CN112043722B

CN112043722B - Prpf6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用

Info

Publication number: CN112043722B
Application number: CN202011021286.3A
Authority: CN
Inventors: 赵越; 王春玉; 刘伟; 林琳; 王胜利; 邹仁龙; 孙洪邈; 曾凯
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112043722A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用。PRPF6靶向抑制剂在制备预防或治疗前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的药物及药物组合物中的应用。本发明首次发现PRPF6可以促进前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的进程，PRPF6在恶性程度更高的前列腺癌组织中表达更高，抑制PRPF6具有明显抑制前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的发生发展。PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗抵抗中的作用。发现PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌内分泌药物中存在药物抵抗潜在功能，制备PRPF6小分子抑制剂，siRNA或发现抑制PRPF6转录生成miRNA以达到治疗临床前列腺癌及去势抵抗前列腺癌。本发明为治疗前列腺癌及去势抵抗前列腺癌提供了新思路、新靶点。

Description

PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用。

背景技术

前列腺癌(prostatecancer，PCa)是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤。在西方国家，其死亡率居各种癌症的第二位，近年来在中国的发病率亦呈上升趋势。雄激素剥夺治疗是前列腺癌早期重要的治疗手段，该方法通常能够抑制肿瘤的进展，但经过一段时间的治疗后，一部分患者会发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostatecancer,CRPC)。前列腺癌转化为去势抵抗前列腺癌后，雄激素剥夺治疗将失去效用，且肿瘤转移的可能性大幅度提高。然而临床上尚缺乏有效的对抗去势抵抗前列腺癌的策略和手段。去势抵抗前列腺癌也成为困扰临床上治疗前列腺癌的棘手问题。因此，对前列腺癌去势抵抗性的机制研究具有重要的意义。雄激素受体(androgen receptor，AR)是雄激素剥夺治疗的靶点，同时作为核转录因子，是类固醇激素受体超家族成员之一，与雄激素配体结合后激活、调控靶基因转录而发挥生物学效应。AR受一系列辅调节因子的调控，研究表明AR辅调节因子通过对AR功能的异常调控在前列腺癌特别是去势抵抗前列腺癌中发挥重要作用。近期越来越多的研究发现，配体非依赖的AR变异体AR-Vs(包括AR-V7)参与去势抵抗前列腺癌的进程。这预示着新的AR及AR-Vs(AR-V7)的辅调节因子的发现和作用机制的研究将为前列腺癌特别是去势抵抗前列腺癌的早期诊断和治疗提供实验依据和新靶点。

我们课题组的早期研究报道了PRPF6结合于ARAF-1区域，增强AR和GR介导的转录调控作用，但未见对ERα介导的转录调控发挥作用。已有研究发现，PRPF6对不同肿瘤的发生发展发挥着重要的生物学功能，如在结直肠癌中，PRPF6通过对与细胞生长相关基因的优先剪接来促进癌细胞的增殖；PRPF6的异常表达促进肺癌的发生等。但是PRPF6在前列腺癌中的作用目前尚未见报道，因此深入研究PRPF6作为辅调节因子在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌中的作用机制及生物学功能有重要意义。有望为PCa/CRPC患者的早期诊断和治疗寻找新的靶点提供可靠的实验依据。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用。通过实验证明PRPF6可以促进前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的进程，PRPF6在恶性程度更高的前列腺癌组织中表达更高，抑制PRPF6具有明显抑制前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的发生发展。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

PRPF6靶向抑制剂在制备预防或治疗前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的药物及药物组合物中的应用，所述PRPF6核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

进一步地，所述的PRPF6靶向抑制剂能够抑制PRPF6表达的siRNA序列，所述siRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链：

