CN114252611B - 一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法和应用。本发明对前列腺癌进行了深入和全面的生物信息学分析，建立了筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法，能够快速、准确、高效地确定前列腺癌潜在的靶标。本发明基于几个大型公共数据库评估了作为治疗靶点和预后生物标志物的潜力，寻找在前列腺癌肿瘤微环境中与免疫相关的因子，通过进一步网络预测靶标，寻找其上游miRNA，进一步明确其在前列腺癌中的调节机制。为前列腺癌后续的药物研发、临床治疗等提供切实的理论基础和科学依据。

Description

一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法及其应用
技术领域
本发明属于医学生物领域，具体涉及一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法及其应用。
背景技术
在世界范围内，男性最常见的癌症类型是前列腺癌(PCa)，美国2019年新诊断例数达174，650例，在癌症相关死亡排序中位居第二。手术、根治性放疗等治疗手段对早期局限性前列腺癌具有很好的疗效，但是对不能行手术治疗或发生转移的病人，临床上多采用内分泌治疗，其治疗中位缓解时间为18-24个月，后逐渐发展为去势抵抗前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)。
随着肿瘤微环境研究的深入，其包含不同类型的细胞，包括增殖性肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞和间充质干细胞(MSC)等，它们在肿瘤的促进和进展中起着至关重要的作用。这些细胞可以被认为是癌症治疗的靶标，以改善传统疗法或寻找新的策略，从而可以预防治疗耐药性。现免疫治疗研究的发展迅速，前列腺癌的免疫治疗也在进行大型临床实验中。然而前列腺癌的发生发展研究机制仍不明确，由于前列腺癌的高发，及其易发展为去势抵抗性前列腺癌的特性，寻找新的治疗靶标仍是重要目标。
由于肿瘤微环境的高度复杂性，如何快速、准确地寻找到与前列腺癌相关的潜在生物标志物则成为了一个棘手的难题，因而有必要建立一种前列腺癌生物标志物的筛选方法，以快速、高效地获取与前列腺癌发生、发展、转移、侵袭等行为有关的潜在靶标，进而为后续的药物研发、临床治疗等提供切实的理论基础和科学依据。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中所存在的上述问题，从而针对前列腺癌发生、发展、转移、侵袭等过程进行了深入研究，提供了一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法，能够快速、准确、高效地确定前列腺癌潜在的靶标，从而为前列腺癌后续的药物研发、临床治疗等提供切实的理论基础和科学依据。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法，包括如下步骤：
(1)对差异基因进行筛选：使用TCGA数据库中前列腺癌数据以评估前列腺癌和正常组织中潜在生物标志物的表达水平；
(2)分析潜在生物标志物与前列腺癌的临床关系：使用GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/example.html)评估在前列腺癌中有表达差异的潜在生物标志物与前列腺癌临床结果之间的相关性，当p＜0.05且HR＞1时具有统计学意义；
(3)对潜在生物标志物间的相互关系进行分析：通过R软件包pheatmap进行展示潜在生物标志物的多基因相关性可视化图，并使用Spearman的相关分析来描述没有正态分布的定量变量之间的相关性，p＜0.05被认为具有统计学意义；
(4)利用生物信息学分析潜在生物标志物与前列腺癌发生、发展过程的相关机制；
(5)预测在前列腺癌中有临床意义并于前列腺癌免疫浸润相关的靶向潜在生物标志物上游miRNA；
(6)对靶向潜在生物标志物的上游miRNA进行验证，并验证其在前列腺癌中的作用机制；
(7)采用统计学软件进行数据分析。
