CN109748982A - 一种桦褐孔菌多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌多糖的制备方法，利用水提醇沉、反复冻融、脱蛋白、透析、冷冻干燥、亲和色谱等方法，从桦褐孔菌中分离纯化出具有抗氧化、抗衰老功能的多糖组分；桦褐孔菌多糖组分具有强的抗氧化活性；桦褐孔菌多糖预处理可抑制依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖抑制和凋亡，抑制依托泊苷引起的细胞衰老β‑半乳糖苷酶活性水平增加、衰老相关异染色质聚集和线粒体膜电位下降；桦褐孔菌多糖预处理可抑制依托泊苷诱导的p53、p21、p16蛋白和mRNA表达水平升高。通过本发明方法制备的桦褐孔菌多糖组分具有良好的抗氧化、抗衰老活性，作为新型抗衰老保护药物有着广阔的应用前景。

Description

一种桦褐孔菌多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及天然产物活性成分领域，更具体的说是涉及一种桦褐孔菌多糖的制备方法及其应用。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr.)Pilt)是一种珍稀而名贵的药用真菌，在《全国中草药汇编》中记载名为桦菌芝，又名桦树茸、白桦茸、桦树菇、褐多孔菌、桦癌褐孔菌、斜管纤孔菌、蔷甘、和西伯利亚灵芝，生物学范畴上，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，多寄生于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下或被砍伐后的枯干上，主要分布在北纬45°-50°的地区。

早在12世纪，满族人们就用桦褐孔菌调理疾病，据称满族人民在大雪封山时是依靠桦褐孔菌治疗百病，多年以来，桦褐孔菌在许多国家被用于抵抗疾病。值得一提的是，其在多种疾病治疗期间未被发现明显的毒性和副反应。美国FDA将其认证称为“The KingofHerbs”，并列入“特殊的天然物质”。现代研究表明，桦褐孔菌活性成分有：多糖、三萜类(桦褐孔菌醇、羊毛甾醇、麦角甾醇、栓菌酸、桦褐孔菌素等)、黄酮类、氨基酸类、木质素类、生物碱类、多酚类、叶酸衍生物、芳香物质(香草酸、丁香酸和γ羟基苯甲酸等)、鞘氨脂类似物、三肽等，具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、降血糖血脂、肝肾损伤保护、抗病毒、抗炎、抗疲劳等诸多药理活性。

桦褐孔菌在医药、保健品等领域具有很大的开发潜力和应用前景，但是，其广泛的药理作用具体归功于哪一种活性组分和其作用机制还不清晰；因此，提供一种桦褐孔菌多糖的制备方法，并研究其功能是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种桦褐孔菌多糖的制备方法及其在抗老化和抗衰老中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种桦褐孔菌多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)将干燥的桦褐孔菌粉碎，过60目筛；

(2)将步骤(1)粉碎过筛的桦褐孔菌粉末用80％乙醇回流脱脂18～24h，残渣利用水提醇沉法提取多糖，反复冻融，酶-Sevag联合法脱蛋白，截留分子量3500Da透析去除小分子物质，在-45～-55℃及真空度5～100Pa下冷冻干燥得到粗多糖；

(3)将步骤(2)获得的粗多糖用蒸馏水复溶成5％的糖溶液，过滤后上样到DEAE-cellulose柱，用0→1mol/L NaCl梯度洗脱，收集洗脱液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，得到两种主要多糖组分；

(4)室温流水透析步骤(3)得到的两种主要多糖组分，分别采用Sepharose CL-6B柱层析进一步纯化，0.15mol/L NaCl洗脱，室温流水透析18～24h，在-45～-55℃及真空度5～100Pa下冷冻干燥，得到分子量均一的桦褐孔菌不同多糖组分。

