KR20030024111A

KR20030024111A - 감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도 저하용 조성물

Info

Publication number: KR20030024111A
Application number: KR1020010057111A
Authority: KR
Inventors: 복성해; 이상구; 정태숙; 김은애; 문석식; 최명숙; 현병화; 이철호; 최양규
Original assignee: (주)바이오뉴트리젠
Priority date: 2001-09-17
Filing date: 2001-09-17
Publication date: 2003-03-26

Abstract

본 발명은 감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도 저하용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 탁월한 혈중 지질농도 저하, 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제, 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료, 및 간 기능 보호 효과를 나타낸다.

Description

감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도 저하용 조성물{COMPOSITION FOR LOWERING BLOOD LIPID LEVEL COMPRISING A DYOSPYROS KAKI LEAF EXTRACT}

본 발명은 감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도 저하용 조성물에 관한 것이다.

관상동맥성 심혈관 질환은 현재 모든 사망 원인의 30% 이상을 차지하고 있을 정도로 미국, 유럽 등 선진국에서는 심각한 문제로 대두되고 있으며, 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동부족 등의 영향을 받아 심장병이 증가하고 있는 추세에있다. 혈중 콜레스테롤의 양이 높을 경우 혈관벽에 지방과 더불어 대식세포 (macrophage), 포말세포 (foam cell) 등이 생성 침착되고 플라크 (plaque)를 형성하여 혈액순환을 저해하는 동맥경화 증세가 오기 쉬운 것으로 알려져 있다 (Ross R.,Nature362: 801-809, 1993).

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 방법으로 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 방법이 주로 이용되고 있다. 아실 코에이: 콜레스테롤-O-아실트랜스퍼레이즈 (acyl CoA: cholesterol-O-acyltransferase, ACAT)는 인체 조직 속에서 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스터로 전환시켜주는 효소이다. 실험적이나 임상학적인 동맥경화 현상에서 대식세포나 평활근 (smooth muscle) 세포 유래 포말세포들의 형성은 아주 중요한 인자이다. 포말세포들은 ACAT 작용에 의해 형성되고 혈액 속의 저밀도 지단백질 (LDL)에 의해 운반되는 콜레스테롤 에스터를 다량으로 함유하고 있다. 동맥 혈관 벽에 존재하는 포말세포들은 ACAT 활성의 증가와 더불어 발견되는 경우가 많기 때문에, ACAT 저해제는 동맥경화 예방제가 될 가능성이 높다. 또한 간 속의 ACAT 활성을 저해할 경우 혈액 내에 유통되는 LDL-콜레스테롤 수준을 낮출 수 있을 것이다 (Witiak D. T. and D. R. Feller(eds),Anti lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects,Elsevier, p159-195, 1991).

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 다른 방법으로 지단백질 사이에 콜레스테롤 전이를 매개하는 콜레스테롤 에스터 전달 단백질 (cholesterol ester transfer protein, CETP)의 작용을 억제하거나 간에서 콜레스테롤 생합성에 관련하는 효소인 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A (HMG-CoA) 환원효소의 작용을 억제하는 방법이 있다. HMG-CoA 환원효소는 스테롤이나 이소프레노이드계 화합물의 생합성 경로의 중간단계인 메발론산 (mevalonic acid) 합성을 매개하는 효소로, 이 효소의 활성을 감소시킬 경우 콜레스테롤의 생합성 속도를 늦추어 고콜레스테롤 혈증 (hypercholesterolemia) 치료에 효과적으로 이용될 수 있다 (William W. P.,Cardiovascular Pharmacology, Kanu Chatterjee(ed), Wolfe Pullishing, 8.6-8.7, 1994). 현재 사용되고 있는 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제는 페니실리움 속 또는 아스퍼질러스 속에서 유래된 것으로 미국 메르크사가 개발한 로바스타틴 (lovastatin)과 심바스타틴 (simvastatin) 및 일본 산쿄사가 개발한 프라바스타틴 (pravastatin) 등이 있다. 그러나 스타틴 (statin)류는 중추신경계에 부작용을 유발하는 문제점이 있고 (Saheki A. T.et al.,Pharm. Res.,11: 304-311, 1994), 로바스타틴과 심바스타틴은 간의 LDL 수용체의 활성을 증가시킴으로써 혈중 LDL 콜레스테롤을 낮추지만 여러 효소의 양 증가, 크레아틴 키나제 (creatine kinase)의 증가, 횡문근변성 (rhabdomyolysis) 등의 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다 (Farmer J. A.et al.,Baillers-clin. Endocrinol. Metab., 9: 825-847, 1995). 따라서, 저렴하고 부작용이 없는 새로운 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제의 개발이 절실하다.

