WO2013094903A1

WO2013094903A1 - 면역기능 증진 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법

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Publication number: WO2013094903A1
Application number: PCT/KR2012/010601
Authority: WO
Inventors: 홍희도; 이영철; 김영찬; 김경탁; 최상윤; 이영경; 조장원; 노정해; 성수경; 신광순; 박혜령; 조선영
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2013-06-27
Also published as: KR101373263B1; US9833462B2; CN103998044A; US20140302067A1; CN103998044B; KR20130070526A

Abstract

본 발명은 감일 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것으로， 좀 더 상세하게는 전체 감잎 다당 분획물 대비 중성 다당 (neutral sugar)은 70 내지 90 중량%， 우론산(uronic acid)은 10 내지 30 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물， 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다당 분획물은 보체계의 활성을 증강시키고, 정상 마우스 및 면역 억제 마우스 모두에서 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나 경쟁력 있는 면역 증강용 식품용 조성물 및 면역 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

Description

. 【명세서]

【발명의 명칭]

면역기능 증진 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법 [기술분야]

<1> 본 발명은 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것으로， 좀 더 상세하게는 전체 감잎 다당 분획물 대비 중성 다당 (neutral sugar)은 70 내지 90 증량 %， 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 증량 % 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물， 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

<2>

【배경기술】

<3> 감잎에는 레몬의 20배 이상인 비타민 C가 많이 함유되고 있어 건강차로 애용 되고 있다. 감잎의 효능으로는 혈액 순환을 원활하게 하고， 혈관을 른튼하게 하여， 괴혈병， 빈혈， 심장병， 동맥경화와 뇌출혈에 효과적이다. 그러나 지금까지 면역계 에 미치는 영향에 대해서는 거의 연구가 이루어지지 않았다.

<4> 보체계 (complement system)는 1차 면역 체계로써 항원 항체 복합체의 Clq로 의 결합에 의하여 활성화되는 고전적 경로와 혈액 중에 존재하는 C3b에 B 인자， D 인자가 관여하여 lipopolysaccharide, 내독소 등의 활성인자에 의해 비특이적으로 활성화되는 부경로， 세포벽에 존재하는 mannose에 특이적으로 결합하는 lectin에 의해서 활성화되는 렉틴 경로의 3가지 경로에 의해서 활성화되는 것으로 알려져있 다.

<5> 지금까지 밝혀진 천연물 유래의 보체계활성화에 관여하는 물질들은 표고버섯

(Lentinus edode)에서 분리한 lentinan과 구름버섯 (Col iolus versicolar)에서 분리 한 PSK(polysaccharide K) 등이 있다.

<6> 감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도 저하용 조성물에 관한 특허 (한국공개 특허 10-2003-0024111)가 있는데， 그 용도가 혈중 지질농도 저하， 간기능 보호 등 이고， 감잎 추출물의 항산화 및 항알레르기 효과에 관한 논문 (한국식품영양과학회 ,2009,v38nol2, 1691-1698)이 있으나 면역 증강 효과나 본 발명자들이 연구한 당 조성을 가지는 다당체가 알려진 적은 없다.

<7>

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 <8> 본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법에 관하여 연구하던 중 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 특정 단당 조성을 가지는 다당체를 포함하 . . 고 있으며， 보체계의 활성올 증강시키는 효능이 매우 뛰어나는 등 면역기능을 증진 하는 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

<9>

<ιο> . 따라서 본 발명의 목적은 전체 감잎 다당 분확물 대비 중성 다당 (neutral sugar)은 70 내지 90 중량 ¾>， 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 중량 ¾ 인 것을 특 징으로 하는 감잎 유래 다당 분확물을 제공하는 것이다.

<11> _.

<12> 본 발명의 다른 목작은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증 진용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

<13>

<14> 본 발명의 다른 목적은 상기 당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기， 알러 지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는.치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

<15>

<16> 본 발명의 다른 목적은 감¾ 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리하껴 상기 감 잎 유래 다당 분획물을 제조하는 제조방법을 제공하는 것이다.

<17>

【기술적 해결방법】

<18> 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은전체 감잎 다당 분획물 대비 증성 다당 (neutral sugar)은 70 내지 90 중량 %， 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 중량 >인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물을 제공한다.

<19>

<20> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 .위하여 본 발명은 상기 다당 분획물을 유효 성분으로 포함하는 면역 증진용 식품 조성물을 제공한다.

<21>

<22> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 다당 분획물을 유효 성분으로 포함하는 감기， 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면 역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<23>

<24> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 감잎 분말에 펙틴 가수 분해 효소를 처리하여 상기 감잎 유래 .다당 분획물을 제조하는 제조방법을 제공한 다.

<25>

<26> 이하 본 발명을 상세히 설명한다.

<27>

<28> 본 발명은 전체 감잎 다당 분획물 대비 중성 다당 (neutral sugar)은 70 ^'내지

90 중량 %， 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 중량 ¾ 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물을 제공한다.

<29>

<30> 상기 우론산은 갈락투로닉산 (galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산

(glucuronic acid)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.

<31> 또한, 상기 중성 다당은 람노오스， 퓨코오스, 아라비노오스， 자일로스, 만노 오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성되는 것을 특징으로 한다. 더 상세하게는 상기 중성 다당은 상기 감잎 유래 _.다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 람 노오스는 10 내지 18 mol ¾/퓨코오스는 1 내지.5 mole%, 아라비노스는 18 내지 28 mole%, 자일로스는 5 내지 15 mole%, 만노오스는 1 내지 5 mole%, 갈락토오스는 30 ： 내지 40 mole%, 글루코오스는 5 내지 .15 mole% 인 다당으로 구성되는 것을 특장으 로 한다. ^'

<32> 상기 중성 다당은 2-메틸퓨코오스， 2-메틸자일로스， 아피오스 및 아세릭산을 추가로 포함할 수 있다.

<33>. 상기 다당 분획물의 주요 성분을 분석해 본 결과, 전체 가수분해물에 대하여 중성 다당은 71.3 내지 78.6 중량 ¾， 우론산은 16.7 내지 26.2 중량 % 인 것으로 나 왔다. 이것을 전체 다당 분획물에 대한 값으로 환산하면, 중성 다당은 71.8 내지 81.7 중량 %， 우론산은 17.4 내지 26.3 중량 % 가 된다 (실시예 4-2 및 표 3 참조).

