CN105647858A - 当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用，具体来说是提供当归多糖在炎性因子微环境中对骨髓间质干细胞增殖的影响和遗传稳定性的保护作用。本发明利用IL-6和TGF-β1建立肿瘤相关炎性微环境，观察IL-6、TGF-β1单独或联合对BMSCs的形态、微丝、增殖及增殖基因Bcl-2、癌基因Ras蛋白表达的变化；分析并探讨当归主要有效成分-当归多糖(<i>Angelica？sinensis？</i>polysaccharide,？ASP)等对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs增殖的影响及遗传稳定性保护作用。

Description

当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用

技术领域

本发明涉及当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用，尤其涉及当归多糖在炎性因子微环境中对骨髓间质干细胞增殖的影响和遗传稳定性的保护作用。

背景技术

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是典型的成体干细胞之一，来源于骨髓，具有高度自我更新、较强增殖能力与多向分化能力，在体外特定条件下可诱导分化为软骨细胞、骨细胞、心肌细胞、干细胞、脂肪细胞等，被认为是组织器官损伤修复的重要细胞来源。此外BMSCs具有免疫原性低、肿瘤趋向性及易于导入各种基因的优良特性。BMSCs作为靶向抗癌载体运用于肿瘤生物治疗研究引起越来越多的关注。经过基因修饰的BMSCs到达肿瘤所在部位后表达治疗相关分子或自杀基因，从而达到缓解或治愈肿瘤的目的。MSCs作为载体携带IFN-β、TRAIL等抗癌分子治疗肿瘤获得了明显疗效，开启了肿瘤新型的治疗途径。

近期研究表明，干细胞的命运受其所处的微环境的影响。正常机体微环境中，干细胞的增殖和凋亡处于平衡状态以保证干细胞功能的正常，一旦这种平衡被破坏后，干细胞将会分化为肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts , CAFs)或发生恶性转化。Weber CE等研究发现骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)能够使乳腺癌微环境中的MSCs转化为TAFs，此过程依赖于TGF-β1的介导。Hou^[等发现在C6胶质瘤微环境中MSCs可表现出恶性肿瘤细胞的特征，增殖能力明显增强，GP130, STAT-3, CyclinD1和BCL-xl的表达明显增加，并且IL-6和IL-6R水平明显升高；SIL-R/GP130的活化可能是肿瘤微环境中MSCs出现恶性转化的重要原因之一。通过STA-21阻断STAT3信号通路可以降低肿瘤微环境中MSCs肿瘤样转化的风险。IFN-γ和TNF-α通过NFκB/SMAD7信号通路协同诱导MSCs损伤和通过NFκB调节的癌基因激活导致肿瘤的发生。

干细胞发生恶性转化与其微环境中的炎症密切相关。炎症已被认为是肿瘤的一大特征。在生物体损伤或病原体入侵后，炎症需要一系列复杂的防御机制协调来恢复自我平衡。炎症是一把双刃剑。机体在正常生理情况下，能对外来或者内在刺激作出炎症反应，具有消除损伤因子、修复组织损伤等重要防御作用，通常此反应对机体是有利的；但在一些情况下，如长期的慢性炎症存在时，炎症对机体的反应又是潜在有害的。Luo等研究发现亚硝酸盐诱导的炎症可促进细胞恶性转化和EMT，其中的分子机制是由于炎性因子IL-6的分泌进一步活化STAT3和miR-21的表达；通过抗IL-6抗体培养人支气管上皮细胞，亚硝酸盐诱导细胞恶性转化和EMT可被逆转。已有研究报道，多种肿瘤的形成与其长期的炎症存在密切相关。各种化学、生物因素等诱导肿瘤形成的过程中，炎性因子起着十分重要的作用，如IL-6、TGF-β1。

