CN104971059A - 氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制药中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域。涉及氯硝柳胺或其药学上可接受的盐的新的医药用途，具体涉及氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制备恶性肿瘤放射增敏制剂中的用途。本发明经试验显示，氯硝柳胺在对三阴性乳腺癌细胞无细胞毒作用的<20%IC₅₀浓度下，具有增强三阴性乳腺癌细胞放射敏感性的作用，其机制与抑制电离辐射诱导的Wnt/β-catenin信号通路和AKT的激活和DNA双链断裂修复有关，可进一步制备安全有效的放射增敏新药，尤其是制备治疗恶性肿瘤放射增敏制剂，该制剂对于提高三阴性乳腺癌放射治疗的效果，降低复发率，提高生存率具有重要的意义。

Description

氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制药中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域。涉及氯硝柳胺或其药学上可接受的盐的新的医药用途，具体涉及氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制备治疗恶性肿瘤放射增敏制剂中的用途。

背景技术

据报道，乳腺癌已是女性发病率最高的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内呈上升趋势并趋于年轻化。放射治疗作为一种重要的治疗手段，其降低乳腺癌术后局部复发率、提高患者生存率的治疗效果已得到普遍肯定。但是，遗传的高度异质性使得部分乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌（TNBC）的疗效欠佳。TNBC是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER-2）均为阴性表达的乳腺癌，约占所有乳腺癌病理类型的10％～20％，多发生于绝经前的年轻女性，具有发病年龄早、病理组织学分化差、侵袭性强、5年内复发/转移率高和死亡率高、缺乏特异性治疗和分子靶向治疗手段的特点，是近年来乳腺癌诊治研究的难点和关注的焦点。由于其特殊的分子表型，TNBC丧失了乳腺癌内分泌治疗这一有效措施，也无法从常规的抗HER-2治疗中获益；更重要的是，TNBC放疗后复发、转移以及多次照射后的辐射抵抗仍是TNBC放射治疗面临的重要难题。因此，探索新的靶向放射增敏剂，促进射线对TNBC细胞的杀伤作用，是目前临床治疗TNBC中亟待解决的关键问题。

越来越多的证据表明，Wnt/β-catenin（Wnt/β-连环蛋白）信号通路异常活化在多种人类肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等的发生和发展中发挥重要作用，尤其是TNBC中β-catenin异常高表达与放/化疗抵抗、预后不良密切相关，可以作为其独立的预后因子；而且电离辐射能诱导乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路过度激活，提示抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是TNBC的放射增敏靶点。目前公认的Wnt/β-catenin信号通路的作用机制是：当分泌型糖蛋白Wnt与细胞膜表面受体卷曲蛋白(Fz或FZD)及其共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)的胞外区结合，致使Wnt/β-catenin信号通路激活。当不存在Wnts信号与受体Fz和共受体LRP5/6相互作用时，胞浆中β-catenin水平受APC、Axin和GSK-3β形成的蛋白多聚体所调控。多聚体中的β-catenin被GSK-3β诱导磷酸化，磷酸化的β-catenin进一步被泛素化，最后被26S蛋白酶体所降。当Wnt蛋白与Fz和LRP5/6受体结合时，GSK-3β失活，β-catenin的磷酸化和降解被阻断，导致β-catenin在胞浆内积聚并进入细胞核，与Tcf/Lef结合，增强下游靶基因的转录，包括涉及细胞生长和细胞周期的基因，如原癌基因c-Myc和CyclinD1表达，抗凋亡基因Survivin表达等，促进细胞增殖与分化、侵袭与转移，抑制细胞凋亡。由此可见，β-catenin不能被降解是该通路激活致癌的一个关键成分。

