KR100291145B1

KR100291145B1 - 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 동맥경화증,고지혈증, 간 질환, 고혈당증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100291145B1
Application number: KR1020000058788A
Authority: KR
Inventors: 복성해; 정태숙; 배기환; 박용복; 최명숙; 문석식; 권용국; 이은숙; 현병화; 최양규; 이철호; 안병태; 이새봄
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2001-05-15
Also published as: KR20010007624A

Abstract

본 발명은 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘(neohesperidin dihydrochalcone)을 포함하는 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환, 고혈당증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 의약용, 식품용 및 음료용 조성물을 포함한다.

Description

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환, 고혈당증의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING ATHEROSCLEROSIS, HYPERLIPIDEMIA, HEPATIC DISEASES AND GLYCOSEMIA, COMPRISING NEOHESPERIDIN DIHYDROCHALCONE}

본 발명은 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환, 고혈당증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

감귤류의 과피에는 하기 표 1의 매우 다양한 바이오플라보노이드가 존재하는 데, 이들은 매우 유익한 약리 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

감귤류 과피는 각종 약리 활성, 예를 들어, 혈압, 동맥경화증 등 심장 순환기 질환과 관련된 지질 대사 개선 효과, 항암 작용 및 항바이러스 작용 등을 갖는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 헤스페리딘 또는 헤스페레틴은 모세혈관 강화, 투과성(permeability) 감소, 혈압 강하, 혈중 콜레스테롤 강하, 항혈소판 응집(antiplatelet aggregation), 항염증 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있다(Meyer, O. C., Angiology, 45, 579-584(1994); Struckmann J. R., et al., Angiol., 45, 419-428(1994); Matsubara, Y., et al., Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal., 52, 318-327(1994. Mar.); Galati E. M., et al., Farmaco., 51(3), 219-221(1996, Mar.); Monforte MT., et al., Farmaco., 50(9), 595-599(1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Chung, M. I., et al., Chin. Pharm. J.(Taipei)., 46, 429-437(1994, Nov.); Galati, E. M., et al., Farmaco., 40(11), 709-712(1994, Nov.); 및 Emim J. A., et al., J. Pharm. Pharmacol., 46(2), 118-122(1994)). 바이오플라보노이드는 항산화, 혈압 강하, 항암 및 항바이러스 작용을 한다고 알려져 있으며(Saija, A., et al., Free Radical Biol. Med., 19, 481-486(1995); Matsubara, Y., et al., 상기 문헌; Galati E. M., et al., 상기 문헌; Felicia V., et al., Nutr. Cancer, 26, 167-181(1996); 유럽 특허공개 제 0352147 A2 호; 및 Kaul, T. N., et al., J. Med. Virol., 15, 71-79(1985)), 나린제닌 및 나린진은 콜레스테롤 강하, 항암 및 항위궤양(알콜로부터 보호) 작용을 한다고 알려져 있다(Monforte MT. et al., 상기 문헌; JP 95-86929; JP 95-86930; Felicia V. et al., 상기 문헌; 유럽 특허공개 제 0352147 A2 호; 및 Martin M. J. et al., Pharmacol., 49, 144-150(1994)).

또한, 감귤의 과피와 씨에는 리모노이드계 물질이 존재하는데 이들이 항암활성을 갖고 있다는 사실도 밝혀져 있다(Lam, L.K.T. et al., Inhibition of chemically induced carcinogenesis by citrus limonoids. In Food Phytochemicals for Cancer Prevention, Vol. I, ACS Symposium series No. 546, Huang, M. T., O. Osawa, C. T. Ho, R. Rosen(ed). 1993).

따라서 감귤류 과피, 이의 추출물, 또는 이로부터 분리 정제된 바이오플라보노이드는 건강 증진용 식품이나 성인병 예방 치료용 의약품 개발에 유용하다.