<34>

<35> 또한， 본 발명의 상기 다당 분획물은 감앞 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처 리 하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다. 상기 제조방법은 감잎 분 말 효소 가수분해불로부터 분자량 30 내지 100 kDa 분획물을 회수하는 단계를 추가 로 포함할 수 있다. 효소 처리된 감잎 분말 상기 다당 분획물의 제조방법은 아래에 자.세히 설명하였다. .

<36>

<37> 또한 본 발명의 상기 다당 분획물은 면역 증진 효능이 뛰어나다. <38> _, 이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 실시예들에 잘 나타나 있다.

<39>

<40> 본 발명의 열수추출 조다당 추출물， 그리고 효소 처리한분획물들을 Mayer 법으로 항보체 활성을 측정한 결과 pectinase로 처리한 분획물의 활성이 가장 우수 하였다. 펙티나아제 처리한 다당추출물은 음성 대조군 (조다당추출물)에 비해 12.5 내지 22% 더 높은 항보체 활성을 나타내었으며 양성대조군인 PSK보다 높은 항보체 활성을 나타내었다. (실시예 2 참조) 따라서 펙티나아제로 분획물을 제조하여， 아래 의 실험을 진행하였다.

<4i> 양성대조군인 PSK (polysaccharideK, 농도 l,000ug/ml), 열수추출 한 본 발

TM

명의 다당 분획물 (농도 10,100,500,1000 ug/ml), Pectinase 으로 처리한 다당 분획 물 (PLE-0, 농도 10 ,100 ,500， 1000 ug/ml), PLE-O를 겔 여과 크로마토그래피로 추출 한 다당 분획물 (PLE-I,농도 10,100,500,1000 ug/ml) 등올 다시 Mayer 법으로 항보 체 활성을 측정한 결과， 양성대조군 (PSK)과 같은 농도인 1000 ug/ml에서는 다당 분 획물들 중 PLE-0는 비슷한 활성을 보였고， PLE-I는 더 우수한 활성 경향을 보이는 것을 확인했다. (실시예 5 참조)

<42> 또한， 대식세포의 사이토킨 (IL-6, IL-12) 분비능을 촉진하는지 여부를 살펴 본 결과， PLE-I 분획물이 PLE-0 및 PLW 보다도 훨씬 더 분비를 촉진한다는 것을 알 수 있고， 촉진능은 농도 의존적이다 (실시예 6 및 도 4 참조). .

<43> IL-6, IL-12는 대식세포에 ^'의해 유도되는 대표적인 cytokine 으로 세균 감염 에 따른 염증반웅에 있어서 중추적인 역할을 하며， 염증 병소에서 그 양이 증가되 는 것으로 알려져 있다. IL-6는 B세포 자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL— 6는 Β 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로 서 발견되고 (Hiran으 T. et al. , Nature, 324， 73-76， 1986) , 그 후， 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다 (Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993).

<44> 또한 정상 마우스를 대상 로 면역 세포 증식능이 있는지 여부를 실험한 결 과， 비장지수 (Spleen index, SI) 및 흉선지수 (Thymus index, TI)가 대조군보다 높 은 편이었고， 비장세포를 구성하는 Τ 세포 및 Β 세포 증식능이 음성대조군보다 높 은 편이었고， 특히 Τ 세포의 경우， 200mg/kg 양으로 투여한 실험군은 대조군에 비 해 유의적인 증가경향을 나타내었다 (실시예 7 및 도 5, 도 6 참조).

<45> 비장 (spleen)은 혈액에서 유래되는 항원에 대한 주된 보호 면역 반응 부위로

B 및 T 림프구의 성숙과 항원의 자극에 의한 림프구의 분화가 이루어지는 주요 림 프 기관으로 비장 내 림프구의 증식은 면역 시스템에서 매우 중요한 의미를 갖는 다.

<46> Cychlophosphamide로 면역을 억제한 마우스를 대상으로 비장세포 (T 세포 및

B 세포)의 증식능 및 NK세포 활성 촉진능을 측정해보았다. K 세포 활성 촉진능에 있어서， PLW는 유의적인 활성을 보이지 않았지만, PLE-I은 유의적으로 촉진능이 우 수하였다. 또한， 비장세포 (T 세포 및 B 세포)의 증식능에서도 PLE-1 우수한 것을 확인할 수 있다 (실시예 8 및 도 7， 도 8 참조).

<47> Cyclophosphamide는 악성 종양의 치료 및 장기이식 후 나타나는 거부반웅의 억제제로 사용되고 있는 대표적인 약물로 알려져 있다. 그러나 Cyclophosphamide의 비선택적안 독성으로 인해 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 독성을 나타내어 백혈 구 수 감소， 혈소판 감소， 빈혈 등과 같은 부작용을 나타내고 있다. 따라서 최근에 는 이와 같은 부작용이나 면역독성을 최소화 할 수 있는 물질을 발굴하고자 하는 . 연구가 이루어지고 있다.

<48> 자연살해세포 (NK cell)는 다양한 기전을 통해 암 세포나 바이러스에 감염된 세포를 직접적으로 공격하여 사멸시키는 기능을 가지며, 전체 림프구에서 5~10% 비 율로 소량 존재하지만 정상 세포에서 돌연변이와 같은 이상이 감지되었을 때 가장 처음으로 방어하여 이를 제거하는 강력한 기능을 갖는다. 또한 다른 면역 세포의 기능 조절에도 매우 중요한 역할을 담당하여 선천면역 세포이면서도 획득면역 세포 를 자극하여 더 강력한 방어 작용을 한다. 정상인의 경우， 유전 및 환경적 요인으 자연 살해 세포에 의해 1차적으로 제거된다.

<49>

<50> 이로서 본 발명의 다당 분획물은 면역 기능 증진 활성이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.

<51>

<52> 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 면역 기능 증진 활성이 매우 뛰어나기 때문에， 본 발명의 다당 분획물을 이용하여 면역 증강용 식품용 조성물 및 면역저 하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

<53> 본 명세서에서 용어 "면역 증강' '은 생체 내 면역시스템의 면역 반웅 또는 활 성을 증가시키는 것을 의미한다.

