位置引入受试者中。细胞可经准备以供以多种不同形式来递送。例如，在含于所述递送装置中时，细胞可悬浮于溶液或凝胶中，或嵌入载体基质中。细胞可与药学上可接受的载剂或稀释剂混合，其中细胞保持存活。
因此，通过本文所述方法产生的细胞可用于制备细胞以治疗或减轻若干种癌症和肿瘤，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑癌、头颈癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头部或颈部癌瘤、乳腺癌瘤、卵巢癌瘤、肺癌瘤、小细胞肺癌瘤、Wilms肿瘤、宫颈癌瘤、睾丸癌瘤、膀胱癌瘤、胰腺癌瘤、胃癌瘤、结肠癌瘤、前列腺癌瘤、生殖泌尿癌瘤、甲状腺癌瘤、食管癌瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌瘤、肾细胞癌瘤、子宫内膜癌瘤、肾上腺皮质癌瘤、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌癌瘤、绒毛膜癌、蕈样肉芽肿病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、多毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、成骨性肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤等。
除了上文以外，本发明方法可用于预防或消除已知使得易患某些癌症的病原体的感染。用于本文所提供癌症疫苗中的特别关注的病原体包括B型肝炎病毒(肝细胞癌瘤)、C型肝炎病毒(肝细胞瘤)、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(Epstein Barr virus)(EBV)(伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、鼻咽癌、免疫抑制个体中的PTLD)、HTLVL(成人T细胞白血病)、致癌人乳头瘤病毒16型、18型、33型、45型(成人宫颈癌)和细菌幽门螺杆菌(B细胞胃淋巴瘤)。可在哺乳动物且更特别是人中用作抗原的其他医学相关微生物广泛描述于文献中，例如C.G.A Thomas，医学微生物学(Medical Microbiology)，Bailliere Tindall，(1983)。
除了上文以外，本发明方法可用于病毒感染。示例性病毒病原体包括但不限于感染哺乳动物且更特别是人的传染性病毒。传染性病毒的示例包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-I(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其他分离物，例如HIV-LP)；细小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、A型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、鼻病毒、埃可病毒)；嵌杯病毒科(Calciviridae)(例如引起胃肠炎的株系)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒(dengue virus)、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒，例如SARS冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如水疱性口腔炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃波拉病毒(ebola virus))；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan virus)、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒和内罗毕病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如呼肠病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科(Bir-naviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(B型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(Poxyiridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹膜病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类病毒(例如海绵状脑病的病原、δ肝炎的病原(认为是B型肝炎病毒的缺陷型卫星)、非A型、非B型肝炎的病原(1类＝内部传播；2类＝非经肠传播(即C型肝炎)；诺瓦克病毒(Norwalk)和相关病毒，和星状病毒)。