한편, 바이오플라보노이드중의 하나인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 (C₂₈H₃₆O₁₅, M.W. 612.60)은 자몽의 과피 또는 외피(rind)로부터 추출하거나 나린진을 화학적으로 변형시켜 얻어지며, 무게비로 설탕보다 1,500 내지 2,000 배의 단맛을 가지고 있어 식품 감미료로 개발되어 왔다(미국 특허 제 4,085,232 호). 따라서, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 동물에 장기간 투여되더라도 독성이 없는데, 아만성 독성(subchronic toxicity) 실험 결과에 따르면 750㎎/㎏/일로 섭취한 경우에도 어떠한 문제도 나타나지 않았다(B.A.R. Lina et. al. Food Chem. Toxicol., 7, 500-513(1990)). 그러나 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 감미료로서의 효과 이외의 약리 활성에 대하여는 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 네오헤스페리딘의 약리 활성에 대해 관심을 가지게 되었다.

함편, 관상동맥성 심혈관 질환은 현재 모든 사망원인의 30% 이상을 차지하고 있으며 미국, 유럽 등 선진국에서는 심각한 문제가 되고 있다. 한편 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동부족 등의 영향을 받아 심장병이 증가하고 있는 추세에 있다. 혈중 콜레스테롤의 양이 높을 경우 혈관벽에 지방과 더불어 대식세포(macrophage), 포말세포(foam cell) 등이 생성, 침착되고 플라크(plaque)를 형성하여 혈액 순환을 저해하는 동맥경화 증세가 오기 쉬운 것으로 알려져 있다(Ross, R., Nature, 362, 801-809(1993)).

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 방법으로는 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 방법이 있다. 아실 코에이: 콜레스테롤-o-아실트랜스퍼레이즈(acyl CoA: cholesterol-o-acyltransferase, ACAT)는 인체 조직내에서 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스터로 전환시켜주는 효소이다. 실험적이나 임상학적인 동맥경화 현상에서 대식세포(macrophage)나 평활근(smooth muscle) 세포 유래 포말세포들의 형성은 아주 중요한 인자이다. 포말세포들은 ACAT 작용에 의해 형성되고 혈액 속의 LDL에 의해 운반되는 콜레스테롤 에스터를 많이 함유하고 있다. 동맥 혈관 벽에 있는 포말세포들은 ACAT 활성의 증가와 더불어 발견되는 경우가 많기 때문에, ACAT 저해제는 동맥경화 예방제가 될 가능성이 높다. 또한 간 속의 ACAT 활성을 저해 할 경우 혈액속에 유통되는 LDL-콜레스테롤 수준을 낮출 수 있을 것이다(Witiak, D. T. and D. R. Feller(eds), Anti lipidemic Drugs: Medicinal, Chemical, and Biochemical Aspects, Elsevier, pp159-195(1991)).

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 다른 방법으로는 지단백질간에 콜레스테롤 전이를 매개하는 콜레스테롤 에스터 전달 단백질(cholesterol ester transfer protein, CETP)의 작용을 억제하거나 간에서 콜레스테롤 생합성에 관련하는 효소인 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소의 작용을 억제하는 방법이 있다. HMG-CoA 환원효소는 스테롤이나 이소프레노이드계 화합물의 생합성 경로의 중간단계인 메발론산(mevalonic acid) 합성을 매개하는 효소로, 이 효소의 활성을 감소시킬 경우 콜레스테롤의 생합성 속도를 늦추어 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 치료에 효과적으로 이용될 수 있다(William, W. P., Cardiovascular Pharmacology, Kanu Chatterjee(ed), Wolfe Pullishing, 8.6-8.7 (1994)). 현재 사용되고 있는 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제는 페니실리움 속 또는 아스퍼질러스 속에서 유래된 것으로 미국 메르크사가 개발한 로바스타틴(lovastatin)과 심바스타틴(simvastatin) 및 일본 산쿄사가 개발한 프라바스타틴(pravastatin) 등이 있다. 그러나 스타틴(statin)류가 중추신경계에 부작용을 주고(Saheki, A.T. et al., Pharm. Res., 11, 304-311 (1994)), 로바스타틴과 심바스타틴은 간의 LDL 수용체의 활성을 증가시킴으로써 혈중 LDL 콜레스테롤을 낮추지만 여러 효소의 양 증가, 크레아틴 키나제(creatine kinase)의 증가, 횡문근변성(rhabdomyolysis) 등의 부작용이 있는 것으로 보고되고 있다(Farmer, J.A. et al., Baillers-clin. Endocrinol. Metab., 9, 825-847 (1995)). 따라서 저렴하고 부작용이 없는 새로운 HMG-CoA 환원효소 활성 저해제의 개발이 절실하다.