한편, 간은 지방 성분이 포함된 음식 또는 알콜의 과다 섭취, 및 B형 또는 C형 간염 바이러스의 감염에 의해 그 기능이 저하되고, 이 상태가 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행된다. 특히 음식을 통한 과다한 지방 섭취 또는 과도한 알콜 섭취는 간 조직에 지질이 쌓이는 지방간을 유발하며, 이때 혈청 속의GOT (glutamate-oxaloacetate transaminase), GPT (glutamate-pyruvate transaminase), γGTP (γ-glutamyl transpeptidase) 등이 증가하게 된다 (T. Banciu,et al.,Med. Interne.,20: 69-71, 1982; A. Par,et al.,Acta. Med. Acad. Sci. Hung.,33: 309-319, 1976).

하야시 (Hayashi) 등은 녹차 추출액이 쥐 혈청 내 GOT 및 GPT의 증가를 예방함으로써 쥐의 간 기능을 개선한다고 보고하고 있다 (M. Hayashi,et al.,Nippon Yakuri gaku Zasshi,100: 391-399, 1992).

한편, 감나무 (Dyospyros Kaki, Thunb)는 우리나라 전국에 야생하며, 감잎에는 플라보노이드 배당체, 탄닌, 페놀류, 수지, 카큐민류 화합물, 환원당, 다당, 정유, 유기산, 엽록소 등이 함유되어 있으며, 플라보노이드 배당체에는 아스트라가린, 미리스트린이 있고, 특히 비타민 C가 아주 풍부하여 4 ~ 6월의 어떤 감잎에는 100 g중에 100 ㎎ 정도 함유되어 있다.

감잎은 우리의 전통 민간 요법에 의하면 기관지 보호에 좋은 것으로 전해지고 있고 비타민 C가 많이 함유되어 있으므로 과음 후 손실되기 쉬운 철분 등 미네랄의 흡수를 도와주는 역할을 하므로 숙취에도 좋은 것으로 알려져 있으나, 감잎을 이용하여 혈중 지질 농도를 저하시키려는 시도는 전무하였다.

이에 본 발명자들은 천연물로부터 혈중 지질농도를 저하시킬 수 있는 물질을 얻기 위하여 꾸준히 노력한 결과, 감잎 추출물이 혈중 콜레스테롤 및 중성 지질농도를 크게 낮추며 동맥 내피에 대식세포-지질층이 침착되는 것을 강력히 억제하고, 간 세포의 손상 및 지방간화를 강력히 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 감잎 추출물을 포함하는 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제, 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감잎 추출물을 포함하는 건강 증진용 식품 또는 음료 조성물을 제공하는 것이다.

도 1a내지1c는 각각 대조군, 로바스타틴 (Lovastatin) 투여군 및 감잎 추출물 투여군 토끼의 대동맥 내벽의 지방선을 관찰한 결과이고,

도 2a내지2c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 감잎 추출물 투여군 토끼의 간을 해부하여 관칠한 결과이다.

본 발명은 감잎 (Diospyros kaki의 시엽) 추출물을 활성성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 혈중 지질농도 저하, 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제, 및 간 기능 보호용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 감잎 추출물을 활성성분으로 포함하고 혈중 지질농도 저하, 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제, 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료, 및 간 기능 보호 효과를 나타내는 건강 증진용 식품 및 음료 조성물을 제공한다.

감잎으로부터 활성성분을 추출하는 방법은 하기와 같다.