进一步，步骤(2)所述残渣利用水提醇沉法提取多糖，反复冻融，酶-Sevag法联合脱蛋白，透析去除小分子物质的具体步骤为：残渣用100℃热水浸提，液料比为30mL/g，提取时间为1.5～2.5h(最佳时间为2.5h)，提取液过滤，合并滤液，将滤液在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下减压浓缩，连续剧烈搅拌下加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，离心沉淀，经75％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗脱并减压干燥后，用蒸馏水复溶多糖使之成2～5％的糖溶液，-80℃反复冻融离心后，上清液加入链霉菌蛋白酶消化4～24h，按体积比4:1加入Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)，震荡离心脱蛋白；将糖溶液置于截留分子量3500Da的透析袋，在0.5～1％NaCl溶液中37℃恒温透析18～24h，每4～6h更换一次透析液。

进一步，步骤(3)所述过滤采用水系0.45μm尼龙滤膜过滤器过滤。

进一步，所述桦褐孔菌多糖在抗氧化和抗衰老中的应用。

进一步，所述桦褐孔菌多糖在制备抗衰老药物中的应用。

进一步，所述桦褐孔菌多糖在制备针对p53-p21、p16-pRb衰老信号通路的抗衰老药物中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种桦褐孔菌多糖的制备方法，利用水提醇沉、反复冻融、脱蛋白、透析、冷冻干燥、亲和色谱等方法，从桦褐孔菌中分离纯化出具有抗氧化、抗衰老功能的多糖组分；桦褐孔菌多糖组分具有强的抗氧化活性，抗氧化能力优于维生素E；桦褐孔菌多糖预处理可抑制依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖抑制和凋亡，抑制依托泊苷引起的细胞衰老β-半乳糖苷酶活性水平增加、衰老相关异染色质聚集和线粒体膜电位下降；桦褐孔菌多糖预处理可抑制依托泊苷诱导的p53、p21、p16蛋白和mRNA表达水平升高；桦褐孔菌多糖组分可以有效抑制依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞的衰老和凋亡。通过本发明方法制备的桦褐孔菌多糖组分具有良好的抗氧化、抗衰老活性，作为新型抗衰老保护药物有着广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明将多糖上样到DEAE-cellulose柱，获取的两个多糖组分；

图2附图为本发明采用Sepharose CL-6B柱层析纯化，获得的IOP-1；

图3附图为本发明采用Sepharose CL-6B柱层析纯化，获得的IOP-2；

图4附图为本发明DPPH自由基清除能力测定结果；

图5附图为本发明ABTS总抗氧化能力测定结果；

图6附图为本发明FRAP铁还原能力测定结果；

图7附图为本发明MTT细胞活力测定结果；

其中，与Con组比较，“#”差异显著(p<0.05)；与Eto组比较，“***”差异极显著(p<0.001)，“**”差异显著(p<0.01)，“*”差异显著(p<0.05)；

图8附图为本发明细胞衰老β-半乳糖苷酶染色分析结果；

图9附图为本发明线粒体膜电位测定结果；

图10附图为本发明DAPI染色检测衰老相关异染色质聚集结果；

图11附图为本发明Westernblot蛋白质免疫印迹分析结果；

图12附图为本发明Westernblot蛋白质免疫印迹分析结果的灰度值定量分析图；

其中，与Con组比较，“###”差异极显著(p<0.001)，“##”差异显著(p<0.01)，“#”差异显著(p<0.05)；与Eto组比较，“***”差异极显著(p<0.001)，“**”差异显著(p<0.01)，“*”差异显著(p<0.05)；

图13附图为本发明qRT-PCRmRNA水平检测基因表达结果；

其中，与Con组比较，“###”差异极显著(p<0.001)，“##”差异显著(p<0.01)，“#”差异显著(p<0.05)；与Eto组比较，“***”差异极显著(p<0.001)，“**”差异显著(p<0.01)，“*”差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1桦褐孔菌多糖的制备

(1)采用响应面法评估基于单因素实验的桦褐孔菌多糖提取参数的组合效应，参数变量包括提取温度、提取时间和液料比，以多糖得率作为响应值，获得最佳提取条件为：提取时间1.5～2.5h，提取温度100℃，液料比30mL/g。