IL-6是存在于肿瘤微环境中的细胞因子，通过活化STAT3,MAPK和AKt信号通路促进肿瘤细胞的增殖，血管形成，侵袭和转移；IL-6可通过改变N-cadherin, vimentin,snail, twist 和 E-cadherin的表达来促进上皮间质转化(epithelial to mesenchymaltransition, EMT) ，进一步导致肿瘤的转移；IL-6可促进干细胞微球体形成和自我更新，有助于肿瘤细胞干性的维持，具有招募MSCs的作用；IL-6通过gp130/MAPK/STAT3调节的转录因子C/EBPβ/δ的活化、p-glycoprotein的过度表达、EMT转化和干细胞的扩增促进肿瘤细胞的多重耐药。IL-6 已经被认为是一种促瘤因子，参与多种肿瘤的发生、发展，与神经胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌等中路密切相关。IL-6 可通过与gp130结合形成复合体，进一步与其下游的JAK 激酶结合，发挥生物效应，进而与转录激活子-3（STAT3）调控靶基因。Jak/STAT3信号通路被认为是联系炎症与肿瘤的桥梁。已有研究表明，肺癌患者血清IL-6水平与临床分期及治疗效果有一定的关联性，临床分期与血清IL-6含量呈正相关；治疗效果与血清IL-6含量负相关。此外IL-6在乳腺癌中还能诱导EMT发生，同时也与肿瘤干细胞（CSC）活性关系密切，而EMT与CSC进一步又影响着EGFR-TKI药物的耐药发生。最近的研究报道揭示，IL-6/STAT3信号通路与NF-κB通路起到协同作用，进一步诱导某些细胞因子的表达，从而以正反馈调节方式促进肿瘤干细胞的形成。研究发现BMSCs与 C6 脑胶质瘤细胞间接共培养后BMSCs发生了瘤化，重要机制之一为 C6脑胶质瘤细胞高分泌白介素6，从而激活下游相关信号通路，包括IL-6/JAK/STAT3信号通路，从而导致BMSCs发生恶性转化，证实了C6脑胶质瘤细胞微环境中某些分泌性因子可以诱导BMSCs发生恶变。Iliopoulos等研究发现， IL-6能够诱导非肿瘤干细胞向肿瘤干细胞的转变。最近，Marotta等利用shRNA文库筛选发现，IL-6 /STAT3信号通路是乳腺癌干细胞的增殖所必需的。

正常情况下，TGF-β与T淋巴细胞之间相互作用，使机体处于平衡状态。病理情况下，TGF-β1过度表达，过高水平的TGF-β1打破了这种平衡导致转化生长因子对淋巴细胞抑制作用增强，导致机体的免疫监督功能受到破坏，使机体对病原体、肿瘤细胞的免疫监视、免疫反应能力遭到削弱或丧失，导致疾病或肿瘤的发生。Chen等测定了TGF-β1在原发性肝癌患者癌组织与癌旁组织中的表达水平，结果显示肝癌组织 TGF-β1表达阳性率明显高于癌旁组织，结果有统计学意义。在肿瘤微环境中，TGF-β信号通路在BMSCs向癌症相关成纤维细胞分化过程中起非常重要作用，将诱饵TGF-β受体基因骨形态发生蛋白和激活素结合抑制剂导入BMSCs中，成功阻断了TGF-β/Smad信号通路的活化和CAF相关标志物的表达，并且成功抑制了BMSCS对乳腺癌生长的促进作用。

炎性因子作为炎症微环境的重要成员之一，也参与了肿瘤的起始与演进。研究者将胶质瘤微环境中同等水平浓度的外来IL-6诱导大鼠BMSCs，结果发现，经过2个月长时间诱导后BMSCs生长接触抑制减弱，蛋白结果表明p53蛋白表达明显降低，MDM2蛋白明显升高，接种裸鼠皮下可形成肿瘤。文献报道，通过IL-4和GM-CSF培养人MSCs，发现MSCs出现与肿瘤细胞相似的形态和表型，将其注入免疫缺陷鼠体内，能引起肺结节的快速增长。炎症反应微环境不仅通过调控干细胞的自我更新和分化潜能，还能够增加细胞突变的概率，并且能够增加突变细胞的增殖能力。

发明内容

本发明提供了当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用，具体来说是提供当归多糖在炎性因子微环境中对骨髓间质干细胞增殖的影响和遗传稳定性的保护作用。