즉, 감잎을 물로 깨끗이 수세하고 상온의 그늘에서 건조한 후, 감잎 1 ㎏당 1 내지 10 ℓ, 바람직하게는 2 내지 5 ℓ의 70 내지 95% 에탄올 또는 물을 가하고70 내지 120℃에서 30분 내지 12시간 가열하여 활성물질을 추출할 수 있다. 일반적으로 물 또는 에탄올을 이용하여 감잎을 추출할 경우, 반응시간, 반응온도, 알콜농도, 감잎의 성숙도 등에 따라 추출물의 조성이 약간의 차이를 나타내나, 상기 반응 조건 내에서 얻어진 추출물은 약리 효과에 있어서 큰 차이가 없다.

상기와 같이 얻은 감잎 추출물은 탁월한 혈중 콜레스테롤 및 중성지방 농도 저하 효과를 나타내므로, 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료에 유용하다. 본 발명에서 "혈중 지질농도-관련 질환"이란, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화, 지방간 등 고농도의 혈중 지질이 한 원인이 되는 질병들을 말한다.

또한, 본 발명의 감잎 추출물은 지질대사와 관련된 ACAT에 대해 우수한 저해효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명에서는 활성성분으로서 감잎 추출물 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 혈중 지질농도 저하용, 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제용, 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료용, 또는 간 기능 보호용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태일 수 있다.

적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산염, 젤라틴, 칼슐 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥내 또는 근육내를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 감잎 추출물의 통상적인 1일 투여량은 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.5 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 선택된 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 증상의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

감잎 추출물은 또한 혈중 지질농도 저하, 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제, 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료 또는 간 기능 보호 효과를 나타낼 목적으로 식품 또는 음료에 첨가제 또는 식품 보조제로서 혼입될 수 있다. 상기 식품 또는 음료로는, 육류; 야채 쥬스 (예를 들어, 당근 쥬스 및 토마토 쥬스) 및 과일 쥬스 (예를 들어, 오렌지 쥬스, 포도 쥬스, 파인애플 쥬스, 사과 쥬스 및 바나나 쥬스); 초콜렛; 스넥류; 과자류; 피자; 빵, 케익, 크래커, 쿠키, 비스킷, 누들 등과 같이 곡물 분말로 만들어진 식품류; 껌류; 우유, 치즈, 요구르트 및 아이스크림과같은 유제품; 스프; 육즙; 페이스트, 케찹 및 쏘스; 차; 알콜성 음료류; 탄산 음료류; 비타민 복합체; 및 다양한 건강 식품류 등이 있다. 이 경우, 식품 또는 음료 중 감잎 추출물의 함량은 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 범위일 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하는 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되지는 않는다.

또한, 고체 중 고체, 액체 중 액체, 및 액체 중 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며, 모든 반응은 별도의 특별한 표시가 없는 한 실온에서 수행되었다.

<실시예 1> 감잎 추출물의 제조

(1-1) 물 추출물의 제조

감잎 2.7 ㎏을 물로 깨끗이 수세한 후 그늘 상태의 상온에서 건조하여 건조된 감잎 700 g을 얻었다. 여기에 3.5 ℓ의 물을 가하고 100℃에서 1시간 동안 끓인 후 여과하여 추출액 및 고상 잔류물을 얻었다. 고상 잔류물을 동일한 방법으로 1회 더 추출하였다. 수득된 추출액을 합하고 감압농축하여 180 g의 감잎 추출물을 얻었다.

(1-2) 에탄올 추출물의 제조

물로 씻어 건조시킨 감잎 1 ㎏에 4 ℓ의 95% 에탄올을 가하고 80℃에서 1시간 동안 끓인 후 여과하여 추출액 및 고상 잔류물을 얻었다. 고상 잔류물을 동일한 방법으로 1회 더 추출하였다. 이로부터 수득된 추출액을 합하고 감압농축하여 220 g의 감잎 추출물을 얻었다.

<실시예 2> 감잎 추출물의 혈중 지질농도 저하 효과

(단계 1) 랫트에 대한 로바스타틴 및 감잎 추출물의 투여

체중 90 내지 110 g인 4주령의 숫컷 스프라그 다우리 (Sprague-Dawley) 랫트 30마리 [(주)바이오제노믹스]를 난괴법 (randomized block design)에 의해 10마리씩 3개의 그룹으로 나누었다. 세 그룹의 랫트들에게 각각 세 가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉 하기표 1과 같이 1% 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이 (Teklad, Madison, 미국) (대조군); 0.02% 로바스타틴 (중외제약)과 1% 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이 (로바스타틴 투여군); 및 0.2% 감잎 추출물 (실시예 1-1에서 제조)과 1% 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이 (감잎 추출물 투여군)를 각각 섭취시켰다.

