CN112656785A

CN112656785A - 槲皮素在制备前列腺癌放疗增敏药物中的用途

Info

Publication number: CN112656785A
Application number: CN202011621151.0A
Authority: CN
Inventors: 邢念增; 陈东; 杨飞亚
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了槲皮素的一种药物新用途。所述新用途为槲皮素在制备癌症放疗增敏药物中的应用。本发明首次提出了槲皮素在制备放疗增敏剂中的应用，槲皮素可有效提高肿瘤细胞的放疗敏感性，提高放疗疗效。其作用机制与槲皮素抑制雄激素受体(AR)和AR剪接变异体7(ARv7)激活信号通路，增加肿瘤细胞DNA损伤有关，应用前景广泛。

Description

槲皮素在制备前列腺癌放疗增敏药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及槲皮素在制备前列腺癌放疗增敏药物中的用途。

背景技术

前列腺癌是男性常见恶性肿瘤之一，根据最新癌症统计结果估计2018年全球新增前列腺癌患者约127.61万，占男性癌症发病的13.5％，是仅次于肺癌的第2常见男性恶性肿瘤。在我国，随着人口结构老龄化、人们生活水平提高以及饮食结构改变，前列腺癌发病率呈现快速上升趋势，且发病年轻化倾向明显。

目前，手术、放射治疗和内分泌治疗是治疗前列腺癌的三大“利器”。对于早期局限性前列腺癌患者，手术或放射治疗都能达到疾病治愈效果。放射治疗主要是指通过使用高剂量的辐射方式来破坏或减缓肿瘤生长。它的主要治疗优势是可以精准靶向病灶，局部创伤相对较小，患者耐受性强，安全性相对较高，而且疗效持续可靠。虽然放射治疗前列腺癌显示出良好疗效，但是肿瘤放疗后出现肿瘤复发、转移等现象，以及多次照射肿瘤后出现的放疗敏感性降低甚至对放疗耐受现象，仍极大程度上制约其长期治疗效果。此外，前列腺癌放疗以大剂量照射为主，这难免极大提高了周围组织器官损伤几率。因此增加前列腺癌对放疗的敏感性，提高治疗的效果是亟待解决的临床难题。

槲皮素是一种植物来源的类黄酮，广泛分布于蔬菜、水果、干果、饮料及中草药中，具有抗癌、抗氧化、抗炎、扩张血管、抗变态反应等多种生物活性。自1971年美国国家癌症研究所首次发现槲皮素对白血病的抑制作用后，国内外学者对其抗癌作用进行了广泛深入的研究。首先，槲皮素可通过多种途径发挥癌化学预防作用。例如，槲皮素可以抑制杂环胺、黄曲霉素等前致癌物转化为致癌物；增强谷胱甘肽-S-转移酶、超氧化物歧化酶等的活性，促进致癌物质在肝脏的解毒代谢和排出；有效捕获和清除氧自由基，防止或减轻氧自由基诱发细胞癌变的可能等。除了具有癌化学预防作用，槲皮素能对癌细胞产生细胞毒作用。研究证实槲皮素可抑制前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞的生长。基于其抗癌作用，槲皮素在美国已经作为非处方药用于治疗晚期前列腺癌。

目前还没有关于槲皮素应用于前列腺癌放疗增敏的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种槲皮素的药物新用途。

本发明所提供的槲皮素的药物新用途是其在制备癌症放疗增敏药物中的应用。

所述癌症具体可为前列腺癌。

所述放疗包括使用选自以下放射线的治疗：X射线、α射线、β射线、γ射线、中子、电子线、质子束、粒子束和其组合；或者所述放疗包括外照射放射治疗和内照射放射治疗；或者所述放射治疗方法包括常规分割放射治疗和一次大剂量放射治疗；或者所述放射治疗的一次照射剂量为2-6Gy；或者所述放疗包括使用放射增敏剂。