<54>

<55> 본 발명에 따른 식품용 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조 제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 천가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. .

<56> 예를 들면， 건강식품으로는 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물 자체를 차， 쥬 스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나， 과립화， 캡슐화 및 분말화하 여 섭취할 수 있다. 또한， 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물과 면역기능 증진의 효 과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 흔합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

<57> 또한， 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함) 과실 및 그의 가공식품( 예: 과일통조림， 병조림 잼, 마아말레이드 등)， 어류， 육류 및 그 가공식품 (예： 햄， 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수， 라면， 스파게티, 마카 로니 등)， 과즙, 각종 드링크， 쿠키， 엿, 유제품 (예: 버테 치이즈 등)， 식용식물 유지， 마아가린， 식물성 단백질， 레토르트 식품， 넁동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장， 소스 등) 등에 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 첨가하여 제조할 수 있

-다-

<58> 본 발명의 식품 조성물. 중 상기 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물의 바람직 한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중

0.01 내지 50 중량 %이다. 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 식품 첨가제의 형태 로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

<59> 본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물의 바람직 한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중

<60>

<61> 또한 본 발명은 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기, 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 면역력 저하로 인한 질환은 면역 기능이 떨어져서 정상인 보다 더 쉽게 걸리게 되는 질환 또는 면역 기능 저하 로 인해 치료가 어려운 질환을 의미하는 것이다. 상기 알러지 질환은 아토피， 천식 및 알러지성 비염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

<62>

<63> 본.발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 다당 분획물 또는 이들의 약학적 으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체， 부형제 또는 회석제를 추가로 함유할 수 있다.

<64> 본 발명의 감잎 유래 다당분획물은 그 자체 또는 염， 바람직하게는 약학적 으로 하용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능 한'이란 생리학작으로 허용되고 인간에게 투여될 때 , 통상적으로 알레르기 반응 또 는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 것을 말하며， 상기 염으로는 약학적으로 허 용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리 산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나， 구연산， 초산， 젖산， 주석산， 말레인산， 푸마르산， 포름산, 프로피온산， 옥살산， 트리플로오로아세트산， 벤조산， 글루콘산， 메타술폰산， 글리콜산, 숙신산, 4-를루엔술폰산， 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브름산, 황산 및 인산을 포함한다.

<65> 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스， 전분， 셀를로스 유 도체， 마그네슘 스테아레이트， 스테아르산 둥을 포함할 수 있다. 또한， 비경구 투 여용 담체는 물， 적합한 오일, 식염수， 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화체 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황 산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄을이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences , 19th ed.， Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995) .

<66> 본 발명의 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인 간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으 나， 정맥내， 근육내， 동맥내, 골수내， 경막내， 심장내, 경피， 피하， 복강내， 비강 내， 장관， 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학 적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성 물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분아 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대， 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으 로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법，；또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

<67> 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

<68> 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립， 정제， 환제, 당 의정제， 캡슐제, 액제， 겔제， 시럽제， 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어， 경구용 제제는 활성성분을 고체 부 형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 흔합물로 가공 함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈， 수크로즈， 솔비를， 만니틀， 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분 류 , 셀를로즈， 메틸 셀를로즈， 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하이드록시프로 필메틸-샐를로즈 등을 포함하는 샐를로즈류, 젤라틴， 플리비닐피를리돈 등과 같은 층전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가， 본 발명의 약학적 조성물은 항웅집제， 윤활제， 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

<69> 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사체， 크림제, 로션제, 외용연고제， 오일 제， 보습제， 겔제， 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문

¾ (Remington ' s Pharmaceutical Science, 15th Edit ion, 1975. Mack Publishing Com any , East on, Penns lvania 18042 , Chapter 87: B 1 aug , Seymour)에 기재되어 있다.

<70> 본 발명의 다당 분획물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에 게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달라할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 다당 분획물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 당 약 O.Olug 내 지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 다당 분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령， 체중， 건강 상태， 성별， 질환의 중증도, 식이 및 배설율 둥 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고 려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 다당 분획물을 면 역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것 이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

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<72> 본 발명은 본 발명의 상기 감잎 유래 다당 분획물의 감기， 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료 제 제조를 위한 용도를 제공한다.

<73> 본 발명은 본 발명의 상기 감잎 유래 다당 분획물을 이를 필요로 하는 개체 에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 감기， 알러지 질환 및 만성피로로 이 루어잔군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한 다.

<74> 상기 알러지 질환은 아토피， 천식 및 알러지성 비염으로 이루어진 군에서 선 택되는 것을 특징으로 한다.

<75>

<76> 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물 그 자체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 유효량으로 경구， 경피， 피하， 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투 여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때， 면역력 저하로 인 한 질환의 치료 및 예방 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개체 (subject)'란 동 물， 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유 - 래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자 (patient) 일 수 있다.

<77> 상기 본 발명의 감잎 유래 다당물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있 으며， 바람직하게는 원하는 효과 즉, 면역력 저하로 인한 질환 예방 또는 치료 효 과 가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉， 경 구 또는 비경구， 예컨대 구강, 근육내， 정맥내， 피내， 동맥내, 골수내， 경막내， 복 강내， 비강내, 질내， 직장내， 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관， 점막 또는 호홉 기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 다당 분획물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제 형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입 하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바 람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으 로 허용가능한 염은 표적 세포나 조직 (예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결 합을 유발하는 분자와 결합되거나 상가 분자 내에 캡슬화된 형태로 투여돨 수도 있 다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 공지된 기술 을 이용하여 스테를 (예: 콜레스테롤)， 지질 (예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예 : 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간 드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디 이미드， N-숙신이미딜 -3-(2—피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.

<78> 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 (Remington's

Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania)에 가술되어 있다.

<79>

<80> 또한 본 발명은 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리하여 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 제조하는 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 상기 감잎 분 말 효소 가수분해물에서 분자량 30 내지 100 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 추가 로 포함할 수 있다.

<81> 상기 본 발명의 다당 분획물을 제조하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같 다.

<82> 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 제조하기 위해서 감잎 분말에 펙틴 가수 분해 효소를 처리한다.