한편, 간은 지방 성분이 포함된 음식 또는 알콜의 과다 섭취, 및 B형 또는 C형 간염 바이러스의 감염에 의해 그 기능이 저하되고, 이 상태가 방치될 경우 간염, 간경변증, 간암 등으로 진행된다. 특히 음식을 통한 과다한 지방 섭취 또는 과도한 알콜 섭취는 간 조직에 지질이 쌓이는 지방간을 유발하며, 이때 혈청 속의 GOT(glutamate-oxaloacetate transaminase), GPT(glutamate-pyruvate transaminase), γGTP(γ-glutamyl transpeptidase) 등이 증가하게 된다(T. Banciu, et al., Med. Interne., 20, 69-71(1982); 및 A. Par, et al., Acta. Med. Acad. Sci. Hung., 33, 309-319(1976)).

하야시(Hayashi) 등은 녹차 추출액이 쥐 혈청 GOT 및 GPT의 증가를 예방함으로써 쥐 간 기능을 개선한다고 보고하고 있다(M. Hayashi, et al., Nippon Yakuri gaku Zasshi, 100, 391-399(1992)).

본 발명자들은 비교적 안전할 것으로 보이는 생약재, 식품재료, 과채류 등에 풍부한 약리 활성 물질 탐색, 연구하던 중, 바이오플라보노이드인 헤스페리딘, 헤스페레틴, 나린진 및 나린제닌과 이들이 풍부하게 함유된 감귤류 과피 추출물이 혈중 콜레스테롤을 현저하게 감소시키고 ACAT 활성을 저해하며 동맥 내피 표면에 거대세포-지질 복합체가 형성되거나 침착되는 것을 강력히 억제하며 간 질환에 대해 치료 및 예방 효과가 있다는 사실을 발견하여 특허출원한 바 있다(WO98/16220, WO98/16221, 한국 특허출원 제 98-10888 호, 한국 특허출원 제 98-10889 호).

본 발명자들은 연구를 거듭하여, 헤스페리딘, 나린진과 같이 바이오플라보노이드에 속하는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘에 대하여도 이러한 활성을 조사한 결과, 동맥경화 억제효과, 고지혈증 억제 효과, 지방간 형성과 간염 억제 효과 등 간 기능 보호 작용, 및 혈당 강하 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 동맥경화증 예방 및 치료용 식품 또는 음료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 고지혈증 예방 및 치료용 식품 또는 음료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 간 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 간 질환 예방 및 치료용 식품 또는 음료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 고혈당증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 고혈당증 예방 및 치료용 식품 또는 음료 조성물을 제공하는 데 있다.

도 1a, 1b 및 1c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군 토끼의 동맥 내피 사진이다.

도 2a, 2b 및 2c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군 토끼의 간 해부 사진이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 식품 조성물 및 음료 조성물이 제공된다.

또다른 목적에 따라, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 식품 조성물 및 음료 조성물이 제공된다.

또다른 목적에 따라, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 간 질환 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 간 질환 예방 및 치료용 식품 조성물 및 음료 조성물이 제공된다.

또다른 목적에 따라, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 고혈당증 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 고혈당증 예방 및 치료용 식품 조성물 및 음료 조성물이 제공된다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 활성 성분으로 사용되는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 자몽 과피와 외피로부터 추출하거나 공지된 합성 방법에 의해서 나린진으로부터 합성할 수 있다. 이들의 추출 및 합성방법은 메르크 인덱스(Merck Index) 등의 문헌 및 특허 등에 다수 공개되어 있다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환 및 고혈당증의 치료 뿐 아니라 예방효과를 가진다. 본 발명자들에 의한 독성 시험 결과에 따르면, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 1000 ㎎/㎏의 용량으로 쥐에게 경구 투여하였을 때 독성이 거의 없는 것으로 밝혀졌으며, 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않는다.