5’-GAGAAGATTGGGCAGCTTAdTdT-3’(SEQ ID No.1)。

反义链：

5’-UAAGCUGCCCAAUCUUCUCdTdT-3’(SEQ ID No.2)。

进一步地，获得一种转录上述的siRNA的转录产物，序列为：

正义链：

5’-GAGAAGATTGGGCAGCTTAdTdT-3’(SEQ ID No.1)。

反义链：

5’-UAAGCUGCCCAAUCUUCUCdTdT-3’(SEQ ID No.2)。

进一步地，所述抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂型。

进一步地，所述抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。

进一步地，所述药物组合物还包括与PRPF6靶向抑制剂的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的PRPF6靶向抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括但不限于乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的PRPF6靶向抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，动脉内，口服，肌肉内，皮下的。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

与现有技术比，本发明有益效果如下。

本发明首次发现PRPF6可以促进前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的进程，PRPF6在恶性程度更高的前列腺癌组织中表达更高，抑制PRPF6具有明显抑制前列腺癌及去势抵抗前列腺癌的发生发展。PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗抵抗中的作用。发现PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌内分泌药物中存在药物抵抗潜在功能，制备PRPF6小分子抑制剂，siRNA或发现抑制PRPF6转录生成miRNA以达到治疗临床前列腺癌及去势抵抗前列腺癌。本发明为治疗前列腺癌及去势抵抗前列腺癌提供了新思路、新靶点。

附图说明

图1是PRPF6的siRNA和shRNA序列。

图2是利用已构建好的PRPF6稳定敲低LNCaP、CWR22Rv1、LNCaP-AI细胞系进行生长曲线实验和克隆形成实验的结果。

图3是敲减PRPF6抑制小鼠体内移植瘤的生长。

图4是敲减PRPF6抑制去势小鼠体内移植瘤的生长。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例。

一、抑制剂的制备。

根据PRPF6核苷酸序列SEQ ID No.3，设计PRPF6的siRNA和shRNA，如图1所示。

二、PRPF6及抑制剂的应用。

利用已有的雄激素依赖性的LNCaP细胞系通过在含有模拟雄激素剥夺条件的雄激素缺乏CSS(5％)的培养基中进行持续长达6个月的培养，从而生成了雄激素非依赖性LNCaP亚系，命名为LNCaP-AI。利用针对PRPF6的shRNA慢病毒载体感染AR阳性前列腺癌细胞株LNCaP，CWR22Rv1和LNCaP-AI。

1、细胞生长曲线(MTS)实验。

1)处理细胞，将PRPF6稳定敲除的细胞和对照细胞接种在96孔板中(3个复孔)，接种细胞数量适宜，再根据实验设计对细胞进行因素处理。

2)分别在细胞培养箱中孵育0、2、4、6天，根据时间梯度收取细胞，每孔加入培养基配制的MTS工作液，每孔100μl，细胞培养箱37摄氏度孵育1h。

3)取出96孔板，利用酶标仪检测吸光度(波长490nm)，保存并记录。

4)汇总分析实验数据，并且绘制细胞生长曲线图，统计分析。

2、细胞克隆形成实验。

1)处理细胞，计数待测细胞。

2)将PRPF6稳定敲除的细胞和对照组细胞分别以相同适宜的细胞量接种于6孔板或者12孔板中，再根据实验设计对细胞进行因素处理。

3)置于37摄氏度孵箱中进行培养7-18天，期间根据细胞状态换液；显微镜下观察细胞，如果有明显细胞克隆形成，则用4％的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗后用考马斯亮蓝R-250染色并拍照保存。

如图2所示，利用已构建好的PRPF6稳定敲低LNCaP、CWR22Rv1、LNCaP-AI细胞系进行生长曲线实验和克隆形成实验，证明敲低PRPF6抑制了前列腺癌细胞的生长。

3、荷瘤小鼠实验。

遵从中国医科大学动物伦理委员会的规章制度进行动物实验操作。

1)购买4-5周龄的雄性NOD/SCID小鼠，将稳定敲减PRPF6的5×105个CWR22Rv1细胞注射到正常或者去势手术的NOD/SCID雄性小鼠右腋皮下，对照细胞以相同的数量注射到小鼠的左腋皮下。每隔3-4天对小鼠身上所承载的肿瘤的长径和短径进行测量，为期约四周。