식이군성분	대조군	로바스타틴투여군	감잎 추출물투여군
카제인	20	20	20
D,L-메티오닌	0.3	0.3	0.3
옥수수 전분	15	15	15
슈크로즈	49	48.98	48.80
셀룰로즈 분말	5	5	5
미네랄 혼합물^*1	3.5	3.5	3.5
비타민 혼합물^*2	1	1	1
바이타트르산 콜린	0.2	0.2	0.2
옥수수유	5	5	5
콜레스테롤	1	1	1
로바스타틴	-	0.02	-
감잎 추출물	-	-	0.2
총	100	100	100
^1AIN-76 미네랄 혼합물(TEKLAD premier Co., Madison, WI, U.S.A.)^2AIN-76 비타민 혼합물(TEKLAD premier Co., Madison, WI, U.S.A.)

랫트들에게 5주 동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며, 식이 섭취량을 매일 기록하고 5일마다 체중을 측정한 후, 사육일지의 자료를 분석하였다. 모든 랫트는 정상 성장 속도를 보였으며 식이 섭취량과 체중증가에 있어서 2개군 사이에 유의적인 차이는 없었다.

(단계 2) 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량의 측정

로바스타틴 또는 감잎 추출물의 투여가 랫트의 혈장 콜레스테롤 및 중성지질 함량에 미치는 영향을 하기와 같이 조사하였다.

(단계 1)과 같이 사육한 세 식이군의 랫트의 복부하대정맥으로부터 혈액 시료를 채취한 후 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 총 콜레스테롤 농도는 알라인등의 방법 (Allainet al.,Clin. Chem.20: 470-475, 1974)에 기초를 둔 시그마사의 진단 키트 (Cat. No.: C0534, Sigma Chemical Co., 미국)를 사용하여 측정하였다. HDL 분획은 헤파린-망간 침전법 (Waenic R. G. and Albers J. J.,J. Lipid Res.19: 65-76, 1978)을 응용한 시그마사의 키트 (Cat. No.: 352-1)를 이용하여 분리하고, HDL-콜레스테롤의 농도는 시그마사의 키트 (Cat. No.: C9908)로 측정하였다. 트리글리세리드의 농도는 리파아제-글리세롤 포스페이트 옥시데이즈 방법 (McGowan M. W.et al.,Clin. Chem.29: 538-542, 1983)에 기초를 둔 시그마사의 분석 키트 (Cat. No.: 336-10)를 사용하여 측정하였다.

세 식이군에서 혈장 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 트리글리세리드의 농도는 하기표 2에 나타낸 바와 같다. 모든 데이타는 평균±표준편차로 나타내었다.

식이군	대조군	로바스타틴 투여군	감잎 추출물투여군
총 콜레스테롤 (㎎/㎗)	82.1 ±1.8	77.4 ±1.8	63.2 ±3.4
HDL-콜레스테롤 (㎎/㎗)	22.4 ±0.7	23.4 ±0.4	27.8 ±0.9
HDL-콜레스테롤/총 콜레스테롤 (%)	27.3 ±0.8	30.2 ±0.5	44.0 ±1.4
트리글리세리드 (㎎/㎗)	55.5 ±2.1	69.0 ±4.7	32.3 ±1.6
동맥경화 지수^*(AI)	2.7 ±0.2	2.3 ±0.2	1.8 ±0.4
*동맥경화 지수(AI)=(총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤)/HDL 콜레스테롤

상기표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 감잎 추출물의 투여로 인해 대조군에 비해 혈중 총 콜레스테롤이 23%, 트리글리세리드가 42% 감소한 반면, 로바스타틴 투여는 총 콜레스테롤을 6%, 트리글리세리드는 오히려 25% 증가시켰으므로, 본 발명의 감잎 추출물은 현재 고지혈증의 치료에 이용되고 있는 로바스타틴에 비해 혈중 중성지방 농도를 감소시키는 효과가 우수함을 알 수 있다. 따라서, 감잎 추출물은 중성지방에 의한 고지혈증의 예방 및 치료에 매우 유용할 뿐만 아니라 혈중 지질농도 증가로 인해 야기되는 각종 질병의 예방 및 치료에도 매우 유용할 것으로 예상된다.