近年来有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致胞核内β-catenin积聚介导了人和小鼠乳腺癌及其干/祖细胞的辐射抵抗，而且与提高辐射诱导的DNA双链断裂（DSBs）的修复能力密切相关。研究表明，DSBs是电离辐射诱发的最严重的损伤形式，抑制DSBs修复能力能明显提高细胞的放射敏感性。DSBs修复机制的研究显示，DSBs损伤一旦发生，细胞将快速启动DNA损伤应答机制，通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）两条重要通路进行修复。其中组蛋白2A变异体的磷酸化（γH2AX）是DSBs发生后最早期的事件之一，它作为重要的DSB传感蛋白，继之募集多种修复相关蛋白快速聚集在损伤部位，形成防止DNA进一步裂解和刺激DNA修复的微环境，称之为电离辐射诱发的灶（IRIF）。目前γH2AX已成为公认的DSBs的分子标志物，γH2AX foci分析技术也成为监测DSBs及其修复的敏感方法。DNA依赖性蛋白激酶DNA-PK是参与NHEJ修复的关键成分，它由一个催化亚基DNA-PKcs和两个识别亚基Ku70和Ku86组成，其中DNA-PKcsThr2609磷酸化标志着NHEJ修复通路被激活。修复蛋白Rad51依赖性链侵入过程是HR修复的关键步骤，HR通路被激活时，细胞核内能检测到明显的Rad51foci，研究已证实它精确定位于DSB处，可作为观察HR修复的理想指标。

乳腺癌的辐射抗性机制十分复杂，与其参与辐射抵抗的多条信号通路的交互作用密切相关。磷酯酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT/PKB）信号通路是广泛存在于细胞内的重要生存信号转导通路之一，其激活与细胞存活、增殖、分化和凋亡等密切相关，它通常在人类很多肿瘤中过度激活，其中在乳腺癌中的异常活化率高达70%以上，特别是在TNBC中高达92%，对乳腺癌的发生发展、放/化疗抵抗和预后不良起到了非常重要的作用。其中，AKT是PI3K/AKT/mTOR信号转导通路的核心，PI3K激活的AKT通过影响下游多种效应分子的活化状态而发挥作用，主要包括抑制凋亡、促进细胞生存和增殖等，与肿瘤的发生、发展以及放/化疗抵抗密切相关，目前正成为肿瘤放射增敏的一个重要靶标。有研究显示，AKT抑制剂能明显提高多种肿瘤对辐射的敏感性。

氯硝柳胺是FDA批准的驱肠虫的首选药物，在临床上使用近50年，毒性低。近年来有研究表明，氯硝柳胺通过促进LRP6降解靶向抑制乳腺癌细胞的Wnt/β-catenin信号通路而发挥抗肿瘤活性，并且对前列腺癌、结直肠癌等亦具有较好的抗肿瘤作用。关于氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在增强肿瘤细胞对射线的敏感性用途目前国内外尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制药中的用途，尤其是氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制备恶性肿瘤放射增敏制剂中的用途。

本发明进行了系列的试验，其中包括：氯硝柳胺对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、Hs578T和非三阴性乳腺癌细胞T47D、MCF-7增殖的抑制作用试验；氯硝柳胺对MDA-MB-231、Hs578T、T47D、MCF-7细胞放射敏感性的影响试验；氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞p-β-catenin(S675)、β-catenin及下游靶蛋白CyclinD1表达的影响试验；氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞β-catenin蛋白在胞核中分布的影响试验；氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞周期的影响试验；氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞p-AKT(S473)、AKT和自噬蛋白LC-3β表达的影响试验；氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞凋亡的影响试验；氯硝柳胺联合LiCl对MDA-MB-231细胞p-β-catenin(S675)、β-catenin、CyclinD1表达和细胞周期的影响试验；LiCl对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用及其对氯硝柳胺放射增敏作用的影响试验；氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞γH₂AX foci形成的影响试验；氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞p-DNA-PKcs(T2609)形成的影响试验；以及氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞Rad51foci形成的影响试验；试验结果显示，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂氯硝柳胺能显著提高TNBC MDA-MB-231和Hs578T细胞的放射敏感性，但对非三阴性乳腺癌MCF-7和T47D细胞则无放射增敏作用；其作用机制研究表明，所述的氯硝柳胺不但能显著降低辐射诱导的TNBC细胞β-catenin表达从而降低辐射诱导的G2/M期阻滞，还能明显抑制辐射诱导的AKT活性的增加，促进细胞凋亡，同时明显抑制辐射诱导的DSBs修复，增强肿瘤细胞对射线的敏感性。

本发明进一步提供了所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在放射增敏Wnt/β-catenin信号通路异常激活的三阴性乳腺癌细胞中的用途，促进射线对三阴性乳腺癌细胞的杀伤作用。