本发明提供当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用。

作为优选，所述应用为当归多糖对炎性因子微环境下的骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

作为优选，所述炎性因子为IL-6和/或TGF-β1。

作为优选，所述应用为当归多糖抑制炎性因子微环境下的骨髓间充质干细胞的遗传稳定性变化。

作为优选，所述应用为当归多糖抑制炎性因子微环境下的骨髓间充质干细胞的增殖。

作为优选，所述当归多糖的浓度为50μg/ml。

本发明还提供当归多糖在制备炎性因子微环境下骨髓间质干细胞抑制剂中的应用。该抑制剂以当归多糖作为有效成分。当归多糖的浓度优选为50μg/ml。

作为优选，所述当归多糖的制备方法为：将当归先醇提，然后水提得到水提液；将水提液去除蛋白后，醇沉得到当归多糖。

作为优选，所述醇提是用90-95%乙醇提取两次，每次0.5-1.5h，加液重量分别为6倍和4倍。

作为优选，所述水提是用水煎法提取3次，每次0.5-1.5h，加水重量分别为8、6、6倍。

作为优选，所述醇沉是在去除蛋白质的水提液中加入95%乙醇至醇体积浓度为75-80%，低温静置22-26h后，再次用相同的方法进行沉淀。

作为优选，在醇沉后还包括减压干燥的步骤。

本发明利用IL-6和TGF-β1建立肿瘤相关炎性微环境，观察IL-6、TGF-β1单独或联合对BMSCs的形态、微丝、增殖及增殖基因Bcl-2、癌基因Ras蛋白表达的变化；分析并探讨当归主要有效成分-当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide, ASP)等对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs增殖的影响及遗传稳定性保护作用。

肿瘤相关炎性微环境中BMSCs细胞生物学特性出现遗传稳定性变化，该变化可能与炎性微环境可促使BMSCs中STAT3信号通路激活有一定相关性；ASP可抑制BMSCs在炎性微环境中的遗传稳定性的变化，其分子机制可能与ASP改善炎性微环境的失衡状态，调控增殖基因Bcl-2、癌基因Ras蛋白表达的变化有关。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为不同浓度ASP对BMSCs增殖影响；

图2为炎性因子诱导后各组细胞形态变化（46 day，10×10）；

图3为炎性因子诱导后各组细胞微丝变化（46 day，10×10）；

图4为炎性因子诱导后各组细胞增殖曲线（46 day）；

图5为炎性因子诱导后各组细胞蛋白表达变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

1 当归多糖（ASP）的制备

（1）当归的预处理

将当归药材粉碎为最粗粉，加90-95%乙醇提取两次，每次0.5-1.5 h，加液量分别为6倍和4倍，将脱脂后的当归药渣于空气中晾干，挥发去溶剂后收集待用。

（2）多糖的提取

取醇提后的当归药渣用水煎法提取3次，每次0.5-1.5h，加水量分别为8、6、6倍，过滤，合并滤液。

（3）多糖的纯化

将上述滤液减压浓缩后采用反复冻融法除蛋白质，将除去蛋白质的提取液浓缩至密度为1.2，加95%乙醇至醇体积浓度为75-80%，低温静置22-26h后离心，取沉淀复溶后按上述方法第二次醇沉，沉淀用无水乙醇反复清洗，70℃减压干燥，即得多糖干膏粉，称量。提取率为4.6%。

使用时，将多糖干膏粉溶于蒸馏水中，得到当归多糖药液。

（4）多糖含量测定

以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定干膏粉中多糖含量，纯度为72%。

（5）药物浓度筛选

小鼠BMSCs细胞株（购自广州赛业生物科技有限公司，编号：MUBMX-01001），细胞贴壁后，加入ASP进行药物浓度筛选：

a、药物ASP组：依次加入浓度为12.5、50、100、200μg/ml的当归多糖药液100μl；

b、对照组：加入等体积的DMEM/F12完全培养基。

每组设 3个实验孔，3个复孔；不接种细胞的空白组为调零孔。原条件下继续培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h。

用CCK-8法检测对细胞增殖率的影响，具体方法如下：

于各时间点终止培养后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育培养箱中继续培养4 h。终止培养后直接在450 nm波长处检测各组细胞的吸光度OD值。重复三次实验，并按公式计算增殖率。

细胞增殖率= (药物组OD值-调零组OD值)/（对照组OD值-调零组OD值)×100%。

实验方法

2.1 炎性微环境的建立

取第2代的状态良好的BMSCs细胞，使用MSCM培养基（间充质干细胞基础培养基（MSCM）购自美国ScienCell公司）调整成细胞浓度为1×10⁴个/mL的单细胞悬液，每孔2mL接种于六孔板内，采用50 ng/mL IL-6、2 ng/mL TGF-β1进行单独诱导和联合诱导7d，每天观察细胞。