2)约四周后结束实验，取出小鼠皮下的肿瘤，分别并对肿瘤的质量及体积进行测量，进行记录。然后标记好将肿瘤组织放入4％的多聚甲醛中固定，用于免疫组化(IHC)实验。肿瘤体积的计算公式：肿瘤体积以公式V＝(π/6)(d1×d2)^3/2计算。

如图3所示，荷瘤小鼠实验表明，敲减PRPF6抑制小鼠体内移植瘤的生长。如图4所示，荷瘤小鼠实验表明，敲减PRPF6抑制去势小鼠体内移植瘤的生长。

序列表

<110> 中国医科大学

<120>PRPF6在前列腺癌及去势抵抗前列腺癌治疗中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAGAAGATTG GGCAGCTTAd TdT 23

<210> 2

<211>

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

UAAGCUGCCC AAUCUUCUCd TdT 23

<210> 3

<211>

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacggcgaca ctttgctacg gagtgcatcg gacgtcgaag cctagagtct ctgcgtcttt 60

ccctcttccg ctgcctcatt cctttccttc ctagccttgg tcgtcgccgc caccatgaac 120

aagaagaaga aaccgttcct agggatgccc gcgcccctcg gctacgtgcc ggggctgggc 180

cggggcgcca ctggcttcac cacgcggtca gacattgggc ccgcccgtga tgcaaatgac 240

cctgtggatg atcgccatgc acccccaggc aagagaaccg ttggggacca gatgaagaaa 300

aatcaggctg ctgacgatga cgacgaggat ctaaatgaca ccaattacga tgagtttaat 360

ggctatgctg ggagcctctt ctcaagtgga ccctacgaga aagatgatga ggaagcagat 420

gctatctatg cagccctgga taaaaggatg gatgaaagaa gaaaagaaag acgggagcaa 480

agggagaaag aagaaataga gaaatatcgt atggaacgcc ccaaaatcca acagcagttc 540

tcagacctca agaggaagtt ggcagaagtc acagaagaag agtggctgag catccccgag 600

gttggcgatg ccagaaataa acgtcagcgg aacccacgct atgagaagct gacccctgtt 660

cctgacagtt tctttgccaa acatttacag accggagaga accatacctc agtggatccc 720

cgacaaactc aatttggagg tcttaacaca ccctatccag gtggactaaa cactccatac 780

ccaggtggaa tgacgccagg actgatgaca cctggcacag gtgagctgga catgaggaag 840

attggccaag cgaggaacac tctgatggac atgaggctga gccaggtgtc tgactccgtg 900

agtggacaga ccgtcgttga ccccaaaggc tacctgacgg atttaaattc catgatcccg 960

acacacggag gagacatcaa tgatatcaag aaggcgcgac tgctcctcaa gtctgttcgg 1020

gagacgaacc ctcatcaccc gccagcctgg attgcatcag cccgcctgga agaagtcact 1080

gggaagctac aagtagctcg gaaccttatc atgaagggga cggagatgtg ccccaagagt 1140

gaagatgtct ggctggaagc agccaggttg cagcctgggg acacagccaa ggccgtggta 1200

gcccaagctg tccgtcatct cccacagtct gtcaggattt acatcagagc cgcagagctg 1260

gaaacggaca ttcgtgcaaa gaagcgggtt cttcggaaag ccctcgagca tgttccaaac 1320

tcggttcgct tgtggaaagc agccgttgag ctggaagaac ctgaagatgc tagaatcatg 1380

ctgagccgag ctgtggagtg ctgccccacc agcgtggagc tctggcttgc tctggcaagg 1440

ctggagacct atgaaaatgc ccgcaaggtc ttgaacaagg cgcgggagaa cattcctaca 1500

gaccgacata tctggatcac ggctgctaag ctggaggaag ccaatgggaa cacgcagatg 1560