<83> 본 발명자는 감잎 분말에서 면역 활성 물질을 수득하는데 가장 적합한 효소 를 찾기 위해， 여러 가지 당 분해효소로 열수추출한 감잎 조다당 분획물에 다양한 효소들을 처리하여 항보체 활성을 측정한 결과， 펙틴 가수분해 효소가 가장 적합한 것을 발견하였다 (실시예 2 및 표 1 참조).

<84> 펙틴 가수분해 효소는 감잎 분말 중량 대비 1 내지 20% 만큼 첨가하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 5 내지 15% 이고， 가장 바람직하게는 10% 일 수 있 . 다. 효소를 처리하는 상가 감잎 분말은 증류수로 5배 내지 15배 (w/v) 정도로 현탁 하여 사용할 수 있다. 상기 가수분해 효소 처리는 1 내지 5일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2 내지 4일일 수 있다. 처리 pH는 3.5 내지 5.5가 바 람직하다. 효소 처리 후, 잔존 펙틴 가수분해 효소를 90 내지 1KTC에서 10 내지 60분동안 가열하여 효소를 불활성화하는 공정을 추가로 포함한다. 상기 가열로 인 해 가용성 다당을 제거할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당성분의 용출을 증 가시키며， 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성， 침전시킴으로서 원 심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.

<85> 또한 효소 처리 전， 감잎 분말을 탈색하는 공정을 포함할 수 있다. 탈색하기 위한 용매로는 인체에 무해하여 그 사용이 허가된 탈색 용매라면 다 가능하다. 바 람직하게는 에탄올， 아황산칼륨, 아황산나트륨， 이산화황, 과산화벤조 일 수 있고, 가장 바람직하게는 에탄을이다.

<86> 상기 제조방법은 상기 감잎 분말 효소 가수분해물에서 분자량 30 내지 100 kDa의 분확물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

<87> 상기 추가 단계는 효소처리 후 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제 거하여 얻은 다당 추출물로부터 분자량이 30 내지 100 kDa 인 분획물을 수득하는 단계로서, 수득하는 수단은 분자량을 기준으로 정제하는 당업계에 알려진 공정은 모두 가능하며， 바람직하게는 한외여과 또는 겔 여과 크로마토그래피 이고， 가장 바람직하게는 겔 여과 크로마토그래피이다. 최종 다당 분획물의 형태는 추출물， 농 축물' 분말 등일 수 있다.

<88> 펙티나아제 처리 후, 60kDa 의 분자량을 갖는 분획물 (PLE-I 지칭) 또한 면역 증강 활성이 있는 것을 확인하였다. 상기 수득 다당 분획물 분자량은 30 내지 lOOkDa 이고， 더 바람직하게는 40 내지 90 kDa, 가장 바람직하게는 50 내지 80 kDa 일 수 있다.

<89> 상기 최종 다당 분획물에 50~100%의 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 저분자 물질 및 불순물을 제거하여 다당을 정제하는 단계를 추가로 실시할 수 있 다.

<90>

【유^'리한 효과】 ^'

< i> 따라서 본 발명은 전체 감잎 다당 분획물 대비 중성 다당 (neutral sugar)은

70 내지 90 증량 %， 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 증량 % 인 것을 특징으로 하 는 감잎 유래 다당분획물， 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다.

<92> 본 발명의 다당 분획물은 보체계의 활성을 증강시키고, 정상 마우스 및 면역 억제 마우스 모두에서 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나 경쟁력 있는 면 역 증강용 식품용 조성물 및 면역 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

<93>

. [도면의 간단한 설명】

<94> 도 1은 감잎 유래 조다당 PLE-0 분획물의 gel filtration chromatography 결

^' 과이다. (Absorbance ： 흡광도， Fraction number ： 분획물 순서) 도 2는 PLE-I의 분자량 측정 결과이다. (Abundance ： 성분함량， Retention time(min): 확산시간)

도 3은 감잎 유래 다당분획물의 항보체 활성 측정 결과이다. (Anticomplementary activity(ITCH50%):항보체 활성도, PSK(polysaccharideK)：양성대조 군， PLW 0:열수추출한 조다당， PLE-0:Pectinase 으로 처리한 조다당, PLE-l:PLE-0 를 1여과크로마토그래피로 정제한 첫 번째 분획물， 10ug/ml~1000ug/ml:증류수로 각 시료의 농도를 맞춘 것) 도 4의 A는 감잎 유래 다당 분획물의 대식세포 사이토킨 IL— 6 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (con ： 대조군， LPS ： Hpopolysacdiaride (양성대조군)， PLW-0 ： 열수추출한 조다당, PLEH) ： Pectinase™으로 처리한 조다당， PLE-1 ： PLE-0 를 겔 여과크로마토그래피로 정제한 첫 번째 분획물) 도 4의 B는 감잎 유래 다당 분획물의 대식세포 사이토칸 IL-12 분비 촉진능 을 측정한 결과이다. (con ： 대조군， LPS ： Hpopolysacdiaride (양성대조군)， PLW- 一 _ TM

0 ： 열수추출한 조다당， PLEH) ： Pectinase 으로 처리한 조다당, PLE-1 ： PLE-0 를 겔여과크로마토그래피로 정제한 첫 번째 분획물) 도 5는 정상 마우스를 대상으로 감잎 유래 다당 분획물이 spleen index(SI) 및 Thymus index(TI) 에 영향을 주는지 여부를 측정한 결과이다. (c ： 대조군 /

100, 200 ： PLE-I을 마우스에게 경구투여한 양 (mg/kg))

도 6 은 정상 마우스를 대상으로 감잎 유래 다당 분획물이 비장 세포인 T세 포와 B 세포 증식에 영향을 주는지 여부를 측정한 결과이다. (c ： 대조군 / 100, 200 ： PLE-I을 마우스에게 경구투여한 양 (mg/kg)) 도 7은 면역억제 마우스를 대상으로 감잎 유래 다당 분획물의 NK 세포 활성 을 측정한 결과이다. (c: 정상 대조군， CY ： cyclophophamide로 면역 억제한 대조 군， L ： PLE— I을 면역 억제 마우스에게 10( g/kg 투여한 군， H ： PLE-I을 면역 억 제한 마우스에게 200 mg/kg투여한 군) <i08> . 도 8은 면역억제 마우스를 대상으로 감잎 유리 다당 분획물이 비장 세포인 T 세포와 B 세포 증식에 영향을 주는지 여부를 측정한 결과이다. (c: 정상 대조군， CY ： cyclophophamide로 면역 억제한 대조군, L ： PLE-I을 면역 억제 마우스에게 100mg/kg투여한 군， H ： PLE-I을 면역 억제한 마우스에게 200 mg/kg 투여한 군)

<109>

【발명의 실시를 위한 형태】

<110> 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세하설명한다.

