CN115011697B - Alyref在前列腺癌治疗和评估中的应用 - Google Patents
Alyref在前列腺癌治疗和评估中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115011697B CN115011697B CN202210946687.2A CN202210946687A CN115011697B CN 115011697 B CN115011697 B CN 115011697B CN 202210946687 A CN202210946687 A CN 202210946687A CN 115011697 B CN115011697 B CN 115011697B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alyref
- prostate cancer
- treatment
- cells
- assessment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及ALYREF在前列腺癌治疗和评估中的应用。本发明通过大量研究发现ALYREF是一个与前列腺癌等发生发展极为相关的基因;通过对ALYREF表达进行抑制后,能够显著抑制前列腺癌细胞体内及体外的增殖、克隆形成以及侵袭等活动及功能。同时,对临床样本的研究显示,ALYREF较高的表达水平与前列腺癌Gleason评分存在明显的正相关性,从而可以用以预测前列腺癌等疾病的恶性程度和治疗预后,为患者接受术前治疗提供提前评估。本发明为人类攻克前列腺癌提供了一个新的药物治疗靶点,从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向,具有极高的社会价值和市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及ALYREF在前列腺癌治疗和评估中的应用。
背景技术
前列腺癌(PCa)在全球男性癌症相关死亡率中排名第五。直到2015年,“外转录组”相关研究才开始出现,并对癌症等人类疾病的研究产生了重大影响。在过去十年中,内分泌治疗和化疗一直是PCa治疗的基础。根据PAM50分类方案,具有LumB亚型的PCa患者的预后比具有基础和LumA亚型的患者更差,但LumB患者从雄激素剥夺治疗(ADT)中获益更多。LumA肿瘤已被证明对吉西他滨更敏感,而基底肿瘤已被证明对多西他赛更敏感。此外,用ARSI(Androgen receptor signaling inhibitor,雄激素受体信号抑制剂)治疗的管腔肿瘤比基底肿瘤具有显着更好的生存率。
在许多恶性肿瘤中,癌症免疫疗法已被证明是一种成功且至关重要的治疗选择。由于PCa的异质性,用于PCa的临床指标不能满足风险预测和个体化治疗。开发用于预测PCa 预后和治疗反应的新型生物标志物势在必行。越来越多的证据表明,独立于基因组不稳定性和突变的非突变表观遗传重编程是癌症进展的新标志。尽管近几十年来PCa的预后有所改善,但大多数患者不可避免地会产生去势抵抗。因此迫切需要找到新的治疗靶点来提高PCa的治疗效果以及改善预后。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中所存在的前列腺癌发病因素不明确、难以进行提前预防且治疗效果不明显、预后差的技术问题,从而提供了一种新的治疗靶点和策略,通过以ALYREF作为关键靶点,能够有效进行前列腺癌的辅助诊断、治疗以及预后评估。
为了解决上述技术问题,本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了ALYREF抑制剂在制备预防和/或治疗前列腺癌的药物中的应用。
作为优选地,所述ALYREF抑制剂选自靶向ALYREF的siRNA。
作为优选地,所述靶向ALYREF的siRNA选自si392、si615和si767中的一种或多种。
作为优选地,所述si392的序列为CAGGAACUCUUUGCUGAAU;si615的序列为GAGGUGGCAUGACUAGAAA;si767的序列为GACGCCUAUAAUGCGAGAA。
本发明第二方面提供了检测ALYREF表达水平的试剂在制备用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的产品中的应用。
作为优选地,所述检测ALYREF表达水平的试剂包括检测ALYREF基因表达水平的引物对和/或检测ALYREF基因编码的蛋白含量的试剂。
作为优选地,所述引物对的正向引物序列为GGCAGCACGATCTTTTCGAC,反向引物序列为CTGTTCCTAAGCTGCGACCA。
作为优选地,所述检测ALYREF基因编码的蛋白含量的试剂选自ALYREF单克隆抗体和/或ALYREF多克隆抗体。
作为优选地,所述产品还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地,所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
本发明第三方面提供了一种用于预防和/或治疗前列腺癌的药物组合物,包括ALYREF抑制剂。