除了上文以外，本发明方法可用于靶向脊椎动物中的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。所述革兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德菌属种(Pasteurella sp.)、葡萄球菌属种(Staphylococci sp.)和链球菌属种。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)和沙门菌属种。传染性细菌的具体示例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、伯氏疏螺旋体(Borellaburgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属种(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增多性李司忒菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)、链球菌属(草绿色组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(厌氧消化种)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、病原性弯曲杆菌属种(Campylobacter sp.)、肠球菌属种(Enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus infuenzae)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属种(Corynebacterium sp.)、豚丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气英膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属种(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次体属(Rickettsia)和以色列放线菌(Actinomyces israelii)。
除了上文以外，本发明方法可用于靶向病原体，所述病原体包括但不限于感染哺乳动物、并且更特别是人的传染性真菌和寄生虫。传染性真菌的示例包括但不限于：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(Candida albicans)。
除了上文以外，本发明方法可用于靶向寄生虫，例如细胞内寄生虫和专性细胞内寄生虫。寄生虫的示例包括但不限于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、间日疟原虫(Plasmdodiumvivax)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(Babesia divergens)、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)、鼠弓形虫、旋毛线虫(Trichinella spiralis)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)、罗德西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、马来丝虫(Brugiamalayi)、帝汶布鲁丝虫(Brugia timori)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)和曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)。
如果经修饰，经诱导树突状细胞可用于诱导致耐受性反应，包括压制针对一种或多种靶抗原的未来或现有免疫反应。因此，诱导DC可用于治疗或预防不需要的免疫反应，包括例如移植排斥、移植物抗宿主病、过敏症、寄生虫疾病、炎症性疾病和自体免疫疾病。可根据本发明治疗或预防的移植排斥的示例包括与骨髓和诸如心脏、肝、胰腺、肾、肺、眼、皮肤等器官的移植相关的排斥。过敏症的示例包括季节性呼吸道过敏症；对诸如花粉症等气源性致敏原过敏；可通过减少血清IgE治疗的过敏症和嗜酸性细胞增多症；哮喘；湿疹；动物过敏、食物过敏；胶乳过敏；皮炎；或可通过过敏脱敏治疗的过敏症。可通过本发明治疗或预防的自体免疫疾病包括例如银屑病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、僵体综合征、甲状腺炎、西德纳姆舞蹈病(Sydenham chorea)、类风湿性关节炎、糖尿病和多发性硬化。炎症性疾病的示例包括克罗恩氏病(Crohn′s disease)、慢性炎症性眼病、慢性炎症性肺病和慢性炎症性肝病、自体免疫溶血性贫血、特发性白细胞减少症、溃疡性结肠炎、皮肌炎、硬皮病、混合性结缔组织病、肠易激综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、重症肌无力、格林-巴利综合征(Guillan-Barre syndrome)(抗磷脂综合征)、原发性黏液水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自体免疫性萎缩性胃炎、艾迪生病(Addison′s disease)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、肺出血肾炎综合征、贝赫切特综合征(Behcet′s syndrome)、合格伦综合征(Sjogren′ssyndrome)、类风湿性关节炎、交感性眼炎、桥本病(Hashimoto′s disease)/甲状腺功能减退症、乳糜泻/疱疹样皮炎和脱髓鞘病、原发性胆汁性肝硬变、混合性结缔组织病、慢性活动型肝炎、格雷夫斯病(Graves′disease)/甲状腺功能亢进症、硬皮病、慢性特发性血小板减少性紫癜、糖尿病神经病变和脓毒性休克。
药学上可接受的载剂和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。所述载剂和稀释剂的使用为本领域所熟知。溶液优选地无菌并为流体。优选地，在引入细胞之前，溶液在制造和储存条件下稳定，并且通过使用例如对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等针对诸如细菌和真菌等微生物的污染作用进行防腐。