作为优选地，步骤(1)中所述评估具体为：使用R软件包中ggplot2包做统计分析与可视化，得到在前列腺癌中上调及下调的潜在生物标志物，并绘制柱状图；随后使用GEPIA网站进行多基因比较，查看潜在生物标志物在前列腺癌中的相对表达水平，筛选在前列腺癌中表达明显且差异明显的基因。
作为优选地，所述统计分析方法为：使用正态性检验，当样本不满足正态性检验(p<0.05)，选择Mann-Whitney U检验(Wilcoxon rank sum test)。
作为优选地，步骤(2)中所述临床结果包括总体生存率(OS)及无病生存率(DFS)。
作为优选地，步骤(2)中在有表达差异的潜在生物标志物与前列腺癌临床结果之间相关性具有统计学意义时，进一步使用R软件包对与前列腺癌临床结果相关的潜在生物标志物的前列腺癌患者的预后做可视化分析，log rank用于检验KM生存分析比较两组之间的生存差异，同时进行timeROC分析以比较基因的预测准确性和风险评分。
作为优选地，步骤(4)中所述生物信息学分析具体步骤为：
(a)使用cbioportal网站(http://www.cbioportal.org/)对在前列腺癌中有明显差异表达的潜在生物标志物进行在前列腺癌中的突变分析，及查看其总的突变频率直方图；参数选择为：mRNA expression z-scores relative to diploid sampl es(RNA SeqV2 RSEM)，z＝±2；
(b)使用GEPIA网站通过相似基因检索，选择每个潜在生物标志物家族中最相似的20个基因；
(c)通过metascape网站(https://metascape.org/gp/index.html)进行GO、KEGG富集分析，显示p＜0.05的结果，并查看在前列腺癌中有明显差异表达的潜在生物标志物及其相似基因在GO、KEGG的结果；
(d)使用STRING(https://string-db.org/)网站查看在前列腺癌中有明显差异表达的潜在生物标志物家族因子的蛋白-蛋白相互作用网络；
(e)使用GeneMANIA(http://genemania.org/)网站查看在前列腺癌中有明显差异表达潜在生物标志物家族因子的蛋白-蛋白相互作用网络及其表达的蛋白所参与生物学通路；
(f)使用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)网站，研究在前列腺癌中有明显差异表达的潜在生物标志物家族因子与前列腺癌中大量免疫细胞浸润之间的相关性，p＜0.05，表示有统计学意义。
作为优选地，步骤(5)中采用Targetscan(http://www.targetscan.org/)及TarBase(https://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/)网站以预测靶向潜在生物标志物上游miRNA。
作为优选地，步骤(6)中所述验证方法选自以下方法中的一种或多种：使用starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)网站及miR_pathway(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/miR_path/)网站，查看目标miRNA在TCGA数据库中的前列腺癌样本中的表达情况；对临床样本测序并行双荧光素酶实验验证其上游miRNA，以正常前列腺组织为对照，通过荧光定量PCR检测前列腺癌组织中上游miRNA的转录水平；体外培养的正常前列腺细胞系及前列腺癌细胞系，采用不同浓度的上游miRNA过表达或siRNA片段，处理不同时间点(24、48及72h)，通过荧光定量PCR及Western blot观察对线粒体凋亡途径Bcl-2/Bax等相关蛋白的表达影响；通过Transwell实验、划痕实验，阐明潜在生物标志物及上游miRNA对前列腺癌细胞功能的影响。
作为优选地，所述潜在生物标志物为FGF家族因子。
作为优选地，所述FGF家族因子选自FGF1、FGF2、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF22、FGF23中的一种或多种。
作为优选地，所述FGF家族因子选自FGF17、FGF22中的一种或多种；最优选地，所述FGF家族因子选自FGF17。
作为优选地，所述miRNA选自miR-1-3p。
本发明第二方面提供了FGF抑制剂在制备治疗前列腺癌药物中的应用。