作为优选地,所述ALYREF抑制剂选自靶向ALYREF的siRNA,所述靶向ALYREF的siRNA选自si392、si615和si767中的一种或多种。
作为优选地,所述si392的序列为CAGGAACUCUUUGCUGAAU;si615的序列为GAGGUGGCAUGACUAGAAA;si767的序列为GACGCCUAUAAUGCGAGAA。
本发明第四方面提供了一种用于前列腺癌辅助诊断和/或预后评估的试剂盒,包括检测ALYREF基因表达水平的引物对和/或检测ALYREF基因编码的蛋白含量的试剂。
作为优选地,所述引物对的正向引物序列为GGCAGCACGATCTTTTCGAC,反向引物序列为CTGTTCCTAAGCTGCGACCA。
作为优选地,所述检测ALYREF基因编码的蛋白含量的试剂选自ALYREF单克隆抗体和/或ALYREF多克隆抗体。
作为优选地,所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。
作为优选地,所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。
在没有特别说明的情况下,在本发明上下文中,所述引物和/或引物对组是指用于在PCR中合成ALYREF基因cDNA链的PCR引物,从而用于检测ALYREF基因的表达水平。
本发明相对于现有技术具有如下技术效果:
(1)本发明对通过大量研究和筛选,对临床样本的研究显示,ALYREF较高的表达水平与前列腺癌Gleason评分存在明显的正相关性,从而可以用以预测前列腺癌等疾病的恶性程度和治疗预后,从而筛选出前列腺癌的高发病人群,以进行合理的提前预防,显著降低疾病发生的概率及严重程度,减少对人体健康的损害,同时为患者接受术前治疗提供提前评估,提供个性化治疗方案。
(2)本发明通过揭示ALYREF基因与前列腺癌的关联性,提示通过抑制体内AYLREF能够有效抑制前列腺癌细胞体内及体外的增殖、克隆形成以及侵袭等活动及功能,其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题,更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克前列腺癌提供了一个新的药物治疗靶点,从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向,具有极高的社会价值和市场应用前景。
附图说明
图1为体内不同ALYREF表达水平的接受一线ARSI治疗的PCa患者Kaplan-Meier曲线(p=0.008,对秩数检验)、时间依赖性ROC分析以及临床结果(生存或死亡)比例分析结果示意图。
图2为体内不同ALYREF表达水平的接受一线ARSI治疗的PCa患者Kaplan-Meier曲线(p=0.055,对秩数检验)、时间依赖性ROC分析以及ARSI抵抗比例分析结果示意图。
图3为对Lasso 模型中最优参数(lambda)的选择示意图。
图4为候选基因LASSO系数谱以及针对log(lambda)序列生成系数剖面示意图。
图5为前列腺癌组织及癌旁正常组织中ALYREF表达水平示意图。
图6为不同ALYREF表达水平的前列腺癌患者生存时间结果示意图。
图7为不同前列腺癌细胞(22Rv1、LNCaP、C4-2、PC-3、DU145)中ALYREF表达水平结果示意图。
图8为在使用siRNA处理后不同前列腺癌细胞(C4-2、LNCaP)中ALYREF表达水平结果示意图。
图9为siRNA对不同前列腺癌细胞(C4-2、LNCaP)增殖能力影响结果示意图。
图10为siRNA对C4-2细胞克隆形成能力影响结果示意图。
图11为siRNA对LNCaP细胞克隆形成能力影响结果示意图。
图12为siRNA对C4-2细胞侵袭能力影响结果示意图。
图13为siRNA对LNCaP细胞侵袭能力影响结果示意图。
图14为siRNA对小鼠体内肿瘤生长体积影响结果示意图。
图15为siRNA对小鼠体内肿瘤生长体积影响定量分析结果示意图。
图16为siRNA对小鼠体内肿瘤生长曲线影响示意图。
图17为利用IHC分析ALYREF表达量与Gleason评分之间相关性结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下,本发明上下文中所列出的包括BPH-1、22Rv1、LNCaP、C4-2、PC-3和DU145等细胞系均按照现有技术进行培养,所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心(武汉)短串联重复分析鉴定,并使用PCR检测试剂盒(上海Biothrive Sci)验证是否存在支原体污染,同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中,均通过市售获得。所有实用动物均购自于广东省医学实验动物中心,所有动物实验均经过动物保健委员会批准。对于临床标本的使用,均与患者签署了知情同意书,相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法,例如DNA提取、全基因组测序、引物设计、免疫组化、Western blot、细胞实验、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中,数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有体外实验至少重复三次,动物实验重复两次。数据采用GraphPad Prism 8.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、Wilcoxon检验、皮尔逊系数、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p<0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1 与前列腺癌相关基因的筛选