优选地，细胞施用模式是相对非侵入性，例如通过静脉内注射、通过吸入经肺递送、局部或鼻内给予来进行。然而，细胞施用途径将取决于要治疗的组织并且可包括植入。细胞递送方法为本领域技术人员已知，并且对于与本文所述方法和组合物一起使用，可由医学领域技术人员推知。
在一些方面中，本文还提供制造经诱导树突状细胞(iDC)的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述包含一种或多种表达载体组分的任一DC诱导组合物。
在一些方面中，本文还提供包括本文所述一种或多种DC诱导因子作为组分的试剂盒，其用于本文所述的制造经诱导树突状细胞的方法。
因此，在一些方面中，本文提供制备经诱导树突状细胞的试剂盒，其包括以下组分：(a)一种或多种表达载体，其编码至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多种选自以下的DC诱导因子：BATF3(SEQ.ID.1、SEQ.ID.2)、SPIB(SEQ.ID.3、SEQ.ID.4)、IRF8(SEQ.ID.5、SEQ.ID.6)、PU.1(SEQ.ID.7、SEQ.ID.8)、STAT3(SEQ.ID.11、SEQ.ID.12)、TCF4(SEQ.ID.13、SEQ.ID.14)、IKZF1(SEQ.ID.15、SEQ.ID.16)、ID2(SEQ.ID.17、SEQ.ID.18)、BCL11A(SEQ.ID.19、SEQ.ID.20)、RELB(SEQ.ID.21、SEQ.ID.22)、ZBTB46(SEQ.ID.23、SEQ.ID.24)、RUNX3(SEQ.ID.25、SEQ：ID.26)、GFI1(SEQ.ID.27、SEQ.ID.28)、IRF2(SEQ.ID.29、SEQ.ID.30)、NFIL3(SEQ.ID.31、SEQ.ID.32)、BCL6(SEQ.ID.33、SEQ.ID.34)、L-MYC(SEQ.ID.35、SEQ.ID.36)、NR4A3(SEQ.ID.37、SEQ.ID.38)和(b)其包装和说明书。
在一些实施方案中，本文所述试剂盒可进一步提供合成mRNA或一种或多种编码DC诱导因子的表达载体，其呈混合物或作为单独等份。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括提高重编程效率的药剂。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括一种或多种抗体或引物试剂以检测细胞类型特异性标志，以鉴别诱导到树突状细胞状态的细胞。
在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括缓冲液。在一些所述实施方案中，缓冲液为pH 7.0的无RNA酶的TE缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括含有细胞培养基的容器。
本文所述所有试剂盒可进一步包括缓冲液、细胞培养基、转导或转染培养基和/或培养基补充剂。在优选实施方案中，缓冲液、细胞培养基、转染培养基和/或培养基补充剂不含DNA酶和RNA酶。在一些实施方案中，试剂盒中提供的合成的经修饰RNA可呈具体数量或质量(例如，20μg)的非溶液形式，例如冻干粉形式，使得最终用户添加适宜量的缓冲液或培养基以使组分达到所需浓度，例如100ng/μl。
本文所述的所有试剂盒可进一步包括装置以促进使用本文所述试剂盒组分生成的细胞的单次施用或重复或频繁输注，例如不可植入递送装置，例如针、注射器、笔式装置；或可植入递送装置，例如泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、池内或囊内)或储存器。在一些所述实施方案中，递送装置可包括分配包含iDC的药物组合物的单位剂量的机构。在一些实施方案中，装置连续(例如通过扩散)释放组合物。在一些实施方案中，装置可包括监测受试者体内参数的传感器。例如，装置可包括例如泵和任选地相关电子元件。
在实施方案中，经诱导树突状细胞是通过例如修饰体细胞、多潜能细胞、祖细胞或干细胞中至少一种本文所公开因子的基因表达，或通过使这些细胞类型中的任一种暴露于产生至少一种如本文所公开蛋白质的至少一种蛋白质或RNA，来人工制造的。细胞可进一步通过使其暴露于开启至少一种本文所公开因子的小分子来制造。在一些方面中，使用至少2、3、4、5、6、7或8种因子来制造经诱导树突状细胞。
在实施方案中，在公开内容的所有实施方案的一些方面中，虽然经诱导树突状细胞的功能性特征与天然存在的内源性树突状细胞相似，但其基因表达与天然存在的内源性树突状细胞显著不同。
在实施方案中，如本文所述的经诱导树突状细胞与天然存在的树突状细胞的不同之处在于其翻译后修饰标记和其基因表达标记二者。
在实施方案中，如本文所述的经诱导树突状细胞与天然存在的树突状细胞的不同之处在于其在体外作为贴壁培养物生长以及在培养中存活多于一个月的能力。
在实施方案中，经诱导树突状细胞还定义为包括与天然存在的树突状细胞不同的基因表达标记。可通过比较天然存在的树突状细胞的基因表达模式与经诱导树突状细胞的基因表达模式，在实验中显示所述差异。因此，在本发明的所有实施方案的一些方面中，经诱导树突状细胞包括与约1-5％、2-5％、3-5％、至多50％、至多40％、至多30％、至多25％、至多20％、至多15％或至多10％的具体基因的表达标记约1-5％、5-10％、5-15％或5-20％不同的表达标记。例如，DC诱导因子(例如PU.1、IRF8、BATF3和TCF4)在iDC中的表达水平高于在天然存在的DC中，因为DC诱导因子过表达。