作为优选地，所述FGF抑制剂选自FGF17抑制剂、FGF22抑制剂中的一种或多种。
作为优选地，所述FGF17抑制剂选自siFGF17或miR-1-3p mimic中的一种或多种。
作为优选地，所述siFGF17序列如SEQ ID NO:1所示；所述miR-1-3p序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明第三方面提供了检测FGF表达水平的试剂在制备诊断或预后前列腺癌的试剂盒中的应用。
作为优选地，所述试剂包括检测FGF基因mRNA表达水平的特异性引物和/或FGF蛋白含量的抗体。无特别说明的情况下，所述特异性引物可采用本领域的常规技术方法进行设计，以特异性检测FGF尤其是FGF17或FGF22的基因表达水平；所述抗体为本领域常规的市售用于检测FGF蛋白尤其是FGF17或FGF22的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
作为优选地，所述FGF选自FGF17、FGF22中的一种或多种。
FGF家族为成纤维细胞生长因子家族，FGF家族参与调节细胞生长、血管生成、免疫和代谢等方面。在肿瘤发展过程中，异常的FGF信号可以通过直接驱动癌细胞增殖和存活，以及支持肿瘤血管生成来促进肿瘤的发展。在前列腺癌的骨转移中，前列腺癌细胞分泌的生长因子，包括内皮素1(ET-1)，成纤维细胞生长因子(FGF)和骨形态发生蛋白(BMP)，可以刺激成骨细胞活化形成新的骨，使前列腺癌细胞定居在骨髓中，癌细胞与骨微环境之间的相互作用就会导致骨骼形成和破坏的“恶性循环”，利于癌细胞的存活和肿瘤的生长。
在前列腺癌治疗研究中，发现靶向FGF信号通路可能是治疗对AR定向疗法有耐药性的前列腺癌的治疗方法，且与AR途径阻滞相结合，可能会规避治疗耐药性，也可能成为转移性去势抵抗前列腺癌的有效治疗方法。提示FGF家族在前列腺癌发生发展及治疗中有着重要作用。
miRNA是普遍表达的长度约为22nt的非编码小RNA。它们由形成miRN A初级前体(pri-miRNA)的细胞核中的基因编码。经过Drosha和Dicer RNase处理后，初级前体miRNA(pre-miRNA)被转录为成熟的miRNA，miRNA 5'端的2–8个核苷酸称为识别靶mRNA的功能性“种子”区域。越来越多的证据表明，microRNAs(miRNAs)通过结合靶基因参与调控癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移和表型转化。寻找基因的上游miRNA，是掌握其作用前列腺癌机制的重要部分。
既往研究已经确定了一些FGF家族因子在前列腺癌中的一般表达谱和功能，但确定合适的FGF家族因子作为前列腺癌的治疗靶点和预后生物标志物仍然是一个迫切需要关注的问题。随着第二代基因测序技术的快速发展和各种数据库的建立，使对FGF家族因子的综合分析成为可能。
基于此，本发明发明人进行了大量研究，对前列腺癌中的FGF家族因子的表达进行了深入和全面的生物信息学分析，并基于几个大型公共数据库评估了其作为治疗靶点和预后生物标志物的潜力，寻找在前列腺癌肿瘤微环境中与免疫相关的因子，通过进一步网络预测靶标，寻找其上游miRNA，进一步明确其在前列腺癌中的调节机制。为帮助临床医生选择适当的治疗药物和更准确地预测前列腺癌患者的长期结果提供证据。
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：
(1)本发明对前列腺癌进行了深入和全面的生物信息学分析，建立了筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法，能够快速、准确、高效地确定前列腺癌潜在的靶标。
(2)本发明基于几个大型公共数据库评估了作为治疗靶点和预后生物标志物的潜力，寻找在前列腺癌肿瘤微环境中与免疫相关的因子，通过进一步网络预测靶标，寻找其上游miRNA，进一步明确其在前列腺癌中的调节机制。
(3)本发明对筛选结果进行了进一步验证，明确了与前列腺癌发生、发展、转移等相关的靶点，为前列腺癌后续的药物研发、临床治疗、潜在病例筛选、预后评估等提供切实的理论基础和科学依据。
附图说明
图1为在前列腺癌与正常前列腺样本组织有差异且上调的FGF家族因子示意图。