优选的，所述癌症放疗增敏药物在放疗前2小时使用，并于用药后2小时再对肿瘤组织进行放疗。

所述槲皮素通过抑制前列腺癌细胞AR和ARv7表达产生，增加肿瘤细胞DNA损伤，发挥对癌症放疗的增敏作用。

所述槲皮素作为癌症放疗增敏药物，其与放疗联合使用，能显著降低癌细胞存活分数(前列腺癌22Rv1细胞)以及显著降低肿瘤组织(如前列腺癌肿瘤组织)体积。

本发明还保护一种癌症放疗增敏药物。

本发明所保护的癌症放疗增敏药物，其活性成分为槲皮素。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

发明人研究发现，阻断抑制前列腺癌细胞中AR和Arv7信号通路，均会显著提高前列腺癌放射治疗的敏感性，进而提高放疗疗效。此外，根据进行的细胞水平研究发现，槲皮素治疗就可以显著降低前列腺癌细胞内AR和ARv7的mRNA和蛋白表达水平。

本发明的有益效果是：

本发明首次提出了槲皮素在制备放疗增敏剂中的应用，槲皮素可有效提高肿瘤细胞的放疗敏感性，提高放疗疗效。其作用机制与槲皮素抑制雄激素受体(AR)和AR剪接变异体7(ARv7)激活信号通路，增加肿瘤细胞DNA损伤有关，应用前景广泛。

附图说明

图1为单独放疗组(IR组)、槲皮素与放疗联合使用组(IR+Que组)在不同照射剂量下对前列腺癌22Rv1细胞的存活分数。

图2为对照组、槲皮素治疗组、单独放射治疗组、放射+槲皮素治疗组，各不同处理组对前列腺癌肿瘤组织体积的影响。

图3为22Rv1细胞中ARv7敲除组(shARv7)及22Rv1细胞中ARv7不敲除空白组(PLKO)，检测ARv7对前列腺癌放疗敏感性影响。

图4为22Rv1细胞槲皮素对照组(0μmol/L)、22Rv1细胞槲皮素10μmol/L治疗组、20μmol/L治疗组和40μmol/L治疗组，各不同处理组对前列腺癌细胞中AR和ARv7蛋白表达影响。

图5为22Rv1细胞槲皮素对照组(0μmol/L)、22Rv1细胞槲皮素10μmol/L治疗组、20μmol/L治疗组和40μmol/L治疗组，各不同处理组对前列腺癌细胞中ARv7的mRNA表达影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

槲皮素：CAS号为CAS:117-39-5，购自sigma公司，货号Q4951。

实施例1、槲皮素对前列腺癌细胞用药

一、槲皮素对前列腺癌细胞放疗敏感性影响

1.1下述前列腺癌细胞为前列腺癌22Rv1细胞：

前列腺癌22Rv1细胞(细胞同时表达AR和ARv7蛋白，以下也称为22Rv1细胞)，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，目录号SCSP-5022；

1.2.将前列腺癌细胞分为如下几组分别用药：

槲皮素治疗组(IR+Que组)：前列腺癌细胞在含有40μmol/L槲皮素的1640培养基中培养24h，得到槲皮素单独治疗后前列腺癌细胞，分别经2Gy、4Gy和6Gy的X射线(中国医学科学院肿瘤医院)照射，照射后更换新的细胞培养基(新培养基里没有槲皮素)，置于细胞培养箱，连续培养2周。

对照组(IR组)：前列腺癌细胞在1640培养基中培养24h，分别经2Gy、4Gy和6Gy的X射线(中国医学科学院肿瘤医院)照射，照射后置于细胞培养箱，连续培养2周，得到对照组细胞。

1.3.平板克隆形成实验

(1)取对数生长期的对照组和槲皮素治疗组细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在完全培养基中备用。

(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据放射剂量)接种于60mm培养皿中，每组设置三个平行样。各组细胞贴壁后，分别经2Gy、4Gy和6Gy的X射线(中国医学科学院肿瘤医院)照射，照射后置于细胞培养箱，连续培养2周。