gtggagaaga tcatcgaccg agccatcacc tcgctgcggg ccaacggtgt ggagatcaac 1620

cgtgagcagt ggatccagga tgccgaggaa tgtgacaggg ctgggagtgt ggccacctgc 1680

caggccgtca tgcgtgccgt gattgggatt gggattgagg aggaagatcg gaagcatacc 1740

tggatggagg atgctgacag ttgtgtagcc cacaatgccc tggagtgtgc acgagccatc 1800

tacgcctacg ccctgcaggt gttccccagc aagaagagtg tgtggctgcg cgccgcgtac 1860

ttcgagaaga accatggcac tcgggagtcc ctggaagcac tcctgcagag ggctgtggcc 1920

cactgcccca aagcagaggt gctgtggctc atgggcgcca agtccaagtg gctggcaggg 1980

gatgtgcctg cagcaaggag catcctggcc ctggccttcc aggccaaccc caacagtgag 2040

gagatctggc tggcagccgt gaagctggag tccgagaatg atgagtacga gcgggcccgg 2100

aggctgctgg ccaaggcgcg gagcagtgcc cccaccgccc gggtgttcat gaagtctgtg 2160

aagctggagt gggtgcaaga caacatcagg gcagcccaag atctgtgcga ggaggccctg 2220

cggcactatg aggacttccc caagctgtgg atgatgaagg ggcagatcga ggagcagaag 2280

gagatgatgg agaaggcgcg ggaagcctat aaccaggggt tgaagaagtg tccccactcc 2340

acacccctgt ggcttttgct ctctcggctg gaggagaaga ttgggcagct tactcgagca 2400

cgggccattt tggaaaagtc tcgtctgaag aacccaaaga accctgggct gtggttggag 2460

tccgtgcggc tggagtaccg tgcggggctg aagaacatcg caaatacact catggccaag 2520

gcgctgcagg agtgccccaa ctccggtatc ctgtggtctg aggccatctt cctcgaggca 2580

aggccccaga ggaggaccaa gagcgtggat gccctgaaga agtgtgagca tgacccccat 2640

gtgctcctgg ccgtggccaa gctgttttgg agtcagcgga agatcaccaa ggccagggag 2700

tggttccacc gcactgtgaa gattgactcg gacctggggg atgcctgggc cttcttctac 2760

aagtttgagc tgcagcatgg cactgaggag cagcaggagg aggtgaggaa gcgctgtgag 2820

agtgcagagc ctcggcatgg ggagctgtgg tgcgccgtgt ccaaggacat cgccaactgg 2880

cagaagaaga tcggggacat ccttaggctg gtggccggcc gcatcaagaa caccttctga 2940

ttgagcggtt gccatggccg gtctccgtgg ggcagggttg ggccgcatgt ggaagggctc 3000

tgagctgtgt cctccttcat taaaagtttt tatgtctcgt gtcagaa 3047

Claims

1.PRPF6靶向抑制剂在制备预防或治疗前列腺癌的药物及药物组合物中的应用，其特征在于，PRPF6核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

PRPF6靶向抑制剂为能够抑制PRPF6表达的siRNA序列，所述siRNA序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链：5’-GAGAAGATTGGGCAGCTTAdTdT-3’；

反义链：5’-UAAGCUGCCCAAUCUUCUCdTdT-3’。

2.PRPF6靶向抑制剂在制备预防或治疗去势抵抗前列腺癌的药物及药物组合物中的应用，其特征在于，PRPF6核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

正义链：5’-GAGAAGATTGGGCAGCTTAdTdT-3’；

反义链：5’-UAAGCUGCCCAAUCUUCUCdTdT-3’。

3.如权利要求1和2任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂型。

4.如权利要求1和2任一项所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂量。