<ιπ> 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<112>

<113> < ^시예 1>

<ιΐ4> 열수추출 감 조 다당분획물 (PLW-0) 제조 및 다양한효소 처리

<Π5> 감잎 (persi麵 on leaf)은 백장생에서 시판하는 감잎 (감잎， 경북영천)을 분말 화하여 사용하였다. 90% ethanol올 건조분말 중량의 10배 (w/v)가 되도록 건조분말 에 첨가하여, 48시간 동안 교반시키고， 여과 및 건조 과정을 거쳐 탈색을 완료하였 다. ^'

<Π6> 상기 탈색 건조분말을 증류수 (10배 (w/v))에 현탁하여 100에서 3시간 동안 가 열처리하였다. 열수추출액을 4^°C, 6,500xg, 15분으로 원심분리 후， 상등액을 분리 하여 상둥액의 4배 부피 (v/v)의 80% ethan 을 가하여 24시간 동안 정치하면서 다 당을 침전시켰다. 참전된 다당에 투석 (분자량 cut-off ： 6,000-8,000)^： 행하여 열 수추출 조다당 분획물 (PLW-0)을 얻었다.

<Π7> 상기 탈색된 건조분말을 증류수 10배 (w/v), pH 4에 현탁_.하여， 식품용 상업용

_ TM TM TM TM TM 소 Econitase ， Rapidase , Viscozyme , Cel luclast 1.5L, Pect inex ,

Rohament™ CL, UltrafloL™, Cytolase™ PCL 5와 Pectinase™ 를 각각 처리한 (분말 의 0.5¾» 첨가) 후, ethanor침전 및 투석을 행하여 효소종류에 따론 조다당 분획물 을 제조하였다 (PLE-0-El~PLE-0-E9).

<118>

<119> <실시예 2>

<120> 보체계 활성화측정으로 최적의 효소 선택

<121>

<122> 항보체 활성은 Mayer방법을 이용하여 시료에 의한 보체소비 (complement rnnsnmnl-ion)^- 자존하는 보체에 의하 적혈구 용혈정도에 근거를 둔 complement fixation test로 .측정하였다. 즉， 여러 농도 (10, 100, 500， 1，000 ug/mL)로 증류수 에 녹인 시료에 정상인의 혈청 (NHS, normla human serum)과 GVB++(gelat in veronal buffered saline, pH 7.4, 2% gelatin, 500 LIM Ca++, 2 mM Mg++ 함유) 완층액을 각 각 50 uL씩 흔합하여 37 ^°C에서 30분간 1차 반응시키고， GVB++를 350 uL를 가한 후 이를 10~160배로 연속 희석하였다. 여기에 다시 750 uL의 GVB+를 가한 후 양의 감 g

작적혈구 (IgM-sensitizat ion_. sheep erythrocyte, EA. Cell, 1X10 cell/mL) 250 uL를 가해 37 ^°C에서 60분간 2차 반응시키고 PBS 2.5 mL를 넣어 반웅을 정지사켰다. 반웅 액을 2,500 rpm에서 약 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈 활성을 측정하였다. NHS는 건강한 성인에서 얻었으며， NHS와 buffer, 증류수만을 반응시켜 대조군으로 사용하였다. 본 발명 다당체의 항보체 활 성은 대조군의 총 보체용혈 (50% total complement hemolysis, TCH₅₀, %)에 대한 저 지율 (inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH₅₀, %)로서 나타내었다.

<I23> 각 조다당 분획물을 대상으로 초기 면역반응에서 중요한 역할을 담당하는 보 체계의 활성화 정도를 500ug/mL에서 측정한 결과， E2, E5, E8 및 E9 처리분획물의 활성이 상대적으로높았고， 단순 열수추출 조다당 분획물 (AGW)의 활성은 상대적으 . 로 낮은 결과를 나타내었다 (표 1 참조).

<124> [표 1】

<125> 효소 처리 당 분획물의 항보체 활성 측정 결과

처리 효소 가이 ^'■

구 . 제품명 주 f 환 s성ᄋ . 시료 명 항 -보체 활성

(ITCHso, %,

- - PSK 40.1±1.8

(양성대조군)

0 Non-enzymatic ― PLW-0 37.6±1.3

treatment

El Econase CE eel lulase PLE-0-E1 30.2±2.8

E2 Ra idase pect inase, PLE-0-E2 35.4±3.1

hemicel lulase,

eel lulase

E3 Viscozyme arabinase, PLE-0-E3 25.4±L9

eel lulase,

-glucanase,

hemicel lulase,

xvlanase

E4 Cel 1 uc last 1.5L eel lulase PLE-0-E4 31.3±1.7

E5 Pect inex Dect inase PLE-0-E5 42.3±0.9

E6 Rohament CL eel lulase PLE-0-E6 29.6土 3.1

E7 Ultraf lo L -glucanase PLE-0-E7 27.4±1.4

E8 Cvtolase PCL 5 Dect inase PLE-0-E8 43.7±1.2

E9 Pect inase oect inase PLE-0-E9 45.9±0.6

<126> 이상의 결과는 pect inase가 주된 활성인 시판 상업용 효소로 처리 시， 감잎 에 존재하는 pect in이 각 효소의 pect inase에 의해 homogalacturonan 영역이 분해 되면서， 면역활성 유효성분이 쉽게 분리됨을 판단하게 하였다. -

<127>

<128> <실시예 3>

<129> 효소 처리 감¾ 유래 다당 분획물 제조

<130>

<131> 탈색한 감잎 건조분말은 상기 실시예 1의 것과 동일한 것을 사용하였다.