本发明进一步提供了所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在对三阴性乳腺癌细胞无毒性的药物浓度下（<20%IC₅₀）具有放射增敏作用。

本发明进一步提供了所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐通过靶向抑制辐射诱导的三阴性乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，同时抑制辐射诱导的AKT活性增加和辐射诱导的DNADSBs的修复，促进辐射诱导的细胞凋亡和自噬，减少辐射诱导的G2/M期阻滞，从而提高三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性。

本发明的氯硝柳胺或其药学上可接受的盐可与药学上可接受的载体组成药用组合物对三阴性乳腺癌具有放射增敏作用，可通过肌肉注射、静脉注射、或口服给药等给药途径使用。

本发明的氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在放疗前和放疗期间使用，能保证其发挥放射增敏作用。

本发明经试验显示，所述的氯硝柳胺在对三阴性乳腺癌细胞无细胞毒作用的浓度下（<20%IC₅₀），具有增强三阴性乳腺癌细胞放射敏感性的作用，其机制与抑制电离辐射诱导的Wnt/β-catenin信号通路和AKT的激活和DNA双链断裂修复有关，可进一步制备安全有效的放射增敏新药，尤其是制备治疗恶性肿瘤放射增敏制剂，该制剂对于提高三阴性乳腺癌放射治疗的效果，降低复发率，提高生存率具有重要的意义。

附图说明

图1显示了氯硝柳胺对人乳腺癌细胞生长的影响，

其中，（A）MDA-MB-231细胞；（B）Hs578T细胞；（C）T47D细胞；（D）MCF-7细胞。

图2显示了氯硝柳胺联合照射对人乳腺癌细胞存活的影响，

其中，A：MDA-MB-231细胞；B：Hs578T细胞；C：T47D细胞；D：MCF-7细胞。

图3显示了氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞内β-catenin及下游靶蛋白Cyclin D1表达的影响。

图4显示了氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞β-catenin在胞核中分布的影响（×100×10倍），其中，A：绿色荧光标记β-catenin蛋白表达代表图，B：核内β-catenin表达阳性细胞率数据图；与空白对照组比较，^**P<0.01;与单纯照射组比较，^#p<0.05。

图5显示了氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞细胞周期变化的影响，其中，与空白对照组的G₀/G₁期比较，^*P<0.05;与空白对照组的S期比较，^#p<0.05;与空白对照组的G₂/M期比较,^$$p<0.01;与单纯照射组G₂/M期比较，^&&p<0.01。

图6显示了氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞P-AKT(S473)/AKT表达和自噬标志物蛋白表达的影响。

图7显示了氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞凋亡的影响，其中，与空白对照组比较，^*P<0.05；与单纯照射组比较，^#P<0.05。

图8显示了氯硝柳胺联合LiCl对MDA-MB-231细胞p-β-catenin(S675)、β-catenin、CyclinD1表达（A）和细胞周期(B)的影响，

其中，与空白对照组的G₀/G₁期比较，^*P<0.05;与空白对照组的S期比较，^#p<0.05。

图9显示了LiCl对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用（A）及其对氯硝柳胺放射增敏作用的影响(B)。

图10显示了氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞γH₂AX foci形成的影响（×100×10倍），

其中，A：红色荧光标记γH₂AX foci的代表图，B：γH₂AX foci/细胞数据图；与空白对照组比较，^*P<0.05；与单纯照射组比较,^#P<0.05。

11显示了氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞p-DNA-PKcs(T2609)foci形成的影响（×100×10倍），

其中，A：红色荧光标记p-DNA-PKcs(T2609)foci的代表图，B：p-DNA-PKcs(T2609)foci/细胞数据图；与空白对照组比较，^*P<0.01；与单纯加药组比较，^#P<0.05。

图12显示了氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞Rad51foci形成的影响（×100×10倍），其中，A：红色荧光标记Rad51foci的代表图，B：含大于5个Rad51foci的阳性细胞率数据图；与空白对照组比较，^**P<0.01；与单纯加药组比较，^#P<0.05。

具体实施方式

实施例1：

氯硝柳胺对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、Hs578T和非三阴性乳腺癌细胞T47D、MCF-7增殖的抑制作用：

采用MTT实验检测氯硝柳胺对所述4株人乳腺癌细胞生长的抑制作用：取对数生长期细胞以每孔4×10⁴个/100μl接种于96孔板中，细胞贴壁后，分别加入不同浓度的氯硝柳胺，另设培养液空白对照组，培养24h后弃药，每孔加入含20μl5mg/L MTT液的新鲜培养液200μl，继续培养4h后弃上清，加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡15min，采用瑞士TECANinfiniteM200型多功能酶标仪在490nm处测定各孔吸光度（A）值，按以下公式计算氯硝柳胺对细胞的抑制率：细胞抑制率（%）=1―[(A_实验―A_空白)／（A_对照―A_空白）]×100%，采用Origin7.5分析软件求出氯硝柳胺的IC₅₀值，结果表明，所述的氯硝柳胺能明显抑制MDA-MB-231、Hs578T、T47D、MCF-7细胞的生长，且随氯硝柳胺浓度的升高而逐渐下降，呈现明显的剂量依赖关系，氯硝柳胺作用细胞24h的IC₅₀值分别为13.63±0.43、25.32±0.54、3.87±0.11和3.68±0.13μmol/L（如图1A、1B、1C和1D所示）；以低于20%IC₅₀的氯硝柳胺浓度进行放射增敏和机制研究实验，实验结果表明，氯硝柳胺能抑制MDA-MB-231和Hs578T细胞的生长，效果低于对T47D和MCF-7细胞的抑制作用。

实施例2：

氯硝柳胺对MDA-MB-231、Hs578T、T47D、MCF-7细胞放射敏感性的影响：

采用克隆形成试验检测氯硝柳胺对细胞放射敏感性的影响，以氯硝柳胺分别对各种细胞IC₅₀的20%以下的浓度作为放射敏感性药物浓度：取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化后，制成单细胞悬液，分别稀释成不同的细胞浓度梯度，接种于60mm培养皿中，分别加入不同浓度的氯硝柳胺培养24h，同时设置DMSO溶剂对照组，然后给予0、2、4和6Gy剂量的照射，继续培养10～14d，在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，进行以下计算：贴壁率（%）=（对照组克隆数/接种细胞数）×100%，细胞存活率（SF）=（实验组克隆数/接种细胞数）／贴壁率。采用Origin7.5软件、根据单靶多击模型拟合细胞存活曲线，求得放射生物学参数，计算放射增敏比（SER）：SER=单纯照射组D₀值/加药照射组D₀值。结果表明，与单纯照射组比较，氯硝柳胺预处理使MDA-MB-231、Hs578T细胞受照射后的存活曲线明显下移，随照射剂量增加曲线下移的趋势加大，肩区变窄，表明给药组细胞的亚致死损伤修复能力下降；1.0和1.5μmol/L氯硝柳胺预处理MDA-MB-231细胞后的SER值分别为1.37±0.05和1.62±0.06，1.0和1.2μmol/L氯硝柳胺预处理Hs578T细胞后的SER值分别为1.54±0.06和1.63±0.06，表明氯硝柳胺对MDA-MB-231、Hs578T细胞具有显著的放射增敏作用；但是氯硝柳胺预处理对T47D、MCF-7细胞的放射敏感性无明显影响：同样采取低于20%IC₅₀的0.4和0.8μmol/L氯硝柳胺预处理T47D和MCF-7细胞，其SER值分别为0.96±0.04、0.99±0.03、1.12±0.06和1.18±0.10，表明氯硝柳胺对T47D和MCF-7细胞无明显的放射增敏作用；

实验结果表明，氯硝柳胺对三阴性乳腺癌MDA-MB-231和Hs578T细胞具有显著的放射增敏作用，而对非三阴性乳腺癌T47D和MCF-7细胞无明显的放射增敏作用。

实施例3：

氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞p-β-catenin(S675)、β-catenin及下游靶蛋白Cyclin D1表达的影响：

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于60mm培养皿中，分为DMSO溶剂对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.0、1.5、2.0μmol/L）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组（1.0μmol/L+6Gy、1.5μmol/L+6Gy、2.0μmol/L+6Gy），照射后6h，收集细胞，经裂解后提取蛋白并检测蛋白含量，采用WesternBlot法检测p-β-catenin(S675)、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达，采用美国Bio-Rad公司的Chemi Doc XRS数字成像系统对Western blot条带进行采集和分析，结果表明，单独加入1.0、1.5、2.0μmol/L氯硝柳胺预处理细胞24h后，细胞内p-β-catenin(S675)、β-catenin和下游靶蛋白Cyclin D1表达均明显下调；当给予细胞6Gy照射后6h，辐射诱导这些蛋白表达明显升高；氯硝柳胺预处理联合照射则明显抑制了代表入核的p-β-catenin(S675)、β-catenin和下游靶蛋白Cyclin D1蛋白表达，实验结果表明，氯硝柳胺抑制了Wnt/β-catenin信号通路，表现为明显抑制辐射诱导的代表入核的p-β-catenin(S675)、β-catenin和下游靶蛋白Cyclin D1蛋白的表达。

实施例4：

氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞β-catenin蛋白在胞核中分布的影响：

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于60mm培养皿中，分为DMSO溶剂对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.5μmol/L）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组（1.5μmol/L+6Gy），照射后6h，采用免疫荧光法观察β-catenin在胞核中的分布，以全核显示绿色荧光作为β-catenin核内表达的阳性细胞，结果表明，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺预处理细胞24h后，核内β-catenin阳性细胞率为41.58%，与空白对照组相比明显降低（P<0.01）；给予细胞6Gy照射后6h，核内β-catenin阳性细胞率为61.34%，显著高于空白对照组（P<0.01）；而氯硝柳胺联合照射组核内β-catenin阳性细胞率为50.98%，显著低于单纯照射组（P<0.05）；实验结果表明，氯硝柳胺明显抑制了MDA-MB-231细胞受照后β-catenin在核内的积聚。

实施例5：

氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞周期的影响：

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于60mm培养皿中，分为DMSO溶剂空白对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.5μmol/L）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组（1.5μmol/L+6Gy），照射后24h，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化，结果表明，与空白对照组比较，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺预处理细胞后，细胞发生了明显的G0/G1期细胞比例增加（P<0.01），S期细胞比例则明显减少（P<0.05）；当细胞受到6Gy照射后产生了明显的G2/M期阻滞（P<0.05），G0/G1期和S期细胞比例均明显减少（P<0.05）；氯硝柳胺预处理细胞24h联合γ射线照射后，仍出现明显的G2/M期阻滞（P<0.01）和S期细胞比例减少（P<0.01），但与单纯照射细胞相比，G2/M期阻滞明显减少（P<0.01），G0/G1期细胞的比例恢复到空白对照组水平；实验结果表明，氯硝柳胺通过使MDA-MB-231细胞的G₀/G₁期细胞比例明显增加，并使辐射诱导的G₂/M期阻滞的细胞比例明显下降，使得DNA损伤得以在G₂/M期修复的机会更少，从而提高了细胞的放射敏感性。

实施例6：

氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞p-AKT(S473)、AKT和自噬蛋白LC-3β表达的影响：

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于60mm培养皿中，分为DMSO溶剂空白对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.0、1.5、2.0μmol/L）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组（1.0μmol/L+6Gy、1.5μmol/L+6Gy、2.0μmol/L+6Gy）。照射后6h，收集细胞，经裂解后提取蛋白并检测蛋白含量，采用Western Blot法检测p-AKT(S473)、AKT、cleaved-caspase3、caspase3和LC-3β蛋白表达，采用美国Bio-Rad公司的Chemi Doc XRS数字成像系统对Western blot条带进行采集和分析，结果表明，单独加入1.0、1.5、2.0μmol/L氯硝柳胺预处理细胞后，细胞内p-AKT(S473)、AKT表达均明显下调，LC-3β蛋白明显上调；当给予细胞6Gy照射后6h，辐射诱导p-AKT(S473)、AKT蛋白表达明显升高，而LC-3β蛋白表达升高不明显；氯硝柳胺预处理联合照射则明显抑制了p-AKT(S473)、AKT蛋白表达，而LC-3β蛋白显著上调；实验结果表明，氯硝柳胺通过抑制辐射诱导的AKT活化和激活自噬，提高细胞的放射敏感性。

实施例7：

氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞凋亡的影响：

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于60mm培养皿中，分为DMSO溶剂空白对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.5μmol/L）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组（1.5μmol/L+6Gy）。照射后48h，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺作用后，早期凋亡率和总凋亡率分别为1.97±1.26%、3.03±2.00%，与空白对照组相比无明显增加，给予细胞6Gy照射48h后，早期凋亡率和总凋亡率分别为6.98±1.07%、12.43±3.10%，显著高于空白对照组（P<0.05）；而氯硝柳胺联合照射组早期凋亡率和总凋亡率分别达16.56±4.65%、22.10±6.25%，显著高于单纯照射组（P<0.05）；实验结果表明，氯硝柳胺明显提高了辐射诱导的细胞凋亡。

实施例8：

氯硝柳胺联合LiCl对MDA-MB-231细胞p-β-catenin(S675)、β-catenin、CyclinD1表达和细胞周期的影响:

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于60mm培养皿中，分为DMSO溶剂空白对照组、氯硝柳胺单纯给药组、单纯LiCl组和氯硝柳胺联合LiCl组，于药物处理后24h，采用WesternBlot法检测p-β-catenin(S675)、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达，采用流式细胞仪检测细胞周期的变化，结果表明，单独加入1.5μmol/L氯硝柳胺处理细胞24h后，细胞内p-β-catenin(S675)、β-catenin、Cyclin D1表达均明显下调；当给予10mM LiCl作用24h后，可使p-β-catenin(S675)、β-catenin蛋白表达明显升高，Cyclin D1表达变化不明显；而LiCl联合氯硝柳胺处理则抵消了氯硝柳胺对p-β-catenin(S675)、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的下调，使其恢复到DMSO溶剂空白对照组水平；细胞周期结果表明，与DMSO溶剂空白对照组比较，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺处理细胞后，细胞发生了明显的G0/G1期细胞比例增加（P<0.01），S期细胞比例则明显减少（P<0.05）；单纯加入20mmol/LLiCl处理细胞后G0/G1期和S期细胞比例均无明显变化；氯硝柳胺联合LiCl处理细胞24h后，G0/G1和S期细胞的比例恢复到DMSO溶剂空白对照组水平，表明LiCl能够降低氯硝柳胺诱导MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞的作用；实验结果表明，GSK-3β特异性抑制剂LiCl通过激活Wnt/β-catenin信号通路，发挥与Wnt配体相似作用，因而能够消除氯硝柳胺引起的G0/G1期阻滞，从而进一步证明氯硝柳胺能够抑制Wnt/β-catenin信号通路。

实施例9：

LiCl对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用及其对氯硝柳胺放射增敏作用的影响：

采用MTT法检测LiCl对MDA-MB-231细胞24h的IC₅₀为154.11±2.86mmol/L。以低于20%IC₅₀的LiCl浓度进行克隆形成实验。实验分为DMSO溶剂空白对照组、氯硝柳胺单纯给药组、单纯LiCl组和氯硝柳胺联合LiCl组，然后给予0、2、4和6Gy剂量的照射，继续培养10～14d，在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，采用单击多靶模型拟合存活曲线，并计算SER值。与单纯照射组比较，LiCl预处理对MDA-MB-231细胞放射敏感性的影响不明显，受照射后的细胞存活曲线无明显变化，虽然随照射剂量增加曲线下移的趋势加大，肩区变窄，但直线部分斜率并没有因为LiCl的预处理而增大，肩区也没有随给药浓度增加而变小，表明LiCl对MDA-MB-231细胞的亚致死损伤修复能力无明显影影响，SER值为1.10±0.06，但是10mmol/LLiCl联合1.5μmol/L氯硝柳胺预处理MDA-MB-231细胞后，却能够明显抵消氯硝柳胺预处理引起的放射敏感性增加，SER值由氯硝柳胺单独作用的1.65±0.13下降到与LiCl联合作用后的1.24±0.09；实验结果表明，LiCl联合氯硝柳胺预处理能够降低氯硝柳胺对MDA-MB-231细胞的放射增敏作用，进一步证实氯硝柳胺通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而发挥放射增敏作用。

实施例10：

氯硝柳胺联合照射对MDA-MB-231细胞γH₂AX foci形成的影响：

取对数生长期细胞接种于腔室载玻片上，分为DMSO溶剂空白对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.5μmol/L，24h）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组，照射后6h，采用免疫荧光法检测并在荧光显微镜下观察并记录DAPI染色的细胞核中红色foci数目，每个样品计数100个细胞，将所得foci数除以细胞数计算得到每个细胞含有的foci数（foci数/细胞），结果显示，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺预处理细胞24h后，γH₂AXfoci形成率为2.73±0.58个/细胞，与DMSO溶剂空白对照组相比无明显增加，给予细胞6Gy照射后6h，γH₂AX foci形成率为6.26±0.71个/细胞，显著高于DMSO溶剂空白对照组（P<0.01）；而氯硝柳胺联合照射组γH₂AX foci形成率达8.46±0.61个/细胞，显著高于单纯照射组（P<0.05）；实验结果表明，氯硝柳胺明显抑制了辐射诱导的DNA双链断裂的修复。

实施例11：

氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞p-DNA-PKcs(T2609)形成的影响：

取对数生长期细胞接种于腔室载玻片上，分为DMSO溶剂空白对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.5μmol/L，24h）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组，照射后6h，采用免疫荧光法检测并在荧光显微镜下观察并记录DAPI染色的细胞核中红色foci数目，每个样品计数100个细胞，换算成每个细胞含有的foci数（foci数/细胞），结果显示，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺预处理细胞24h后，p-DNA-PKcs(T2609)形成率为1.74±0.66个/细胞，与DMSO溶剂空白对照组相比无明显增加，给予细胞6Gy照射后6h，p-DNA-PKcs(T2609)foci形成率为8.30±0.45个/细胞，显著高于DMSO溶剂空白对照组（P<0.01）；而氯硝柳胺联合照射组p-DNA-PKcs(T2609)foci形成率为4.16±1.85个/细胞，显著低于单纯照射组（P<0.05）；实验结果表明，氯硝柳胺明显抑制了辐射诱导的DNA双链断裂的非同源末端连接修复。

实施例12：

氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞Rad51foci形成的影响：

取对数生长期细胞接种于腔室载玻片上，分为DMSO溶剂空白对照组、单纯氯硝柳胺给药组（1.5μmol/L，24h）、单纯照射组（6Gy）和氯硝柳胺联合照射组，照射后6h，采用免疫荧光法检测并在荧光显微镜下观察并记录DAPI染色的细胞核中含>5个红色foci的细胞数，每个样品计数100个细胞，换算成含5个以上foci的阳性细胞率。结果显示，单纯加入1.5μmol/L氯硝柳胺预处理细胞24h后，Rad51foci阳性细胞率为31.64±9.13%，与DMSO溶剂空白对照组相比无明显变化，给予细胞6Gy照射后6h，Rad51foci阳性细胞率为62.85±2.85%，显著高于DMSO溶剂空白对照组（P<0.01）；而氯硝柳胺联合照射组Rad51foci阳性细胞率为66.98±5.10%，与单纯照射组无明显差异；实验结果表明，氯硝柳胺对辐射诱导MDA-MB-231细胞DNA双链断裂的同源重组修复无明显影响。

Claims (7)

1.氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在制备治疗恶性肿瘤放射增敏制剂中的用途。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述恶性肿瘤为三阴性乳腺癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述恶性肿瘤为Wnt/β-catenin信号通路和AKT过度激活且电离辐射诱导后Wnt/β-catenin信号通路和AKT激活增强的三阴性乳腺癌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐在对三阴性乳腺癌细胞无细胞毒性的<20%IC₅₀药物浓度下具有放射增敏作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐是靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路及其与之有交互作用的AKT通路，提高辐射诱导的细胞凋亡和自噬，降低辐射诱导的G2/M期阻滞；以及通过抑制NHEJ通路进而抑制辐射诱导的DNADSBs修复发挥放射增敏作用。

6.根据权利要求1-4任一所述的用途，其特征是，所述氯硝柳胺或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体组成肿瘤放射增敏的药用组合物。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述的药用组合物在放疗前和放疗期间使用。