(2)根据响应面实验获得的最佳提取条件热水提取桦褐孔菌多糖：将干燥的的桦褐孔菌粉碎过筛，乙醇回流脱脂后，残渣于100℃热水浸提，液料比为30mL/g，提取时间1.5～2.5h，提取液过滤，合并滤液，将滤液在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下减压浓缩至一定体积，连续剧烈搅拌下加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，离心沉淀，经75％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗脱并减压干燥后，用蒸馏水复溶，反复冻融离心后，上清液加入适当体积链霉菌蛋白酶消化4～24h，按体积比4:1加入Sevag试剂剧烈震荡脱蛋白36次，0.5～1％NaCl截留分子量3500Da透析24h，冷冻干燥得到褐色的桦褐孔菌粗多糖样品。蒸馏水复溶经0.45μm滤膜滤过后，采用explorer 100层析系统分级纯化多糖，上样到DEAE-cellulose柱，用0→1mol/L NaCl梯度洗脱，收集洗脱液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，得到两个主要多糖组分，分别为中性多糖IOP-1和酸性多糖IOP-2，结果如图1所示；流水透析24h后采用Sepharose CL-6B柱层析进一步纯化，0.15mol/L NaCl洗脱，得到分子量均一的多糖组分，仍命名为IOP-1和IOP-2，结果如图2和图3所示，透析、冻干备用。

实施例2建立体外抗氧化模型对不同桦褐孔菌多糖活性组分进行筛选

(1)DPPH自由基清除能力测定：分别取25～1600μg/mL的多糖溶液和维生素E 100μL加入96孔板中，再加入2×10^-4mol·L^-1的DPPH溶液(无水乙醇配制)100μL，混匀，避光室温静置30min，在517nm波长处测定吸光度，根据下式计算清除率：

式中，A₃为不同浓度多糖加DPPH测得的吸光度，A₂为不同浓度多糖加水测得的吸光度，A₁为水加DPPH测得的吸光度值，A₀为水测得的吸光度；结果如图4所示，结果表明，IOP-1的DPPH自由基清除能力优于IOP-2和维生素E。

(2)ABTS总抗氧化能力测定：首先根据待测定样品的数量(含标准曲线)使用等体积ABTS(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)溶液和氧化剂溶液配制适量的ABTS工作母液，室温避光存放12～16h，将ABTS工作母液用PBS稀释成ABTS工作液，要求ABTS工作液的吸光度减去PBS空白对照后，A734为0.7±0.05；接下来用PBS把10mMTrolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM；在96孔板中加入200μL ABTS工作液，空白对照孔中加入10μL PBS溶液；标准曲线检测孔内加入10ul不同浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10μL 25～1600μg/mL不同浓度的桦褐孔菌多糖和维生素E溶液。轻轻混匀，室温孵育2～6min后测定A734。根据标准曲线计算桦褐孔菌多糖和维生素E的ABTS总抗氧化能力，结果如图5所示，结果表明，IOP-1的ABTS总抗氧化能力优于IOP-2和维生素E。

(3)FRAP铁还原能力测定：根据待测定样品的数量(含标准曲线)使用TPTZ稀释液、TPTZ溶液、检测缓冲液配制适量的FRAP工作液，37℃孵育。称取27.8mg FeSO₄·7H₂O，mL蒸馏水溶解定容至浓度为100mM，稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。在96孔板的每个检测孔中加入180μL FRAP工作液，空白对照孔中加入5μL蒸馏水；标准曲线检测孔内加入5μL各种浓度的FeSO₄标准溶液；样品检测孔内加入5μL 25～1600μg/mL不同浓度的桦褐孔菌多糖和维生素E溶液，37℃孵育3～5分钟后测定A593。根据标准曲线计算桦褐孔菌多糖和维生素E的铁还原能力，结果如图6所示，结果表明，IOP-1的铁还原能力优于IOP-2和维生素E。

