CN105385653A

CN105385653A - 肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用

Info

Publication number: CN105385653A
Application number: CN201510719183.7A
Authority: CN
Inventors: 刘永琦; 安耀荣; 张志明; 雍文兴; 张月梅
Original assignee: Gansu University of Chinese Medicine
Current assignee: Gansu University of Chinese Medicine
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2016-03-09

Abstract

本发明提供肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用，所述应用为肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本申请人通过实验发现：肉苁蓉超滤膜提取物可以减小CdCl₂诱导的BMSCs微核数、微核率、染色体畸变率的发生，可以降低细胞的凋亡率；与模型组相比均具有显著性差异（p<0.05）。中药肉苁蓉提取物可以通过减少细胞的凋亡来降低BMSCs的微核率和染色体畸变率，以提高BMSCs的遗传稳定性。

Description

肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用

技术领域

本发明涉及肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用，尤其涉及肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

背景技术

随着现代工业的迅猛发展，镉污染问题日益严重，大量的研究表明少量的镉(Cd)进入人体即可通过生物放大作用和生物积累；镉是被国际公认的致癌物质之一，镉是一种毒性很强的重金属,已被美国毒性管理委员会(ATSDR)列为第6位危害人类健康的有毒物质。镉不仅可引起机体的急性和慢性中毒，而且对哺乳动物具有较强的致畸、致癌、致突变作用。

骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是临床细胞与移植治疗的重要种子细胞，同时其在生物或化学性致癌环境中的遗传稳定性及其防治措施研究，日益成为其安全临床应用研究的热点。本课题组前期已初步研究证实，CdCl₂可诱发BMSCs形态出现异型性，微核发生率、染色体畸变率、细胞凋亡及DNA的损伤均显著增加。肉苁蓉归经甘、咸、温。归肾、大肠经，气微，味甜、微苦。为我国传统的名贵中药材，是补肾壮阳处方中使用频率最高的补益药物之一。具有补肾阳，益精血，润肠通便之功效。现代药理研究，肉苁蓉具有抗肿瘤、增强免疫能力、抗氧化的作用。

发明内容

本发明提供了肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用，涉及到肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用，尤其涉及肉苁蓉超滤膜提取物对化学毒性物质氯化镉(CdCl₂)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖、细胞微核率和染色体畸变率的保护作用。

本发明提供肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用。

作为优选，所述应用为肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本发明还提供肉苁蓉提取物在制备保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。

作为优选，所述应用为肉苁蓉提取物对镉元素诱导的骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。本发明还提供肉苁蓉提取物在制备保护镉元素诱导环境下的骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物中的应用。

作为优选，所述肉苁蓉提取物的分子量为200,000以下。

作为优选，所述肉苁蓉提取物的分子量为10,000以下。

作为优选，所述肉苁蓉提取物的浓度为0.8g/L。

作为优选，所述肉苁蓉提取物的制备方法为：将肉苁蓉水提，用超滤膜过滤水提液，根据分子量要求收集截留液或透过液，干燥，得到肉苁蓉提取物。

更优选地，所述将肉苁蓉水提是加入8倍重量的水提取1次，提取时间为1小时；再加入6倍重量的水提取2次，每次提取1小时。

本发明贴壁培养了小鼠BMSCs细胞株，随机分为正常对照组、模型对照组、肉苁蓉超滤膜提取物不同分子量段干预组，模型组与干预组以CdCl₂诱导的BMSCs染毒。显微镜下观察各组BMSCs的形态学变化，通过微核实验、染色体分析观察对BMSCs细胞微核率、染色体畸变率的影响，并通过流式细胞仪检测肉苁蓉对CdCl₂染毒的BMSCs细胞凋亡各自的影响。结果可见：不同分子量段的肉苁蓉超滤膜提取物均可以减小CdCl₂诱导的BMSCs微核数、微核率、染色体畸变率的发生，可以降低细胞的凋亡率；且以分子量10,000以下效果最明显；与模型组相比均具有显著性差异(p<0.05)。中药肉苁蓉提取物可以通过减少细胞的凋亡来降低BMSCs的微核率和染色体畸变率，以提高BMSCs的遗传稳定性。由实验结果可知，肉苁蓉提取物能够作为保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物使用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs增殖的形态观察(10×10)，其中，图A为对照组，图B为模型组，图C为10,000分子量以下肉苁蓉超滤物组，图D为10,000-100,000分子量肉苁蓉超滤物组，图E为100,000-200,000分子量肉苁蓉超滤物组；

图2为肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs微核试验(40×10)；其中，图A为正常细胞对照组BMSCs，图B为模型对照组CdCl₂诱导的BMSCs，图C为10,000分子量以下肉苁蓉超滤物组干预后对CdCl₂诱导的BMSCs；

图3为肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs染色体分析结果(40×10)；其中，图A为正常细胞对照组BMSCs，图B为模型对照组CdCl₂诱导的BMSCs，图C为10,000分子量以下肉苁蓉超滤物组干预后对CdCl₂诱导的BMSCs；