동맥경화증, 고지혈증, 간 질환 및 당뇨병의 예방 및 치료를 위하여, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 활성 성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 이들 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 활성 성분으로 함유하는 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환 및 고혈당증의 예방 및 치료용 조성물을 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1 내지 500 ㎎, 바람직하게는 1 내지 100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환 및 고혈당증을 예방 또는 치료할 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 경우, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 건강보조식품용 개발을 위하여 이들 물질들을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 육류, 쥬스류, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 토마토 페이스트, 차, 알콜 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 동물 투여, ACAT 저해 효과 및 HMG-CoA 환원효소 저해 효과

(1) 동물 투여

3주령의 스프라그 다우리(Sprague Dawley) 흰쥐 20마리를 충북 음성군의 대한실험 동물센터로부터 구입하여 1주일간 제일제당 실험동물 사료로 사육하고, 4주령(체중: 90 내지 110g)이 되었을 때, 난괴법(randomized block design)에 의해 2개의 그룹으로 나누었다. 2 그룹의 쥐들에게 각각 정상식이(AIN-76 실험동물 식이)에 1% 콜레스테롤(대조군), 1% 콜레스테롤 및 0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘이 각각 함유된 식이를 섭취시켰다. 2 그룹에게 섭취시킨 식이의 조성은 표 2에 나타나 있다.

실험식이의 조성(%)

식이군성분	대조군	네오헤스페리딘디하이드로칼콘 군
카제인	20	20
D,L-메티오닌	0.3	0.3
옥수수 전분	15	15
슈크로즈	49	48.95
셀룰로즈 분말	5	5
미네랄 혼합물	3.5	3.5
비타민 혼합물	1	1
중타르타르산 콜린	0.2	0.2
옥수수유	5	5
콜레스테롤	1	1
네오헤스페리딘 디하이드로칼콘	-	0.05
총	100	100

모든 식이들은 고콜레스테롤 식이(1%, wt/wt)에 해당하고, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 미국의 시그마사(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo)로부터 구입하였으며, 실험용 흰쥐의 실험실 식이인 AIN-76 식이 조성 중 셀룰로즈, 미네랄 혼합물 및 비타민 혼합물 성분은 미국의 테크라드 프리미어사(TEKLAD premier, Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다.

모든 식이군의 쥐들에게 6주동안 해당 식이를 물과 함께 자유로이 섭취하도록 하였으며, 식이 섭취량을 매일 기록하고 7일마다 체중을 측정하였다. 동물 사육이 종료된 후 사육 일지의 자료를 분석한 결과, 식이 섭취량과 체중 증가에 있어서는 2개군 간에 유의적인 차이가 없었으며 정상적인 성장을 보였다.

(2) 실험 동물의 혈중 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성 지질 함량 측정

8주간 사육후 각 실험군의 쥐를 희생시켜 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 2시간 정도 정치한 다음 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층부의 혈청을 분리하여 초저온 냉동고에 보관하였다가 혈액 분석에 사용하였다. 혈액 분석은 혈액화학분석기(CIBA Corning 550 Express, USA)를 이용하여 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성 지질 등의 변화를 측정한 다음 각 실험군 간의 차이를 분석하였다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여가 쥐의 혈중 지질농도에 미치는 영향

식이군지질함량	대조군	네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군
총 콜레스테롤(㎎/㎗)	135 ± 28	115 ± 10
HDL-콜레스테롤(㎎/㎗)	18 ± 4	19 ± 3
중성 지질(㎎/㎗)	57 ± 13	52 ± 8
(%)	13	16

표 3에서 보듯이, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘이 투여된 쥐에서 혈중 콜레스테롤이 대조군과 비교해서 15% 감소하였다. 따라서 감귤류 유래 바이오플라보노이드인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 동물의 콜레스테롤을 저하시키는 작용이 있음을 알 수 있다.