(3)当60mm培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用适量PBS小心浸洗2次。每个培养皿中加甲醇2ml，固定10min。然后吸走甲醇，加0.1％结晶紫染20min，然后用缓慢流水冲去结晶紫，自然干燥。

(4)统计各组细胞的克隆数，计算存活分数(SF)。

克隆形成率(PE)＝(未照射组的克隆数/未照射组的接种细胞数)×100％

存活分数(survival fraction，SF)＝(某一剂量的克隆数/某一剂量的接种细胞数×PE)×100％

(5)在GraphPad Prism 7.0软件中用单击多靶模型，拟合剂量生存曲线。放疗后细胞存活分数(SF)为纵坐标，照射剂量为横坐标，使用单击多靶模型拟合细胞的生存曲线。

结果显示，与单独放疗相比(IR组)，槲皮素与放疗联合使用(IR+Que组)，能显著降低前列腺癌22Rv1细胞存活分数(P<0.05)，提示槲皮素具有显著的放疗增敏作用(结果见图1)。

二、槲皮素对裸鼠前列腺癌荷瘤放疗敏感性影响

2.1实验动物

10周龄BALB雄性裸鼠40只，体重20-25g，定购并饲养在中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心SPF级动物室。

2.2实验设备

1.小鼠放疗固定器(中国医学科学院实验动物研究所)

2.游标卡尺(北京医疗仪器厂)

3.微量注射仪

2.3实验主要试剂

1.人工基质胶(BD Biosciences公司)

2.0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)

2.4实验方法

(l)前列腺癌22Rv1细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养至指数生长期，配制成1×10⁸/ml的细胞悬液备用。

(2)10周龄的BALB雄性裸鼠在SPF级环境下饲养1周。

(3)存活裸鼠行22Rv1接种。将100μL含有5×10⁶22Rv1细胞悬液直接接种到裸鼠右下肢腋下。

(4)接种后的裸鼠继续在SPF级实验室饲养，定时观察裸鼠的精神、饮食、排便及体重，同时用游标卡尺测量瘤结节的直径并做记录。每隔7天观察并测量肿瘤长度(L)和宽度(W)一次，连续观察记录4周。体积计算公式：0.5×L×W²。

(5)当瘤结节的平均体积后，按处理方法不同将裸鼠随机分为4组，每组10只。分组如下：

NC组(对照组)：大鼠接受一次槲皮素的溶剂DMSO，100mg/kg DMSO的腹腔注射；

Que组(槲皮素治疗组)：大鼠接受一次100mg/kg槲皮素的腹腔注射；

IR组(单独放射治疗组)：大鼠不接受槲皮素的腹腔注射，肿瘤组织只受一次2Gy放射治疗；

IR+Que组(放射+槲皮素治疗组)：大鼠接受一次100mg/kg槲皮素的腹腔注射，并且24小时后肿瘤组织接受一次2Gy放射治疗；

结果显示，与对照组相比(NC组)，槲皮素治疗组(Que组)中大鼠接受一次100mg/kg槲皮素的腹腔注射，并不能显著降低前列腺癌肿瘤组织的体积。此外，与单独放疗相比(IR组)，槲皮素与放疗联合使用(IR+Que组)，能显著降低前列腺癌肿瘤组织的体积(P<0.001)，提示槲皮素具有显著的放疗增敏作用(结果见图2)。

三、槲皮素通过抑制前列腺癌细胞AR和ARv7表达可增强前列腺癌细胞的放疗敏感性

3.1构建ARv7敲除的22Rv1前列腺癌细胞，并进行平板克隆实验，方法如下：

采用慢病毒转染的方法建立ARv7敲除组(shARv7)及空白组(PLKO)的22Rv1前列腺癌细胞，细胞培养及平板克隆实验同前所述，使用单击多靶模型拟合细胞的生存曲线。