分组如下：

BMSCs组：以六孔板单独培养的BMSCs细胞作为对照组；

IL-6组：以50 ng/mL IL-6单独干预BMSCs细胞作为模型组1；

TGF-β1组：以2 ng/mL TGF-β1单独干预BMSCs细胞作为模型组2；

IL-6+TGF-β1组：以50 ng/mL IL-6和2 ng/mL TGF-β1联合干预BMSCs细胞作为模型组3；

ASP+IL-6组：以50 μg/mL ASP干预IL-6组作为实验组1；

ASP+ IL-6+TGF-β1组：以50 μg/mL ASP干预IL-6+TGF-β1组作为实验组2。

各组分别连续诱导7d，每72 h换液一次，同时添加IL-6、TGF-β1和ASP以维持其最佳浓度。7d之后，将细胞进行传代，连续培养。采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态直至形态发生变化，之后进行相关指标的检测。

细胞形态学观察

倒置相差显微镜下，观察各组细胞的形态，采集图像。

细胞骨架染色

1. 将诱导后的各组细胞分别接种于激光共聚焦培养皿，5% CO₂、饱和湿度、37℃孵箱中培养，待细胞长至50%~60%，终止培养；

2. 弃培养液，PBS洗涤细胞2次；

3. 用新鲜配制的4%多聚甲醛固定15min，用含0.1%Triton-X 100的PBS缓冲液洗3次，每次5min；

4. 用含有5%BSA和0.1%Triton-X 100的PBS缓冲液按照说明书稀释比例稀释Actin-Tracker Green，即为Actin-Tracker Green工作液，加到细胞上，室温避光孵育1h；

5. 用含0.1%Triton-X 100的PBS缓冲液洗3次，每次5min；

6. 加入DAPI染液，避光孵育30min。用含0.1%Triton-X 100 PBS洗3次，每次5min；

7. 加入抗荧光淬灭剂，在激光共聚焦显微镜下观察细胞并采集图像。

法检测细胞增殖能力并绘制各组细胞生长曲线

诱导培养46d(即第7代)后终止，转移细胞至培养瓶中培养。收集处于对数期的各组细胞，0.25%胰蛋白酶消化，倒置相差显微镜下观察，待细胞间隙增大，折光性增强，成为单个细胞时，用MSCM培养基将其吹散成单细胞悬液，计数、调整细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔200 μL接种于96孔培养板中，5％CO₂、37℃饱和湿度孵箱中继续培养，每72h换液一次。

接种后第l、2、3、4、5、6、7天分别采用CCK-8法检测各组细胞吸光值。每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育4 h。终止培养，用酶标仪读取450 nm波长处的各组吸光度OD值。重复3次实验，取平均值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线图。

Western blot技术检测蛋白的表达

2.5.1 总蛋白的提取和制备

2.5.1.1 细胞总蛋白的提取

终止各组细胞培养，用预冷的PBS缓冲液冲洗2次；加入1 mLPBS缓冲液，用细胞刮刀沿瓶壁同一方向刮取细胞，并冲洗瓶壁；转移液体至提前做好标记的1.5 mL离心管内，12000rpm、4℃离心8 min，去除上清；向离心管中加入200 μL含有蛋白酶抑制剂（PMSF，购自AppliChem公司）的RIPA裂解液，吹打使其重悬；超声波细胞破碎仪上将细胞破碎4 s，间歇2s，反复4次；12000 rpm、4℃离心8 min吸取上清，上清即为细胞总蛋白。以上操作均在冰上进行。

2.5.1.2 蛋白浓度测定

按照BCA定量试剂盒说明书进行操作： 多标记分析仪562 nm波长处测定吸光度OD值。绘制标准曲线，并计算相应蛋白浓度。

Western Blot

SDS-PAGE电泳、蛋白转膜、显色及图像分析

TBST洗涤经过二抗孵育过的PVDF膜3次，每次8 min；显影定影试剂按照ECL化学发光液试剂盒中的说明书进行配置，在PVDF 膜目的蛋白处均匀滴加ECL显影液；保鲜膜封闭后使用凝胶成像系统采集图像。后期使用Quantity One软件计算各条带的光密度值，以GAPDH作为内参照，结果将目的蛋白条带与内参GAPDH条带的比值作为参照。重复实验3次。

3 统计学分析

应用SPSS 21.0统计软件分析。结果采用均数±标准差(±s)表示，多组间均数的比较采用one-way ANOVA，两两比较采用最小显著法（LSD）检验；两组间的比较采用Student'stest，p<0.05为差异有统计学意义。

4 实验结果

4.1 当归多糖浓度的筛选

由表1及图1可知，50 μg/ml ASP作用24h后，能明显促进BMSCs增殖（P＜0.05），其中60h后增殖作用最为明显（P＜0.01），随着时间延长，增殖作用较前减弱。100 μg/ml和200 μg/ml APS对BMSCs生长有抑制作用。其中100 μg/ml在作用60 h后对BMSCs增殖有明显抑制作用（P＜0.01）；200 μg/ml APS作用BMSCs12 h后，其抑制作用明显（P＜0.01），且具有时间依赖性。

表1 不同浓度ASP对BMSCs增殖的影响

*表示与control组比较P<0.05；**表示与control组比较P<0.01.