图2为在前列腺癌与正常前列腺样本组织有差异且下调的FGF家族因子示意图。
图3为在前列腺癌与正常组织中有差异表达且在前列腺癌中表达水平较高的所有FGF家族因子示意图。
图4为FGF2与前列腺癌DFS相关性示意图。
图5为FGF17与前列腺癌OS相关性示意图。
图6为FGF22与前列腺癌OS相关性示意图
图7为通过通过R软件包pheatmap及Spearman对前列腺癌表达有差异的FGF家族分子相关性分析结果示意图。
图8为使用cbioportal网站对FGF家族基因在前列腺癌中的总的突变频率直方图。
图9为使用STRING网站查看不同表达的FGF家族因子的蛋白-蛋白相互作用网络结果示意图。
图10为使用GeneMANIA网站查看不同表达的FGF家族因子的蛋白-蛋白相互作用网络结果示意图。
图11为使用starbase网站查看目标miR在TCGA数据库中的前列腺癌样本中的表达情况结果示意图。
图12为使用miR_pathway网站查看目标miR在TCGA数据库中的前列腺癌样本中的表达情况结果示意图。
图13为前列腺癌及癌旁细胞中的FGF17和FGF22表达量定性分析结果示意图。
图14为前列腺癌及癌旁细胞中的FGF17和FGF22表达量定量分析结果示意图。
图15为过表达FGF17对PC3细胞增殖影响示意图。
图16为过表达FGF17对C4-2细胞增殖影响示意图。
图17为siFGF17对PC3细胞增殖影响示意图。
图18为siFGF17对C4-2细胞增殖影响示意图。
图19为siFGF17对PC3及C4-2细胞凋亡影响示意图。
图20为siFGF17对PC3细胞迁移和侵袭能力影响示意图。
图21为siFGF17对C4-2细胞迁移和侵袭能力影响示意图。
图22为miR-1-3p/FGF17对PC3细胞增殖影响示意图。
图23为miR-1-3p/FGF17对PC3细胞迁移影响示意图。
图24为miR-1-3p/FGF17对PC3细胞侵袭影响示意图。
图25为miR-1-3P/siFGF17对体内肿瘤生长质量的影响示意图。
图26为miR-1-3P/siFGF17对小鼠体内肿瘤生长体积影响示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括PC3、C4-2等细胞系从American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、USA)购入并根据ATCC指南进行培养。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心(武汉)的短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒(上海Biothrive Sci)验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如肿瘤细胞培养、动物实验、Western blot、分子克隆、小分子干扰技术、Transwell实验、划痕实验、Brdu标记等均为本领域的常规方法和技术。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和/或mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPadPrism 5.0或SPSS 20.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异
实施例1
既往研究已经确定了一些FGF家族因子在前列腺癌中的一般表达谱和功能，基于此，本发明选择FGF家族基因作为示例，以对本发明中所提及的筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法进行详细说明。应注意的是，以下有关FGF家族基因及其上游miRNA、所采用的软件版本等内容，仅应理解为方便本领域技术人员更加全面地掌握本发明的分析方法，而并非用于对本发明筛选方法的局限。
一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法，包括如下步骤：
