KR20030082219A - 플라바논 에스테르 유도체 및 이를 포함하는 혈중 지질농도 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

플라바논 에스테르 유도체 및 이를 포함하는 혈중 지질농도 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 플라바논 에스테르 유도체 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물들은 독성이 거의 없으면서 탁월한 혈중 지질 농도 저하 효과, 콜레스테롤 대사 관련 효소 억제 효과, 동맥경화 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
상기 식에서,
R1은 R5CO- 그룹이고;
R2는 H 또는 R5CO- 그룹이고;
R3는 H, CH3, R5CO- 또는 R6그룹이고;
R4는 H, OH, R5COO- 또는 OR6그룹이고;
R5는 C1-C18알킬 그룹이고;
R6는 C2-C18알킬 또는 알케닐 그룹이다.

Description

플라바논 에스테르 유도체 및 이를 포함하는 혈중 지질 농도 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물{FLAVANONE ESTER DERIVATIVES AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING BLOOD LIPID LEVEL-RELATED DISEASES COMPRISING SAME}
최근에 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증 등과 같은 관상동맥성 심혈관 질환이 점차 주요한 사망 원인이 되고 있다. 혈중 콜레스테롤 농도가 높아지면 관상동맥성 심혈관 질환이 유발되기 쉬우므로, 혈중 콜레스테롤 농도를 줄이기 위해서는 콜레스테롤 및 지방의 섭취를 줄이는 식이요법을 실시하거나 지질대사와 관련된 효소를 저해함으로써 콜레스테롤의 흡수를 억제해야 한다.
아실 CoA-콜레스테롤-O-아실트랜스퍼라즈(acyl:CoA-cholesterol acyltransferase, ACAT)는 혈중 콜레스테롤의 에스테르화를 촉진시켜서 콜레스테롤 흡수에 관여하므로 ACAT의 저해제를 이용하여 동맥경화를 예방할 수 있다. 또한 간 속의 ACAT 활성을 저해할 경우 혈액속에 유통되는 LDL-콜레스테롤 수준을 낮출 수 있을 것이다(Witiak D.T. 및 D.R. Feller(eds),Anti lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects, Elsevier, 159-195, 1991).
혈중 콜레스테롤의 양을 줄이기 위한 방법으로 ACAT 활성을 저해하는 약물을 개발하기 위해 수많은 연구가 이루어졌다. 그 결과, 아스퍼질러스 푸미가투스 배양액으로부터 분리된 피리피로펜(S. Omura 등,J. Antibiotics,46, 1168-1169, 1993) 및 슈도모나스 종으로부터 분리된 아카테린 등과 같이 다양한 미생물을 배양하여 혈중 콜레스테롤 저하용 화합물들을 분리할 수 있다고 보고하였다(S. Nagamura 등,J. Antibiotics,45, 1216-1221, 1992).
고콜레스테롤혈증은 스테롤 또는 이소프레노이드계 화합물의 생합성 경로의 중간산물인 메발론산의 생합성을 매개하는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 CoA 환원효소(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase; HMG-CoA 환원효소)를 저해하여 콜레스테롤 생합성 속도를 줄임으로써 효과적으로 치료될 수 있는 것으로 보고되어 있다(William W. 등(ed),Cardiovascular Pharmacology, Wolf Publishing, 8.6-8.7, 1994).
따라서, HMG-CoA 환원효소를 저해하는 고콜레스테롤혈증 치료용 약물을 개발하기 위해 페니실리움 속 및 아스퍼질러스 속 미생물에 의해 합성되는 화합물을 분리 정제하였으며 미국 머크사에서는 로바스타틴 및 심바스타틴을, 일본 산교사에서는 프라바스타틴을 상업화하였다(C.D.R. Dunn,Stroke: Trends, Treatment and Markets, SCRIPT Report, PJB Publications Ltd., 1995). 그러나 이 같은 약물들은 매우 비싸거나, 장기간 투여시 간의 LDL 수용체의 활성을 증가시킴으로써 혈중 LDL 콜레스테롤을 낮추지만 여러 효소의 양 증가, 크레아틴 키나제(creatine kinase)의 증가, 횡문근변성(rhabdomyolysis) 등의 부작용이 있는 것으로 보고되고있다(Farmer, J.A. 등,Baillers-clin. Endocrinol. Metab.,9, 825-847, 1995). 따라서, 경제적이고 독성이 없는 HMG-CoA 환원효소 저해제의 개발이 계속해서 요구되고 있다.
혈중 콜레스테롤 증가로 인한 동맥경화는 노화와 더불어 주요 질환중의 하나로서 임상 및 기초분야에서 가장 활발히 연구되고 있다. 지금까지 동맥경화증의 발병에 대한 메카니즘으로 여러 가지 가설이 있으며, 그 중에서 대표적인 것으로는 "변형된 저밀도 지단백질(modified low density lipoprotein; M-LDL)"이 있다(Steinberg, D. 등,N. Engl. J. Med., 320, 915-92, 1989).