结合上述结果， 与control组相比，ASP 50 μg/ml可促进BMSCs细胞增殖（P<0.01）；故选ASP最佳药物浓度为50μg/ml。

ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs形态学的影响

为了探讨ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs生物学特性的影响，我们采用炎性因子诱导BMSCs 46d，同时给予ASP干预，并在培养46d后置于倒置显微镜下观察细胞形态，发现正常BMSCs组细胞为长梭形，成纤维细胞样，形态均一，排列整齐，呈现旋涡状生长；TGF-β1组细胞未见明显改变；IL-6组BMSCs细胞部分排列紊乱、成团簇状生长、呈现一定的异型性；IL-6+ TGF-β1组细胞排列紊乱更明显；IL-6+ASP组细胞为成纤维样，排列较整齐；IL-6+TGF-β1+ASP组细胞为成纤维样，排列分布较均匀，具体参见图2。其中，A：BMSCs组；B：TGF-β1组；C：IL-6组；D：IL-6+ TGF-β1组；E：IL-6+ASP组；F：IL-6+TGF-β1+ASP组。

4.3 ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs细胞骨架的影响

微丝作为细胞骨架的重要组成部分，在不同种类的细胞中结构存在差异。微丝为细胞整体结构的一种局部表现，参与细胞形态的维持。除此之外，微丝也可通过一些途径调控细胞信号的传递进一步影响细胞的功能，如细胞的增殖、凋亡、分化、恶性肿瘤的形成及转移等。微丝结构的改变与细胞的功能变化有一定的关联性。微丝结构的调整与肿瘤的转移有密切的关系。微丝结构的调整伴有细胞外基质的降解，从而影响肿瘤的向邻近或远处的转移。研究发现，TRIOBP-4/-5能增强胰腺癌细胞的运动能力和引起微丝的重组。Yin等研究发现，中性粒细胞和激活的单核细胞分泌的S100A8/A9与其受体RAGE结合通过肌动蛋白聚合、增强细胞的间质特性和EMT促进人乳腺癌细胞的侵袭、迁移，其中的机制是通过NF-κB信号通路稳定Snail实现的；在低浓度下，S100A8/A9具有增强细胞增殖能力的作用；RAGE的表达与浸润性导管癌患者的淋巴结和远处转移密切相关。有研究表明，正常细胞的恶性转化伴随着细胞骨架发生异常改变，细胞骨架已成为反映肿瘤细胞的恶性的生物学行为的特征之一。

实验结果如图3所示，正常BMSCs组细胞微丝平行排列；TGF-β1组细胞微丝未见明显改变；IL-6组BMSCs细胞部分微丝排列紊乱；IL-6+ TGF-β1组细胞微丝排列紊乱；IL-6+ASP组细胞微丝排列整齐，偶见散乱分布，IL-6+TGF-β1+ASP组细胞微丝平行排列，部分散乱分布。图3中，A：BMSCs组；B: TGF-β1组；C: IL-6组；D: IL-6+ TGF-β1组；E: IL-6+ASP组；F:IL-6+TGF-β1+ASP组。

ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs增殖能力的影响

为了比较ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs增殖的影响，我们用CCK-8法定量分析ASP对炎性微环境中BMSCs增殖情况，并绘制了增殖曲线。发现，与正常BMSCs组比较，IL-6组在第4~7天，细胞生长速度显著增快，差异有统计学意义（P＜0.05）；与正常BMSCs组比较，IL-6+TGF-β1组细胞生长速度增快更显著；与IL-6或TGF-β1单独组比较，第6、7天IL-6+TGF-β1联合组，细胞生长速度显著增快，差异有统计学意义（P＜0.05）；与IL-6组比较， ASP+IL-6组在第4~7天，细胞生长速度缓慢，差异有统计学意义（P＜0.05）；与IL-6+TGF-β1组比较，IL-6+TGF-β1+ASP组细胞生长速度明显减慢 (表2和图4)。