图4为不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs凋亡率影响；其中，A为10,000分子量以下肉苁蓉超滤物组，B为10,000-100,000分子量肉苁蓉超滤超物组，C为100,000-200,000分子量肉苁蓉超滤超物组，D为正常细胞对照组；E为模型对照组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

材料：小鼠BMSCs株，由解放军兰州军区总医院骨科研究所馈赠，购自美国ATCC公司(细胞株编号：CRL-10925)。

实验药物：肉苁蓉提取物的制备方法如下：

(1)在肉苁蓉中加入8倍量的水，提取1小时，提取1次；之后加入6倍量的水，提取1小时，提取2次，合并提取液。

(2)将肉苁蓉提取液用陶瓷超滤膜清洗、过滤：用0.2nm的膜管过滤，截留液为分子量200,000以上的肉苁蓉；然后将透过液用0.1nm膜管过滤，截留液为分子量100,000-200,000的肉苁蓉；最后将透过液用0.01nm膜管过滤，截留液为分子量10,000-100,000的肉苁蓉，透过液为分子量10,000以下的肉苁蓉。

(3)分别将分子量10,000以下、10,000-100,000、100,000-200,000的肉苁蓉超滤膜过滤物进行蒸汽浓缩、真空干燥。取出呈干膏状的肉苁蓉，小心刮出后收集放入中药皿中研磨呈药粉后称重装袋，装入含有干燥剂的容器中低温保存。

实验方法：

细胞培养及CdCl₂的诱导：将小鼠BMSCs株分别接种至含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，分装至培养瓶中，置于37℃培养箱静置培养。每24h换液1次，待细胞铺到瓶底80％-90％时，用含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化细胞，收集后吹散细胞，分装到培养瓶中。继续培养、传代。以前期研究筛选出的CdCl₂最适宜作用浓度，400μg/L干预小鼠BMSCs24h作为CdCl₂诱导BMSCs遗传损伤的细胞模型。

1MTT法检测不同浓度的肉苁蓉超滤物对BMSCs增殖的影响

试验分为四组：

(1)模型对照组；

(2)正常细胞对照组；

(3)空白对照组；

(4)诱导组；每组各条件均设有6个复孔。

空白对照组：只加入100μL完全培养液，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，再加入100μL完全培养液。

正常细胞对照组：将完全培养液培养的BMSCs调整密度为1×10⁴个/mL，接种于96孔板，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，再加入100μL完全培养液。

模型对照组：将完全培养液培养的BMSCs调整密度为1×10⁴个/mL，接种于96孔板，加入400μmol/LCdCl₂后，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，再加入100μL完全培养液。

诱导组：分为10,000以下、10,000-100,000、100,000-200,000三个分子量段的肉苁蓉超滤物组，每个分子量段超滤物组均设有0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L的不同浓度的肉苁蓉超滤物诱导液。将完全培养液培养的BMSCs调整密度为1×10⁴个/mL，加入400μmol/LCdCl₂后，培养24h后取出培养板，吸弃孔中培养液，每孔再加入不同浓度不同分子量段的肉苁蓉超滤物诱导液。

以上各组分别在24h、48h、72h时取出培养板，每孔加入10μL的MTT溶液，CO₂培养箱中避光孵育4h，终止孵育，小心吸弃孔中培养液，每孔加入150μL的DMSO，摇床低速振荡10min使结晶物充分溶解。同时设置调零孔、对照孔。492nm测吸光值，以该组复孔的平均值作为该组细胞的吸光度值。实验重复三次，取平均值。取增殖最明显的最小药物浓度为最佳浓度。

2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs的干预

将完全培养液培养的BMSCs调整密度为1×10⁴个/mL，加入400μmol/LCdCl₂培养24h后，随机分为：对照组(BMSCs+400μmol/LCdCl₂)；分子量1万以下肉苁蓉超滤膜提取物组(BMSCs+0.8g/L分子量1万以下肉苁蓉超滤膜提取物+400μmol/LCdCl₂)；分子量1-10万肉苁蓉超滤膜提取物组(BMSCs+0.8g/L分子量1-10万以下肉苁蓉超滤膜提取物+400μmol/LCdCl₂)；分子量10-20万肉苁蓉超滤膜提取物组(BMSCs+0.8g/L分子量10-20万肉苁蓉超滤膜提取物+400μmol/LCdCl₂)，每组分别加入相关药物进行干预，并设正常细胞空白对照组，在37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱培养24h。

2.1不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的形态学观察

在倒置相差显微镜下观察各组BMSCs的形态特征并予以拍照。

2.2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的微核率检测

收集各组细胞在CO₂培养箱中培养24h后，胰酶消化细胞后，收集细胞，4℃离心1000r/min，5min，去上清，加入37℃水浴的KCl溶液，水浴锅中静置30min，去上清加入甲醇和冰乙酸的固定液，固定细胞，制片。吉姆萨染液中染色。显微镜下观察，每组各染3个标本，每个标本观察1000个细胞，记录有微核的细胞数，重复三次实验。判断标准：选取细胞完整，微核和主核完全分离或与主核相切，圆形或椭圆形，大小为主核三分之一以下，结构和主核一致，边缘光滑。