<실시예 3> 감잎 추출물의 동맥경화 억제 효과

(단계 1) 토끼에 대한 감잎 추출물의 투여

체중 2.0∼2.3 ㎏의 건강한 수컷 뉴질랜드 백색종 (New Zealand White) 토끼를 연암 원예축산대학으로부터 분양받아 온도 20±2℃, 습도 55±10 % 및 12시간 명/암 주기로 조절되는 사육환경 하에서 실험에 사용하였다. 실험군은 수분 (7.6%), 조단백질 (22.8%), 조지방 (2.8%), 조회분 (8.8%), 조섬유 (14.4%) 및 가용성 무질소물 (43.7%) 등으로 구성된 토끼용 고형사료 (RC4 diet, Oriental Yeast Co., Japan)에 1% 콜레스테롤이 첨가된 사료만을 섭취시키는 대조군과 로바스타틴 (lovastatin) 또는 감잎 추출물을 일정비율로 혼합하여 투여하는 두 개의 실험군을 포함하여 총 3개 군으로 나누었으며, 8주 동안 사료와 물은 충분히 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 각 실험군의 사료조성과 실험내용은표 3에 나타내었다.

토끼 실험군

실험군	토끼수	투여기간	투여 식이
대조군	6마리	8주	1% 콜레스테롤 식이
로바스타틴 투여군	6마리	8주	1% 콜레스테롤 + 로바스타틴 (1 ㎎/㎏) 식이
감잎 추출물 투여군	10마리	8주	1% 콜레스테롤 + 감잎 추출물 (0.5 중량%) 식이

(단계 2) 대동맥내 지방선 분석

(단계 1)에서 사육된 토끼를 희생시키고 흉부를 절개하였다. 대동맥궁을 따라 하방으로 횡경막 부위까지 절취한 후, 대동맥 주변의 지방을 잘 제거하고 중앙부위를 종축 방향을 따라 절개한 다음 두 번째 늑간동맥 기시부에서 7번째 늑간동맥 기시부까지를 잘라내어 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 고정하였다. 이어서 동맥내벽의 지방선 (fatty streak) 염색을 위하여 절취한 대동맥을 디쉬 위에 핀으로 고정한 다음 에스퍼 등의 방법 (Esper E.et al.,J. Lab Clin Med.121: 103-110, 1993)에 따라 프로필렌 글리콜로 각각 2분씩 3회 수세하고 프로필렌 글리콜에 용해시킨 오일 레드 오 (ORO) 포화용액으로 옮겨 30분간 염색한 다음, 85% 프로필렌 글리콜로 각각 3분씩 2회 수세하여 여분의 염색액을 제거하였다. 이어서 생리식염수로 1회 세척하고 사진촬영을 한 다음 사진을 얻어 염색된 부위를 투사 (tracing)하고 화상분석기 (LEICA, Q-600, Germany)로 단위 대동맥 면적에 대한 염색부위 (지방선 부위)의 비율 (%)을 계산하였으며, 컴퓨터 통계프로그램 (Microsoft excel, version 7.0)을 이용하여 각 실험군간의 유의성 차이를 분석·검정 (studentt-test)하였고, 토끼 동맥내 지방선 분석 결과 (%)를 하기표 4에 나타내었다. 이때, 측정값은 평균±표준편차로 나타내었다.

대조군 (n = 6)	로바스타틴 투여군 (n = 6)	감잎 추출물 투여군 (n = 10)
50.0 ±12.4	18.2 ±10.4*	10.0 ±5.4*
*: 대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 차이 (T-test,p< 0.01)를 보였음.

그 결과, 대조군과 비교하여 로바스타틴과 감잎 추출물을 투여한 2개의 실험군에서 지방선 부위의 비율이 모두 유의성 있게 감소된 양상을 나타내었으며, 감잎 추출물을 투여한 군이 로바스타틴을 투여한 군보다 더욱 효과적으로 지방선을 억제하는 것으로 나타났다.