在实施方案中，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是以如下方式来分离并纯化：使Clec9aCre/Cre动物(10)与Rosa26-stopflox-tdTomato报道分子小鼠(The JacksonLaboratory)杂交以生成双重纯合Clec9aCre/Cre RosatdTomato/tdTomato(C9A-tdTomato)小鼠。分别从Charles River和Taconic获得C57BL/6小鼠、Rag2组成型敲除(KO)/OT-II随机转基因(Rag2KO/OT-II)小鼠和Rag2KO/OT-I随机转基因小鼠(17-19)。所有动物饲养在受控温度(23±2℃)下，经历固定的12-h光/暗循环，自由获得食物和水。
在实施方案中，MEF的初代培养物是从C9A-tdTomato或C57BL/6小鼠的E13.5胚胎分离(6、10)。移除头、胎儿肝脏和所有内脏并将剩余组织机械解离。使用0.12％胰蛋白酶/0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(3mL/胚胎)对经解剖组织进行酶消化，并在37℃下孵育15min。每个胚胎另外添加3mL相同溶液，之后再进行15min孵育期。获得单细胞悬浮液并平铺于0.1％明胶涂布的10em组织培养皿中的生长培养基中。使细胞生长2-3天直到汇合为止，用Tryple Express解离并在胎牛血清(FBS)10％二甲亚砜(DMSO)中冷冻。在平铺用于慢病毒转导之前，分选MEF以移除残留的可代表具有造血潜力的细胞的CD45+和tdTomato+细胞。用于筛选和以下实验的MEF为tdTomato-CD45-，纯度为99.8％并且扩增多达4代。
在实施方案中，将HEK293T细胞、MEF和人真皮成纤维细胞(HDF，ScienCell)维持在补充有10％(v/v)FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素(10μg/ml青霉素和链霉素)]的生长培养基[达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中，将OP-9和OP-9-DL1细胞系培养于含有20％FBS、1mML-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(10μg/ml)的最小必需培养基(MEM)α中。OP-9和OP-9-DL1在80％汇合时以常规方式传代。将所有细胞维持在37℃和5％(v/v)CO2下。除非另有说明，否则所有组织培养试剂均来自Thermo Fisher Scientific。
在实施方案中，病毒转导和重编程实验是以如下方式来进行：将C9A-tdTomatoMEF以40,000个细胞/孔的密度接种于0.1％明胶涂布的6孔板上。将细胞以1∶1FUW-TetO-TF和FUW-M2rtTA慢病毒颗粒的比率在补充有8μg/mL聚凝胺的生长培养基中孵育过夜。在测试TF的组合时，应用相等MOI的每种个别病毒颗粒。将细胞在连续几天中转导两次，并且在过夜孵育后，用新鲜的生长培养基更换培养基。在第二次转导后，向生长培养基中补充多西环素(1μg/mL)-第0天。每2-3天更换培养基以持续培养。在转导后1-15天分析新出现的tdTomato+细胞。在陈述时，应用培养条件的变化，即RPMI-1640、脂多糖(LPS，100ng/ml，Sigma)、2-巯基乙醇(1×104μM；2-ME)、L-谷氨酰胺(2μmol/ml)、GM-CSF(10ng/ml，STEMCELLTechnologies)、IL-4(20ng/ml，STEMCELL Technologies)和Flt31(100ng/ml，STEMCELLTechnologies)。
在实施方案中，以如下方式评估荧光显微术和免疫荧光：将MEF和经转导HDF中C9A驱动的tdTomato在6孔板上在倒置显微镜(Zeiss AxioVert200M)下直接可视化，并用AxioVision和Adobe Photoshop软件加工图像。分别使用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，1μg/mL，Sigma)和鬼笔环肽(50μg/ml，Sigma)对细胞核和F-肌动蛋白进行染色。对于延时显微术，在添加Dox后经6天4小时使用INCELL Analyzer 2200(GE Healthcare)每1小时获得荧光照片。用ImageJ软件(NIH)生成影片。
在实施方案中，以如下方式进行流式细胞术分析：用TrypLE Express解离经转导C9A-tdTomato MEF或经转导人成纤维细胞，重悬浮于200μL PBS 5％FBS中并保持在4℃下，之后在BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)中分析。以配置3-蓝-1-红(FL1中的533/30过滤器；FL2中的585/40，FL3中的670LP和FL4中的675/25)进行样品采集。在FL2通道中分析tdTomato荧光。对于CD45或MHC-II细胞表面标志表达的分析，将经解离细胞与稀释于PBS5％FBS中的APC-Cv7大鼠抗小鼠CD45抗体或Alexa Fluor 647大鼠抗小鼠I-A/I-E在4℃下在大鼠血清(1/100，GeneTex)存在下一起孵育30分钟，以阻断非特异性结合。用PBS5％FBS洗涤细胞，重悬浮于PBS 5％FBS中并在BD Accuri C6流式细胞仪中分析。在FL4通道中分析CD45APC-Cy7和I-A/I-E Alexa Fluor 647荧光。对于MHCII、CD80和CD86细胞表面表达的组合分析，用Alexa Fluor 647大鼠抗小鼠I-A/I-E、BV650大鼠抗小鼠CD80和PE-CY7大鼠抗小鼠CD86对经解离细胞进行染色，并在BD FACSAria III(BD Biosciences)中分析。对于经转导HDF的分析，用APC小鼠抗人CLEC9A和FITC小鼠抗人HLA-DR对经解离细胞进行染色。为了评价在与APC共培养7天后的CD4+和CD8+T细胞增殖和激活，将羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的T细胞与PE大鼠抗小鼠CD44一起孵育，并在BD Accuri C6中分析。使用FlowJo软件(FLOWJO，LLC，7.6版)分析流式细胞术数据。