(1)使用TCGA数据库中前列腺癌数据以评估前列腺癌和正常组织中FGF家族基因的表达水平。发现在前列腺癌与正常前列腺样本组织有差异且上调的FGF家族因子(FGF8、FGF13、FGF17、FGF22)(参见图1)，有差异且下调FGF家族因子(FGF1、FGF2、FGF6、FGF7、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF14、FGF16、FGF19、FGF20、FGF23)(参见图2)。为进一步了解FGF家族因子在前列腺癌中的表达情况，使用GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/example.html)进一步对在前列腺癌与正常组织中有差异表达的所有FGF细胞因子进行多基因比较，查看FGF家族中分子在前列腺癌中的相对表达水平，得到了在前列腺癌与正常组织中有差异表达且在前列腺癌中表达水平较高的所有FGF家族因子(FGF1、FGF2、FGF7、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF17、FGF20、FGF22)(参见图3)；
(2)使用GEPIA网站评估在前列腺癌中有表达差异的FGF家族基因与前列腺癌临床结果之间的相关性，当p＜0.05且HR＞1时具有统计学意义。
分析结果参见图4-6，结果显示，在前列腺癌中差异表达的FGF基因、在前列腺癌患者无病生存期(Disease Free Survival(DFS))中，发现具有高转录水平的FGF2(p＜0.01，图4)，低转录水平的FGF17(p＜0.01，图5)、FG F22(p＜0.05，图6)的前列腺癌患者与更长的无病生存期显着相关，而与前列腺癌患者总生存期(Overall Survival(OS))中差异无统计学意义。
使用R软件包对TCGA数据库中前列腺癌数据分析，结果显示，在前列腺癌中表达FGF2、FGF17、FGF22的前列腺癌患者的临床预后(无病生存期，DF S)，发现FGF2与前列腺癌患者的临床预后无明显相关性(p＝0.0556)，发现前列腺癌患者随着FGF17、FGF22表达上升，死亡人数越集中，再次证实在前列腺癌患者DFS中，低表达的FGF17、FGF22前列腺癌患者与更长的无病生存期显著相关(p＜0.05)，FGF17、FGF22在患者1、3、5年的患者生存预测中具有预测意义(AUC＞0.7)；
(3)通过R软件包pheatmap进行展示FGF家族基因的多基因相关性可视化图，使用的数据集包含来自496个TCGA中前列腺肿瘤的mRNA序列数据(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)；并使用Spearman的相关分析来描述没有正态分布的定量变量之间的相关性，p＜0.05被认为具有统计学意义；
结果如图7所示，结果显示，通过对在前列腺癌表达有差异的FGF家族分子进行相关性分析，发现FGF22与FGF17具有正相关性，两者低表达均与前列腺癌患者更长的无病生存期显着相关；
(4)利用生物信息学分析FGF家族基因与前列腺癌发生、发展过程的相关机制；具体步骤如下：
(a)使用cbioportal网站(http://www.cbioportal.org/)进行上述基因在前列腺癌中的突变分析，及查看其总的突变频率直方图；参数选择为：mRNA expre ssion z-scores relative to diploid samples(RNA Seq V2 RSEM)，z＝±2；发现FGF家族基因以mRNA突变为主，FGF家族基因在前列腺癌中突变频繁且明显(参见图8)；
(b)使用GEPIA网站通过相似基因检索，每个FGF家族基因选择最相似的20个相似基因；
(c)通过metascape网站(https://metascape.org/gp/index.html)进行GO、KEGG富集分析，显示p＜0.05的结果，并查看在前列腺癌中有明显差异表达的FGF家族基因及其相似基因在GO、KEGG的结果。
结果显示，在与其相关的KEGG的前两条通路分别为：库欣综合征、雌激素信号通路；已发现前列腺癌的发生发展与雌激素有一定的关系，考虑FGF家族因子可能通过雌激素信号通路参与前列腺癌的发展，FGF17基因突变与先天性性腺功能减退性腺功能减退(CHH)相关。而已知先天性性腺功能减退性腺功能减退(CHH)是由促性腺激素释放激素(GnRH，也称LHRH)缺乏引起的罕见病，在前列腺癌的雄激素剥夺疗法(ADT)治疗过程中促性腺激素释放激素(GnRH，也称LHRH)拮抗剂/激动剂药物的使用是主要药物治疗手段。已有研究证明，FGF17是编码GnRH神经元个体发育的第二重要的FGFR1c配体的基因，显示FGF17在成年期GnRH神经元存活中具有潜在作用，考虑可能FGF17在前列腺癌中高表达可致GnRH表达增加与前列腺癌的发生、发展有一定的关系；