콜레스테롤은 HMG-CoA 환원효소에 의해서 합성되기도 하고 음식물로부터 유입된 콜레스테롤에 의해 합성이 억제되어 항상성을 유지한다. LDL은 콜레스테롤 에스테르 형태의 콜레스테롤 운반체로서 중간밀도 지단백질(IDL)을 지나 초저밀도 지단백질(VLDL)로부터 생성된다. 모세관 내피 세포들 사이의 접합점을 통과해서 아포(apo) B-100 단백질을 인식하는 세포막의 LDL 수용체에 결합한다. LDL 수용체와 결합한 LDL은 세포내로 유입된 후에 리소좀 분해(lysosomal degradation) 과정을 거처서 유리 콜레스테롤이 형성되고, 유리 콜레스테롤은 ACAT의 자극을 받아 콜레스테릴 에스테르로 에스테르화되어 수용체로서 작용한다. 또한, 세포내 콜레스테롤이 증가하면 LDL 수용체는 감소하는 방향으로 조절된다. 정상적인 LDL은 세포내에서 콜레스테롤 합성을 조절하는 역할을 하지만 산화 변형된 Ox-LDL은 세포독성을 나타내고, 내피의 기능이상을 촉진하고, 지방선(fatty streak)를 형성하여 영역을 더 넓혀가고, 동맥벽의 다른 유전자의 발현에 영향을 미쳐서 동맥경화를 발병시키거나 동맥경화를 더욱 악화시키기도 한다.
한편, 플라바논 모핵을 갖는 나린제닌 및 헤스페레틴은 오렌지, 귤 등의 감귤류에 존재하는 천연물 나린진 및 헤스페리딘에서 배당체를 제거하여 얻어진 물질로서 본 발명자들에 의해 고지혈증 억제 및 동맥경화 억제 작용이 있음이 보고된 바 있다(Bok 등, 미국 특허 제 5,877,208 호(1999. 3. 2) 및 미국 특허 제 5,763,414 호(1998. 6. 9)).
본 발명자들은 플라바논 에스테르 모핵을 가지는 플라바논 에스테르 유도체를 합성하고, 이 화합물이 독성이 거의 없으면서 지질 대사 개선 효능이 탁월하여 혈중 지질 농도 저하 효과 및 동맥경화 억제 효과가 뛰어나다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 지질 대사 개선 효능이 탁월한 플라바논 에스테르 유도체들을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 플라바논 에스테르 유도체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 플라바논 에스테르 유도체를 포함하는, 혈중 지질 농도 저하, 콜레스테롤 대사 관련 효소 억제, 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 하기 화학식 1의 플라바논 에스테르 유도체를 제공한다:
화학식 1
상기 식에서,
R1은 R5CO- 그룹이고;
R2는 H 또는 R5CO- 그룹이고;
R3는 H, CH3, R5CO- 또는 R6그룹이고;
R4는 H, OH, R5COO- 또는 OR6그룹이고;
R5는 C1-C18알킬 그룹이고;
R6는 C2-C18알킬 또는 알케닐 그룹이다.
상기 화학식 1의 화합물들 중 바람직한 것들은 R1이 부탄오일, 헥산오일, 옥탄오일, 라우르오일, 팔미트오일 또는 스테아르오일이고; R2가 수소이고; R3가 H,CH3, 라우릴, 팔미틸, 스테아릴, 올레일, 라우르오일, 팔미트오일, 스테아르오일 또는 올레오일이고; R4가 H, OH 또는 에톡시인 화합물들이다.
더욱 바람직한 화학식 1의 화합물들은 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르, 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르 및 헤스페레틴 7-O-스테아르산 에스테르들이다.
화학식 1의 화합물들은 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 즉, 헤스페레틴 또는 나린제닌을 유기용매, 예를 들어, 테트라하이드로푸란(THF) 및 디클로로메탄(CH2Cl2) 등에 용해시키고 1 내지 5몰 당량의 트리에틸아민(Et3N)을 넣고 혼합물의 온도를 얼음물로 냉각시킨다. 얻어진 혼합물에 1 내지 1.5몰 당량의 아실 클로라이드를 가하고 2 내지 10 시간, 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 반응시킨다. 얻어진 반응물은 EtOAc로 희석하고 포화 탄산수소나트륨 용액 및 염수로 세척한 후, 건조, 여과 및 농축하여 에스테르형의 유도체를 얻는다.
본 발명의 화합물들은 이를 잘 녹이지 않는 적당한 용매를 이용하여 분쇄(trituration)하거나 실리카 겔 크로마토그라피, C-18 HPLC 등의 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 플라바논 에스테르 유도체들은 탁월한 혈중 콜레스테롤 및 중성지방 농도 저하 효과를 나타내므로, 혈중 지질 관련 질환의 예방 및 치료에 유용하다. 본원에서 혈중 지질 관련 질환이란, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화증, 지방간 등 고농도의 혈중 지질이 한 원인이 되는 질병들을 말한다. 또한, 본 발명의 화합물들은 지질대사와 관련된 HMG-CoA 환원효소, ACAT 및 LDL-산화에 대해 우수한 저해효과를 나타낸다. 이러한 유효성에도 불구하고, 본 발명의 유도체들은 마우스를 사용한 시험에서 독성 또는 유사분열원성(mitogenicity)을 거의 나타내지 않는다.