在实施方案中，以如下方式进行荧光激活细胞分选(FACS)：为了纯化C9A-tdTomato MEF，将细胞与稀释于PBS5％FBS中的APC-Cy7抗CD45抗体一起在4℃下孵育30分钟。随后，用PBS 5％FBS洗涤MEF，重悬浮于PBS5％FBS中并在BD FACSAria III中纯化tdTomato-CD45-MEF。在描述时，使用BD FACSAria III纯化tdTomato+细胞并在多西环素不存在或存在下培养。对于脾DC的分离，将脾细胞与Alexa Fluor 647大鼠抗小鼠I-A/I-E、FITC大鼠抗小鼠CD11c和APC-Cy7大鼠抗小鼠CD8a一起孵育。在BD FACSAria III(BDBiosciences)中纯化CD11c+MHCII+CD8a+脾DC。在FlowJo软件中加工FACS数据。
在实施方案中，使用GPSforGenes软件来计算PU.1、IRF8和BATF3组合对DC谱系的特异性。对于不同样品中的每一基因，基因表达数据是从BioGPS数据库(GeneAtlasMOE430)下载，转化至对数空间并经标准化，以使表达值在0-1范围内。随后在所得数据中搜索对Pu.1+Irf8+Batf3具有最高平均表达的样品。
在实施方案中，以如下方式进行单细胞mRNAseq分析：使用Salmon v0.8.1以k＝21将单端读取映射到mm10小鼠基因组(Ensembl注释，版本89)。使用tximport库将所得TPM输入R中，并使用在monocle库中实施的Census算法转化为mRNA计数。使用分散库弃去未通过质量控制阈值的细胞和基因。使用以下QC标准：1)每个细胞的库大小；2)在每个单细胞中检测到的基因数；3)线粒体基因中的计数的百分比。在首先剖析的192个细胞中，163个个别细胞通过质量控制过滤器并用于分析。使用定制R脚本来进行t分布随机邻域嵌入(tSNE)(Monocle和分散包)、主要组分分析(PCA)(Monocle和分散包)、分级聚类(SC3包)、方差分析，并构建热图、箱形图、散布图、小提琴曲线、树形图、条形图和直方图。通常，使用ggplot2、gplots、图形和pheatmap包来生成数据图形。
在实施方案中，使用Monocle包进行差异性表达分析，并用小于0.05的BH校正p值选择基因。随后通过方差过滤所得基因(选择在所有条件下方差＞＝1的基因)。最后，基于分级聚类将所得6,525个基因分为4个不同聚类组。
在实施方案中，使用STAR v2.5.3a以默认设定来确定基因的内源性表达。基于-10kb，即基因的起点和基因的终点+10kb来定义窗口，其对应于5′和3′非翻译区(UTR)并用于使用来自bedtools v2.27.0的multicov计算UTR中的读取数。
在实施方案中，通过使用来自Schlitzer的cDC1和cDC2基因标记确定iDC的DC谱系(11)。大多数基因在MEF中并且在所有本发明条件中高表达。弃去这些基因。此外，由于sDC细胞是针对cDC1标志CD11c、MHC-II和CD8a来纯化，弃去在sDC中表达但同时发现于cDC2标记列表中的基因。然后使用cDC1/cDC2基因列表来进行分级聚类。随后，仅选择基因在MEF细胞中的中值表达显著低于第3天、第7天和第9天的聚类。除此以外，对于cDC2基因列表，除了上述程序以外，还弃去基因在sDC细胞中的中值表达显著高于第3天、第7天和第9天的基因聚类。随后，从每一特定条件来计算基因表达在每一所选基因之间的中值。最后，计算由Schlitzer和同事定义的基因表达在所有预分选cDC1和cDC2基因标记之间的中值。
在实施方案中，使用Monocle包将细胞按在MEF到iDC细胞重编程期间的伪时间过程排序，其为使用独立组分分析和最小生成树沿伪时间排序路径连接细胞的算法。Monocle分析是基于来自Schlitzer，2015(11)的cDC1和cDC2基因作为基因来进行，其定义细胞进展，因为这是证实第9天是cDC1样细胞的替代性方法。使用Monocle功能将所得轨迹可视化。由于单细胞轨迹包括分支，使用分支化表达分析建模(BEAM)，其为在Monocle包中实施以寻找分支间差异性表达基因的特殊统计学测试。作为Monocle分支算法的替代性方法，使用TSCAN，其通过构建最小生成树连接聚类来组合聚类与伪时间分析。与Monocle相比，TSCAN可使用所有基因将细胞排序。
在实施方案中，使用Enrichr(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)和注释、可视化和集成发现数据库(Database for Annotation，Visualization and IntegratedDiscovery，DAVID)聚类功能分析(david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(生物学过程、细胞组分和KEGG路径)。
在实施方案中，使用miRTarBase 2017，Enrichr网站(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)进行微RNA靶相互作用分析。
在实施方案中，使用Network2canvas(http：//www.maayanlab.net/N2C/#.WmRvOjLc8yk)进行小鼠表型分析。
在实施方案中，针对来自分子标记数据库(Molecular Signatures Database，MSigDB)和NetPath的C7：免疫标记进行所有可能的条件与状态之间的基因集富集分析(GSEA)。