(d)使用STRING及GeneMANIA网站查看不同表达的FGF家族因子的蛋白-蛋白相互作用网络。结果如图9-10所示，结果显示，FGF家族因子间相互作用密切，且在前列腺癌有表达差异的FGF家族因子(FGF1、FGF2、FGF7、FG F9、FGF10、FGF17、FGF20、FGF22)表达蛋白与免疫反应调节细胞表面受体信号通路相关，FGF1、FGF2、FGF10因子表达蛋白与泌尿生殖系统发展相关；
(e)使用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)网站，网站，研究差异表达的FGF家族与免疫细胞浸润之间的相关性，选择前列腺癌为组织类型进行分析；
结果显示，FGF1、FGF2、FGF7、FGF9、FGF10、FGF11与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞浸润均呈正相关(p＜0.05)，FGF12与CD8+T细胞浸润呈正相关，FGF13与B细胞、CD8+T细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞浸润均呈正相关(p＜0.05)，FGF14与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞浸润均呈正相关(p＜0.05)，FGF20与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞及树突状细胞浸润均呈正相关(p＜0.05)，FGF22与CD4+T细胞浸润均呈正相关(p＜0.05)；发现CD4+T细胞浸润越少，FGF22表达就越高(Cor＝0.15，p＝2.33e-3)。FGF17与CD4+T细胞、嗜中性粒细胞浸润均呈正相关，其中与CD4+T细胞明显相关(p＜0.001)，与B细胞、CD8+T细胞浸润均呈负相关，其中与CD8+T细胞明显相关且发现CD8+T细胞浸润越多，FGF17表达就越低(p＜0.001)(图中未示出)；
(5)使用Targetscan v7.2(http://www.targetscan.org/)网站，预测靶向FG F17的miRNA。结果显示，has-miR-206、has-miR-613及has-miR-1-3p与FGF17的3’UTR有对应的结合位点；使用TarBase v.8(https://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/)网站，预测靶向FGF17的miRNA，得到miR-335-5p、has-let-7b-5p；
(6)使用starbase网站及miR_pathway网站，查看目标miR在TCGA数据库中的前列腺癌样本中的表达情况。结果如图11-12所示，结果显示，miR-1-3p在前列腺癌中下调；通过对临床样本测序分析，进一步验证了miR-1-3p在前列腺癌中低表达；
(7)采用统计学软件进行数据分析。
综合上述结果，本发明发现FGF家族的多个基因在前列腺癌的发生发展中起到一定的作用，其中FGF22、FGF17可能是前列腺癌的诊断及前列腺癌的临床预后标志物，FGF17与前列腺癌肿瘤微环境中的免疫浸润相关，miR-1-3p通过靶向FGF17调节前列腺癌的增殖、侵袭。
实施例2前列腺癌及癌旁细胞中的FGF17和FGF22表达量分析
(1)收集46位前列腺癌患者手术切除的前列腺癌组织及癌旁组织，并与患者签署知情同意书；
(2)将组织样本在离体30分钟内冻存于液氮中，随后转-80℃；
(3)将-80℃中样本用于蛋白的提取及qRT-PCR实验。
结果如图13所示。结果显示，与邻近的正常组织相比，前列腺癌组织中的FGF17与FGF22表达量显著增高，差异有统计学意义(P<0.001)。
进一步地，选取前列腺癌细胞C4-2、DU145、PC3以及正常前列腺细胞RWPE-1，通过WB实验定量检测其中FGF17及FGF22表达水平，结果如图14所示。结果与上述对前列腺癌组织的检测结果一致，即FGF17和FGF22在三种前列腺癌细胞中表达均显著降低，差异具有统计学意义。