따라서, 본 발명에서는 활성성분으로서 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는, 혈중 지질 농도 저하용, 콜레스테롤 대사 관련 효소 억제용, 혈중 지질 농도 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태일 수 있다.
적당한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산염, 젤라틴, 칼슐 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥내 또는 근육내를 포함한여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 화학식 1의 화합물의 통상적인 1일 투여량은 0.1 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 선택된 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 증상의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
화학식 1의 화합물은 또한 혈중 지질 농도 저하, 콜레스테롤 대사 관련 효소 억제, 동맥경화 예방 및 치료를 통해 건강을 유지 및 개선할 목적으로 식품 또는 음료에 첨가제 또는 식품 보조제로서 혼입될 수 있다. 상기 식품 또는 음료로는, 육류; 야채 쥬스(예를 들어, 당근 쥬스 및 토마토 쥬스) 및 과일 쥬스(예를 들어, 오렌지 쥬스, 포도 쥬스, 파인애플 쥬스, 사과 쥬스 및 바나나 쥬스); 초콜렛; 스넥류; 과자류; 피자; 빵, 케익, 크래커, 쿠키, 비스킷, 누들 등과 같이 곡물 분말로 만들어진 식품류; 껌류; 우유, 치즈, 요구르트 및 아이스크림과 같은 유제품; 스프; 육즙; 페이스트, 케찹 및 쏘스; 차; 알콜성 음료류; 탄산 음료류; 비타민 복합체; 및 다양한 건강 식품류 등이 있다. 이 경우, 식품 또는 음료 중 화학식 1의 화합물의 함량은 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 범위일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하는 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되지는 않는다.
또한, 고체 중 고체, 액체 중 액체, 및 액체 중 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며, 모든 반응은 별도의 특별한 표시가 없는 한 실온에서 수행되었다.
실시예 1: 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르의 제조
헤스페레틴 1.0 g(3.3 mmol)과 트리에틸아민 1.3 ㎖(9.3 mmol)을 건조 디클로로메탄(CH2Cl2) 20 ㎖에 녹인 후 용액을 얼음물로 냉각시켰다. 여기에 라우르오일 클로라이드 0.72 g(3.3 mmol)을 천천히 가하여 실온에서 3시간 교반하였다. 얻어진 반응액을 에틸아세테이트(EtOAC)로 희석하고 포화 탄산중수소나트륨 용액으로 세척한 후 다시 소금물로 세척하였다. 얻어진 용액을 무수황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여 농축하였다. 이 농축액을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(컬럼: 25 mm x 150 mm, 실리카겔: 70-230 메쉬, 용출액: 헥산/EtOAc(6/1))하여 640 ㎎의 표제 화합물을 얻었다. 이 물질의 분석결과는 다음과 같다.
1H NMR(CDCl3) δ11.85(s, 1H), 7.03(d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.92(dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 6.88(d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.29(d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.28(d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.69(s, 1H), 5.36(dd, J = 13.2, 2.8 Hz, 1H), 3.92(s, 3H), 3.11(dd, J = 17.6, 13.2 Hz, 1H), 2.83(dd, J = 17.2, 2.8 Hz, 1H), 2.52(t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.72(m, 2H), 1.26(m, 16H), 0.87(t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm.
13C NMR(CDCl3) δ197.4, 171.4, 163.5, 162.5, 158.7, 147.2, 146.1, 131.3, 118.4, 112.8, 110.8, 106.3, 103.4, 101.9, 79.2, 56.2, 43.6, 34.6, 32.1, 29.9, 29.8, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 25.0, 22.9, 14.3 ppm.
실시예 2: 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르의 제조
헤스페레틴 1.0 g(3.3 mmol)과 팔미트오일 클로라이드 0.9 g(3.3 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 0.7 g의 표제 화합물을 얻었다. 이 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 25mm x 150mm, 실리카 겔 70-230 메쉬, 용출액: 헥산/EtOAc(6/1))하여 최종 정제하였다.
실시예 3: 헤스페레틴 7-O-스테아르산 에스테르의 제조
헤스페레틴 1.0 g(3.0 mmol)과 스테아르오일 클로라이드 1.0 g(3.3 mmol)을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 0.7 g의 표제 화합물을 얻었다. 이 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼 사이즈: 25 mm x 150 mm, 실리카 겔 70-230 메쉬, 용출액: 헥산/EtOAc(6/1))하여 최종 정제하였다.
시험예 1: 플라바논 에스테르 유도체의 고지혈증 예방 효과
(단계 1) 랫트에 대한 헤스페레틴 및 플라바논 에스테르 유도체의 투여
체중 90 내지 120 g인 4주령의 숫컷 스프라그 다우리(Sprague-Dawley) 랫트 40 마리(한국화학연구소)를 난괴법(randomized block design)에 의해 4개의 그룹으로 나누었다. 네 그룹의 랫트들에게 각각 네 가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉,표 1과 같이 1 % 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이(ICN Biochemicals, Cleveland, 미국)(대조군); 0.02 % 헤스페레틴(Sigma Chemical Co., 미국)과 1 % 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이; 0.031 % 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르와 1 % 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이; 및 0.032 % 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르와 1 % 콜레스테롤을 함유한 AIN-76 실험동물 식이를 각각 섭취시켰다.
식이군성 분 대조군 헤스페레틴 투여군 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르 투여군 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 투여군
카제인 20 20 20 20
D,L-메티오닌 0.3 0.3 0.3 0.3
옥수수 전분 15 15 15 15
슈크로즈 49 48.98 48.968 48.969
셀룰로즈 분말 5 5 5 5
미네랄 혼합물*1 3.5 3.5 3.5 3.5
비타민 혼합물*2 1 1 1 1
바이타트르산 콜린 0.2 0.2 0.2 0.2
옥수수유 5 5 5 5
콜레스테롤 1 1 1 1
헤스테레틴 - 0.02 - -
플라바논 에스테르 유도체 - - 0.032 0.031
총(%) 100 100 100 100
*1AIN-76 미네랄 혼합물(TEKLAD premier Co., Madison, WI, U.S.A.)*2AIN-76 비타민 혼합물(TEKLAD premier Co., Madison, WI, U.S.A.)
랫트들에게 6주 동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며,식이 섭취량을 매일 기록하고 7일마다 체중을 측정한 후, 사육일지의 자료를 분석하였다. 모든 랫트는 정상 성장 속도를 보였으며 식이 섭취량과 체중증가에 있어서 4개군간 유의적인 차이가 없었다.
(단계 2) 혈중 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량의 측정
헤스페레틴 또는 플라바논 에스테르 유도체를 투여했을 때 랫트의 혈장 콜레스테롤 및 중성지질 함량에 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다.
단계 1과 같이 사육한 네 식이군의 랫트의 복부하대정맥으로부터 혈액 시료를 채취한 후 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 총 콜레스테롤 농도는 알라인 등의 방법(Allain 등,Clin. Chem.,20, 470-475, 1974)에 기초를 둔 시그마 진단 키트(Cat. No.: C0534, Sigma Chemical Co., 미국)를 사용하여 측정하였다. HDL 분획은 헤파린-망간 침전법(Waenic, R.G. 및 Albers, J.J.,J. Lipid Res.,19, 65-76, 1978)을 응용한 시그마사의 키트(Cat. No.: 352-1)를 이용하여 분리하고, HDL-콜레스테롤의 농도는 시그마사의 키트(Cat. No.: C9908)로 측정하였다. 트리글리세리드의 농도는 리파아제-글리세롤 포스페이트 옥시다제 방법(McGowan, M.W. 등,Clin. Chem., 29, 538-542, 1983)에 기초를 둔 시그마사의 분석 키트(Cat. No.: 336-10)를 사용하여 측정하였다.
네 식이군에서 혈장 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 트리글리세리드의 농도는표 2에 나타낸 바와 같다. 모든 데이타는 평균 ±표준편차로 나타내었다.
식이군 대조군 헤스페레틴 투여군 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르 투여군 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 투여군
총 콜레스테롤 (㎎/㎗) 158.0 ±6.2 110.32 ±6.9 104.4 ±4.6 102.1 ±7.2
HDL-콜레스테롤 (㎎/㎗) 31.7 ±2.1 31.6 ±1.3 31.4 ±2.1 31.4 ±1.4
HDL-콜레스테롤/총 콜레스테롤 (%) 20.1 ±1.2 28.6 ±1.9 30.0 ±2.6 30.8 ±2.2
트리글리세리드 (㎎/㎗) 107.0 ±6.2 79.0 ±5.5 75.9 ±4.3 81.3 ±4.6
동맥경화 지수*(AI) 4.0 ±0.4 2.5 ±0.2 2.4 ±0.3 2.3 ±0.2
*동맥경화 지수 (AI)=(총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤)/HDL 콜레스테롤
표 2에서와 같이, 플라바논 에스테르 유도체를 투여했을 경우에 대조군에 비해 혈중 총콜레스테롤이 34.0 % 내지 35.4 %, 트리글리세리드가 24.0 % 내지 29.0 % 정도 감소한 반면, 헤스페레틴을 투여했을 경우에 총콜레스테롤은 30.2 %, 트리글리세리드는 26.2 % 정도 감소하였다. 따라서, 본 발명의 화합물 플라바논 에스테르 유도체는 헤스페레틴에 비해 혈중 총 콜레스테롤 농도를 감소시키는 효과가 우수하므로, 혈중 총 콜레스테롤에 의한 고지혈증의 예방 및 치료에 매우 유용할 것으로 예상된다.
시험예 2: 플라바논 에스테르 유도체에 의한 HMG-CoA 환원효소의 활성저해효과
(단계 1) 마이크로좀의 제조
랫트에 의해 섭취된 플라바논 에스테르 유도체가 간에서 콜레스테롤 생합성의 조절 효소인 HMG-CoA 환원효소의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 간조직으로부터 효소원인 마이크로좀을 분리하였다.
먼저, 시험예 1의 (단계 1)에서와 같이 사육한 네 그룹의 랫트들을 참수하여 희생시킨 후 간을 적출한 후, 1 g의 간을 5 ㎖의 균질화 용액(0.1 M KH2PO4, pH 7.4, 0.1 mM EDTA 및 10 mM β-머캅토에탄올)에 균질화하였다. 이 균질액을 4 ℃에서 3,000 x g 로 10분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 4 ℃에서 15,000 x g로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액을 초원심분리 튜브(Beckman)에 넣고, 4 ℃에서 100,000 x g 로 1 시간 동안 원심분리하여 마이크로좀 펠렛을 얻은 후, 이를 3 ㎖의 균질화 용액에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액을 4 ℃에서 100,000 x g로 1 시간 동안 다시 원심분리하여 얻어진 펠렛을 1 ㎖의 균질화 용액에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액중의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정한 후 단백질 농도를 4 내지 8 ㎎/㎖로 조절하였다. 얻어진 현탁액을 딥 프리저(Biofreezer, Forma Scientific Inc.)에 보관하였다.
(단계 2) HMG-CoA 환원효소 분석
HMG-CoA 환원효소 활성을 [14C]HMG-CoA를 사용하여 사피로 등의 방법(Biochemica et Biophysica Acta,370, 369-377, 1974)에 따라 다음과 같이 결정하였다.
(단계 1)에서 얻은 마이크로좀을 포함하는 상층액의 효소를 37 ℃에서 30분 동안 활성화시켰다. 반응 튜브에 20 ㎕의 HMG-CoA 환원효소 분석 완충용액(0.25 M KH2PO4(pH 7.0)), 8.75 mM EDTA, 25 mM DTT, 0.45 M KCl 및 0.25 ㎎/㎖ BSA), 5 ㎕의 50 mM NADPH, 5 ㎕의 [14C]HMG-CoA(0.05 μCi/튜브, 최종 농도 120 μM), 및 10 ㎕의 활성화된 마이크로좀 효소(0.03-0.04 ㎎)를 가하고, 혼합물을 37 ℃에서 30분 동안 보관하였다. 혼합물에 10 ㎕의 6 M HCl을 가하여 반응을 종료시키고, 혼합물을 37 ℃에서 15분 동안 보관하여 반응 산물(메발로네이트)이 완전히 락톤화되도록 하였다. 그리고 나서, 이 혼합물을 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 실리카겔 60G TLC 판(Altech, Inc., Newark, U.S.A.)에 적용시킨 후 벤젠:아세톤(1:1(v/v))으로 전개시켰다. 0.65 내지 0.75 범위의 Rf값을 갖는 영역을 1회용 커버 슬립으로 긁어내어 분리한 후 1450 마이크로 베타 액상 신틸레이션 계수기(Wallacoy, Finland)를 이용하여 방사능을 분석하였다. 효소 활성은 단백질 ㎎당 분당 합성된 메발론산 pmole로 계산하였다. 그 결과는표 3에 나타낸 바와 같다.
식이군 대조군 로바스타틴 투여군 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르 투여군 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 투여군
HMG-CoA 환원효소(pmole/분/㎎ 단백질) 181.0 ±9.6 149.6 ±8.6 142.4 ±6.1 151.1 ±9.0
표 3에서와 같이, 플라바논 에스테르 유도체은 대조군에 비해 HMG-CoA 환원효소 활성을 16.5∼21.3 % 억제하였으므로, 콜레스테롤 생합성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
시험예 3: 플라바논 에스테르 유도체에 의한 ACAT의 활성저해효과
(단계 1) 마이크로좀의 제조
랫트에 NG5006을 섭취시키는 것이 ACAT의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 (1)의 (단계 1)에서와 같이 간 조직으로부터 마이크로좀을 분리하여 효소원으로 사용하였다.
(단계 2) ACAT 활성 측정
아세톤에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 ㎕를 아세톤중의 10 % 트리톤 WR-1339(Sigma Co.) 6 ㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 얻어진 혼합물에 증류수를 가하여 콜레스테롤의 농도가 30 ㎎/㎖가 되도록 조절하였다.
10 ㎕의 생성된 콜레스테롤 수용액에 10 ㎕의 1 M KH2PO4(pH 7.4), 5 ㎕의 0.6 mM 우 혈청 알부민(BSA), 10 ㎕의 (단계 1)에서 얻은 마이크로좀 용액 및 55 ㎕의 증류수를 가하였다(총 90 ㎕). 혼합물을 37 ℃ 수욕에서 30 분 동안 예비 반응시켰다.
10 ㎕의 (1-14C)올레일-CoA 용액(0.05 μCi, 최종 농도: 10 μM)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37 ℃ 수욕에서 30분 동안 반응시켰다. 혼합물에 500 ㎕의 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1(v/v)), 300 ㎕의 헵탄 및 200 ㎕의 0.1 M KH2PO4(pH 7.4)를 가하고, 혼합물을 볼텍스(vortex)로 격렬하게 혼합한 후 상온에서 2분 동안 방치하였다.
200 ㎕의 생성된 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액(Lumac) 4 ㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량을 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy, Finland)로 측정하였다. ACAT 활성은 1분 동안 단백질 1 ㎎ 당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였으며, 각 데이타는 평균 ±표준편차로 나타내었다(p<0.05). 그 결과는표 4에 나타내었다.
식이군 대조군 로바스타틴 투여군 헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르 투여군 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 투여군
ACAT(pmole/분/㎎ 단백질) 384.4 ±20.4 350.5 ±16.2 295.9 ±20.2 351.1 ±17.7
표 4에서와 같이, 플라바논 에스테르 유도체은 대조군에 비해 ACAT 활성을 8.7∼23.0 % 억제하였으므로 콜레스테롤 흡수를 억제할 수 있음을 알 수 있다.
시험예 4: 플라바논 에스테르 유도체에 의한 토끼 동맥경화의 억제효과
(단계 1) 토끼에 대한 플라바논 에스테르 유도체의 투여
체중 2.0∼2.3 ㎏의 건강한 수컷 뉴질랜드 백색종(New Zealand White) 토끼를 연암원예축산대학으로부터 분양받아 온도 20 ±2 ℃, 습도 55 ±10 % 및 12 시간 명/암 주기로 조절되는 사육환경하에서 실험에 사용하였다. 실험군은 수분(7.6 %), 조단백질(22.8 %), 조지방(2.8 %), 조회분(8.8 %), 조섬유(14.4 %) 및 가용성무질소물(43.7 %) 등으로 구성된 토끼용 고형사료(RC4 diet, Oriental Yeast Co., Japan)에 1 % 콜레스테롤이 첨가된 사료만을 섭취시키는 대조군 및 헤스페레틴 또는 플라바논 에스테르 유도체를 일정비율로 혼합하여 투여하는 두 개의 실험군을 포함하여 3개 실험군으로 나누었으며, 8주 동안 사료와 물은 충분히 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 각 실험군의 사료조성과 실험내용은표 5에 나타내었다.
실험군 토끼수 투여기간 투여식이
대조군 7마리 8주 1% 콜레스테롤 식이
헤스페레틴 투여군 9마리 8주 1% 콜레스테롤 + 헤스페레틴 (0.025 중량%) 식이
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 투여군 9마리 8주 1% 콜레스테롤 + 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 (0.025 중량%) 식이
(단계 2) 대동맥내 지방선 분석
단계 1에서 사육된 토끼를 희생시키고 흉부를 절개하였다. 대동맥궁을 따라 하방으로 횡경막 부위까지 절취한 후, 대동맥 주변의 지방을 잘 제거하고 중앙부위를 종축 방향을 따라 절개한 다음 두번째 늑간동맥 기시부에서 7번째 늑간동맥 기시부까지를 잘라내어 10 % 중성 완충 포르말린에 24시간 고정하였다. 이어서 동맥내벽의 지방선(fatty streak) 염색을 위하여 절취한 대동맥을 디쉬 위에 핀으로 고정한 다음 에스퍼 등의 방법(Esper, E. 등,J. Lab Clin Med,121: 103-110, 1993)에 따라 프로필렌 글리콜로 각각 2분씩 3회 수세하고 프로필렌 글리콜에 녹인 오일 레드 오(ORO) 포화용액으로 옮겨 30분간 염색한 다음, 85 % 프로필렌 글리콜로 각각 3분씩 2회 수세하여 여분의 염색액을 제거하였다. 이어서 생리식염수로 1회 세척하고 사진촬영을 한 다음 사진을 얻어 염색된 부위를 투사(tracing)하고 화상분석기(LEICA, Q-600, Germany)로 단위 대동맥 면적에 대한 염색부위(지방선 부위)의 비율(%)을 계산하였으며, 컴퓨터 통계프로그램 (Microsoft excel, version 7.0)을 이용하여 각 실험군간의 유의성 차이를 분석·검정 (studentt-test)하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 헤스페레틴과 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르를 투여한 2개의 실험군에서 지방선 부위의 비율이 모두 유의성 있게 감소된 양상을 나타내었으며, 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르를 투여한 군이 헤스페레틴을 투여한 군보다 더욱 효과적으로 지방선을 억제하는 것으로 나타났다(표 6).
대조군 (n = 7) 헤스페레틴 투여군 (n = 9) 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 투여군 (n = 9)
43.3 ±4.4a 35.8 ±14.1b 30.7 ±6.0b
a: 측정값은 '평균±표준편차'로 나타내었음.b: 대조군에 비하여 통계학적으로 유의한 차이 (T-test,p< 0.01)를 보였음.
표 6에서와 같이, 플라바논 에스테르 유도체는 대조군에 비해 지방선 축적을 29.1 % 억제하는 반면, 헤스페레틴은 17.3 % 억제시켰으므로 본 발명의 플라바논 에스테르 유도체가 헤스페레틴에 비해 지방선 축적을 억제시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.