<132> 탈색된 건조분말을 증류수 10배 (w/v), pH 4에 현탁하여， pectinase(Rapidase

C80MAX, 비전비이오켐)를 원료당 10%로 첨가한 후， 50 incubator에서 3일간 효소 처리한다. 그 후 상기 효소 처뫼 반웅액을 1이에서 30분 간 가열처리하여 가용성 다당의 추출 및 잔존 pect inase를 불활성화 시킨다.

<133> . 효소 처리를 마친 상기 시료를 4， 6,500, 15분 원심분리하여 잔사를 제거하 고， 한외 여과로 여과시켜, 분자량이 3kDa 이하인 미세한 물질들을 제거하여 효소 처리 조다당 분획물 (PLE— 0)을 얻었다.

감잎 유래 조다당 PLE-0 분획물을 50 mM ammonium formate buffer (pH 5.5) 로 평형화된 Sephadex G— 75 column (2.5x90cm)에 loading하고 동일 buffer를 이용 하여 용출시켰다. 그 결과 유래 조다당 분획물 PLE— 0은 분자량이 상이한 3개 분획 물로 구성된 것을 확인하였는데， 이중 가장 첫 번째로 나온 분획을 PLE-I으로 명명 하였다 (도 1 참조). 동일 실험을 6-7회 반복하여 실험 결과를 검증하였다.

<실시예 4>

감잎 유래 당분획물 (PLE-1) 특성 규명 <4-1>순도및 분자량측정

감잎으로부터 정제된 PLE-I의 순도 및 분자량을 HPLC를 통하여 확인하였다. 분석은 Asahipak GS-320+GS220(각 0.76x50cm, Asahi Chemical Industry Co., 일본)을 장착한 Shimadzu LC 6A를 사용하였다. 0.2M NaCl를 용매로 용출하였 으며 정제다당의 분자량은 standard pul lul ns(P-400, 200, 100, 50， 20 and 5； Showa Denko Co., 일본)를 표준물질로 하여 얻어진 표준곡선과 비교하여 측정하였 다.

그 결과, 좌우대칭의 단일 peak를 나타내어. 비교적 순수하게 정제되었음을 확인할 수 있었으며， 표준물질 (pullulan series)을 이용한 분자량 측정 결과 감잎 으로부터 정제된 PLE— I의 분자량은 각각 60 kDa임을 확인하였다 (도 2 참조).

<4-2> PLE-I 구성당측정

구성당 분석은 Albersheim 등의 방법을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성 당을 alditol acetate로 유도체화 하여 GC를 이용하여 분석하였다. 다당 시료를 2 M TFA (trifluoroacetic acid) 중에서 121 ^°C , 1.5시간 반응시켜 가수분해한 후， 그 가수분해물을 Dowex-K acetate form)resin에 의해 중성당과 산성당으로 분리하였 다. 1 mL의 1 M NH₄0H(Ammoniasolution)에 용해하여 10 mg의 NaBH₄로 4시간 환원시 켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH₄를 제거한 후， methan 을 가하며 반 복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 이 후 각각의 alditol은 1 mL의 acetic anhydride를 가하여 121^°C에서 30분 동안 반웅시켜 alditol acetate로 전환시켰으며 이를 chloroform/H₂0₂상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone 에 용해하여 GC 분석용 시료로사용하였다. Alditol acetate 유도체의 GC분석 조건 은 표 2와 같으며， 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak면적， 분자량 및 FID에 대한 molecular response factor를 각각 산출하여 계산하였다.

【표 2】

GC 분석 조건

<148> . 그 결과， 감잎 유래 다당의 구성당올 측정한 결과， 감잎 조다당을 구성하는 것 중 주류는 rhamnose(Rha) , arabinose(Ara) , galactose(Gal ) , galacturonic acid(GalA)로 구성이 되어있음을 확인하였다 (표 3 참조).

<149> [표 3】

<150> 당 분확물의 구성 당 분석 결과

1

<i5i> 상기 KDO— liked material은 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3— deoxy-D- 1 yxo-2-hep tulosaricacid (DHA)를 지칭하는 것이고， Uronic acid는 Galacturonic acid, Glucuronic acid를 지칭하는 것이다. 중성당을 구성하는 당들 은 전체 중성 다당을 기준으로 성분의 함량을 표시한 것이다.

<152>

<153> <실시예 5>

<154> 감¾ 유래 당분획물의 항보체 활성 측정

<155>

<156> 인체의 초기 감염 방어에 있어 증요한 역할을 담당하고 있는 보체계에 대하 여 감잎 유래 다당의 활성화 여부를 측정하기 위해 실시예 2와 동일한 방법으로 항 보체 활성을 측정하였다.

<157>

<158> 양성대조군으로는 운지버섯 (Coriolus versicolor) 유래 면역 활성 다당체인

PSK (polysaccharideK) l,000ug/ml를 사용하였으며 음성대조군으로써 시료를 첨가 하지 않은 증류수를 이용하였으며 음성대조군에서의 활성화 정도를 ITCH₅₀ 0 로 하 여 각 시료의 활성화능을 확인하였다. „

^' 丄 y

<159>

<i60> 측정 결과，_. 단순 열수 추출 조다당 PLW-0 보다 pectinase처리하여 얻은 조다 당 PLE— 0 분획물은 저농도에서도 높은 항보체 활성을 보았으며 양성대조군인 시판 면역활성다당인 PSK와 유사정도의 활성을 농도 의존적으로 나타내는 것을 확인하였 다. 또한 PLE— 0를 추가 정제한 PLE-I와 경우， PLE-0보다 더 우수한 활성 경향을 보 이는 것을 확인하였다 (도 3 참조).