前列腺腺癌组织的基因表达序列、DNA突变和拷贝数变异 (CNV)数据从癌症基因组图谱 (TCGA, http://portal.gdc.cancer.gov/)中获取并经过R包GDCRNATools中的函数进行加工处理。从泌尿生殖发育分子解剖项(GUDMAP)数据库下载并整合了健康人类前列腺中不同细胞类型的单细胞 RNAseq。从 Gene Expression Omnibus (GEO) 和cBioPortal (https: //www.cbioportal.org/)获取了来自包括 GSE91061、GSE135222和Checkmate三种癌症的免疫治疗队列。ALYREF的RNA-seq和RIP-seq被上传到 GEO(GSE195701),随后进行聚类分析。
根据分析结果选择了TIDE评分高于1的PCa患者,以确定相关评分特征和各基因调节剂是否可以预测免疫检查点阻断 (ICB)反应和结果。分析结果显示,只有ALYREF与TIDE评分间接正相关。重要的是,ALYREF的高mRNA表达预示着接受ARSI治疗的患者预后不良和缺乏临床益处(参见图1-2)。此外,在三个免疫疗法验证队列中ALYREF均呈现高表达,表明接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的患者预后不良且缺乏临床益处。基于上述结果表明ALYREF可能是PCa的潜在预后和治疗预测因子。
进一步地,以TCGA-PRAD中具有生化复发(Biochemical recurrence ,BCR)生存信息患者作为研究对象,其中总共有来自 TCGA-PRAD的464名PCa患者和来自GSE54460、斯德哥尔摩、CPC和DKFZ群体的396名PCa患者分别作为测试组和验证组,没有BCR随访信息的患者被排除在外。同时应用LASSO回归来避免评分模型的过度拟合(参见图3-4),产生包括ALYREF在内的7个候选预后基因。通过对前列腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织中ALYREF表达水平的分析发现,在肿瘤组织中ALYREF表达水平明显高于癌旁正常组织(参见图5),该差异具有统计学意义(p<0.05)。通过Kaplan-Meier生存曲线分析显示,ALYREF在体内的表达水平与前列腺癌患者的生产率密切相关,其中ALYREF低表达患者总体生存率率明显高于ALYREF高表达患者,该差异具有统计学意义(p<0.001)(参见图6)。由此可以明确,ALYREF与前列腺癌存在高度的关联性。
实施例2 ALYREF前列腺癌细胞中的表达情况研究
为了确定ALYREF在体外和体内PCa中的潜在作用,首先检测了五种前列腺细胞系中ALYREF蛋白的表达水平,具体步骤如下:
(1)将前列腺癌细胞(22Rv1、LNCaP、C4-2、PC-3、DU145)或前列腺上皮细胞(BPH-1)消化、收集,加入裂解液,冰上裂解1h;
(2)4℃ 15000×g离心15min,取上清加入loading buffer(至1×),95℃水浴5min;
(3)取步骤(2)制备得到的样品进行蛋白凝胶电泳;
(4)电泳完成后取蛋白凝胶进行转膜操作(PVDF膜,200mA恒流转膜2h);
(5)转膜完成后取出PVDF膜置于封闭液中,于垂直摇床10rpm室温封闭2h;
(6)封闭完成后清洗PVDF膜,浸入一抗(anti-ALYREF)中,置于垂直摇床上10rpm 4℃孵育过夜;
(7)一抗孵育完成后,清洗PVDF膜,随后浸入二抗(HRP-linked anti-rabbit IgG)中,置于垂直摇床上10rpm室温孵育2h;
(8)二抗孵育完成后,清洗PVDF膜,利用化学发光仪对目标蛋白进行检测(β-actin作为内参)。
检测结果如图7所示。结果显示,ALYREF在正常前列腺组织细胞中低表达,而在前列腺癌细胞中明显高表达。
随后,通过靶向ALYREF的siRNA(si392、si615、si767)分别转染C4-2和LNCaP细胞,并对其中ALYREF表达情况进行检测,其中si392的序列为CAGGAACUCUUUGCUGAAU;si615的序列为GAGGUGGCAUGACUAGAAA;si767的序列为GACGCCUAUAAUGCGAGAA;具体步骤如下:
(1)将靶向ALYREF的siRNA(si392、si615、si767)分别转染至C4-2和LNCaP细胞中,于常规培养条件进行培养;取对数生长期的细胞进行消化、收集,加入裂解液,冰上裂解1h;