平行条件下培养ARv7敲除的22Rv1细胞(慢病毒转染法制备)和转空病毒的22Rv1细胞，使用单击多靶模型拟合细胞的生存曲线。

结果显示，与对照组相比(PLKO)，前列腺癌细胞敲除ARv7表达后(ARv7敲除组)能显著降低前列腺癌22Rv1细胞存活分数(P<0.05)，提示减少ARv7具有显著的放疗增敏作用(结果见图3)。

3.2槲皮素对前列腺癌细胞AR和ARv7蛋白和mRNA表达影响，方法如下：

1.22Rv1前列腺癌细胞分成两组，并进行如下处理：

槲皮素治疗组(Que组)：前列腺癌细胞在含有10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L槲皮素的培养基中培养24h，得到槲皮素单独治疗后前列腺癌细胞。

对照组(IR组)：前列腺癌细胞在1640培养基中培养24h，得到对照组细胞。

2.Western Blot实验检测这两组中AR和ARv7蛋白表达变化。

取步骤1处理后的细胞，提取细胞总蛋白，进行WesternBlot(采用的一抗为：AR购自Santa Cruz公司，产品目录号sc-816；ARv7购自abcam公司，产品目录号ab198394；GAPDH购自Santa Cruz公司，产品目录号sc-32233)。

结果显示，40μmol/L槲皮素可显著降低前列腺癌细胞AR和ARv7蛋白表达水平,提示槲皮素的放疗增敏作用的分子机制是通过抑制前列腺癌细胞AR和ARv7蛋白表达产生(结果见图4)。

3.qRT-PCR实验检测这两组中AR和ARv7的mRNA表达变化。

取步骤1处理后的细胞，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，进行qRT-PCR，检测AR的表达量和ARv7的表达量。采用GAPDH基因为内参基因。

用于检测AR的引物如下：

上游引物：CCAGGGACCATGTTTTGCC；

下游引物：CGAAGACGACAAGATGGACAA。

用于检测ARv7的引物如下：

上游引物：ATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTA；

下游引物：TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT。

结果显示，40μmol/L槲皮素可显著降低前列腺癌细胞AR和ARv7的mRNA表达水平，进而减少前列腺癌细胞AR和ARv7蛋白表达，提示槲皮素的放疗增敏作用是通过抑制前列腺癌细胞AR和ARv7表达产生(结果见图5)。

Claims

1.槲皮素在制备癌症放疗增敏药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述癌症为前列腺癌。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述放疗包括使用选自以下放射线的治疗：x射线、α射线、β射线、γ射线、中子、电子线、质子束、粒子束和其组合；或者所述放疗包括外照射放射治疗和内照射放射治疗；或者所述放射治疗方法包括常规分割放射治疗和一次大剂量放射治疗。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述放疗的一次照射剂量为2-6Gy。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述癌症放疗增敏药物在放疗前2小时使用，并于用药后2小时再对肿瘤进行放疗。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述槲皮素通过抑制AR和ARv7表达产生，发挥对癌症放疗的增敏作用。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于：所述槲皮素作为癌症放疗增敏药物，其与放疗联合使用，能降低癌细胞存活分数和/或降低肿瘤组织体积。

8.一种癌症放疗增敏药物，其活性成分为槲皮素。

9.根据权利要求8所述的癌症放疗增敏药物，其特征在于：所述癌症为前列腺癌。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述放疗包括使用选自以下放射线的治疗：x射线、α射线、β射线、γ射线、中子、电子线、质子束、粒子束和其组合；或者所述放疗包括外照射放射治疗和内照射放射治疗；或者所述放射治疗方法包括常规分割放射治疗和一次大剂量放射治疗；

所述放疗的一次照射剂量为2-6Gy；

所述癌症放疗增敏药物在放疗前2小时使用，并于用药后2小时再对肿瘤进行放疗。