1上述结果表明，IOP-1的抗氧化活性较强，用于后续实验。

实施例3MTT细胞活力测定

将处于对数生长期的大鼠主动脉平滑肌细胞A10(4,000cells/孔)接种于96孔板，置37℃、含5％CO₂的培养箱培养12～24h后，将维生素E(Vitamin E)和25～200μg/mL不同浓度的桦褐孔菌多糖IOP-1预处理细胞，设置空白组(只加培养液，不加细胞和IOP-1)、对照组(加细胞和培养液，不加IOP-1)和Eto模型组(加细胞和培养液)，每组设置5个复孔。24h后在维生素E、IOP-1预处理组和Eto模型组中加入6μM Eto(依托泊苷，Etoposide是一种阻碍DNA修复的细胞周期特异性抗肿瘤药物，通过诱导细胞衰老，使细胞周期阻滞于G1期发挥作用，可作为衰老诱导模型)。诱导24h后，将细胞与0.5mg/mL MTT 37℃孵育4h，除去MTT，每孔加入150μL DMSO，摇床10min，490nm波长处测定吸光度，根据下式计算细胞存活率：

式中，A_实验组为加药处理组(IOP-1、Vitamin E预处理组和Eto模型组)测得的吸光度，A_对照组为不加药物组测得的吸光度，A_空白组为不加细胞和药物组测得的吸光度；结果如图7所示，结果表明：在25～200μg/mL浓度范围内，桦褐孔菌多糖IOP-1预处理对Eto诱导的A10细胞损伤具有保护作用。在浓度为50μg/mL时，保护作用最强，表现增殖活性，浓度为100～200μg/mL时保护作用下降，此现象是由于桦褐孔菌多糖剂量过大产生毒性。桦褐孔菌多糖IOP-1的最佳保护剂量为50μg/mL，用于后续实验，同样浓度下的50μg/mL维生素E保护作用小于桦褐孔菌多糖。

实施例4细胞衰老β-半乳糖苷酶染色分析

A10细胞(3,0000cells/孔)接种于12孔板，IOP-1预处理6h，6μM Eto诱导24h，正常培养24h后，使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒评估细胞衰老水平，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入0.5mLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min，吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min。吸除PBS，每孔加入0.5mL染色工作液(β-半乳糖苷酶染色液A 5μL，β-半乳糖苷酶染色液B 5μL，β-半乳糖苷酶染色液C465μL，X-Gal溶液25μL)，37℃孵育过夜，倒置荧光显微镜下观察。衰老细胞中β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达水平增加，在试剂盒作用下衰老细胞被染成蓝色，结果如图8所示，Con组细胞(正常培养的A10细胞，未加桦褐孔菌多糖IOP-1、Eto和VitaminE)无衰老阳性细胞；Eto模型组蓝染细胞较多，表达高的SA-β-gal活性水平；50μg/mL IOP-1处理组(IOP-1+Eto)蓝染细胞明显减少且少于同样浓度的维生素E组(VitaminE)，表达低的SA-β-gal活性水平。结果表明：桦褐孔菌多糖IOP-1可降低Eto所致的A10细胞衰老β-半乳糖苷酶水平增加，对衰老细胞的保护作用强于维生素E。

实施例5线粒体膜电位测定

细胞模型的处理与SA-B-gal染色测定相同，然后根据Beyotime生物技术研究所的说明使用JC-1线粒体膜电位测定试剂盒检测不同处理组细胞的线粒体膜电位变化水平。首先配制JC-1染色工作液，取适量JC-1(200X)，按照每50μL JC-1(200X)加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1染色缓冲液(5X)，混匀即得。吸除培养液，用PBS洗涤细胞一次，加入0.5mL细胞培养液，加入0.5mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液(5X)加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次，加入1mL细胞培养液，荧光显微镜下观察，结果如图9所示，Con组细胞(正常培养的A10细胞，未加桦褐孔菌多糖IOP-1、Eto和Vitamin E)线粒体膜电位正常经染色激发后呈现红色荧光；Eto模型组细胞中线粒体膜电位大大下降甚至完全丧失，红色荧光显著减少；而50ug/mL IOP-1处理组(IOP-1+Eto)细胞线粒体膜电位明显升高，红色荧光大大增强，甚至强于Con组细胞，50μg/mL维生素E组(Vitamin E)细胞与Eto模型组比较红色荧光增强但弱于IOP-1组。结果表明：桦褐孔菌多糖IOP-1可抑制Eto诱导的A10细胞线粒体膜电位下降，对衰老细胞的保护作用强于维生素E。