(2)4℃ 15000×g离心15min,取上清加入loading buffer(至1×),95℃水浴5min;
(3)取步骤(2)制备得到的样品进行蛋白凝胶电泳;
(4)电泳完成后取蛋白凝胶进行转膜操作(PVDF膜,200mA恒流转膜2h);
(5)转膜完成后取出PVDF膜置于封闭液中,于垂直摇床10rpm室温封闭2h;
(6)封闭完成后清洗PVDF膜,浸入一抗(anti-ALYREF)中,置于垂直摇床上10rpm 4℃孵育过夜;
(7)一抗孵育完成后,清洗PVDF膜,随后浸入二抗(HRP-linked anti-rabbit IgG)中,置于垂直摇床上10rpm室温孵育2h;
(8)二抗孵育完成后,清洗PVDF膜,利用化学发光仪对目标蛋白进行检测(β-actin作为内参)。
检测结果如图8所示。结果显示,相较于空白载体siNC组,转染有si392、si615或si767的前列腺癌细胞中ALYREF的表达得到了显著抑制,该差异具有统计学意义。
实施例3 ALYREF对体外前列腺癌细胞行为和功能的影响
通过靶向ALYREF的siRNA,研究其对前列腺癌细胞增殖的影响,具体步骤如下:
(1)将靶向ALYREF的siRNA(si615和si767)分别转染至C4-2和LNCaP细胞中;
(2)待细胞生长至对数期时,胰酶消化并计数,按各种细胞的倍增时间选择合适的细胞密度,接种到96孔板中(3个重复);
(3)于37℃培养箱中进行培养,并分别于24h、48h、72h以及96h搜集细胞,每孔加10μL CCK-8,将培养板在培养箱内孵育1-4h,测定450nm吸光度,评估细胞的增殖状况。
结果如图9所示。结果显示,在利用siRNA对ALYREF基因进行沉默后,前列腺癌细胞的增殖能力显著减弱,可显著抑制前列腺癌细胞生长,使得前列腺癌细胞的增殖活性明显降低,差异具有统计学意义。
随后,通过靶向ALYREF的siRNA,研究其对前列腺癌细胞克隆形成的影响,具体步骤如下:
(1)将靶向ALYREF的siRNA(si615和si767)分别转染至C4-2和LNCaP细胞中;
(2)待细胞生长至对数期时,胰酶消化并计数,按各种细胞的倍增时间选择合适的细胞密度,接种到含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀,置37℃5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养;
(3)当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养,弃去上清液,用PBS小心浸洗2次,每孔加入含0.5%结晶紫的甲醇1mL,染色30min;弃甲醇,用水清洗残留的甲醇;即可观察到细胞克隆;显微镜下观察,细胞数>50个才计为一个有效克隆。
检测结果如图10-11所示。结果显示,相较于空白载体siNC组,在利用siRNA对ALYREF基因进行沉默后,前列腺癌细胞的克隆形成能力显著减弱,可显著抑制前列腺癌细胞克隆形成,差异具有统计学意义。
进一步地,通过靶向ALYREF的siRNA,研究其对前列腺癌细胞侵袭的影响,具体步骤如下:
(1)将ECM Gel原液提前1h放在4℃冰箱中解冻,实验前转移到冰盒中;将1.5mL EP管、枪头和细胞小室,置于冰上预冷;
(2)按照ECM Gel:无血清培养基=1:7.5的比例在冰上稀释成使用液。将枪头剪去一小段(约3µm)后在冰上吸取40µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入小室的上室中,加入时慢慢移动枪头,保证液体平铺在底部;随后置于37℃培养箱15min,待胶凝固;
(3)待细胞生长至对数期时,胰酶消化并计数,按各种细胞的倍增时间选择合适的细胞密度,用无血清培养基稀释细胞,制成细胞悬液;
(4)按照每孔200µL,将细胞悬液加入上室,同时在下室加入10% FBS+培养基500µL,放入37℃培养箱培养;
(5)24小时后取出,吸去上室多余液体,用PBS清洗两次,用棉棒在上室中轻轻转动,吸干水分并擦去膜内侧的细胞;
(6)在上室中加入结晶紫染液,染色5min,回收染液,用PBS缓缓冲去染液,再次用棉棒在上室中轻轻转动,吸干水分;
(7)在正置显微镜上放置一块载玻片,将细胞小室倒置于载玻片上,在100倍视野下进行拍照,对膜的上下左右及中间计数。
检测结果如图12-13所示。结果显示,无论是对于C4-2细胞还是LNCaP细胞,相较于空白载体siNC组,在利用siRNA抑制剂抑制细胞内ALYREF的表达水平后,均能够显著抑制前列腺癌细胞的侵袭能力,该差异具有统计学意义。
实施例4 ALYREF对体内前列腺癌细胞生长的影响
(1)选取4周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠分为两组,待C4-2细胞生长至对数期后,胰酶消化并计数,将细胞与Matrigel(Corning,354277)混合后注射至小鼠背部皮下,每只小鼠接种约3×106个细胞;
(2)待成瘤后,将小鼠随机分为2组,计为组1和组2,每组各5只;
(3)将siNC或si615与RNAi-Mate(GenePharm,G04001)混合后,原位注射至小鼠肿瘤内,其中组1注射10μL siNC,组2注射10μL si615(浓度为0.1nmol/uL),每周2次,连续治疗3周;