2.3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的染色体畸变率检测

收集各组细胞在CO₂培养箱中培养24h后，分别加秋水仙素，培养3h后，消化细胞，离心收集细胞，加入37℃水浴的KCl低渗液，再加甲醇和冰乙酸固定液反复固定细胞，同时准备冰水浸泡玻片，吸管抽吸细胞悬液滴在冰玻片上，干燥后，放入吉姆萨染液中染色10min，显微镜下观察，每组各染3个标本，每个标本观察1000个细胞，记录染色体缺失及裂隙的数目，重复三次实验。判断标准：选取制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置，损伤长度大于染色单体的宽度为断裂，损伤的长度小于染色单体的宽度为裂隙。

2.4不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的细胞凋亡检测

收集各组细胞培养24h后，用PBS洗涤细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，吹打细胞后收集入离心管。4℃离心1000r/min，5min，去上清，用PBS再次洗涤细胞，4℃离心1000r/min，5min后，去上清加入195μLAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。再加入5μLAnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10min，包裹锡纸。4℃离心1000r/min，5min，弃上清，加入190μLAnnexinV-FITC结合液轻轻混匀并重悬细胞，加入10μLPI染色液，轻轻混匀，冰浴避光静置。上流式细胞仪检测细胞凋亡，设三次重复。

3统计学处理方法

应用SPSS16.0软件进行统计分析，所得计量资料均采用均数和标准差()表示。采用单因素方差分析，进一步采用LSD或Dunnet法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

4结果

4.1MTT法测定不同浓度肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs增殖的影响

由表1-1、1-2、1-3得出各分子量段肉苁蓉超滤物在浓度0.8g/L时，对CdCl₂诱导的BMSCs增殖促进作用最明显。

表1-1不同浓度10,000分子量以下肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的影响(n＝5，)

注：*与对照组相比，P<0.05

表1-2不同浓度10,000-100,000分子量肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的影响(n＝5，)

注：*与对照组相比，P<0.05

表1-3不同浓度100,000-200,000分子量肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的影响(n＝5，)

注：*与对照组相比，P<0.05

4.2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs增殖的形态学观察

倒置相差显微镜下观察可见，空白对照组：BMSCs24h后贴壁细胞数量增多，逐渐形成数个大小不同的细胞集落，这时细胞形态均一，排列紧密，多呈长梭形。模型对照组：BMSCs24h时贴壁缓慢，可见细胞悬浮并开始死亡，细胞生长缓慢，数量不多。与对照组相比，诱导组即各分子量肉苁蓉超滤物组均可见部分细胞贴壁，贴壁细胞数量有不同程度增加，见图1。

4.3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的微核率、染色体畸变率、凋亡的影响

4.3.1不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs微核率影响

结果表明，与空白对照组比较，模型对照组BMSCs微核率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，10,000分子量以下组、10,000-100,000分子量组、100,000-200,000分子量组肉苁蓉超滤物BMSCs微核率明显降低，其中以10,000分子量以下组变化最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)；10,000-100,000分子量组、100,000-200,000分子量组与10,000分子量以下组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2及图2。

表2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs微核率影响(n＝3，)

注：^*与空白对照组比较,P<0.05；^△与模型对照组比较,P<0.05；^▲与10,000分子量以下组比较,P<0.05。

4.3.2不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导BMSCs的染色体畸变率影响

结果表明，与空白对照组比较，模型对照组BMSCs染色体畸变率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，10,000分子量以下组、10,000-100,000分子量组、100,000-200,000分子量组肉苁蓉超滤物BMSCs染色体畸变率明显降低，其中以10,000分子量以下组变化最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)；10,000-100,000分子量组、100,000-200,000分子量组与10,000分子量以下组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3及图3。

表3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs染色体畸变率影响(n＝3，)

4.3.3不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs细胞凋亡影响

结果表明，与空白对照组比较，模型对照组BMSCs凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，10,000分子量以下组、10,000-100,000分子量组、100,000-200,000分子量组肉苁蓉超滤物BMSCs凋亡率明显降低，其中以10,000分子量以下组变化最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)；10,000-100,000分子量组、100,000-200,000分子量组与10,000分子量以下组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4及图4。

表4不同分子量段肉苁蓉超滤物对CdCl₂诱导的BMSCs凋亡率影响(n＝3，)

由上述实验可知，肉苁蓉提取物能够作为保护骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的药物使用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.肉苁蓉提取物在骨髓间充质干细胞中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为肉苁蓉提取物对骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为肉苁蓉提取物对镉元素诱导的骨髓间充质干细胞的增殖和遗传稳定性的保护作用。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的分子量为200,000以下。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的分子量为10,000以下。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的浓度为0.8g/L。

7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于：所述肉苁蓉提取物的制备方法为：将肉苁蓉水提，用超滤膜过滤水提液，根据分子量要求收集截留液或透过液，干燥，得到肉苁蓉提取物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述将肉苁蓉水提是加入8倍重量的水提取1次，提取时间为1小时；再加入6倍重量的水提取2次，每次提取1小时。