<161>

<162> <실시예 6>

<i63> PLE-I의 대식세포사이토킨 생성 촉진능

<164>

<165> C57BL/6 (암컷， 6 weeks) mouse의 복강에 5% thioglycol late medium 2 mL 주 입하여 72시간 동안 유도된 macrophage를 회수하여 96 well culture plate에 2.25 10⁵ cells/mL으로 조제된 macrophage 100 uL를 가한 후 여러 농도의 시료를 lOOul 첨가하고 37 ^°C, 5% C0₂배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 1,500 rpm, 4^°C 에서 5분간 원심분리하여 세포배양액 150 uL를 회수하고 상등액 중에 유도된 cytokine의 함량을 측정하였다. 양성대조군 LPS는 2 ug/mL 의 농도로 처리하였다. <166> . Macrophage (대식세포)에 의해 생성된 사이토킨 (cytokine)의 함량은 sandwich

EL ISA (enzyme i隱 unosor bent assay)에 의해 분석하였다. 각 사이토킨의 항체는 coating buffer에 회석하여 f lat96microplate에 coating한 후 4에서 12시간 방치하 였다. Coating이 완료된 microplate는 washing buffer (PBS with 0.05% tween 20， PBST)를 이용하여 3차례 세척하고， assay diluent (PBS with 10% FBS or 2% skim milk) 200 mL를 가하여 1 시간 동안 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. blocking 완료 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 재차 3회 세척하고， 각 well에 연속 희석한 표준물질 (recombinant mouse cytokine)과 면역세 포배양액을 각각 50 mL씩 분주하였 . 이를 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 washing buffer로 세척하고 detect ion antibody (in assay diluent) 100 mL를 처리 하여 실온에서 1시간 방치한 후 재차 세척하였다. Enzyme reagent (avidinperoxidase conjugate) 100 mL를 처리하여 실온에서 30분간 결합시킨 후 substrate solution [tetramethyl benzidine (TMB) and hydrogen peroxide] 100 mL 를 가하여 암소에서 30분간 반웅시킨 후 50 mL의 stop solution [(1 M H₃P0₄ or 2 N

¾S0₄)]을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다 (Saike I et al .， Vaccine 6： 238-244, 1988 참조).

감잎 유래 다당 시료의 직접적인 자극에 의한 대식세포의 cytokine 생산을 측정한 결과는 [도 4]에 기재하였다. [도 4]에서 PLE-I은 IL-6, IL— 12의 분비능을 농도의존적으로 촉진함을 확인할 수 있다. PLE-I은 PLW, PLE-0 보다 사이토킨 분비 촉진능이 우수하다.

<169> <실시_.예 7>

<170> 정상마우스의 비장 면역세포 증식 효과

<171>

<172> <7-1>실험 동물 준비

<173> 본 연구에 사용된 실험동물은 7~8주령된 수컷 SPF KM마우스를 (연변대학 실 험동물센터로부터) 분양 받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 5일 정도 실 험동물실의 IVC시설에서 순화시킨 후 무작위로 매개 실험군에 10마리씩 나누었다. 마우스 사양조건은 온도 22±2^°C, 습도는 40~60%로 유지하였고， 명암 주기 (Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 다당시료는 100 mg/kg, 200 mg/kg의 2개 투여량으로 나누어 경구투여하였다. 대조군은 다당시료 수용액 대신 증류수를 경구투여하였다. 경구투여 방법은 위내에 직접 투여하였고, 기간은 15일 이다.

<174>

<i75> <7-2> Spleen index(SI) 및 Thymus index(TI) 측정

<176> 경추 탈골법으로 회생시킨 마우스로부터 비장올 무균적으로 적출하여， 비장 및 흉선의 무게를 측정하였고， 이로부터 Spleen index(SI) 및 Thymus index(TI)를

/^.n흉^)두 7¾|xlCH)

구하였다. 구하는 공식은 V ^~마÷스들두 71ᅳ— 이다ᅳ si와 TI 값을 [도 5]에 표 시하였다. 대조군에 비해서， PLE-I을 투여한 실험군의 상기 두 지수 값이 높다는 것을 확인할 수 있다.

<177>

<178> <7-3>면역세포 증식능 측정

<179> 다당시료들을 15일간 투여한 후 마우스 비장세포 분리는 Mishell의 방법에 의해 시행되였다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출 하여 RPMI 1640 배양액으로 씻은 후 멸균 유리봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리 시켰다. ^'분리된 세포현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시켜 배양액 으로 2번 세척하고， 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이것을 Tris—buf fered a誦 onium chlor ide(NH₄Cl ,pH7.2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제 거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는：다시 RPMI medium 1640 용액에 분산시켜ᅳ trypan blue solution으로 염색한 후, hetnocytometer를 이용하여 그 세포수를 측정 한다. 세포농도 3.0xi0⁶cell/mL로 분산시킨 후 96-well plate에 90 uL 씩 분주한 후 세포 증식능 측정에 사용하였다.

ConA와 LPS는 최종농도로 5 ug/mL(ConA)와 10 ug/mL(LPS)을 첨가하여 72 시 간, 비장세포 증식능은 배양액 10% FBS-RPMI 1640을 넣은 대조군의 흡광도와 비교 하여 표현하였다.

결과는 [도 6]에 표시하였다. PLE-I은 음성대조군보다 T 세포 및 B 세포 증 식능이 높은 편이었고， 특히 T 세포의 경우， 200mg/kg 양으로 투여한 실험군은 대 조군에 비해유의적인 증가경향을 나타내었다 (ONE WAY-AN0VA, ρθ.10).

<실시예 8>

면역억제 동물모델에서 면역력 증강 기능 평가 <8-1>실험 동물 준비

실험동물과 다당시료 투여방법， 투여량은 정상 마우스 면역기능 평가 방법과 같다 . _.Contr 군은 매일 1회씩 증류수를 경구투여하였고 면역억제 모델군은 Cychlophosphamide(Cy) 100 mg/kg을 매일 1회씩 3일간 복강주사하여 면역력을 억제 한 후， 증류수를 14일간 경구투여하였고， 기타 실험군은 Cy 100mg/kg을 매일 1회씩 3일간 복강주사한 후， 다당시료들을 100mg/kg과 200mg/kg 두개 투여량으로 매일 1 회씩 14일간 경구투여하였다.

마지막 투여가 끝난 다음 24 h후, 체중을 측정하고， 마우스의 혈액을 채집한 다음 마우스를 회생하여 비장과 흉선을 적출하여 그들의 중량을 축정한 다음 비장 세포 (T 세포 및 B 세포)의 증식능， NK세포 활성 등을 측정하였다. 실험결과는 SPSS 17.0을 이용하여 실험군당 Mean士 SD로 표시하였고， 실험군간 통계적인 유의성 은 ONE WAY-AN0VA로 검정하였다.