(3) ACAT 효소 활성 저해 효과 검정

(단계 1) 마이크로좀의 제조

대조군과 0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군의 흰쥐들을 희생시켜 간을 적출하였다. 1g의 간 조직을 5 ㎖의 용액 1(0.1M 인산칼륨(pH 7.4), 0.1 mM EDTA 및 10 mM β-머캅토에탄올)을 이용하여 균질화하였다. 이 균질액을 4℃에서 3,000xg로 15분 동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 4℃에서 15,000xg로 15분 동안 다시 원심분리하였다. 상층액을 5 ㎖ 초원심분리 튜브(Beckman)로 옮기고, 4℃에서 100,000xg로 1 시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 3 ㎖의 용액 1 로 현탁시킨 후, 이 용액을 4℃에서 100,000xg로 1 시간 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 펠렛을 1 ㎖의 용액 1 로 현탁시켰다. 현탁액중의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정하고, 단백질 농도를 4 내지 8 ㎎/㎖로 조절하였다. 이 현탁액을 딥 프리저(deep freezer)에 보관하였다.

(단계 2) ACAT 활성 측정

아세톤에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 ㎕를 아세톤중의 10% 트리톤(Triton) WR-1339 6 ㎕와 혼합하고, 질소 가스를 이용하여 아세톤을 증발시킨 후, 10 ㎖ 부피당 300㎎의 콜레스테롤이 포함되도록 증류수를 가했다.

상기에서 얻은 콜레스테롤 수용액 10 ㎕, 10 ㎕의 1 M 인산 칼륨(pH 7.4), 5 ㎕의 0.6 mM 혈청 알부민(BSA), (단계 1)에서 얻은 마이크로좀 10 ㎕ 및 55 ㎕의 증류수를 혼합하였다(총 90㎕). 혼합물을 37℃에서 30 분 동안 수욕(water bath)에서 예비 반응시켰다.

올레일-CoA와 방사능 표지된 올레일-CoA를 혼합하여 제조된 10 ㎕의 올레일-CoA 용액(0.3 mg/ml)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 30분 동안 수욕에서 반응시켰다. 여기에 이소프로판올과 헵탄의 혼합 용액(혼합비 4:1(v/v)) 500 ㎕, 300 ㎕의 헵탄 및 200 ㎕의 0.1M 인산 칼륨(pH 7.4)을 가하고, 볼텍스(vortex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분 동안 방치하였다.

200 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액(Lumac 사 제품) 4 ㎖를 섞어 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 방사선량을 측정하였다. ACAT 효소 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 피코몰/분/㎎ 단백질 단위로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여가 ACAT 활성에 미치는 영향

시료	ACAT 활성 저해도(%)
대조군	0
0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군	20

표 4에서 보듯이, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 ACAT 활성을 20 % 정도 저해하므로, 콜레스테롤의 체내 흡수를 억제하고 있음을 알 수 있다.

(4) 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 HMG-CoA 환원효소 저해 활성 측정

HMG-CoA 환원효소의 활성을 측정하기 위해, 본 발명에서는 헐커(Hulcher) 등이 발표한 방법(J. Lipid Res. 14:625-641(1973))을 수정하여 사용하였다. 측정원리는 HMG-CoA가 HMG-CoA 환원효소의 작용에 의해 메발론산염으로 환원될 때 생성되는 조효소-A(CoA-SH)를 분광광도계로 측정하여 HMG-CoA 환원효소의 활성도로 환산하는 것이다. 구체적인 방법 및 그 결과를 하기에 나타내었다.

(단계 1) 마이크로좀의 제조

대조군과 0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼쿤 투여군의 흰쥐들을 희생시켜 간을 적출하였다. 3g의 간 조직을 100 ㎖의 차가운 염수(0.15M NaCl)와 100㎖의 차가운 완충용액 A(0.1M 트리에탄올아민 HCl, 0.2M EDTA 및 2mM 디티오트레이톨)로 세척한 후, 2㎖/g씩 차가운 완충용액 A를 가하고 파쇄한 다음 호모게나이저를 이용하여 균질화하였다. 이 균질액을 15,000xg로 15분 동안 원심원리하였다. 상등액을 새로운 튜브로 옮기고, 100,000xg로 60분 동안 초원심분리하여 침전물을 얻었다. 상층액을 버리고 침전물을 5㎖의 차가운 완충용액 A로 세척한 다음 100,000xg로 60분 동안 다시 초원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 1㎖의 차가운 완충용액 A로 세척하고 1.5㎖ 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.