도 1a,1b및1c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 감잎 추출물 투여군 토끼의 동맥 내피 사진이다 (×100).도 1a에서 보듯이, 대조군은 동맥내피 표면에 많은 대식세포-지질복합체 형성에 의해 죽상경화반이 침착되어 있는데 반하여,도 1b와1c에서 보듯이, 로바스타틴 투여군과 감잎 추출물 투여군은 동맥내피의 표면이 깨끗하며 여기에 대식세포-지질 복합체가 형성되지 못하고 있다. 따라서, 본 발명의 감잎 추출물은 동맥경화 예방 효과가 강력하다는 것을 알 수 있다.

(단계 3) 조직학적 관찰

토끼의 각 장기와 조직에 대한 영향을 조사하기 위하여, 동물부검시 대동맥, 심장, 폐, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여 특이소견의 유무를 육안으로 확인하였다. 그 후, 각 장기를 10% 중성 포르말린에 넣어 24시간 이상 고정시킨 후, 흐르는 물로 충분히 수세하고 70, 80, 90 및 100% 에탄올을 이용하여 단계적으로 탈수시킨 다음 파라핀 투과과정을 거쳐 포매기 (SHANDON, Histocentre 2, USA)로 포매하였다. 포매된 조직은 박절편기 (LEICA, RM2045, Germany)로 약 4 ㎛의 두께로 조직절편을 제작하여 H & E (Hematoxylin & eosin) 염색을 하고 자일렌 (xylene)으로 투명화 과정을 거쳐 퍼마운트 (permount)로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 각 장기의 조직에서 특별한 병변 육안 소견이 발견되지 않았다.

<실시예 4> 감잎 추출물의 간 보호 효과

고콜레스테롤 식이와 각 시험물질들의 투여가 간조직에 미치는 영향을 정량적으로 알아보기 위하여 포그트 등의 방법 (Fogt F. and Nanji A. A.,Toxicology and Applied Pharmacology136: 87-93, 1996)과 키간 등의 방법 (Keegan A.et al.,Journal of Hepatology23: 591-600, 1995)을 참고하여, 실시예 3의 (단계 3)에서 제조된 각 실험군의 간 조직 표본을 현미경으로 관찰한 후, 간 중심정맥을 기준으로 간 소엽 내 비정상 지방함유세포의 분포비율 정도에 따라 1+ (0∼25%), 2+ (26∼50%), 3+ (51∼75%) 및 4+ (75∼100%)로 분류하고 점수를 산정하였으며, 컴퓨터 통계프로그램 (Microsoft excel, version 7.0)을 이용하여 각 실험군간의 유의성 차이를 분석·검정 (studentt-test)하였고 그 결과를 하기표 5에 나타내었다. 이때, 측정값은 평균±표준편차로 나타내었다.

대조군 (n = 6)	로바스타틴 투여군 (n = 6)	감잎 추출물 투여군 (n = 10)
3.78±0.13	3.97±0.15	3.38±0.47

그 결과, 지방변성 세포의 분포비율은 감잎 추출물을 투여한 실험군에서 유의하게 (p< 0.05) 감소하였다.

또한, 실시예 3의 (단계 3)에 의해 준비된 간 조직 표본을 동일한 방법으로 H & E로 염색하여 조직학적 관찰을 수행하였다.도 2a,2b및2c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 감잎 추출물 투여군 토끼의 간 해부 사진이다 (×100).도 2a및2b에서 보듯이, 대조군 토끼의 간에는 중심 정맥 주변부에 지방질이 과도하게 함유된 세포들이 존재하고, 로바스타틴 투여군 토끼의 간에도 중심 정맥 주변부와 주변의 모든 세포가 지방간 세포를 형성하고 있다. 이에 반하여,도 2c에서 보듯이, 감잎 추출물 투여군 토끼의 간에는 거의 모든 간세포가 정상적이다. 따라서, 본 발명의 감잎 추출물은 지방간 형성을 강력히 저해함을 알 수 있다.