(2)定期记录每组小鼠的生长状态、体重以及肿瘤体积,一个月后,处死小鼠,收集肿瘤测量体积和重量。
检测结果如图14-16所示。结果显示,相较于组1,组2小鼠在经注射si615对ALYREF表达进行抑制后,体内肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤生长体积明显更小,该差异具有统计学意义。由此可见,通过对ALYREF进行抑制,能够显著抑制体内前列腺癌细胞的生长。
进一步地,搜集70位前列腺癌患者病理组织标本,进行免疫组化(IHC)实验分析,评估其中ALYREF表达情况,具体步骤如下:
(1)病理组织切片机将前列腺癌癌组织切片至4μm厚度,展于防滑玻片上,65℃,2小时烤干备用;
(2)脱蜡:将载玻片依次放入二甲苯I中浸泡5min→二甲苯II中浸泡5min→二甲苯III中浸泡5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→ddH2O I 3min→ddH2O II 3min;
(3)封闭过氧化物酶:3%过氧化氢中浸泡10min,PBS清洗5min;
(4)高压抗原修复;配置EDTA修复液加入高压锅中,将载玻片放入锅中,800W,20min后,放至自然冷却;
(5)PBS清洗载玻片2遍,每次3min,用小纸片吸干组织周围水分,组化油笔距离组织边界0.5cm画圈;
(6)油化组织表面:将载玻片浸泡在0.1%PBST中,上下提拉并浸泡3min;
(7)一抗孵育:按说明书比例用抗体稀释液稀释抗体,50uL 4℃孵育过夜后,PBS洗3min,PBST洗3min;
(8)二抗孵育:DAKO二抗每组织1滴,覆盖组织表面,37℃孵育1小时后,PBS洗3min,PBST洗3min;
(9)配置DAB显色液:按比例配置显色液,甩干载玻片上液体后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,载玻片浸泡PBS终止显色;
(10)复染细胞核:终止DAB染色后的载玻片用苏木素复染3分钟左右,流水冲洗;
(11)加入20ul封片剂封片后,显微镜下计数。
检测结果如图17所示。结果显示,在Gleason高评分组(Gleason评分7-9)中,ALYREF呈现高表达,且ALYREF主要位于细胞核中(参见图17)。由此可以明确ALYREF在前列腺癌中的表达水平与Gleason评分呈现正相关,ALYREF表达水平越高,前列腺癌恶性程度越高。
由上述可以明确,ALYREF是一个与前列腺癌等发生发展极为相关的基因,相较于前列腺正常细胞或组织,前列腺癌细胞中ALYREF明显高表达;而通过对ALYREF表达进行抑制后,能够显著抑制前列腺癌细胞体内及体外的增殖、克隆形成以及侵袭等活动及功能。同时,对临床样本的研究显示,ALYREF较高的表达水平与前列腺癌Gleason评分存在明显的正相关性,从而可以用以预测前列腺癌等疾病的恶性程度和治疗预后,为患者接受术前治疗提供提前评估。同时,本发明通过揭示ALYREF基因与前列腺癌等发生发展之间关联性,其对于解决前列腺癌个体间临床疗效差异与退缩效果/预后评估空白的难题,更好地实现精准治疗具有重要的现实意义。为人类攻克前列腺癌提供了一个新的药物治疗靶点,从而为后续的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向,具有极高的社会价值和市场应用前景。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是,上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路,而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下,本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改,上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.ALYREF抑制剂在制备预防和/或治疗前列腺癌的药物中的应用,其特征在于,所述ALYREF抑制剂选自靶向ALYREF的siRNA,所述靶向ALYREF的siRNA选自si392、si615和si767中的一种或多种,其中si392的序列为CAGGAACUCUUUGCUGAAU;si615的序列为GAGGUGGCAUGACUAGAAA;si767的序列为GACGCCUAUAAUGCGAGAA。
2.一种用于预防和/或治疗前列腺癌的药物组合物,其特征在于,包括ALYREF抑制剂,所述ALYREF抑制剂选自靶向ALYREF的siRNA,所述靶向ALYREF的siRNA选自si392、si615和si767中的一种或多种,其中si392的序列为CAGGAACUCUUUGCUGAAU;si615的序列为GAGGUGGCAUGACUAGAAA;si767的序列为GACGCCUAUAAUGCGAGAA。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210946687.2A CN115011697B (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | Alyref在前列腺癌治疗和评估中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210946687.2A CN115011697B (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | Alyref在前列腺癌治疗和评估中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115011697A CN115011697A (zh) | 2022-09-06 |