(단계 2) HMG-CoA 환원효소 저해 활성 측정

HMG-CoA 환원효소 활성 측정에 사용되는 반응기질은 하기와 같다: ① 완충액 B : 0.1M 트리에탄올아민, HCl/0.02M EDTA(pH 7.4), ② HMG-CoA 용액 : 150 μmoles/배양혼합물, 및 ③ NADPH 용액 : 2 μmoles/배양혼합물.

상기 (단계 1)에서 얻은 현탁액(마이크로좀)을 반응기질과 혼합하여 원심분리 튜브에 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 20㎕의 0.01M 아비산 나트륨(sodium arsenite) 용액을 처리하여 1분간 방치하였다. 100㎕의 구연산 완충용액 (2M 구연산염, 3% 텅스텐산염 나트륨, pH 3.5)를 처리하여 37℃에서 10분 동안 반응시키고 25,000xg로 15분 동안 고속 원심분리하여 단백질을 제거하였다. 상층액 1㎖을 취하여 마개달린 튜브로 옮기고 2M 트리스-염산 용액(pH 10.6) 0.2㎖과 2M 트리스-염산 용액(pH 8.0) 0.1㎖을 넣어 반응물의 pH를 8.0으로 조절하였다. 여기에 20㎕의 DTNB 완충용액(3mM DTNB, 0.1M 트리에탄올아민 및 0.2M EDTA, pH 7.4)를 가하고 잘 혼합한 후 분광광도계로 412㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여, 형성된 CoA-SH의 양(HMG-CoA 환원효소 활성도)을 산출하였다. 이를 기준으로 하여, 대조군 및 네오헤스페리딘 디하이드로칼쿤 투여군의 HMG-CoA 환원효소 활성 저해도를 측정하였다.

그 결과는 표 5와 같다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘이 HMG-CoA 환원효소 활성에 미치는 영향

식 이 군	HMG-CoA 환원효소 저해 활성도(%)
대 조 군	0
네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군	30

실시예 2: 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘이 혈중 지질 대사에 미치는 영향

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 50대 중반의 남자에게 하루 10㎎/㎏의 양으로 캅셀제로 60일 동안 경구 투여한 후 혈중 콜레스테롤 및 중성지질을 측정하였다. 그 결과, 혈중 콜레스테롤과 중성지질은 각각 20%와 15%씩 감소하였다. 따라서 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 고지혈증 치료 효과를 가진다.

실시예 3: 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 동물 투여 실험 및 이로 인한 대식세포-지질층의 동맥내피상 축적 억제 효과 및 간기능 보호 효과

(1) 동물 투여

실험동물은 체중이 2.5-2.6 ㎏ 정도의 3개월령 뉴질랜드 백색종(New Zealand White)의 건강한 수컷 토끼 30마리(연암원예 축산대학으로부터 분양받음)를 온도 20±2℃, 습도 55±5%, 조명 12L/12D의 동물 사육실에서 사육하고 3개의 그룹으로 나누었다. 3개 그룹의 토끼에게 각각 세가지의 서로 다른 고콜레스테롤 식이, 즉, 정상 식이(토끼용 고형사료 RC 4 식이; 7.6%, 조단백질 22.8%, 조지방 2.8%, 조회분 8,8%, 조섬유 14.4%, 가용성 무질소물 42.7%, 콜레스테롤 1%)에 1% 콜레스테롤(대조군); 1% 콜레스테롤 및 0.05%의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘; 및 1% 콜레스테롤 및 대조약제 로바스타틴(1㎎/㎏)이 각각 함유된 식이를 하기 표 6과 같이 6주 동안 섭취시켰다.

고콜레스테롤 식이를 이용한 실험군

실험군	실험동물	마리수	투여기간	투 여 방 법
1	토끼 숫컷	6두	6주	1% 콜레스테롤 (대조군) 식이
2	토끼 숫컷	6두	6주	1% 콜레스테롤 + 로바스타틴(1mg/kg)(대조약제)
3	토끼 숫컷	6두	6주	1% 콜레스테롤 + 0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘

모든 식이들은 고콜레스테롤 식이(1%, wt/wt)에 해당하고, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 및 로바스타틴은 미국의 시그마사(Sigma Chemical company, St. Louis, Mo)로부터 구입하였으며, 토끼의 실험식 식이인 고형사료 RC 4 식이는 일본의 오리엔탈 이스트사(Oriental Yeast Co.)로부터 구입하였다.