表2 炎性因子诱导后各组细胞吸光度值（±s，n=4）

*P＜0.05，与BMSCs组比较；△P＜0.05，与IL-6组比较；▽P＜0.05，与IL-6+TGF-β1组比较。

ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs增殖基因Bcl-2、癌基因Ras蛋白表达的影响

信号转导和转录激活因子-3(Signal transducer and activator of transcription3, STAT3 )是STAT家族的重要组成成员，已成为近年肿瘤研究的重要调控分子。STAT3信号通路是由胞外传递到胞内的一条重要信号通路，STAT3在细胞外被磷酸化后形成P-STAT后，进入细胞核进而调控基因的表达，参与调控肿瘤的形成、侵袭和转移等。在正常生理状态下，STAT3的激活是快速而短暂的，对于正常细胞的生理功能起着关键性作用。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src 等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道的汇聚焦点，在多种肿瘤细胞中均发现有持续性过度激活。临床研究发现，在某些肿瘤中，STAT3活性发生异常活化，且其活化水平与患者的不良预后呈正相关，如肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌等。STAT3过度激活后诱导与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因异常高表达，通过各种途径促进细胞增殖和恶性转化、阻碍细胞凋亡，表现出致癌作用。Sui等报道阻断STAT3的活化能抑制肝癌细胞的生长和延长荷瘤小鼠的存活时间；STAT3信号通路的阻断能够放大NK细胞的细胞毒效应，升高NK细胞活化分子的表达，降低IL-10和TGF-β的表达进而起到抑制肝癌细胞生长的作用。Zhao等研究发现在使用MEK抑制剂—靶向Ras通路后，STAT在肿瘤细胞中异常活化；联合使用STAT3抑制剂可抑制胰腺癌和结肠癌的生长，揭示STAT3活化可能是肿瘤细胞抵抗MEK抑制剂的一个可能机制。

STAT3异常激活可影响其下游抑癌基因p53与原癌基因Ras、促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2的表达。增殖与凋亡的失衡是肿瘤形成的一个重要过程。此外癌基因的活化与抑癌基因的缺失也是细胞发生恶性表型转化的一个重要原因。抑癌基因P53具有维持细胞正常生长、抑制细胞恶性增殖中起着非常重要的作用。众所周知，p53通过破坏细胞线粒体的完整性，释放下游的细胞因子，并最终激活半胱天冬酶而诱导细胞凋亡。Ras基因家族包括K-ras、H-ras等，在正常细胞中原癌基因Ras能促进细胞増殖和生长，当其受到不良因素的影响发生突变激活时，能持续促进细胞异常增殖，进而使细胞发生恶性转化。但是研究发现单独激活癌基因Ras不会使细胞发生恶性转化，它需要在某些抑癌基因失活或其它的条件共同作用下才能使细胞发生恶性转化。研究报道在胰腺癌和结肠癌肿瘤中存在K-ras的突变，并且与靶向Ras通路的MEK抑制的抵抗有密切关系。RAS蛋白的激活通过内部的GTP 酶的活力促进肿瘤形成，包括基因表达、细胞周期进展、细胞增殖、细胞迁移等一系列细胞活动。

Bcl-2 家族蛋白是一个通过线粒体途径的调节而诱导细胞凋亡的蛋白质家族。它包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2。这些蛋白通过共同调节线粒体膜通透性，促进释放促凋亡相关蛋白，从而导致细胞凋亡。

为了比较ASP对肿瘤相关炎性微环境中BMSCs蛋白表达的影响，我们用Westernblot法检测了各组Bcl-2、Ras蛋白的表达。结果显示，与正常对照BMSCs组比较，TGF-β1组Ras、Bcl-2蛋白表达均有升高；IL-6组Ras、Bcl-2蛋白表达均有升高，差异有统计学意义（P<0.05）；IL-6+TGF-β1组Ras、Bcl-2蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义。与IL-6组比较，IL-6+ASP组Ras、Bcl-2、蛋白表达均下调，差异有统计学意义；与IL-6+TGF-β1组比较，IL-6+TGF-β1+ASP组Ras、Bcl-2蛋白表达均下调，差异有统计学意义。具体结果参见图5，其中，A：BMSCs组；B: TGF-β1组；C: IL-6组；D: IL-6+ TGF-β1组；E: IL-6+ASP组；F: IL-6+TGF-β1+ASP组。