在实施方案中，通过配对关联矩阵使用Pearson相关计算TF网络分析。TF是基于小鼠中的DBD：转录因子预测数据库(http：//www.transcriptionfactor.org/)来选择。因为目标是研究从mef到第9天之间的条件之间的切换，创建3个对应于从mef到第3天；第3天到第7天；第7天到第9天的切换的列表，并且仅包括那些对于条件对logFC＝0.5的TF。随后，在基于针对3对条件的logFC确定的TF中，选择Pearson关联大于0.35的TF和至少5种其他TF。考虑到那些结果可以是偶然得到的事实，使用排列来确定TF偶然通过该阈值的概率。进行100种排列并且它们全部产生0个通过该阈值的TF。使用igraph R包的功能图形.邻近()，其采用针对3对条件所选TF的Pearson配对关联矩阵。
在实施方案中，以如下方式进行甲基纤维素克隆原测定：在1％甲基纤维素培养基(Methocult M3434，Stem Cell Technologies)中测定在添加Dox后第3天、第5天、第7天、第10天和第25天的PIB转导的MEF。使用经分选sDC1(MHC-II+CD11c+CD8a+)以及未经分选的脾细胞和骨髓细胞作为对照。在5％CO2中于37℃下培养7-10天后，对造血集落进行评分和计数。
在实施方案中，以如下方式评估珠粒纳入测定：将经转导C9A-tdTomato MEF或经转导HDF培养物与2.5％黄绿荧光偶联的固体胶乳珠粒(羧基修饰的聚苯乙烯，Sigma)以1∶1000比率在生长培养基中一起孵育。16小时后，将细胞在PBS 5％FBS中洗涤两次，并在倒置显微镜下分析。使用DAPI(1μg/mL，Sigma)进行核染色。
在实施方案中，以如下方式评估经标记卵白蛋白的纳入：将经转导MEF和人成纤维细胞培养物与Alexa647标记的卵白蛋白(Life Technologies)在37℃或4℃下一起孵育20分钟。在用PBS 5％FBS洗涤后，在BD Accuri C6中分析细胞。
在实施方案中，以如下方式评估死细胞的纳入：使HEK293T细胞暴露于紫外线(UV)照射以诱导细胞死亡，并且用Claret远红外荧光细胞接头试剂盒(Sigma)根据制造商说明书来标记。将经转导MEF与远红外标记的死细胞一起孵育过夜，并且在BDAccuri C6中分析。
在实施方案中，以如下方式进行炎症性细胞因子测定：在Dox补充后10天时，在iDC培养上清液中评价细胞因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-12p70(IL-12p70)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)的水平。在第9天，添加100ng/mL LPS或25μg/mL聚肌苷-聚胞苷酸(聚I：C)(Invivogen)以供过夜刺激。从6孔板的孔收集50μL培养上清液并通过CBA小鼠炎症试剂盒(BD Biosciences)根据制造商说明书进行分析。用BDAccuriC6进行采集并使用FCAP阵列软件3.0版(BD Biosciences)分析数据。CBA中的检出限为：IL-6，20.91pg/ml；IL-10，10.55pg/ml；IFN-γ，18.2pg/ml；TNF，18.13pg/ml；IL-12p70，20.05pg/ml。
在实施方案中，以如下方式评估脾DC分离：使用两个无菌载玻片的磨砂端将刚分离的脾均质化。将细胞收获于补充有2％FBS的PBS中并经70μm细胞滤网(BD Biosciences)过滤。在室温下用BD Pharm Lyse(BD Biosciences)将红血细胞溶解8min。将MHC-II+CD11c+DC通过FACS (BD FACSAria III，BD Biosciences)纯化并直接用于抗原呈递测定。
在实施方案中，以如下方式评估CD4+T细胞分离和抗原呈递测定：使用Dynabeads未接触小鼠CD4细胞试剂盒(BD Biosciences)根据制造商说明书对来自Rag2KO/OT-II小鼠的脾的CD4+T细胞进行富集。将经富集CD4+T细胞用CFSE 5μM在室温下标记10min，洗涤并计数，之后与APC一起培养。将在添加Dox后第8天的iDC培养物或脾CD11c+MHC-II+DC细胞与OVA蛋白质(10μg/mL)或OVA323-339肽(10μg/mL)在100ng/mL LPS存在或不存在下一起孵育，并与未接触的CFSE标记的OT-II CD4+T细胞共培养。将iDC培养物(20000个细胞)或20000个脾CD11c+MHC-II+DC与20000个CFSE标记的CD4+T细胞在96孔圆底组织培养板中一起孵育。在共培养7天后通过流式细胞术评价T细胞增殖(CFSE染色的稀释)和激活(CD44表达)。
在实施方案中，以如下方式评估CD8+T细胞分离和抗原交叉呈递：使用Dynabeads未接触小鼠CD8细胞试剂盒(BD Biosciences)根据制造商说明书对来自Rag2KO/OT-I小鼠的脾的CD8+T细胞进行富集。将经富集CD8+T细胞用CFSE5μM在室温下标记10min，洗涤并计数，之后与APC一起培养。将在添加Dox后第8天的iDC培养物或脾CD11c+MHC-II+DCs细胞与OVA蛋白质(10μg/mL)在25μg/mL聚I：C存在下一起孵育，并与未接触的CFSE标记的OT-I CD8+T细胞共培养。将iDC培养物(20000个细胞)或20000个脾CD11c+MHC-II+DC与20000个CFSE标记的CD8+T细胞在96孔圆底组织培养板中一起孵育。在共培养4天后通过流式细胞术评价T细胞增殖(CFSE染色的稀释)和激活(CD44表达)。