更进一步地，通过对具有临床病理参数和生存数据的前列腺癌患者进行分析，发现FGF17和FGF22表达水平与组织学分级呈现正相关；此外，FGF17和FGF22表达较低的前列腺癌患者的总生存率明显高于FGF17和FGF22表达较高的患者(图中未示出)。由此可见，FGF17和FGF22的表达高低会直接影响前列腺癌患者的预后及生存时间。
实施例3前列腺癌细胞增殖实验
(1)从PC3及C4-2细胞中提取RNA并逆转录，PCR扩增FGF17 cDNA并构建到相关载体中，测序及蛋白表达验证，得到了FGF17的过表达质粒，通过WB检测验证其有效性及特异性；
(2)利用构建好的FGF17过表达质粒分别转染至PC3及C4-2细胞中，构建获得PC3-FGF17过表达细胞及C4-2-FGF17过表达细胞；
(3)于96孔中分别接种C4-2细胞、C4-2-FGF17过表达细胞、PC3细胞及PC3-FGF17过表达细胞，每孔接种1×104个细胞，每种细胞三个平行孔；
(4)分别于接种后的24h、48h、72h和96h利用CCK-8于450nm处检测吸光度，以监测细胞的增殖情况。
结果如图15-16所示。结果显示，在FGF17基因过表达后，PC3及C4-2细胞的增殖能力显著增强，差异具有统计学意义。
进一步地，针对FGF17的mRNA序列设计并合成了siRNA(siFGF17)，其中siFGF17序列为如如SEQ ID NO:1所示，为AGUCCUGUUCACGCAGCU CACC，将其转染至PC3及C4-2细胞中，通过WB检测验证了该siFGF17的有效性及特异性。
进而采用转染有siFGF17的PC3和C4-2细胞分别处理24、48及72小时，采用CCK-8、Brdu标记等方法对细胞进行检测，结果如图17-19所示，可以看到，在利用siFGF17对FGF17基因进行沉默后，PC3及C4-2细胞的增殖能力显著减弱，且可显著抑制前列腺癌细胞生长并诱导细胞凋亡，使得PC3及C4-2细胞的凋亡率明显升高，差异具有统计学意义。
实施例4细胞划痕及侵袭实验
选择PC3和C4-2细胞，分别进行细胞划痕实验，具体步骤如下：
(1)对处于对数生长期的PC3对照组、PC3-siFGF17组和C4-2对照组、C4-2-siFGF17组各组别细胞进行消化，细胞计数2×105个/mL种在6孔板中，待细胞密度长到95％以上时进行划痕实验，实验前进行血清饥饿4h；
(2)用1ml的枪头垂直孔板划线：横向2-3条线，纵向2-3条线，用2mLPBS清洗掉的细胞，共3次；将孔板中的培养液更换为无血清培养液。之后，用无血清培养基在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中培养细胞；
(3)拍照记录0h、24h的细胞迁移情况。用ImageJ软件进行数据处理。
进一步地，选择选择PC3和C4-2细胞，分别进行Transwell实验，具体步骤如下：
(1)于-20℃取出Matri-gel置于4℃过夜水化；
(2)采用无血清培养液稀释水化后的Matri-gel(Matri-gel:无血清培养液为1:4)，混匀后置于冰上备用，用200μL枪头吸取70μL稀释后的Matri-gel，枪头垂直对准侵袭上室中间小心加入Matri-gel，轻轻画圈，使胶铺满小室底部；
(3)将铺好Matri-gel胶的小室轻轻放入37℃培养箱，放置30-40min，使Matri-gel聚合成凝胶；
(4)实验前将PC3对照组、PC3-siFGF17组和C4-2对照组、C4-2-siFGF17组细胞血清饥饿4-6h；随后取出细胞进行细胞消化计数，用DPBS洗涤细胞一次，用500μL无血清培养基将细胞重悬、调整细胞密度至1×105/mL；
(5)取出铺好胶的Transwell小室，于小室下部加入600μL含10％FBS的培养基；轻轻在胶上加入200μL细胞悬液(即2×104个细胞)；
(6)在细胞培养箱中培养24h后，吸去上室内培养基，用DPBS湿润棉签，用棉签轻轻擦去上室内的细胞，用DPBS洗涤上室，吸取多余细胞；
(7)采用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，0.1％结晶紫染色20分钟，ddH2O清洗至背景清晰；
(8)镜下随机选取3个视野，进行拍照。