CN115011697B true CN115011697B (zh) | 2022-12-27 |
Family
ID=83065881
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210946687.2A Active CN115011697B (zh) | 2022-08-09 | 2022-08-09 | Alyref在前列腺癌治疗和评估中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115011697B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117180297B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-09-20 | 广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心) | 用于前列腺癌诊断、治疗以及预后评估的标志物及其应用 |
CN117143925B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-01-12 | 细胞生态海河实验室 | 定量表达Alyref手段在制备诊断或延缓血液系统衰老试剂盒中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107904311A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-04-13 | 徐州维康生物科技有限公司 | 一种前列腺癌标志物及其用途 |
CN114252611A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-03-29 | 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院) | 一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112043722B (zh) * | 2020-09-25 | 2022-02-15 | 中国医科大学 | Prpf6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用 |
CN112250751B (zh) * | 2020-10-22 | 2022-06-03 | 济南市中心医院 | LENG8作为mRNA转录调控蛋白及线粒体活性调控蛋白的应用 |
CN112516317B (zh) * | 2020-12-10 | 2021-12-17 | 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院) | 一种预防和治疗癌症的药物组合物及其应用 |
CN112725453B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-07-12 | 复旦大学附属肿瘤医院 | m5c修饰调节基因组在制备肿瘤预后评估试剂或试剂盒中的应用 |
-
2022
- 2022-08-09 CN CN202210946687.2A patent/CN115011697B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107904311A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-04-13 | 徐州维康生物科技有限公司 | 一种前列腺癌标志物及其用途 |
CN114252611A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-03-29 | 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院) | 一种筛选前列腺癌潜在生物标志物的方法及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115011697A (zh) | 2022-09-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115011697B (zh) | Alyref在前列腺癌治疗和评估中的应用 | |
CN108315414B (zh) | 一种预测食管鳞状细胞癌预后的生物标志物 | |