在实施方案中，以如下方式进行杂交瘤交叉呈递测定：将在添加Dox后第16天的PIB转导的Clec9a-tdTomato MEF用TrypLE Express解离，重悬浮于生长培养基中并与不同浓度的OVA蛋白质一起孵育4小时。在广泛洗涤后，将PIB转导的MEF(100,000个细胞)与100,000个B3Z细胞在96孔圆底组织培养板中在100ng/mL LPS或25μg/mL PIC存在或不存在下共培养。在18h后，将细胞溶解在含有0.125％Nonidet P-40(取代物)、9mM MgC12和比色法CPRG β-半乳糖苷酶底物的缓冲液中。在微量板读取器上作为在590nm下的光学密度来测量β-半乳糖苷酶活性。
在实施方案中，通过基于细胞荧光测定法的测定来分析Clec9a-tdTomato+细胞的抗原排出到细胞溶质的效率。简单来说，将在添加Dox后第16天的PIB转导的MEF用TrypLEExpress解离，重悬浮于加载缓冲液中，并加载1μM CCF4-AM并在室温下保持30min。然后洗涤细胞并与2mg/mL β-内酰胺酶在37℃下一起孵育30、60和90分钟。为了停止反应，将细胞转移至冰冷的PBS中。在即将于BD FACSAriaIII中进行流式细胞术分析之前，将细胞用可固定生存力染料eFluor 780(eBioscience)染色。使用具有高蓝：绿(V450/V500)荧光比率的活Clec9a-tdTomato+细胞的百分比作为抗原排出到细胞溶质中的效率的量度。
在实施方案中，通过单向ANOVA进行组间对比，之后用GraphPad Prism5软件进行Bonferroni多重对比测试。在相关时显示P值(*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。
表6-用于分析中的一级抗体
本领域技术人员将仅使用常规实验即可识别或能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同物。本发明的范围不欲受限于上文的说明，而是如所附权利要求书中所述。
如果在权利要求书的说明书中使用要素或特征的单数形式，如果未明确排除，则也包括复数形式，并且反之亦然。例如，术语“一细胞”或“所述细胞”也包括复数形式“多个细胞”或“所述多个细胞”，并且反之亦然。在权利要求书中，除非指示相反含义或从上下文中明确另有表示，否则诸如“一(a)”、“一(an)”和“所述”等冠词可意指一个或多于一个。除非指示相反含义或上下文明确另有指示，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、用于给定产物或过程中或以其他方式与所述产物或过程相关，则在组中一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明被视为令人满意的。本发明包括其中确切地一个组成员存在于、用于给定产物或过程中或以其他方式与所述产物或过程相关的实施方案。本发明还包括其中多于一个或所有组成员存在于、用于给定产物或过程中或以其他方式与所述产物或过程相关的实施方案。
此外，应理解，本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中将来自一个或多个权利要求或来自说明书相关部分的一个或多个限制、要素、条款、说明项等引入另一权利要求中。例如，附属于另一权利要求的任何权利要求可经修改以包括在附属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。此外，如果权利要求书叙述组合物，应理解，除非另有指示或除非对于本领域普通技术人员显然会出现矛盾或不一致，否则包括出于本文所公开任何目的使用所述组合物的方法，并且包括根据本文所公开任何制造方法或本领域中已知的其他方法制造所述组合物的方法。
如果给出范围，则包括端点。此外，应理解，除非另有指示或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解显然为其他含义，否则表述为范围的值在本发明的不同实施方案中可假定为所述范围内的任何具体值，除非上下文明确另有指示，否则精确到所述范围的下限的十分之一单位。还应理解，除非另有指示或根据上下文和/或本领域普通技术人员的理解显然为其他含义，否则表述为范围的值可假定为给定范围内的任何子范围，其中子范围的端点表述为与所述范围下限的十分之一单位相同的准确度。
另外，应理解，本发明的任何特定实施方案可从任何一个或多个权利要求明确排除。如果给出范围，则范围内的任何值可从任何一个或多个权利要求明确排除。本发明组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或多个权利要求排除。出于简洁性目的，其中排除一个或多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案在本文中不明确陈述。
上述实施方案是可组合的。
以下权利要求进一步陈述本公开的特定实施方案。
本文件中列举的所有参考文献均以引用方式整体并入本文中，如同每一参考文献以引用方式单个地并入一般。
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Claims (30)

1.一种用于将干细胞或已分化细胞或其混合物重编程或诱导为树突状细胞或抗原呈递细胞的组合物，其包含至少三种转录因子的组合，所述三种转录因子的组合是由SEQ.ID. 1或SEQ. ID. 2编码的BATF3、由SEQ. ID. 5或SEQ. ID. 6编码的IRF8 和由SEQ. ID.7或SEQ. ID. 8编码的PU.1 的组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述干细胞或已分化细胞或其混合物为：多能干细胞、或专能干细胞、已分化细胞和其混合物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述干细胞或已分化细胞或其混合物为肿瘤细胞、癌细胞和其混合物。
4.一种或多种构建体或载体，其编码至少三种转录因子的组合，其中所述至少三种转录因子的序列为：SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68所示的BATF3、SEQ ID NO: 69或SEQ IDNO:70所示的IRF8和SEQ ID NO: 71或SEQ ID NO:72所示的PU.1。
5. 根据权利要求4所述的一种或多种构建体或载体，其中三种转录因子的组合从5'到3'呈以下序列顺序：
PU.1、IRF8、BATF3；或
IRF8、PU.1、BATF3。
6.根据权利要求4所述的一种或多种构建体或载体，其中所述一种或多种载体是病毒载体。
7.根据权利要求6所述的一种或多种构建体或载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体或腺相关病毒载体。
8.一种将干细胞或已分化细胞重编程或诱导为树突状细胞或抗原呈递细胞的方法，其包括以下步骤：
用一种或多种载体转导选自由以下组成的组的细胞：干细胞、已分化细胞和其混合物，所述载体编码至少三种转录因子，其中所述至少三种转录因子的序列为：SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68所示的BATF3、SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO:70所示的IRF8和SEQ ID NO: 71或SEQ ID NO:72所示的PU.1；
在支持树突状细胞或抗原呈递细胞生长的细胞培养基中培养经转导细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少三种转录因子为以下序列的组合：
由SEQ.ID.1或SEQ.ID.2编码的BATF3、由SEQ.ID.5或SEQ.ID.6编码的IRF8 和由SEQ.ID.7或SEQ.ID.8编码的PU.1 。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中转录因子的所述组合从5'到3'呈以下序列顺序：
PU.1、IRF8、BATF3；或
IRF8、PU.1、BATF3。
11.根据权利要求8所述的方法，在至少2天期间培养经多种转录因子转导的所述细胞。
12.根据权利要求8所述的方法，在至少5天期间培养经多种转录因子转导的所述细胞。
13.根据权利要求8所述的方法，在至少8天期间培养经多种转录因子转导的所述细胞。
14.根据权利要求8所述的方法，在至少9天期间培养经多种转录因子转导的所述细胞。
15. 根据权利要求8所述的方法，其中转导步骤进一步包括至少一种载体，其中所述载体包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码IL12的核酸序列；编码GM-CSF的核酸序列；编码IL-7的核酸序列；编码靶向IL-10 RNA的siRNA的核酸序列和其混合物。
16.根据权利要求8所述的方法，其中转导步骤进一步包括至少一种载体，所述载体包括编码免疫刺激性细胞因子的多核苷酸序列。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的列表：多能干细胞、或专能干细胞、已分化细胞和其混合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述多能干细胞、专能干细胞或已分化细胞选自由以下组成的组：内胚层衍生的细胞、中胚层衍生的细胞或外胚层衍生的细胞、包括间充质干细胞的专能干细胞、造血干细胞、肠干细胞、多能干细胞和细胞系。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞是人或小鼠成纤维细胞、或者人或小鼠已分化细胞或癌细胞，或哺乳动物造血谱系细胞，包括单核细胞、造血干细胞和祖细胞、或间充质干细胞或多能干细胞。
21.一种通过权利要求8-20中任一项所述的方法获得的经诱导树突状细胞。
22.根据权利要求21所述的经诱导树突状细胞，其中所述细胞比脾DC-天然DC-本质上更成熟和/或较不依赖于抗原呈递的外源性激活刺激。
23.一种通过权利要求8-20中任一项所述的方法获得的经诱导抗原呈递细胞。
24.根据权利要求23所述的经诱导抗原呈递细胞，其中所述抗原为：癌症抗原、自体抗原、变应原、来自病原性和/或传染性生物体的抗原。
25.一种组合物，其包含治疗有效量的如权利要求21-22中任一项所述的经诱导树突状细胞或如权利要求23-24中任一项所述的经诱导抗原呈递细胞或其混合物以及药学上可接受的赋形剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其进一步包含抗病毒剂、止痛剂、消炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、抗生素、利尿剂或其混合物。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物是可注射制剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述可注射制剂用于原位注射。
29.一种癌症疫苗，其包括如权利要求1-3和25-28中任一项所述的组合物，或如权利要求21-22中所述的经诱导树突状细胞，或如权利要求23-24中所述的经诱导抗原呈递细胞，或其混合物。
30.一种试剂盒，其包括以下组分中的至少一种：
如权利要求21-22中任一项所述的经诱导树突状细胞；
如权利要求23-24中任一项所述的经诱导抗原呈递细胞，
如前述权利要求1-3、25-28中任一项所述的组合物；
如权利要求4-7中任一项所述的一种或多种载体或构建体；或其混合物。
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