(단계 3) 조직학적 관찰
플라바논 에스테르 유도체가 토끼의 각 장기와 조직에 대해 미치는 영향을 조사하기 위하여, 토끼를 부검한 후, 심장, 폐, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여특이소견의 유무를 육안으로 확인하였다. 그리고 나서, 각 장기를 10 % 중성 포르말린에 넣어 24시간 이상 고정시킨 후, 흐르는 물로 충분히 수세하고 70 %, 80 %, 90 % 및 100 % 에탄올을 이용하여 단계적으로 탈수시킨 다음 파라핀 투과과정을 거쳐 포매기(SHANDON, Histocentre 2, USA)로 포매하였다. 포매된 조직은 박절편기(LEICA, RM2045, Germany)로 약 4 ㎛의 두께로 조직절편을 제작하여 H & E(Hematoxylin & eosin) 염색을 하고 자일렌(xylene)으로 투명화 과정을 거쳐 퍼마운트(permount)로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 플라바논 에스테르 유도체가 투여된 토끼에서는 조직학적 특이소견이 발견되지 않았다.
시험예 5: LDL-항산화제의 활성 측정
LDL-항산화제로서 플라바논 에스테르 유도체의 활성을 측정하기 위해 Cu2+-매개된 LDL-산화를 유발시키고, 이때 생성된 불포화지방산의 산화 산물인 디알데하이드(dialdehyde)를 TBA(thiobarbituric acid)법으로 측정하였다(Packer L.(ed.),Methods in Enzymology,234, Academic press, San Diego, 1994).
플라바논 에스테르 유도체를 DMSO를 이용하여 40 μM 농도로 용해시켜 제조된 플라바논 에스테르 유도체 용액 10 ㎕, 사람의 혈액으로부터 초원심분리기를 이용해 분리한 LDL 50 ㎕(50-100 ㎍ 단백질), 10 mM 인산염 완충 식염수(PBS) 180 ㎕를 혼합한 후에 0.25 mM CuSO410 ㎕를 첨가하였다. 이 혼합액을 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 20 % 트리클로로아세트산(TCA) 용액 1 ㎖을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 0.05 N NaOH 용액에 녹인 0.67 % TBA 1 ㎖을 첨가하고 교반한 후, 발색반응이 일어나도록 95 ℃에서 5 분 동안 가열한 후, 얼음물에 냉각시켰다. 이 반응액을 3,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고 상등액을 취하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 양을 계산하였다. 테트라메톡시프로판(tetramethoxypropane(malonaldehyde bis(dimethylacetal)))의 저장용액을 이용하여 250 ㎕ PBS 용액에 0 내지 5 nmol MDA를 포함하는 표준용액을 만들어서 위와 같은 방법으로 가열하여 MDA의 생성 표준곡선을 구하였다.
한편, 테트라메톡시프로판의 저장용액을 이용하여 0 내지 5 nmol의 MDA를 포함하는 PBS 표준용액을 250 ㎕씩 만들었다. 이 표준용액을 상기와 같은 방법으로 발색시켜 540 nm에서의 흡광도를 측정하고, MDA의 표준곡선을 구하였다. 플라바논 에스테르 유도체 화합물을 사용한 상기 실험에서 MDA의 양은 이 표준곡선을 이용하여 정량하였으며, 대조군에 대한 플라바논 에스테르 유도체 화합물의 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성을 결정하였다, 그 결과는표 7에 나타내었다.
플라바논 에스테르 유도체의 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성
화합물 LDL-산화 활성 저해 (%)
대조군 0
헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르(40 μM) 66
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르(40 μM) 75
헤스페레틴 7-O-올레산 에스테르(40 μM) 61
헤스페레틴 7-O-스테아르산 에스테르(40 μM) 56
상기표 7에서와 같이, 본 발명의 플라바논 에스테르 유도체 화합물의 저밀도 지질 단백질에 대한 항산화 활성이 우수하므로 본 발명의 플라바논 에스테르 유도체 화합물은 저밀도 지질 단백질이 산화되어 유발되는 것으로 알려진 동맥경화 등 순환계 질환의 예방제 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
시험예 6: 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르의 독성실험
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르의 경구독성시험을 다음과 같이 실시하였다. 4 주령의 특정 병원체 부재(specific pathogens free) ICR 마우스로서 암컷 12마리와 숫컷 12 마리(암수 각각 3마리/용량군)를 온도 22 ±3 ℃, 습도 55 ±10 %, 조명 12L/12D의 동물실내에서 사육하였다. 마우스는 실험에 사용되기 전 1주일 정도 순화시켰다. 실험동물용 사료((주)제일제당, 마우스 및 랫드용) 및 음수는 멸균한 후 공급하였으며 자유섭취시켰다.
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르를 0.5 % 트윈 80을 용매로 하여 100 ㎎/㎖ 농도로 조제한 후, 마우스 체중 20 g 당 0.2 ㎖(1 g/㎏), 0.4 ㎖(2 g/㎏) 또는 0.8 ㎖(4 g/㎏)씩 경구 투여하였다. 시료는 1 g/㎏ 및 2 g/㎏ 용량군은 1회 경구 투여하였고, 4 g/㎏ 용량군은 1일 간격 2회 경구 투여하였으며, 투여 후 7일 동안 다음과 같이 부작용 또는 치사 여부를 관찰하였다. 즉, 투여당일은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간 뒤에 그리고 투여 익일부터 7일째까지는 매일 오전, 오후 1회 이상씩 일반증상의 변화 및 사망동물의 유무를 관찰하였고, 투여 7일째에 동물을 치사시켜 해부한 후 육안으로 내부 장기를 검사하였다. 또한, 투여당일부터 1일 간격으로 체중의 변화를 측정하여 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르에 의한 동물의 체중 감소 현상을 관찰하였다.