5 结论

5.1 炎性微环境能诱导正常BMSCs细胞发生遗传稳定性改变

以上实验结果显示在炎性微环境中已改变了正常BMSCs的形态、微丝及增殖能力，提示该炎性微环境能诱导正常BMSCs细胞发生遗传稳定性改变，而这与文献报道相符合。

ASP对炎性微环境中BMSCs具有保护作用

中医的先天之精与西医的干细胞在生理功能方面存在很多相似相通之处，先天之精在细胞层面上的存在形式是干细胞。干细胞对机体的生长、发育、更新及损伤修复起着十分重要的作用，调节着机体的生长发育过程以及疾病的发展，其分布十分广泛。干细胞是禀受于父母的先天之精的物质基础。脏腑之精藏于肾，是由来自父母先天之精和来自水谷精微的后天之精相结合产生的；干细胞更新以及所分化形成的不同阶段的子代细胞以维持机体的平衡状态是人体之精的生理功能的表现；在损伤因素的刺激下，成体干细胞通过各种过程修复损伤是由先天之精和后天之精构成的脏腑之精的功能体现。源于父母的先天之精在胚胎的形成、发育及分化过程中的功能与机体干细胞的作用有相通之处。首先，两者在胚胎的形成发育和成长过程中具有重要作用。先天之精是生命产生的本原，是构成胚胎的原始物质，具有促进机体的发育成长及人体脏腑器官的形成作用。先天之精所化生先天元气的不断激发促进生命的形成、发育生长和脏腑组织器官四肢百骸的分化形成。胚胎干细胞可分化为神经细胞、心肌细胞、软骨细胞等各种细胞类型，并进一步形成机体的全身组织器官，是干细胞分化全能性的体现。其次，两者在调节机体生殖繁衍功能方面也有相似之处。禀受与父母的生殖之精，在生命个体形成及繁衍方面发挥着关键性作用，携带着父母的遗传信息。人体繁衍生命的功能主要是由生殖干细胞完成的，当然胚胎干细胞也起着一定的作用，因为两者都携带着来自于父母的遗传信息。再次，两者均具有调控生长发育和机体损伤修复的功能，以保证机体正常的正常生命活动顺利进行。来源于父母的先天之精可以化生先天之气，与后天之气共同组成人体的一身之气。人体之气具有激发和促进精血津液的生成及运行输布，促进人体生长发育和繁衍生殖功能，以保证人体生命活动的正常程序性运行。因此，先天元气的推动作用是机体生长发育功能的前提。由此可见，在机体实现损伤修复和调控生长发育方面，又有许多相通之处。以基因调节为主的干细胞的增殖分化与先天之精的生长发育功能相关，干细胞在人体分布十分广泛，调控着人体的生长发育和疾病的发展过程，是顺利完成机体生长发育繁衍、损伤修复功能和组织更新的前提。人体生长发育出现不正常是由成体干细胞生理功能得不到正常发挥引起的。

中医认为：“精血同源”是指精血之间可以互相转化。如《类经》曰：“肾之精液入心化赤而为血。”明代孙一奎在《赤水玄珠•调经门》提及：“夫血者，水谷之精气也，和调五脏，洒陈六腑，男子化而为精，女人上为乳汁，下为经水。”清代医家张猫在《张氏医通•诸血门》中提到，“气不耗，归精于肾而为精，精不泄，归精于肝而为清血。”以上记载充分说明精血同源，相互资生互相转化。肝能够储藏血液、调节血量以供人体的需要，血液也可化生为精、滋养肾精，使肾精不断充盛。肝血的化生有赖于肾中精气的推动；肾精的充盛有赖于肝中血液的滋养。精足血自旺，血旺精自足，精血相互滋生，共同生存。在病理上，肾精不足则可导致肝血的亏虚；同样，肝血不足则可导致肾精的亏虚，最后肝肾精血两虚。

肿瘤为外邪、饮食不节、七情内伤、脏腑功能失调等多种病因均可使机体阴阳平衡受到破坏，经络气血的正常运行出现障碍，导致气滞血瘀，痰凝、毒蕴、湿聚等，形成肿瘤。中医学认为，肿瘤的形成与正气不足，无力抗邪，外邪进入引起脏腑功能紊乱，进一步导致病理产物的积聚有着密切的关系。《内经》提出了“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”这一精辟的论述。《灵枢》说：“故邪之所在，皆为不足。”《外科医案汇编》亦说：“正虚则为岩。”《外科启玄》曰：“癌发四十岁以上，血亏气衰。”故癌症的发生与机体正气不足，脏腑失调及气血失荣密切相关。