结果如图20-21所示。其中迁移实验结果显示，在正常PC3和C4-2细胞中，24h内划痕闭合迅速。而在抑制FGF17表达后，PC3和C4-2细胞划痕闭合速度明显降低，差异具有统计学意义。由此可见确定，通过沉默FGF17能够有效降低前列腺癌细胞的迁移能力。侵袭实验结果显示，与正常PC3和C4-2细胞相比，在抑制FGF17表达后，PC3和C4-2细胞跨膜速度明显降低，差异具有统计学意义。由此可见确定，通过沉默FGF17能够有效降低前列腺癌细胞的侵袭能力。
实施例5miR-1-3p/FGF17对前列腺癌细胞行为及功能的影响
(1)取对数生长期的PC3细胞，胰酶消化并计数，按各种细胞的倍增时间选择合适的细胞密度，接种到96孔板中(3个重复)；
(2)37℃培养箱中培养24h，采用经胆固醇(Ribobio Inc.)包裹的miR-1-3p Mimic(序列如SEQ ID NO:2所示，为UGGAAUGUAAAGAAGUAUGU AU，终浓度为50nM)和/或FGF17(终浓度为100nM)对细胞进行处理，空白对照组加入等体积空白培养基，处理72h后，每孔加10μlCCK-8；
(3)将培养板在培养箱内孵育1-4h，测定450nm吸光度，评估细胞的增殖状况。
结果如图22-24所示。可以发现，FGF17过表达能够提高前列腺癌细胞的增殖活性以及增殖、侵袭能力，而miR-1-3p Mimics处理后，前列腺癌细胞的增殖能力均减弱，且其迁移以及侵袭能力也得到了显著的降低，显示miR-1-3p对于FGF17的活性以及前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力具有很好的抑制作用。
实施例6miR-1-3p/FGF17在体内对前列腺癌的影响
(1)于6周龄裸鼠皮下注射正常PC3细胞，成瘤后选取瘤体大小接近的24只裸鼠，随机分为3组，每组6只；
(2)对组1小鼠每天于肿瘤部位注射200μL生理盐水，对组2小鼠每天于肿瘤部位注射200μL经胆固醇(Ribobio Inc.)包裹的siFGF17(100μM)，对组3小鼠每天于肿瘤部位注射200μL经经胆固醇(Ribobio Inc.)包裹的mi R-1-3p mimic(100μM)，对组4小鼠每天于肿瘤部位注射100μL经胆固醇(Ribobio Inc.)包裹的siFGF17(100μM)和100μL经经胆固醇(Ribobio Inc.)包裹的miR-1-3p mimic(100μM)；
(3)定期记录每组小鼠的生长状态及体重，一个月后，处死小鼠，收集肿瘤测量质量。
实验结果如图25-26所示。由结果可以看到，相较于对照组组1，接种siF GF17或miR-1-3p mimic后裸鼠体内的肿瘤生长明显被抑制，差异具有统计学意义；而在同时接种siFGF17及miR-1-3p mimic后，裸鼠体内肿瘤生长抑制效过更为明显，差异具有统计学意义。由此验证了对于FGF17的抑制和/或miR-1-3p的激活在体内能够显著抑制前列腺癌细胞生长。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院)
<120> 一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aguccuguuc acgcagcuca cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uggaauguaa agaaguaugu au 22

Claims (2)

1.FGF17抑制剂在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特征在于，所述FGF17抑制剂选自siFGF17或miR-1-3p mimic中的一种或多种，所述siFGF17序列如SEQ ID NO:1所示；所述miR-1-3p mimic序列如SEQ ID NO:2所示。
2.检测FGF表达水平的试剂在制备诊断或预后前列腺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述FGF选自FGF17、FGF22中的一种或多种；所述试剂包括检测FGF基因mRNA表达水平的特异性引物和/或检测FGF蛋白含量的抗体。
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