그 결과, 급성 경구독성 실험의 경우에는 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르는 1 g/㎏, 2 g/㎏, 4 g/㎏의 용량에서 7일 동안 치사동물이 관찰되지 않았다. 7일 후 생존동물에 대한 부검을 실시한 바, 특별한 병변 육안 소견이 없었으며, 투여 익일부터 7일간 어떠한 체중의 감소 없이 정상적인 체중의 증가가 관찰되었다.
제제예 1: 약학적 제제의 제조
다음의 성분들을 혼합하여 경질 젤라틴 캅셀에 충진함으로써 캅셀제를 제조하였다:
양(㎎/캅셀)
활성 성분(헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르) 20
건조 전분 160
마그네슘 스테아레이트 20
총 200 ㎎
제제예 2: 플라바논 에스테르 유도체를 포함하는 식품
본 발명의 플라바논 에스테르 유도체를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
(1) 토마토 케찹 및 소스의 제조
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르를 토마토 케찹 또는 소스에 0.2 중량%의양으로 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 수득하였다.
(2) 밀가루 식품의 제조
헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르를 밀가루에 0.5 중량%의 양으로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케익, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 수득하였다.
(3) 스프 및 육즙(gravies)의 제조
헤스페레틴 7-O-올레산 에스테르를 스프 및 육즙에 0.1 중량%의 양으로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 수득하였다.
(4) 그라운드 비프(ground beef)의 제조
헤스페레틴 7-O-스테아르산 에스테르를 그라운드 비프에 10 중량%의 양으로 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 수득하였다.
(5) 유제품(dairy products)의 제조
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르를 우유에 5 중량%의 양으로 첨가하고 이 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
그러나, 헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르를 치즈 제조시에는 응고된 우유 단백질에 첨가하고, 요구르트 제조시에는 발효 후에 수득된 응고된 우유 단백질에첨가하였다.
제제예 3: 플라바논 에스테르 유도체를 포함하는 음료
(1) 야채쥬스의 제조
헤스페레틴 7-O-라우르산 에스테르 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 수득하였다.
(2) 과일쥬스의 제조
헤스페레틴 7-O-팔미트산 에스테르 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 수득하였다.
본 발명의 플라바논 에스테르 유도체는 독성이 거의 없으면서도 탁월한 혈중 지질 농도 저하, 콜레스테롤 대사 관련 효소 억제, 동맥경화 예방 및 치료 효과를 나타내므로 이를 포함하는 조성물은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화증, 지방간 등의 혈중 지질 관련 질환의 치료에 유용하다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1의 화합물:
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1은 R5CO- 그룹이고,
    R2는 H 또는 R5CO- 그룹이고,
    R3는 H, CH3, R5CO- 또는 R6그룹이고,
    R4는 H, OH, R5COO- 또는 OR6그룹이고,
    R5는 C1-C18알킬 그룹이고,
    R6는 C2-C18알킬 또는 알케닐 그룹이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1이 부탄오일, 헥산오일, 옥탄오일, 라우르오일, 팔미트오일 또는 스테아르오일이고; R2가 수소이고; R3가 H, CH3, 라우릴, 팔미틸, 스테아릴, 올레일, 라우르오일, 팔미트오일, 스테아르오일 또는 올레오일이고; R4가 H, OH 또는 에톡시인 화합물.
  3. 나린제닌 또는 헤스페레틴을 유기용매에 녹이고 1 내지 5 몰 당량의 트리에틸아민(Et3N)을 넣고 혼합물을 냉각시킨 후 1 내지 1.5 몰 당량의 아실 클로라이드를 넣고 2 내지 10시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는, 제 1항의 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기용매가 테트라하이드로푸란(THF) 또는 디클로로메탄(CH2Cl2)인 제조방법.
  5. 제 1항의 화학식 1의 화합물을 포함하는 혈중 지질농도 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    혈중 지질농도 관련 질환이 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화증 또는 지방간인 조성물.
  7. 제 1항의 화학식 1의 화합물을 포함하는 아실 CoA-콜레스테롤-O-아실트랜스퍼레이즈(ACAT) 활성 저해용 조성물.
  8. 제 1항의 화학식 1의 화합물을 포함하는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 CoA(HMG-CoA) 환원효소 저해용 조성물.
  9. 제 1항의 화학식 1의 화합물을 포함하는 LDL-항산화제용 조성물.
  10. 제 1항의 화학식 1의 화합물을 포함하는 건강 개선용 식품.
  11. 제 10 항에 있어서,
    육류; 초콜렛; 스넥류; 과자류; 피자; 곡물 분말로 만들어진 식품류; 껌류; 유제품; 스프; 육즙; 페이스트, 케찹 및 쏘스; 비타민 복합체; 및 건강 식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품.
  12. 제 10항에 있어서,
    음료의 형태인 식품.
  13. 제 12항에 있어서,
    야채 쥬스, 과일 쥬스, 우유, 요구르트, 차, 알콜성 음료류 및 탄산 음료류로 이루어진 군으로부터 선택되는 식품.
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