炎症导致细胞恶性转化以及肿瘤的起始均为机体“正气不足而邪气盘踞，正虚邪实，正不胜邪”的结果。扶正祛邪，恢复平衡一直是防治肿瘤的基本原则。不同于化疗药对病灶和正常细胞都有杀灭作用，中药及其复方制剂通过扶助正气进一步抗御和祛除病邪，不仅能杀灭肿瘤细胞，而且还能增强和调动机体细胞自身的抗癌应答能力，具有毒副作用小的优势。

当归为伞形科植物当归的干燥根，为甘肃的道地药材之一，味甘辛，性温，具有补血活血、扶正祛邪等功效，品质优良。当归通过补血达到血旺，血旺则精足，从而起到维持干细胞遗传稳定性的作用，进一步达到预防干细胞恶化的作用。现代研究发现，当归含有有机酸、挥发油、多糖和黄酮等成分，其中当归多糖（ASP）是当归抗肿瘤的主要活性成分之一。大量研究发现当归多糖可通过多种途径调控造血支持、免疫促进、肿瘤抑制、各种因素刺激导致的细胞损伤及表型转变等较为广泛的药理作用。ASP 体外作用于CD34+CD38−LSC，具有明显的增殖抑制作用，能有效抑制LSC自我更新能力，诱导其衰老。ASP能阻止K562细胞由G0/G1期向S，G2+M移行。

本发明通过筛选的ASP最佳浓度（50 μg/mL）对炎性因子诱导组进行干预，倒置相差显微镜下观察发现， IL-6+ASP组细胞为成纤维样，排列较整齐；IL-6+TGF-β1+ASP组细胞为成纤维样，排列分布较均匀。激光共聚焦下观察发现IL-6+ASP组细胞微丝排列整齐，偶见散乱分布，IL-6+TGF-β1+ASP组细胞微丝平行排列，部分散乱分布。

增殖曲线结果显示，与IL-6组细胞比较，ASP+IL-6组生长速度显著缓慢，差异有统计学意义（P＜0.05），与IL-6+TGF-β1组比较，IL-6+TGF-β1+ASP组生长速度明显减慢。蛋白印迹结果表明，与IL-6组比较，IL-6+ASP组Ras、Bcl-2、STAT3及P-STAT3蛋白表达均下调，Bax和P53蛋白表达升高，差异有统计学意义；与IL-6+TGF-β1组比较，IL-6+TGF-β1+ASP组Ras、Bcl-2、STAT3及P-STAT3蛋白表达均下调，Bax和P53蛋白表达升高，差异有统计学意义。说明ASP可能通过抑制STAT3信号通路的活化，从而起到预防炎性微环境中干细胞遗传稳定性变化的作用。

综上所述，50 μg/mL ASP干预炎性因子诱导组后，炎性微环境对BMSCs的增殖促进作用受到抑制，表明ASP具有维持炎性微环境BMSCs遗传稳定性的作用，其中的可能机制为ASP提高了炎性微环境中BMSCs的损伤耐受性，或引起了炎性微环境中的一成分改变，或调控相关信号传导通路保护BMSCs。本研究结果显示，ASP可抑制炎性微环境中Ras、Bcl-2、STAT3及P-STAT3蛋白表达，抑制炎性微环境引起的BMSCs蛋白表达的异常改变；中医理论认为，ASP的这种调控作用，与当归能够补血活血，达到血旺精足有关，起到了“扶正祛邪”的作用，并将干细胞的增殖分化维持在正常平衡状态，从而起到预防干细胞发生恶性表型转变的作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.当归多糖在骨髓间质干细胞中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为当归多糖对炎性因子微环境下的骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述炎性因子为IL-6和/或TGF-β1。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述应用为当归多糖抑制炎性因子微环境下的骨髓间充质干细胞的遗传稳定性变化。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述应用为当归多糖抑制炎性因子微环境下的骨髓间充质干细胞的增殖。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述当归多糖的浓度为50μg/ml。

7.根据权利要求6任一所述的应用，其特征在于：所述当归多糖的制备方法为：将当归先醇提，然后水提得到水提液；将水提液去除蛋白后，醇沉得到当归多糖。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述醇提是用90-95%乙醇提取两次，每次0.5-1.5h，加液重量分别为6倍和4倍。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述水提是用水煎法提取3次，每次0.5-1.5h，加水重量分别为8、6、6倍。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述醇沉是在去除蛋白质的水提液中加入95%乙醇至醇体积浓度为75-80%，低温静置22-26h后，再次用相同的方法进行沉淀；

作为优选，在醇沉后还包括减压干燥的步骤。