<실시예 5> 토끼에서 감잎 추출물의 ACAT 활성 저해 효과

(단계 1) 마이크로좀의 제조

토끼에서 감잎 추출물의 ACAT 효소 활성 저해 효과를 확인하기 위해, 간 조직으로부터 효소원으로서 마이크로좀을 분리하였다. 먼저, 실시예 3의 (단계 1)에서와 같은 방법으로 사육한 토끼들을 참수하여 희생시킨 후 간을 적출하였다. 1 g의 간을 5 ㎖의 균질화 용액 (0.1 M KH₂PO₄, pH 7.4, 0.1 mM EDTA 및 10 mM β-머캅토에탄올)에 균질화하였다. 이 균질액을 4℃에서 3,000 ×g로 10분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 4℃에서 15,000 ×g로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액을 초원심분리 튜브 (Beckman)에 넣고, 4℃에서 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리하여 마이크로좀 펠렛을 얻은 후, 이를 3 ㎖의 균질화 용액에 현탁시키고 4℃에서 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 1 ㎖의 균질화 용액에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액 중의 단백질 농도를 로우리 (Lowry) 등의 방법으로 측정하고, 단백질 농도를 4 내지 8 ㎎/㎖로 조절하였다. 얻어진 현탁액을 딥 프리저 (Biofreezer, Forma Scientific Inc.)에 보관하였다.

(단계 2) ACAT 활성 측정

아세톤에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 ㎕를 아세톤 중의 10% 트리톤 WR-1339 (Sigma Co.) 6 ㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 얻어진 혼합물에 증류수를 가하여 콜레스테롤의 농도가 30 ㎎/㎖가 되도록 조절하였다.

10 ㎕의 생성된 콜레스테롤 수용액에 10 ㎕의 1 M KH₂PO₄(pH 7.4), 5 ㎕의 0.6 mM 우 혈청 알부민 (BSA), 10 ㎕의 (단계 1)에서 얻은 마이크로좀 용액 및 55 ㎕의 증류수를 가하였다 (총 90 ㎕). 혼합물을 37℃ 수욕에서 30분 동안 예비 반응시켰다.

10 ㎕의 (1-¹⁴C)올레일-CoA 용액 (0.05 μCi, 최종 농도: 10 μM)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 수욕에서 30분 동안 반응시켰다. 혼합물에 500 ㎕의 이소프로판올:헵탄 혼합물 (4:1 v/v), 300 ㎕의 헵탄 및 200 ㎕의 0.1 M KH₂PO₄(pH 7.4)을 가하고, 혼합물을 볼텍스 (vortex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분 동안 방치하였다.

200 ㎕의 생성된 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액 (Lumac) 4 ㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량을 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기 (1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy, Finland)로 측정하였다. ACAT 활성은 1분 동안 단백질 1 ㎎당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰 (pmol/분/㎎ 단백질)로 계산하였으며, 각 데이타는 평균±표준편차로 나타내었고 그 결과를 하기표 6에 나타내었다.

시험군	ACAT 활성도(pmol/분/㎎ 단백질)	ACAT 활성저해도 (%)
감잎 추출물 투여군	102.8 ± 32.7	18.7
로바스타틴 투여군	96.2 ± 21.3	23.8
대조군	126.5 ± 10.0	0

표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 감잎 추출물 투여군은 대조군에 비해 ACAT 활성을 18.7% 억제하였다.

<실시예 6> 감잎 추출물의 독성시험

감잎 추출물의 경구독성시험을 하기와 같이 실시하였다.

4 주령의 특정 병원체 부재 (specific pathogens free) ICR 마우스로서 암컷 12마리와 숫컷 12마리 (암수 각각 3마리/용량군)를 온도 22±3℃, 습도 55±10%, 조명 12L/12D의 동물실 내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료 [(주)제일제당, 마우스 및 랫트용] 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유롭게 섭취시켰다.

감잎 추출물을 0.5% 트윈 80을 용매로 하여 100 ㎎/㎖ 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g당 0.2 ㎖(1 g/㎏), 0.4 ㎖(2 g/㎏) 또는 0.8 ㎖(4 g/㎏)씩 경구 투여하였다. 시료는 1 g/㎏ 및 2 g/㎏ 용량군은 1회 경구 투여하였고, 4 g/㎏ 용량군은 2회 경구 투여하였으며, 투여 후 7일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여 당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에 그리고 투여 익일부터 7일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 투여 7일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 투여 당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 감잎 추출물에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.

그 결과, 급성 경구독성의 경우에는 감잎 추출물은 1 g/㎏, 2 g/㎏, 4 g/㎏의 용량에서 7일 동안 치사동물이 관찰되지 않았다. 7일 후 생존동물에 대한 부검을 실시한 바, 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 7일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다.

결론적으로 감잎 추출물은 상기의 농도로 경구 투여시 LD₅₀값은 암수 마우스에서 4 g/㎏ 체중 이상에 존재하는 것으로 추정되었다.

<제제예 1>: 약학적 제제의 제조

다음의 성분들을 혼합하여 경질 젤라틴 캅셀에 충진함으로써 캅셀제를 제조하였다:

양 (㎎/캅셀)

활성 성분 (실시예 1-1의 감잎 추출물) 20

건조 전분 160

마그네슘 스테아레이트 20

총 200 ㎎

<제제예 2> 감잎 추출물을 포함하는 식품

본 발명의 감잎 추출물을 포함하는 식품들을 하기와 같이 제조하였다.

(1) 토마토 케찹 및 소스의 제조

감잎 추출물을 토마토 케찹 또는 소스에 0.2 중량%의 양으로 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 수득하였다.

(2) 밀가루 식품의 제조

감잎 추출물을 밀가루에 0.5 중량%의 양으로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케익, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 수득하였다.

(3) 스프 및 육즙 (gravies)의 제조

감잎 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%의 양으로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 수득하였다.

(4) 그라운드 비프 (ground beef)의 제조

감잎 추출물을 그라운드 비프에 10 중량%의 양으로 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 수득하였다.

(5) 유제품 (dairy products)의 제조

감잎 추출물을 우유에 5 중량%의 양으로 첨가하고 이 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

그러나, 감잎 추출물을 치즈 제조시에는 응고된 우유 단백질에 첨가하고, 요구르트 제조시에는 발효 후에 수득된 응고된 우유 단백질에 첨가하였다.

<제제예 3> 감잎 추출물을 포함하는 음료

(1) 야채쥬스의 제조

감잎 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 수득하였다.

(2) 과일쥬스의 제조

감잎 추출물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 수득하였다.

본 발명의 감잎 추출물을 포함하는 조성물은 독성이 거의 없으면서도 탁월한 혈중 지질농도 저하, 콜레스테롤 대사-관련 효소 억제, 동맥 내 지방선 축적 억제, 및 간 보호 효과를 나타내므로 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

활성성분으로서 감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도 저하용 약학 조성물.
제 1항에 있어서,

활성성분으로서 감잎 추출물을 포함하는 혈중 지질농도-관련 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 2항에 있어서,

혈중 지질농도-관련 질환이 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
활성성분으로서 감잎 추출물을 포함하는 간기능 보호용 약학 조성물.
활성성분으로서 감잎 추출물을 포함하는 아실 CoA-콜레스테롤-O-아실트랜스퍼레이즈 (ACAT) 활성 저해용 약학 조성물.
제 1항, 제 4항 또는 제 5항에 있어서,

감잎 추출물은 감잎을 물 또는 에탄올로 추출하여 제조된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 6항에 있어서,

감잎 추출물은 감잎 1 ㎏당 1 내지 10 ℓ의 70 내지 95% 에탄올 또는 물을 가하고 70 내지 120℃에서 30분 내지 12시간 가열하여 활성물질을 추출하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
활성성분으로서 감잎 추출물을 포함하는 건강 증진용 식품 조성물.
제 8항에 있어서,

혈중 지질농도-관련 질환을 예방함으로써 건강 증진 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 9항에 있어서,

혈중 지질농도-관련 질환이 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 8항에 있어서,

간기능 보호 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 8항에 있어서,

아실 CoA-콜레스테롤-O-아실트랜스퍼레이즈 (ACAT) 활성 저해 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 8항에 있어서,

음료의 형태인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 8항에 있어서,

감잎 추출물은 감잎을 물 또는 에탄올로 추출하여 제조된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 14항에 있어서,

감잎 추출물은 감잎 1 ㎏당 1 내지 10 ℓ의 70 내지 95% 에탄올 또는 물을 가하고 70 내지 120℃에서 30분 내지 12시간 가열하여 활성물질을 추출하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.