CN112409503A

CN112409503A - 一种桦褐孔菌抗过敏多糖提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112409503A
Application number: CN202011240352.6A
Authority: CN
Inventors: 陈少丹; 吴清平; 关小莺; 谢意珍
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-02-26

Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌多糖提取物及其制备方法和应用。桦褐孔菌多糖提取物，其重均分子量为1.21×10⁴，数均分子量为4.84×10³，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，其按质量比1.00:4.49:1.00:0.85。本发明从桦褐孔菌中分离提取出一种桦褐孔菌多糖提取物，该桦褐孔菌多糖提取物能够治疗OVA引起的全身过敏，因此可以将其用于制备治疗抗过敏的药物。

Description

一种桦褐孔菌抗过敏多糖提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种桦褐孔菌多糖提取物及其制备方法和应用。

背景技术

在机体跟外界物质接触的过程中，免疫系统对一些对机体无危害性的物质如花粉、动物皮毛、食物等物质过于敏感而产生免疫应答，是机体的一种自我防御机制。然而当此反应过激时则可形成炎症反应，这一过程，称为变态反应(allergy)，或超敏反应(hypersensitivityreaction)。根据反应速度，变态反应可分为四型，即Ⅰ型速发型(immediat type)，Ⅱ型细胞毒型(cytotoxic type)/细胞溶解型，Ⅲ型免疫复合物型(immunecomplex type)，Ⅳ型迟发型(delayed type)或细胞介导型(cell-mediatedtype)，生活中较为常见的主要是Ⅰ型和Ⅳ型。其中，Ⅰ型速发型(immediat type)是IgE介导的超敏反应。当机体初次接触外源大分子蛋白抗原刺激时，会产生特异性IgE抗体，IgE抗体与肥大细胞或嗜碱粒细胞结合，形成致敏靶细胞，使机体呈致敏状态。当机体再次接触同种抗原时，抗原与特异性IgE发生桥联，使胞外Ca²⁺流入，胞内Ca²⁺积聚并激活酪氨酸磷酸化通路，导致肥大细胞活化及脱颗粒，释放包括组胺、趋化剂、白三烯、PGE2、血小板活化因子及多种酶类在内的多种生物活性物质，引起平滑肌收缩、黏膜水肿、血管通透性增高等，临床表现为皮肤粘膜过敏症(荨麻疹、湿疹、血管神经性水肿)，呼吸道过敏反应(过敏性鼻炎、支气管哮喘、喉头水肿)，消化道过敏症(食物过敏性胃肠炎)，全身过敏症(过敏性休克)。

过敏反应是机体受到抗原性物质刺激后引起的组织损伤或生理功能紊乱。近年来随着社会加速发展，环境污染加剧，过敏性疾病如特异性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎、哮喘等发病率逐年升高，过敏性疾病在全球范围内已是多发性常见病。

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，也称作桦树茸、白桦茸，是一种寄生于白桦、银桦树上的珍贵药食两用真菌，主要分布在俄罗斯、芬兰及我国黑龙江和吉林地区。近年来，桦褐孔菌的化学成分和药理作用逐渐引起国内外研究人员的重视，其主要化学成分有多糖、多酚、三萜类化合物等，具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫、降血糖等多种功效，然而，尚未有见其关于抗过敏的相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能够治疗过敏性疾病的桦褐孔菌多糖提取物。

本发明的桦褐孔菌多糖提取物，其重均分子量为1.21×10⁴，数均分子量为4.84×10³，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，其按质量比1.00:4.49:1.00:0.85。

本发明的第二个目的是提供一种桦褐孔菌多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

取桦褐孔菌菌核粉碎后用水浸提，过滤收集滤液，浓缩后加入乙醇或乙醇水溶液，静置收集沉淀，沉淀用乙醇和/或丙酮洗涤，再用水溶解，加入氯仿-正丁醇溶液，振荡，离心取上清液，如此重复若干次直至下层不产生胶状沉淀，上清液经浓缩后，用分子量3500Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析内液，冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖。

优选，所述的氯仿-正丁醇溶液是由氯仿：正丁醇按体积比5:1混合得到。

优选，具体步骤如下：

取桦褐孔菌菌核，经粉碎机打粉，过4目～50目检验筛进行筛选，收集过筛物，加到10倍重量水中进行浸泡4h，加热回流提取2h、滤纸抽滤，收集滤液，55℃减压浓缩至桦褐孔菌菌核粉末重量的2倍，得到浓缩液，所得浓缩液中加入体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇的体积分数为70％，静置48h，沉淀用无水乙醇和丙酮交替清洗3次；

所得沉淀加适量水溶解，加入五分之一体积的体积比5:1的氯仿-正丁醇溶液，振摇20-30min，离心，取上清液，重复该步骤5-7次，直到下层不产生胶状沉淀；

上清液减压浓缩后，用分子量为3500Da的透析袋在去离子水中透析48h，收集透析內液冷冻干燥，得到桦褐孔菌精多糖提取物。

本发明的第三个目的是提供桦褐孔菌多糖提取物在制备抗过敏药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种抗过敏药物，其含有桦褐孔菌多糖提取物作为活性成分。

所述的抗过敏药物是治疗特异性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或哮喘的药物。

本发明从桦褐孔菌中分离提取出一种桦褐孔菌多糖提取物，该桦褐孔菌多糖提取物能够治疗OVA引起的全身过敏，因此可以将其用于制备治疗抗过敏的药物。

附图说明：

图1是桦褐孔菌IO多糖的HPGPC图谱

图2是桦褐孔菌IO多糖经PMP衍生化-酸水解后单糖组成的HPLC图谱

图3是血清IgE浓度测定。数据以mean±SD表示；与正常组比较，*p<0.05；**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05；##p<0.01；