Hao et al. | Characterization of distinct populations of carcinoma-associated fibroblasts from non–small cell lung carcinoma reveals a role for ST8SIA2 in cancer cell invasion | |
Wallerand et al. | Phospho-Akt pathway activation and inhibition depends on N-cadherin or phospho-EGFR expression in invasive human bladder cancer cell lines | |
Ke et al. | ALG3 contributes to the malignancy of non-small cell lung cancer and is negatively regulated by MiR-98-5p | |
Mansoori et al. | High GD2 expression defines breast cancer cells with enhanced invasiveness | |
US11834682B2 (en) | Method for identifying anti-cancer agents using an in vitro cell culture system that maintains cancer cell stemness | |
Liu et al. | Increased expression of lncRNA FTH1P3 promotes oral squamous cell carcinoma cells migration and invasion by enhancing PI3K/Akt/GSK3b/Wnt/β-catenin signaling. | |
CN106834486B (zh) | 骨肉瘤分子诊疗标志物及其应用 | |
Tsai et al. | Epigenetic therapy regulates the expression of ALDH1 and immunologic response: relevance to the prognosis of oral cancer | |
Leiser et al. | Prognostic value of heparanase expression and cellular localization in oral cancer | |
CN112501299A (zh) | 一种用于预测肝癌复发和转移的方法及应用 | |
Matsuda et al. | EpCAM, a potential therapeutic target for esophageal squamous cell carcinoma | |
CN115032397A (zh) | 一种胃癌预后分子标志物 | |
Sun et al. | miR‐2392 functions as tumour suppressor and inhibits malignant progression of hepatocellular carcinoma via directly targeting JAG2 | |
CN114427003A (zh) | Nhp2在预测癌症放疗敏感性和预后中的应用 | |
Wu et al. | CK2α causes stemness and chemotherapy resistance in liver cancer through the Hedgehog signaling pathway | |
Qin et al. | High expression of neutrophil cytosolic factor 2 (NCF2) is associated with aggressive features and poor prognosis of esophageal squamous cell carcinoma | |
CN113755594B (zh) | 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用 | |
Yoneyama et al. | TMEM2 expression is downregulated as bladder cancer invades the muscle layer | |
CN106520992A (zh) | 分子标志物stac2在口腔鳞状细胞癌中的应用 | |
CN109402253A (zh) | Aldh18a1在结直肠癌的治疗和诊断中的应用 | |
CN104740649B (zh) | Plekha5在制备肿瘤诊断试剂中的应用 | |
CN116121393B (zh) | 一种头颈部鳞状细胞癌的标志物及其应用 | |
CN104388541B (zh) | miR‑1914*和miR‑1915的用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |