CN105349486A - 黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用。所述应用为黄芪多糖对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本申请人经研究得到：黄芪多糖对各种因素造成的骨髓间质干细胞的损伤均具有防护作用，能够作为预防其恶变的药物使用。

Description

黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用

技术领域

本发明涉及黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)已成为肺癌等肿瘤细胞学治疗的最佳干细胞之一，但因其在肿瘤环境中可向恶性转化，其安全问题日渐突出。研究肺癌微环境中BMSCs恶性转化的机制并筛选可预防其恶变的药物日益受到重视。表观遗传原理与技术已成为探讨肿瘤发生机制及筛选防治肿瘤中药有效部位的重要途径之一。

黄芪有补气升阳、益卫固表、利尿消肿、托毒生肌之功效，始载于《神农本草经》，谓其“主痈疽，久败疮，排脓，止痛，大风癞疾，五痔，鼠瘘”，列于上品，是常用补益药之一。从上世纪70年代开始，人们便开始对黄芪在临床上的应用进行研究。药用黄芪有两种：豆科植物蒙古黄芪[Astragalusmongholicus(Bge.)Hsiao]及膜荚黄芪[A.menbranaceus(Fisch.)Bge]的干燥根。其主要有效成分包括黄芪多糖(AstragalusPolysacharin，APS)、黄芪总苷(Astragalosides)、黄酮类、氨基酸等。近年来，国内对其抗肿瘤作用的研究较为活跃。

发明内容

本发明提供了黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用，黄芪多糖对骨髓间充质干细胞具有良好的保护作用。

本发明提供黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用。

作为优选，所述应用为黄芪多糖对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在制备保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。

作为优选，所述应用为黄芪多糖在肿瘤环境中对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在制备肿瘤环境中保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。

进一步地，所述黄芪多糖的浓度为1-50μg/ml。

作为优选，所述应用为黄芪多糖在甲醛环境中对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在甲醛环境中保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。

进一步地，所述黄芪多糖的浓度为50-100μg/ml。

作为优选，所述应用为黄芪多糖在辐射条件下对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本发明还要求保护黄芪多糖在辐射条件下保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。

进一步地，所述黄芪多糖的浓度为1-50μg/ml。

本申请还提供黄芪多糖在制备预防骨髓间充质干细胞恶变的药物中的应用。

本申请人研究了黄芪提取物黄芪多糖对肺癌微环境诱导下BMSCs细胞形态学、生长周期、染色体核型变化、CEA等肺癌相关蛋白的表达水平，以及对p16等肺癌相关基因甲基化、组蛋白乙酰化、关键基因转录水平等的影响；统计分析BMSCs表观遗传变化与关键基因转录、癌相关蛋白表达水平的相关性及黄芪提取物的调控作用。揭示BMSCs恶性转化的能力及其机制，并筛选出可预防其恶性转化的黄芪有效部位，为黄芪联合BMSCs安全有效地临床应用奠定基础。本申请人还研究了甲醛对BMSCs的增殖和遗传毒性影响，并用黄芪进行干预，阐明黄芪对甲醛环境中BMSCs的保护作用，不但为甲醛导致白血病的发生提供生物学依据，而且为甘肃地方中药材的临床应用进一步提供实验依据。同时，本申请人经试验发现，黄芪多糖对X射线辐射诱发细胞基因组DNA损伤也有防护作用。可见，黄芪多糖对各种因素造成的骨髓间质干细胞的损伤均具有防护作用，能够作为预防其恶变的药物使用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为共培养体系的基本组成示意图；

图2为不同浓度APS对BMSCs的增殖率；

图3为不同浓度APS对A549细胞的抑制率；

图4为共培养后细胞形态变化图；其中，A：BMSCs(100×)；B：APS干预组(100×)；C：CO-BMSCs(100×)；D：CO-BMSCs，(oil，1000×)E：A549(100×)；

图5为各组细胞周期的变化；

图6为APS干预共培养后Westernblot结果；

图7为APS干预共培养后蛋白相对表达值(n＝3)；其中，**表示与CO-BMSCs比较，p<0.01；NS表示与BMSCs比较，p>0.05；

图8为WesternBlotting检测各组细胞中HDAC4蛋白表达及相应的柱形图；其中，A为HDAC4蛋白表达图，B为HDAC4蛋白表达柱形图；

图9为WesternBlotting检测各组细胞中组蛋白乙酰化的表达情况；其中，A为组蛋白H3乙酰化的表达情况；B为组蛋白H4乙酰化的表达情况；

图10为Real-TimePCR检测各组细胞中抑癌基因的蛋白表达；其中，A为p16基因的蛋白表达；B为p53基因的蛋白表达；HB组即正常对照组hBMSC组，HB-Co组即为模型对照组Co-hBMSC组；*表示与BMSCs组比较，p<0.05；**表示与BMSCs组比较，p<0.01；

图11为Real-TimePCR检测各组细胞中肿瘤相关分子的表达；其中，A为Rasgrp2的表达；B为Wnt5b的表达；C为EGFR的表达；HB组即正常对照组hBMSC组，HB-Co组即为模型对照组Co-hBMSC组；*表示与BMSCs组比较，p<0.05；**表示与BMSCs组比较，p<0.01；

图12为小牛胸腺DNA的标准曲线；

图13为甲醛对BMSCs的增殖活性影响；其中，*表示甲醛作用组与对照组(0μmol/L)相比较P<0.05；**表示P<0.01；

图14为黄芪对甲醛环境中BMSCs的增殖活性影响；其中，*表示黄芪作用组与对照组(0μg/ml)相比较P<0.05；**表示P<0.01；

图15为甲醛对BMSCs形态的影响及黄芪的干预作用；其中，A为对照组细胞形态(200X)，B为甲醛染毒组细胞形态(400X)，C为黄芪干预组细胞形态(200X)；

图16为甲醛对BMSCsDNA断裂的影响及黄芪的干预作用；其中，A为对照组彗星实验(400X)，B为甲醛染毒组彗星实验(400X)，C为黄芪干预组彗星实验(400X)；

图17为黄芪多糖对辐照后骨髓间充质干细胞的增殖影响，其中，*表示IR与Control相比，P<0.05；**表示APS+IR与IR比较，P<0.05；

图18为荧光显微镜观察X射线照射细胞后0.5h的y-H2AX免疫荧光簇集点及APS的保护作用；

图19为APS对X射线照射后细胞γ-H2AX荧光焦点数的影响；

图20为APS对2GyX射线诱发细胞微核率的影响；其中，*表示IR与Control相比，P<0.05；**表示APS+IR与IR比较，P<0.05。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

一、黄芪多糖抑制肿瘤细胞共培养体系中BMSCs肿瘤相关蛋白表达及其提高遗传稳定性作用-生物因素

1材料

1.1细胞来源

BMSCs购自CyagenBiosciencesInc.(CatalogNumber:HUXMA-01001；RegistrationNumber:08795844465781)；A549细胞株购自中国科学院上海细胞研究所(CatalogNumber:TCHu150)；黄芪多糖(简称APS)购自源叶生物科技有限公司，货号YY91332。

2方法

2.1细胞增殖与毒性实验(MTT比色法)筛选黄芪有效部位、有效浓度

2.2.1细胞样品的制备取对数生长期未做处理的BMSCs、A549细胞，分别使用含有10％胎牛血清的DMEM/F12、DMEM培养基配成浓度约为5×10⁴个/ml的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液，37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养至贴壁。

2.2.2药物筛选步骤两组细胞培养至贴壁后分别分组进行药物筛选：APS组：依次加入浓度为50、100、200、400μg/ml的APS药液100μl；对照组：加入等体积的DMEM/F12、DMEM培养基。每组设3个试验孔，3个复孔；不接种细胞的空白组为调零孔。原条件下继续培养24h、48h、72h。

2.2.3MTT检测终止培养后，每孔加入10μlMTT溶液(5g/l)，原条件继续培养4h。终止培养，小心吸去培养液，每孔加入150μlDMSO，水平摇床上振荡15min后，在酶标仪570nm波长处检测吸光度OD值。实验重复三次，按下式计算细胞增殖率及抑制率。

细胞增殖率＝(药物组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100％

细胞抑制率＝[1-(药物组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]×100％。

2.2筛选肺癌微环境A549与BMSCs共培养体系建立

确定将第五代骨髓间充质干细胞共培养7天作为本申请后续观察肺癌A549细胞共培养对BMSCs遗传性稳定性影响的观察条件。

采用具有聚碳酸酯膜(孔径为0.4μm)的Transwell悬挂式培养小室(Corning3450)结合6孔板进行非接触共培养(图1)。将Transwell小室放入六孔板中，小室内称上室，六孔板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，聚碳酸酯膜孔径为0.4μm，细胞不能自由通过小孔。细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。本实验将BMSCs细胞种于上室，每孔2×10⁴个，A549细胞种于下室，每孔5×10⁴个，研究A549细胞分泌或代谢产生的物质对BMSCs细胞的影响(图7)。

2.3黄芪多糖(APS)对共培养BMSCs细胞的影响

BMSCs在肺癌微环境中与A549细胞预共培养24h，之后加入黄芪多糖至终浓度为0.5g/L继续进行共培养，每天观察细胞生长情况，7d后传代，5代后取样进行相关检测。

2.4肺癌微环境共培养体系对BMSCs表观遗传学的影响以及黄芪多糖的干预作用

2.4.1共培养体系对BMSCs组蛋白乙酰化的影响

组蛋白的乙酰化是组蛋白转录后修饰的一种重要形式,肿瘤发生发展过程中,组蛋白的修饰出现异常是一个正在受到密切关注的方向,尤其是组蛋白乙酰化和去乙酰化异常的研究最多。而组蛋白乙酰化状态取决于组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)之间的活性竞争。组蛋白乙酰化多发生于核心组蛋白氨基端的赖氨酸残基上，其中存在于组蛋白H3和H4的6个赖氨酸位点(H3K9、H3K14、H4K5、H4K8、H4K12、H4K16)为组蛋白乙酰化的关键位点。通常组蛋白的乙酰化的增加会伴随着基因的表达上升。

2.4.2共培养体系对BMSCs中肺癌相关基因启动子甲基化的影响

肺癌的发生是一个多因素多阶段的过程，其中相关基因启动子的甲基化与去甲基化成为肺癌早期发生的信号，也是对肺癌进行早期诊断的依据。与肺癌相关的基因甲基化模式分为两类：癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化。本发明重点选取与肺癌发生相关的抑癌基因p16(CDKN2α)、p53，通过检测其启动子的甲基化水平和该基因的表达水平，来分析肺癌微环境对BMSCs分化的影响。Real-TimePCR检测以上基因的表达量变化。

2.5肺癌微环境共培养体系对BMSCs肿瘤相关信号通路失衡、表观遗传学相关分子的影响以及黄芪多糖的干预作用

肿瘤相关信号通路的活性失衡是肿瘤发生发展的重要机制之一。Wnt、EGFR、RAS等肿瘤相关信号通路活性失衡与肺癌的发展关系密切，是近年来防治肺癌等肿瘤药物研发的潜在靶点和重要途径。

2.5.1AgilentmRNA单通道表达谱芯片分析肿瘤相关信号通路失衡以及黄芪多糖的干预作用

基因芯片技术分析A(A549组)、B(BMSCs组)、C(Co‐BMSCs组，即A549与BMSCs共培养组)、D(APS干预Co‐BMSCs组)4组细胞。

2.5.2Real-TimePCR验证共培养体系对BMSCs肿瘤相关信号通路失衡的影响以及黄芪多糖的干预作用

分析A(A549组)、B(BMSCs组)、C(Co-BMSCs组)、D(APS干预Co-BMSCs组)4组细胞中与肿瘤发生相关的各信号通路的关键分子，对其表达量进行比较，以此分析肺癌微环境共培养体系对BMSCs肿瘤相关信号通路失衡的影响以及黄芪多糖的干预作用。

2.6统计学分析

实验数据均以表示，采用SPSS17.0forWindows软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One-wayANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1APS对BMSCs细胞增殖的作用

APS对BMSCs细胞增殖的作用MTT结果见表1。不同浓度的APS对BMSCs的增殖的有明显影响。不同浓度的APS作用于BMSCs24h后，50μg/mlAPS具有明显促进BMSCs增殖的作用(P<0.05)，100μg/ml、200μg/ml及400μg/mlAPS对BMSCs的增殖有抑制作用；作用48h、72h后，50μg/ml、100μg/mlAPS对BMSCs的增殖均有促进作用(P<0.05)，而200μg/ml、400μg/mlAPS对BMSCs的增殖则有抑制作用(P<0.01)。不同浓度APS对BMSCs的增殖率见图2。

表1不同浓度APS对BMSCs增殖影响的吸光度值(n＝6)

*表示与control组比较P<0.05；**表示与control组比较P<0.01.

3.2APS对A549细胞增殖的作用

APS对A549增殖MTT结果见表2和图3。由表2和图3可见，不同浓度的APS对A549细胞的增殖均有一定的抑制作用。

表2不同浓度APS对A549增殖影响的吸光度值(n＝6)

*表示与control组比较P<0.05；**表示与control组比较P<0.01。

不同浓度的APS作用于A54924h、48h、72h后，APS浓度的从50μg/ml增加到100μg/ml后，对A549细胞增殖的抑制作用增强(P<0.05)，而当APS浓度的从100μg/ml增加到400μg/ml后，对A549细胞增殖的抑制作用则明显降低(P<0.01)。不同浓度APS对A549细胞的抑制率见图3。

由上述结果可见，50μg/mlAPS不仅对BMSCs具有增殖作用，而且能够抑制A549细胞的增殖，并具有时间依赖效应，因此本实验以50μg/mlAPS作为共培养药物干预的最佳浓度，用于药物干预共培养实验。

3.3APS对共培养BMSCs细胞形态学的影响

BMSCs细胞形态均一，为成纤维细胞样，呈梭形或纺锤形贴壁生长，细胞分布均匀，排列有序，边界清晰，漩涡样生长；与A549共培养7d后，共培养组细胞(CO-BMSCs)出现了细胞形态的改变，细胞缩短变小，排列紊乱，呈不规则多边形重叠生长，胞核增大，核形状和染色不一，核浆比增大，并可见病理性核分裂象；APS干预共培养后的BMSCs，细胞形态呈梭形或纺锤形，分布均匀，漩涡样生长，未出现CO-BMSCs组的形态改变，具体结果见图4。

3.4APS对共培养BMSCs细胞集落形成的影响

APS干预共培养组细胞集落形成率为0.86±0.23％，与CO-BMSCs组(48.96±1.95％)相比，差异有统计学意义(p<0.01)，与BMSCs组相比(9.67±2.08％)，差异无统计学意义(p>0.05)(表3)。

表3各组细胞集落形成率(n＝3)

**表示与CO-BMSCs组比较p<0.01。

3.5APS对共培养BMSCs细胞周期的影响

从图5看出，APS干预共培养组G₁期细胞及S期细胞占82.45％±5.83％、8.65±0.52％，CO-BMSCs组占62.57％±6.65％、23.54±0.6％，APS干预共培养组处于G₁期的细胞比例高于CO-BMSCs组，S期细胞比例明显较CO-BMSCs组降低，两组间有统计学差异(p<0.05)。BMSCs组G₁期与S期细胞分别为77.8％±5.04％和9.05±0.8％，APS干预共培养组与BMSCs组间无显著性差异(p>0.05)。

3.6APS对共培养BMSCs细胞肿瘤相关蛋白表达量的影响

Westernblot显示(图6和图7)，APS干预共培养后，与CO-BMSCs组相比，p53、caspase3表达量上调，Ras、p-ERK、NF-κB表达量下调(p<0.01)；与BMSCs组相比，差异无统计学意义(p>0.05)。

3.7共培养体系中MSC组蛋白乙酰化的影响以及黄芪多糖的干预作用

组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylase,HDAC)在染色体结构修饰、转录调节和细胞分化中扮演了重要的角色，HDAC4属于第2类HDAC，可在核-质之间穿梭传递信号，调节相应基因的转录，在多种肿瘤中异常表达。本申请发现共培养组细胞HDAC4蛋白表达量高于BMSCs组(图8)；此外，蛋白芯片结果显示，与对照组BMSCs相比，共培养组细胞HDAC6蛋白的表达量明显上升，而APS干预共培养组的HDAC6蛋白表达量呈下降趋势。说明共培养组细胞存在着乙酰化紊乱，可能是导致细胞过度增殖、转化与遗传稳定性变化的主要机制之一。

由图9可见，与肺癌细胞A549相比，组蛋白H3K9的乙酰化水平在骨髓间充质干细胞中本底表达水平较高，而在肺癌微环境共培养诱导条件下明显下降，这与HDAC4活性增强(图8)的结果相一致；H4K5的乙酰化水平在BMSCs和Co-BMSCs细胞中表达水平较接近，并无明显区别，而在A549细胞中的本底表达水平较低，暗示HDAC4对BMSCs中该位点没有明显的抑制作用；H4K8的乙酰化水平在骨髓间充质干细胞中本底表达水平较高，而在肺癌微环境共培养诱导条件下明显下降，接近A549细胞中H4K8的乙酰化本底水平；黄芪多糖的干预均未能使得共培养条件下H3K9和H4K8的乙酰化水平回复；值得一提的是，黄芪多糖的干预导致共培养条件下BMSCs细胞中H4K5的乙酰化水平明显下降。

肺癌微环境共培养的BMSCs通过调节自身HDAC活性的升高，引起自身H3K9及H4K8乙酰化水平降低，进而改变下游基因的表达，最终导致BMSCs向着A549方向分化。黄芪多糖对共培养BMSCs的干预并未使H3K9、H4K5、H4K8的乙酰化水平得到回复。

3.8共培养体系中MSC中肺癌相关基因启动子甲基化的影响以及黄芪多糖的干预作用

p16基因与许多肿瘤的发生发展密切相关，也称为多肿瘤抑制基因。在肺癌患者中，p16基因启动子的甲基化频率为17％-80％。Real-TimePCR结果(图10)显示，与正常BMSCs相比，肺癌微环境共培养的BMCs中的p16基因表达量略有下降，这与肺癌A549细胞中的p16基因低表达相一致；此外，黄芪多糖(APS)干预共培养组的p16基因表达量明显上升，暗示APS具有促进抑癌基因p16高表达的效果以及其可能的抑癌机制，也在一定程度上体现了黄芪在抑制及治疗肿瘤疾病方面的食疗价值。

p53基因编码一类高效的肿瘤细胞抑制蛋白，该蛋白包含转录激活结构域、DNA结合结构域、寡聚化结构域。该蛋白响应各种细胞内胁迫，进而调节下游基因表达，主要功能有：抑制细胞生长周期、促进凋亡、修复DNA、改变代谢。结果(图10)显示，与正常BMSCs相比，肺癌微环境共培养的BMCs中的p53基因表达量明显下降，这与肺癌A549细胞中的p16基因低表达相一致；而APS干预共培养组的p53基因表达量并未出现上升趋势，反而出现较明显的下降趋势，暗示APS对肺癌微环境共培养BMSCs中的p53抑癌基因的激活能力较弱。

肺癌微环境共培养条件下BMSCs中抑癌基因p16及p53的表达受到明显抑制，在一定程度上促进了BMSCs恶性转化的趋势。

APS干预对p16基因的表达提升作用较为明显，暗示其可能的抑癌机制。

3.9共培养体系中肿瘤相关信号通路失衡以及黄芪多糖的干预作用

Real-TimePCR结果(图11)显示，与正常BMSCs相比，肺癌微环境共培养的BMCs中的Wnt5b基因表达量下降，这与肺癌A549细胞中的Wnt5b基因低表达相一致；同时，基因芯片结果显示，APS组与共培养模型组相比，Wnt信号通路中Wnt5b基因表达量出现明显差异。此外，黄芪多糖(APS)干预共培养组的Wnt5b基因表达量明显上升(图11)，基因芯片结果同样显示，A549组与APS组相比，Wnt信号通路中Wnt5b基因表达量出现明显差异。

表皮生长因子受体(EGFR)在调节肿瘤细胞生长、新血管生成、肿瘤侵袭和转移过程具有重要作用。Real-TimePCR结果(图11)显示，与正常BMSCs相比，肺癌微环境共培养的BMCs中的EGFR基因表达量下降，这与肺癌A549细胞中的Wnt5b基因低表达相一致。

肺癌微环境共培养BMSCs中与肿瘤相关的信号通路Wnt、EGFR、RAS中的关键分子表达量发生异常，而黄芪多糖对该异常活动具有一定的回复效果。

4小结

(1)肺腺癌微环境中培养的BMSCs细胞出现类A549样形态改变，异常增殖；

(2)BMSCs异常增殖的分子机制可能与ERK1/2信号传导通路异常，抑制细胞凋亡、过度增殖有关；

(3)低浓度(50、100μg/ml)APS可促进BMSCs细胞增殖，50μg/ml增殖效果最显著；确定以50μg/mlAPS进行后续研究；

(4)APS可抑制BMSCs在肺腺癌微环境中的异常增殖，可能与APS介导ERK1/2信号通路调控有关；

(5)肺癌微环境共培养条件下BMSCs中抑癌基因p16及p53的表达受到明显抑制，在一定程度上促进了BMSCs恶性转化的趋势。APS干预对p16基因的表达提升作用较为明显，提示这可能是APS的抑癌机制之一；

(6)Real-TimePCR分析肺癌微环境共培养BMSCs中与肿瘤相关的信号通路Wnt、RAS中的关键分子表达量发生异常，而黄芪多糖对该异常活动具有一定的回复效果；

(7)肺癌微环境共培养的BMSCs通过调节自身HDAC活性的升高，引起自身H3K9及H4K8乙酰化水平降低，进而改变下游基因的表达，最终导致BMSCs向着A549方向分化。APS对共培养BMSCs的干预并未使H3K9、H4K5、H4K8的乙酰化水平得到回复，可能APS不是通过影响H3K9、H4K5、H4K8的乙酰化而调控肺癌微环境共培养体系中BMSCs的异常分化，具体机制有待进一步深入研究；

(8)由上述实验可以得知：黄芪多糖能够用于制备肿瘤环境中保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物。

二、黄芪抑制化学环境中BMSCs肿瘤相关蛋白表达及其提高遗传稳定性作用(化学环境)

甲醛(formaldehyde)是A1类致癌物质，可以导致白血病的发生，但是生物学证据不足。已有研究证实甲醛对骨髓中的造血干细胞具有毒性影响，然而对骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的毒性作用，还未见报道。BMSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还能调节造血干细胞的正常增殖和分化。因此，BMSCs一旦受损，就会影响骨髓的正常造血，从而导致白血病的发生。

1材料

1.1细胞来源

鼠骨髓间充质干细胞(mousebonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)购自于美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，细胞编号：CRL-12424。

2方法

2.1黄芪对甲醛环境中BMSCs的增殖活性影响

采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖活性，具体方法同2.2。在96孔板中加入200μl的细胞悬液，培养24h。吸弃培养液，加入终浓度分别为50、100、150、200、250μg/ml的黄芪多糖，培养12h后加入确定染毒浓度的甲醛继续培养12h，用酶标仪测定，对照组采用不加黄芪的175μmol/甲醛进行培养。

2.2细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下观察BMSCs经过甲醛染毒和黄芪多糖干预后的形态变化，并利用显微成像系统进行拍照，记录结果。

2.3蛋白酶K修饰的彗星实验(CometAssay)

1)常规载玻片用砂纸打磨，泡酸，清洗，烘干备用；

2)收集细胞：细胞经胰酶消化收集，用PBS洗净。800rpm/min，4℃，离心5min，弃上清液后再加入2ml的PBS重悬，将细胞密度调整为4×10⁴个/m1，放入37℃恒温水浴锅中备用；

3)铺底层胶：配制1％(M/V)的正常熔点琼脂糖，取50μl滴加到打磨完全的载玻片上，确保覆盖整个玻片，室温凝固；

4)铺顶层胶：配制1％(M/V)的低熔点琼脂糖，将收集的细胞悬液与低熔点琼脂糖在37℃条件下混匀(体积比为1:3)，此时胶中细胞密度为1×10⁴个/m1取400μl均匀铺到底胶上，放置4℃条件下10min，使胶凝固；

5)裂解：将载玻片移入盒中，浸入4℃预冷的蛋白酶K修饰的彗星实验裂解液中，37℃细胞培养箱中裂解4h；

6)电泳：倒去裂解液，载玻片用PBS漂洗三次，每次10min。小心取出载玻片，放入电泳槽，缓慢倒入4℃预冷的电泳缓冲液，约覆盖过载玻片50mm，在缓冲液中静置30min解旋。解旋完毕后，调节电压15V，电流300mA，避光电泳25min；

7)中和：电泳结束后，取出载玻片，浸入0.4mol/LTris缓冲液(pH7.5)，4℃条件下避光中和15min，进行两次，期间小心操作，以防止凝胶脱落；

8)固定：载玻片浸入1％的H₂O₂中固定10min，然后超纯水洗3次，每次5min；

9)染色：滴加5μg/ml的碘化丙啶(PI)，4℃避光染色30min，最后用超纯水漂洗玻片3次，每次5min。24h内观察和拍照；

10)观察与拍照：使用荧光显微镜对样品进行观察，利用显微成像系统对随机选取细胞进行拍照以便后续分析；

11)图像分析：应用彗星实验专业分析软件CASP1.2.3对采集的图片进行分析，每个处理组随机选取50个细胞进行分析。并釆用国际公认的Olive尾矩(OliveTailMoment，OTM)值对DNA链的断裂进行评价。OTM值等于彗星头尾部密度重心间距离×彗尾DNA含量。实验重复三次。

2.4KCl-SDS沉淀实验

1)细胞的裂解：胰酶消化、收集细胞，加入0.5ml2％的SDS溶液并轻微振荡，然后在65℃水浴中加热10min，待用。

2)游离DNA的分离：从水浴中取出裂解好的细胞，加入溶于20mmol/LTris-HCl的1mol/L的KCl(pH＝7.5)，将混合液6次穿过1ml的聚丙烯枪头，从而使DNA长度一致。然后待混合液在冰上冷冻5min，形成SDS-K⁺沉淀后，在10000rpm/min、4℃下离心5min收集沉淀，将上清液转入另一5ml离心管中。沉淀中加入1ml的清洗缓冲液以重悬浮，65℃水浴加热10min，冰上骤冷5min，重复清洗3次，每次都将上清转入5ml离心管中，此上清中为游离的DNA。

3)DPCs中结合DNA的分离：将最终的沉淀重悬浮于0.5ml的清洗缓冲液中，然后加人0.5ml的0.8g/ml蛋白酶K，50℃水浴消化3h，从水浴中取出冰上骤冷5min，12000rpm/min，4℃离心10min，收集上清液，此上清中为DPCs中的DNA。

4)DNA标准曲线的绘制：以小牛胸腺DNA为标准绘制标准曲线。用清洗缓冲液配制终浓度分别为0、100、300、500、750、1000、1500、2000、3000、5000ng/mL的小牛胸腺DNA标准液，将标准液各取1ml置于5ml离心管中，紧接着加入1ml新鲜配制的500ng/ml的荧光染料Hoechst33258。使终浓度为250ng/ml，置于暗处30min，用荧光分光光度仪在353nm激发光和455nm发射光下测得各标准处理组的荧光值，绘制标准曲线。标准曲线参见图12。

5)DNA与蛋白质交联程度的测定：取上述含自由DNA和交联DNA的上清液1ml，加入1ml新鲜配制的400ng/ml的荧光染料Hoechst33258，使其中浓度为200ng/ml，置于暗处30min，用荧光分光光度仪在353nm激发光和455nm发射光下测得各处理组的荧光值，根据标准曲线来定量自由DNA和交联DNA，用以下公式计算DPCs水平，DPCs＝交联DNA/(交联DNA+自由DNA)×100％，以此值表示DNA与蛋白质交联的程度。实验重复三次。

2.5统计学处理方法

实验数据均以表示，采用SPSS17.0forWindows软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One-wayANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1甲醛对BMSCs的增殖活性影响

MTT结果显示(见图13)，与对照组相比，BMSCs经25和50μmol/L甲醛作用12h后增殖活性均无明显变化。当甲醛浓度≥75μmol/L时，作用12h后，细胞存活率均显著下降，与对照组相比有统计学意义(P<0.01)，并且呈浓度依赖关系。我们选择接近半数抑制量的175μmol/L甲醛进行后续实验。

3.2黄芪对甲醛环境中BMSCs的增殖活性影响

MTT结果显示(见图14)，与对照组相比，175μmol/L甲醛环境中的BMSCs经50μg/ml黄芪多糖作用24h后，仍然处于增殖抑制状态，与对照组比有统计学意义(P<0.01)。150-250μg/ml黄芪多糖作用24h后，增殖活性均有明显升高(P<0.01)。100μg/ml黄芪多糖作用24h后，甲醛环境中的BMSCs增殖活性与对照组接近，无统计学差异(P>0.05)，因此，我们选择100μg/ml黄芪多糖进行后续实验。

3.3甲醛对BMSCs形态的影响及黄芪的干预作用

如图15所示，对照组BMSCs贴壁生长，呈长梭形或多边形，大小较一致，排列呈旋涡状。175μmol/L甲醛染毒组的BMSCs数量明显减少，细胞开始变圆、变小、甚至出现不规则形状，胞浆减少，可见胞膜出泡现象，而且细胞排列紊乱。黄芪干预组，细胞形态改变不明显，可见部分细胞变圆。

3.4甲醛对BMSCsDNA断裂的影响及黄芪的干预作用

我们用蛋白酶K修饰的彗星实验检测DNA断裂作用，并釆用国际公认的Olive尾矩(OliveTailMoment，OTM)值对DNA链的断裂进行评价。彗星实验结果显示(图16)，175μmol/L甲醛在作用BMSCs12h后，DNA断裂效应明显升高，与对照组比具有显著差异(P<0.01)。而黄芪干预组DNA断裂较对照组轻微升高，无统计学意义(P>0.05)。

3.5甲醛对BMSCsDPCs的影响及黄芪的干预作用

我们用KCl-SDS沉淀实验来检测DPCs的水平。研究发现，175μmol/L甲醛作用时，DPCs值为20.457±0.426，明显升高(P<0.01)。而黄芪干预组DPCs水平较对照组轻微升高(4.013±0.324vs.3.32±0.519)，无统计学意义(P>0.05)。

4小结

(1)甲醛对BMSCs具有细胞毒性和遗传毒性，为研究甲醛导致白血病的发生提供了生物学依据；

(2)黄芪对甲醛环境中的BMSCs具有保护作用，为甘肃道地药材——黄芪的临床应用进一步提供实验依据；

(3)蛋白酶K修饰的彗星实验可作为一种更为敏感的方法来检测甲醛引起的DNA链断裂效应。

(4)由上述实验可以得知：黄芪多糖能够用于制备甲醛环境中保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物。

三、黄芪多糖对辐射诱发骨髓间充质干细胞基因组DNA损伤的防护研究(物理环境)

电离辐射广泛存在于人们日常生活中，对人体造成危害。近年来肿瘤放射治疗的病人逐年升高，但放射治疗在治疗肿瘤细胞的同时，也损伤正常的组织和细胞。骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)是一类具有多分化潜能的前体细胞，在应激条件下可向不同成体细胞方向分化，可参与损伤部位的组织修复研究。而骨髓造血系统是辐射损伤的主要靶器官之一，国内外有研究低剂量辐射对BMSCs的兴奋效应，但关于中高剂量辐射对该细胞损伤及其保护措施研究少有报道。目前研究抗辐射药物多为化学类药物，其毒副作用明显，一般在达到中毒剂量时才显示出抗辐射活性。本申请系统研究了黄芪多糖对X线电离辐射诱发正常人BMSCs细胞增殖异常、基因组DNA损伤和微核形成的防护作用，为将其开发为安全有效的辐射防护药物提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要仪器及试剂

二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，荧光显微镜(日本Nikon公司)，X射线辐照装置(美国RX-650)。全波长酶标仪(美国Thermo公司),0.25％胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，CCK-8试剂盒(上海东仁公司)，DAPI(美国Sigma公司)，53BP1兔抗(美国abcam公司)，免疫荧光抗体594羊抗兔(美国abcam公司),细胞松弛素B(北京Solarbio公司)。

1.2细胞来源及培养

人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells-bonemarrow,HMSC-bm))购自美国ScienCell公司(CatalogNumber:7500)。细胞培养液为MSCM专用培养基(美国ScienCell公司)，内含10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素及0.5％的MSCGS(间充质干细胞生长因子)。黄芪多糖药物用MSCM专用培养基溶解，储存液为1mg/ml。细胞用60mm培养皿培养，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度孵箱中。每2～3d换液一次，待细胞汇合度约达80％后，0.25％胰蛋白酶对其消化传代，第5代细胞用于实验。

1.3照射条件和实验分组

照射由中国科学院近代物理研究所的X射线辐照装置提供，剂量率为0.6Gy/分钟(100KeV,5mA)，实验分正常组(Control)，照射组(IR)，加药照射组(IR+APS)。

1.4CCK-8法筛选APS最佳有效浓度

收集对数生长期的HMSC-bm分别接种于96孔板(5×10³个/孔,100μl)，移至细胞培养箱中培养至细胞贴壁。依次加入浓度为25、50、75、100、125μg/mlAPS药物100μl，对照孔加入等体积的HMSC-bm专用培养基，每组设5个复孔；不接种细胞的空白组为调零孔。继续培养，分别于1d、2d、3d、4d、5d进行CCK-8法检测。于各时间点终止培养后，每孔加入10μlCCK-8溶液，孵育培养箱中继续培养4h，终止培养后直接在450nm波长处用全波长酶标仪检测各组细胞的吸光度OD值。实验进行3次生物学重复。

1.5CCK8法检测黄芪多糖对辐射细胞增殖影响

选取对数生长期的HMSC-bm制成单细胞悬液，分别接种于96孔板(5×10³个/孔，100μl)，移至细胞培养箱中培养至细胞贴壁。贴壁后加药组加药，每孔加入100μl浓度为50μg/ml的APS，对照孔加入等体积的MSC专用培养基，每组设5个复孔；不接种细胞的空白组为调零孔。继续培养3d，照射组进行X射线2Gy剂量辐照,分别于1至5d进行CCK-8法检测各组细胞增值水平。实验进行3次生物学重复。

1.6γ-H2AX免疫荧光检测

取无菌的12孔板，每孔加入20mm×20mm已灭菌盖玻片，紫外照射一小时。选取对数生长期的HMSC-bm，0.25％的胰酶消化，分别种入2×10⁴个细胞于12孔板，每孔2ml，每组设3次重复。贴壁后加药组加药，每孔加入100μl浓度为50μg/ml的APS，照射组进行2GyX射线辐照，受照射细胞分别培养30min,2h后收集样品，对照组样品平行收集。先用冰甲醇中固定20min，0.5％Triton-X100(PBST)孵育10min；然后用5％脱脂牛奶封闭1h后，细胞与兔抗53BP1单克隆抗体在室温孵育2h；以PBST洗涤三遍后再与IgG二抗在室温孵育1h,以PBST洗涤5遍。最后细胞核以4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染并制片，注意避光操作。荧光显微镜观察并拍照，每个样品计数100个细胞并计算平均焦点数目。实验进行3次生物学重复。

1.7CB法检测细胞微核

取对数生长期HMSC-bm细胞，以1×10⁴个/L接种于24孔板，待细胞贴壁后加药组加药。照射组2GyX射线，照射前细胞换液。照完后各组细胞加入细胞松弛素B(终浓度4μg/mL)1μl培养48h后终止培养，PBS洗两次。冰乙酸和甲醇(体积比1:9)固定，通风橱干燥20min,吖啶橙染料染色。用荧光显微镜观察1000个双核细胞，依微核判断标准计数细胞微核数(MNF)，计算结果以千分率(‰)，实验重复3次。

1.7统计学分析

应用SPSS21.0统计软件分析。两组间均数比较采用T检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析；p＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度APS对HMSC-bm增殖的影响

由表4可知，同一浓度APS作用于细胞，细胞吸光度值随着时间的增加而增加，各组与对照组(第一天)相比，p＜0.05，差异具有统计学意义；在相同的时间点，与对照组(0ug/ml)比较,不同浓度APS作用于细胞后，细胞吸光度值均增加。当APS浓度在50μg/ml时，与其他浓度(同一时间点)相比细胞的OD值最大，p＜0.05，差异具有统计学意义。本实验依据可促进HMSC-bm增殖最大药物浓度为最佳药物浓度，选50μg/mlAPS浓度为后续实验最佳干预药物浓度。

表4不同浓度APS对细胞增殖的影响(n＝5)

^▲表示APS+HMSC-bm与各组第一天比较，p＜0.05；#表示APS+HMSC-bm与HMSC-bm(0ug/ml)组比较p＜0.05。

2.2APS提高HMSC-bm细胞对X射线的辐射抗性

如图17所示，随着时间的增加，各组HMSC-bm增殖率逐渐增高，到第五天时，增值率达最高；在相同的时间点，2.0Gy的X射线照射HMSC-bm后细胞的增殖水平明显下降(P＜0.05)；而加药(50μg/ml)后细胞增殖水平明显增加P＜0.05)。

2.3APS对X射线诱发细胞DNA双链断裂损伤的保护效应

由图18可以看出，正常组未照射细胞未见γ-H2AX簇集焦点，2GyX射线照射后30min，单个细胞γ-H2AX簇集焦点(foci)明显增多，照射前3天加入50μg/ml的APS，细胞内γ-H2AX簇集焦点明显减少。其单个细胞平均foci点在2个；图19中，正常对照组细胞foci点为0；照射后，0.5h,2h均出现大量的foci点，0.5小时foci最多，计数100个细胞foci点达到372个，加药后foci点为190个,与照射组比较foci明显减少(P<0.05)；2h细胞foci点达到253个，加药后减少至157个,与照射组相比，P<0.05，差值具有统计学意义。

2.4APS对X射线照射诱发细胞微核的影响

HMSC-bm细胞在APS预先作用3d后经2.OGyX照射诱发微核率的测定结果如图20所示。可以看出，正常组细胞微核率在较低，微核率在正常细胞水平范围内。与对照组相比，2.OGyX射线照射后细胞的微核率明显增加(P＜0.05)，加药后，与照射组相比，细胞微核率显著下降(P＜0.05)。

由上述实验可以得知：黄芪多糖能够用于制备辐射条件下保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.黄芪多糖在骨髓间充质干细胞中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为黄芪多糖对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为黄芪多糖在肿瘤环境中对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述黄芪多糖的浓度为1-50μg/ml。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为黄芪多糖在甲醛环境中对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述黄芪多糖的浓度为50-100μg/ml。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为黄芪多糖在辐射条件下对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述黄芪多糖的浓度为1-50μg/ml。

9.黄芪多糖在制备预防骨髓间充质干细胞恶变的药物中的应用。