图4是血清HIS浓度测定。数据以mean±SD表示；与正常组比较，*p<0.05；与模型组比较，#p<0.05；

图5是小鼠脾脏指数。数据以mean±SD表示；与正常组比较，*p<0.05；**p<0.01；与模型组比较，#p<0.05；##p<0.01。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

一、桦褐孔菌多糖的提取和制备

取桦褐孔菌菌核，经粉碎机打粉(25000r/min，10s)，使用孔径为4目(65μm)～50目(355μm)药典检验筛进行筛选，收集过筛物(能够通过4目筛，但不能通过50目筛的粉碎物，下同)，加到10倍重量水中进行浸泡4h，加热回流提取2h、滤纸抽滤，收集滤液；重复上述步骤2次，合并所得滤液，55℃减压浓缩至桦褐孔菌菌核粉末重量的2倍，得到浓缩液；所得浓缩液中加入体积分数95％乙醇水溶液，使乙醇的体积分数为70％，静置48h，沉淀用少量无水乙醇和丙酮交替清洗3次。所得沉淀加适量水溶解，加入五分之一体积的氯仿-正丁醇溶液(氯仿：正丁醇v/v＝5:1)，剧烈振摇20-30min，离心，取上清液，重复该步骤5-7次，直到下层不产生胶状沉淀。上清液减压浓缩后，用分子量为3500Da的透析袋在去离子水中透析48h，收集透析內液冷冻干燥，得到桦褐孔菌多糖提取物(IO)。

二、桦褐孔菌多糖的分子量范围和单糖组成

如图1和图2所示，经HPGPC测定，IO的重均分子量为1.21×10⁴Da，数均分子量为4.84×10³Da，多分散性为2.5。采用PMP-HPLC柱前衍生法，经HPLC分析，IO主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，其摩尔比为1.00:4.49:1.00:0.85，该多糖提取物为以葡萄糖为主的中性杂多糖。

三、桦褐孔菌多糖提取物对OVA致敏的全身性过敏小鼠模型的治疗

1、材料与方法

(1)造模与给药

BALB/C雌性小鼠，适应性喂养5天后，按体重随机分成正常组(N)，模型组(M)，氯雷他定组(Loratadine)，桦褐孔菌多糖提取物组(IO)，每组10只。除正常组小鼠外，其余小鼠分别在第1天和第14天腹腔注射致敏液(200μL/只，内含500μg/mL卵清蛋白(OVA)和10mg/mL明矾)。在第15天与第29天腹腔注射激发液(200μL/只，内含25mg/mL OVA)，共2次。氯雷他定组给予10mg/kg氯雷他定，桦褐孔菌多糖提取物组给予200mg/kg所制备的桦褐孔菌多糖提取物，正常组，模型组给予等体积纯净水，连续灌胃给药28天，每天一次。

(2)取材与检测

实验过程中，每三天记录小鼠体重(即每周2次)，观察毛发、活动变化。第29天进行最后一次刺激。刺激30min后，摘眼球法采集静脉血，室温静置约2h，离心(1500×g，4℃，10min)，分离血清，分装(100μL/管)，-80℃保存。取所得血清，参照IgE、HIS试剂盒说明书，测定各组动物血清相应物质含量。颈椎脱臼处死受试动物，剖取脾脏，迅速称重，计算脾脏指数。

(3)结果

IgE由鼻咽、扁桃体、支气管、胃肠粘膜等处固有层的浆细胞产生，是引起I型变态反应的主要抗体。IgE在血清中含量过高，常提示遗传过敏体质，或I型变态反应的存在。因此血清IgE含量可作为反映过敏状态的指标之一。IgE含量测定结果如图3.所示。建立OVA全身过敏模型后，受试动物血清中IgE含量显著升高(p<0.01)，而给予阳性药氯雷他定与IO多糖后，受试动物血清中IgE含量明显下降。

HIS存在于肥大细胞内，亦存在于肺、肝及胃的粘膜组织内。当被大量分泌到血液中时，HIS可结合到血管平滑肌上的接受器(H1R)导致血管扩张因而产生局部水肿，使肺的气管平滑肌收缩引起呼吸道狭窄进而呼吸困难，并引起降低血压、增加心跳等多项生理反应。因此血清HIS含量可作为反映过敏状态的指标之一。HIS测定结果如图4所示。模型组动物血清中HIS含量比正常组升高(p<0.05)，而给予氯雷他定和IO多糖(p<0.05)后动物血清中IgE含量下降。

小鼠脾脏指数结果如图5所示。建立OVA全身过敏模型后，受试动物的脾脏明显肿大，脾脏指数明显升高(p<0.01)；给予阳性药氯雷他定与IO多糖(p<0.05)后，受试动物脾脏指数均有下降。

Claims

1.一种桦褐孔菌多糖提取物，其特征在于，其重均分子量为1.21×10⁴，数均分子量为4.84×10³，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成，其按质量比1.00:4.49:1.00:0.85。

2.一种桦褐孔菌多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的氯仿-正丁醇溶液是由氯仿：

正丁醇按体积比5:1混合得到。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

5.权利要求1所述的桦褐孔菌多糖提取物在制备抗过敏药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗过敏药物是治疗特异性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或哮喘的药物。

7.一种抗过敏药物，其特征在于，其含有权利要求1所述的桦褐孔菌多糖提取物作为活性成分。

8.根据权利要求7所述的抗过敏药物，其特征在于，所述的抗过敏药物是治疗特异性皮炎、食物过敏、过敏性鼻炎或哮喘的药物。