<8-2> NK cell 활성 측정

NK cell 활성 측정 방법은 NK세포가 암세포의 일종인 YAC-1세포 (NK- sensitive cell line)를 공격하여 파괴된 YAC— 1 세포로부터 유리된 LDH를 측정하는 방법 (modified lactate dehydrogenase(LDH) release assay)이용하였다 (KonjeviG. et al.ᅳ J I画 unol Methods; 200(1-2)： 199-201， 1997 참조). <191> 96-ho 1 e well U-bottom culture plate(Corning Glass Works , Corning, USA) 에 lxioVlOOul가 되도톡 YAC-1세포수를 조정하고 분리된 비장세포와 같이 배양했 는데， 비장세포수는 effector-to-target 세포 비가 50:1이 되도록 세포수를 조정하 였다ᅳ 이후 5% C0₂가 포함된 습도 90¾>， 37^°C의 공기에서 4시간 동안 반응이 되도록 세포배양기에 두었다가 원심 분리하여 LDH가 유리된 상층액 100 uL만을 채취하여 flat -bottom microplates (Nunc, RosRi lde, ' Denmark)에 다시 옮겼다. LDH release assay는 EL ISA (microt iter plate reader, Roche , Mannheim, Germany)를 이용하였 는데 우선 시약 (LDH. substrate mixture)을 100 uL 첨가하고 빛을 차단한 상태의 실온 (15-25^°C)에서 30분간 반웅시킨 후， stop solution인 IN HC1 50 ul로 반웅을 증지시켜 492nm의 흡광도에서 측정하였다. Spontaneous LDH 측정을 위한 well에는 배양액 만을 첨가하고 YAC-1 세포로부터 유리된 LDH의 최대치를 알기 위한 maximum LDH well에는 triton X-100 용액을 첨가하여 세포가 완전히 용해되도록 (total lysis) 배양하였다. 독성의 백분율 of cytotoxicity)은 각각의 배양액으로부터 유리된 LDH로 다음과 같은 공식을 이용했다.

<193> 측정 결과는 [도 기에 기재하였다. PLE-1 투여군과 면역억제 동물 대조군을 비교해봤을 때， PLE-I 투여군이 유의적인 수준 (ρθ.01)에서 정상 대조군과 비슷한 수준으로 회복시켜주는 것을 확인할 수 있다.

<194>

<195> <8-3> T cell & B cell 증식능측정

<196> 비장세포 증식능 측정방법은 정상 마무스 모델에서와 동일한 방법 (실시예

7-3 참조)을 활용하였다.

<197> 결과는 [도 8]에 표시하였다. Cychlophosphamide 투여한 면역력 억제 대조군 과 비교해봤을 때 , PLE-I이 가장우수하게 T 세포 및 B 세포를 증식시켰다.

<198>

[산업상 이용가능성】

<199> 이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 전체 감잎 다당 분획물 대비 중성 다당

(neutral sugar)은 70 내지 90 중량 %, 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 중량 % 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물， 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공 하다. - .^. 본 발명의 다당 분획물은 보체계의 활성을 증강시키고 , :정상 마우스 _.및 면역 억제 마우스 모두에서 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나 경쟁력 있는 면 역 증강용.식품용 조성물 및 면역 증강용 의.약품 제조에 이용할 수 있어 산업상 이 용가능성이 높다. ^.

Claims

【청구의 범 위】

[청구항 1】

전체 감잎 다당 분획물 대비 중성 다당 (neutral sugar)은 70 내지 90 중량 %， 우론산 (uronic acid)은 10 내지 30 중량 % 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물 .

【청구항 ²】

제 1항에 있어서， 상기 우론산은 갈락투로닉산 (gal acturonic acid) 및 글루쿠 로닉산 (glucuronic ac id)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물 .

[청구항 3】

제 1항에 있어서 , 상기 다당 분획물의 중성 다당은 람노오스， 퓨코오스， 아라 비노오스， 자일로스， 만노오스 , 갈락토오스 및 글루코오스로 구성되는 것을 특징으 로 하는 감잎 유래 다당 분획물 .

【청구항 ⁴】

제 3항에 있어서， 상기 다당 분획물의 중성 다당은 상기 감잎 유래 다당 분획 물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 람노오스는 10 내지 18 mol e%, 퓨코오스는 1 내지 5 mole%, 아라비 노스는 18 내지 28 mole%, 자일로스는 5 내지 15 mole% , 만노 오스는 1 내지 5 mole%, 갈락토오스는 30 내지 40 mole%, 글루코오스는 5 내지 15 mole% 인 다당으로 구성 되는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물 .

【청구항 5】

제 3항에 있어서， 상기 다당 분획물의 중성 다당은 2-메틸퓨코오스， 메틸자 일로스， 아피오스 및 아세릭산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물 .

【청구항 6]

제 1항에 있어서， 상기 다당 분획물은 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처 리 하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물 .

[청구항 7]

제 6항에 있어서, 상가 다당 분획물은 상기 감잎 분말 효소 가수분해물에서 분자량 30 내지 100 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.

[청구항 8】

제 1항에 있어서， 상기 감잎 유래 다당 분획물은 면역 기능 증진활성이 있는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.

【청구항 9】 .

제 1항의 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 식품용 조성물.

【청구항 10】

제 1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기， 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치 료용 약학적 조성물-

【청구항 11】

제 1항의 감잎 유래 다당 분확물와 감기， 알러지 질환 및 만성피로로 이루어 진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료제 제조를 위한 용

[청구항 12】

제 1항의 감잎 유래 다당 분획물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여 하는 것을 특징으로 하는 감기， 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택 되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료 방법 .

【청구항 13】

제 10항에 있어서， 상기 알러지 질환은 아토피， 천식 및 알러지성 비염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

【청구항 14】

감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리하는 제 1항와감잎 유래 다당 분획물 제조방법

【청구항 15】. .

제 14항에 . 있어서 , 상기 제조방법은 상기 감잎 분말 효소 가수분해물에서 분 자량 30 내지 100 kDa의 분획물을 .회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감잎 유래：다당 분획물 제조방법 .