实施例6DAPI染色检测衰老相关异染色质聚集(SAHF)

细胞处理与SA-B-gal染色测定相同，细胞模型完成后，用PBS洗涤细胞，然后用4％冰冷的多聚甲醛固定10min。用PBS洗涤两次后，DAPI(2μg/mL)在暗处染色6min后，荧光显微镜下拍摄细胞以观察DNA染色质聚集，结果如图10所示，细胞经DAPI试剂染色激发后细胞核呈现亮蓝色荧光。Con组细胞(正常培养的A10细胞，未加桦褐孔菌多糖IOP-1、Eto和VitaminE)数量多且细胞核完整呈圆形；Eto模型组细胞数量明显减少，细胞核增大并呈现衰老相关异染色质聚集现象；而50μg/mL IOP-1处理组(IOP-1+Eto)细胞数量与Eto模型组相比明显增加，细胞核衰老相关异染色质聚集现象降低，50μg/mL维生素E组(Vitamin E)细胞数量增加但对细胞衰老相关异染色质聚集现象的抑制作用较IOP-1组弱。结果表明：桦褐孔菌多糖IOP-1可抑制Eto诱导的A10细胞核衰老相关异染色质聚集，对衰老细胞的保护作用强于维生素E。

实施例7Westernblot蛋白质免疫印迹分析

细胞衰老模型的处理与SA-B-gal染色测定相同，造模完成后，PBS洗涤细胞一次，NP-40裂解液提取蛋白质，使用BCA蛋白质测定试剂盒定量蛋白质浓度。通过12.5％SDS-PAGE电泳分离蛋白质并电转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶TBST(TBS中含有0.1％Tween-20)封闭1h后，将PVDF膜分别与Anti-phospho-p53抗体(TBST 1000：1稀释)、Anti-phospho-p21抗体(TBST1000：1稀释)、Anti-phospho-p16抗体(TBST 1000：1稀释)、Anti-β-actin(TBST400：1稀释)等单克隆抗体4℃孵育过夜。孵育结束后用TBST洗涤PVDF膜3次，每次8～10min，后将PVDF膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(TBST 8000：1稀释)在室温下孵育2h，孵育结束后用TBST洗涤PVDF膜3次，每次8～10min，使用超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天)检测蛋白质条带，结果如图11-12所示，衰老细胞的蛋白表达谱发生改变。与Con组细胞(正常培养的A10细胞，未加桦褐孔菌多糖IOP-1、Eto和Vitamin E)相比，Eto模型组细胞中p53、p21、p16蛋白表达明显增加，50μg/mL IOP-1处理组(IOP-1+Eto)细胞中p53、p21、p16蛋白表达下降，作用强于同样浓度下的维生素E组(Vitamin E)。灰度值定量分析差异均有统计学意义(p<0.05)。结果表明：桦褐孔菌多糖IOP-1可明显抑制Eto诱导的衰老标志物p53、p21、p16蛋白表达增加，对衰老细胞的保护作用强于维生素E。

实施例8qRT-PCRmRNA水平检测基因表达情况

细胞衰老模型的处理与SA-B-gal染色测定相同，造模完成后，RNeasy Mini Kit(QIAGEN，74104)试剂盒提取mRNA，采用TakaraPrimeScript^TMRT reagentKitwith gDNAEraser(Perfect Real Time)和PremixEx TaqTM II(Tli RNaseH Plus)通过qRT-PCR使用基因特异性引物定量衰老标志基因p53、p21、p16的mRNA转录水平，结果如图13所示，衰老细胞的基因表达谱发生改变，与Con组细胞(正常培养的A10细胞，未加桦褐孔菌多糖IOP-1、Eto和Vitamin E)相比，Eto模型组细胞p53、p21、p16基因mRNA表达明显增加，而50μg/mL IOP-1处理组(IOP-1+Eto)细胞中p53、p21、p16基因mRNA表达下降，作用强于同样浓度下的维生素E组(Vitamin E)。结果表明：桦褐孔菌多糖IOP-1可明显抑制Eto诱导的p53、p21、p16基因mRNA表达增加，对衰老细胞的保护作用强于维生素E。

其中，p53、p21、p16的引物序列如下：

p53：Forward，5’-GTTCCGAGAGCTGAATGAGG-3’，SEQ ID NO.1；

Reverse，5’-TTATGGCGGGAGGTAGACTG-3’；SEQ ID NO.2；

p21：Forward，5’-TTGTCGCTGTCTTGCACTCT-3’，SEQ ID NO.3；

Reverse，5’-TTTCGGCCCTGAGATGTTCC-3’；SEQ ID NO.4；

p16^INK4a：Forward，5’-TGGTGGTGCTGCACGGGTC-3’，SEQ ID NO.5；

Reverse，5’-GCACGATGTCTTGATGTCCC-3’；SEQ ID NO.6；

β-actin：Forward，5’-TGAACCCTAAGGCCAACC-3’，SEQ ID NO.7；

Reverse，5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’；SEQ ID NO.8。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 北华大学

<120> 一种桦褐孔菌多糖的制备方法及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gttccgagag ctgaatgagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttatggcggg aggtagactg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttgtcgctgt cttgcactct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tttcggccct gagatgttcc 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tggtggtgct gcacgggtc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcacgatgtc ttgatgtccc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgaaccctaa ggccaacc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tgatgtcacg cacgattt 18

Claims (6)

1.一种桦褐孔菌多糖的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将干燥的桦褐孔菌粉碎，过筛；

(2)将步骤(1)粉碎过筛的桦褐孔菌粉末用80％乙醇回流脱脂18～24h，残渣利用水提醇沉法提取多糖，反复冻融，酶-Sevag联合法脱蛋白，截留分子量3500Da透析去除小分子物质，在-45～-55℃及真空度5～100Pa下冷冻干燥得到粗多糖；

(3)将步骤(2)获得的粗多糖用蒸馏水复溶成5％的糖溶液，过滤后上样到DEAE-cellulose柱，用0→1mol/L NaCl梯度洗脱，收集洗脱液，苯酚-硫酸法测定多糖含量，得到两种主要多糖组分；

(4)室温流水透析步骤(3)得到的两种主要多糖组分，分别采用Sepharose CL-6B柱层析进一步纯化，0.15mol/L NaCl洗脱，室温流水透析18～24h，在-45～-55℃及真空度5～100Pa下冷冻干燥，得到分子量均一的桦褐孔菌不同多糖组分。

2.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述残渣利用水提醇沉法提取多糖，反复冻融，酶-Sevag法联合脱蛋白，透析去除小分子物质的具体步骤为：残渣用100℃热水浸提，液料比为30mL/g，提取时间为1.5～2.5h，提取液过滤，合并滤液，将滤液在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下减压浓缩，连续剧烈搅拌下加入4倍体积无水乙醇，4℃静置过夜，离心沉淀，经75％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗脱并减压干燥后，用蒸馏水复溶多糖使之成2～5％的糖溶液，-80℃反复冻融离心后，上清液加入链霉菌蛋白酶消化4～24h，按体积比4:1加入Sevag试剂，震荡离心脱蛋白；将糖溶液置于截留分子量3500Da的透析袋，在0.5～1％NaCl溶液中37℃恒温透析18～24h，每4～6h更换一次透析液。

3.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述过滤采用水系0.45μm尼龙滤膜过滤器过滤。

4.根据权利要求1-3所述的桦褐孔菌多糖在抗氧化和抗衰老中的应用。

5.根据权利要求1-3所述的桦褐孔菌多糖在制备抗衰老药物中的应用。

6.根据权利要求1-3所述的桦褐孔菌多糖在制备针对p53-p21、p16-pRb衰老信号通路的抗衰老药物中的应用。