(2) 혈액 화학 분석

상기 (1)에서 6주간 사육한 3개 식이군 토끼의 대퇴부에 케타민(ketamine, 50 mg/kg)을 근육 주사하여 마취한 다음 각 식이군의 토끼를 희생시키고 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 2시간 정도 정치한 다음 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층부의 혈청을 분리하고 초저온 냉동고에 보관하였다가 혈액분석에 사용하였다. 혈액 분석은 혈액화학분석기(CIBA Corning 550 Express, USA)를 이용하여 GOT, GPT, γGT, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성 지질 및 크레아틴 키나제(creatin kinase) 등의 변화를 측정한 다음 각 식이군간의 차이를 분석하였다.

(3) 대동맥내 지방선 분석

실험종료후 각 식이군 토끼의 흉부를 절개하여 대동맥궁을 따라 하방으로 5cm 정도를 절취한 후, 혈관 주변부의 지방을 잘 제거하고 대동맥의 중앙 부위를 종축 방향을 따라 절개하여 접시위에 핀으로 고정하고 사진 촬영을 하였다. 지방선 염색은 에스퍼 등의 방법을 이용하여 (Esper E. et al., J Lab Clin Med, 121, 103-110(1993)) 절개된 대동맥을 무수 프로필렌 글리콜로 각각 2분씩 3회 세척하고, 프로필렌 글리콜에 녹인 오일 레드 오(ORO) 포화 용액으로 옮겨 30분간 염색하였다. 염색된 대동맥을 85% 프로필렌 글리콜로 각각 3분씩 2회 세척하여 여분의 염색액을 제거하고 생리식염수로 세척한 후 사진 촬영을 하고, 투사하여 화상분석기(LEICA, Q-600, Germany)로 전체 대동맥 면적에 대한 염색 부위(지방선 부위)의 비율(%)을 계산하여 각 동물 실험군간의 동맥경화 죽상반 형성 정도의 차이를 분석하였다.

(4) 각 장기의 조직학적 관찰

실험종료 후 토끼 부검시 흉부를 절개하고 대동맥을 절취하여 상기 (3)의 지방선 분석에 사용하고, 곧바로 대동맥 일부와 심장, 폐, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여 육안적으로 특이 소견의 유무를 확인한 다음, 각 장기의 절반은 급속 동결시키고 나머지 절반은 10% 중성 포르말린에 넣어 24시간 이상 고정하였다. 고정시킨 각 조직들을 흐르는 물로 충분히 수세하고 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올로 단계적으로 탈수시킨 다음 파라핀 투과 과정을 거치고 포매장치(SHANDON, Histocentre 2, USA)를 이용하여 포매한 후 박절편기(LEICA, RM2045, Germany)로 약 4 ㎛의 두께로 조직 절편을 제작하여 H＆E 염색을 하고 크실렌으로 투명화 과정을 거친 다음 퍼마운트(permount)로 봉입하고 광학현미경으로 관찰하였다(100x 배율).

(5) 간 조직의 형태 계측

고콜레스테롤 식이와 각 시험물질들의 투여가 간 조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여 포그트 등의 방법(Fogt F. and Nanji AA. Toxicology and Applied Pharmacology, 136, 87-93(1996))과 키간 등의 방법(Keegan A. et al., Journal of Hepatology, 23, 591-600(1995))을 참고하여 각 실험군의 간조직 표본을 현미경으로 관찰한 후, 간 중심정맥을 기준으로 간소엽내 비정상 지방함유세포의 분포 비율 정도에 따라 1+ (0∼25%), 2+ (26∼50%), 3+ (51∼75%) 및 4+ (75∼100%)로 분류하고 점수를 산정하여 분석하였다.

상기 (2) 내지 (5)에서 얻어진 혈액분석치, 대동맥 지방선 및 간 조직의 비정상 지방함유 세포의 형태 계측치 등은 컴퓨터 통계 프로그램(Microsoft excel, version 7.0)을 이용하여 각 실험군간의 유의성 차이를 분석 및 검정(student t-test)하였다.

그 결과는 하기 표 7과 같다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여에 의한 고지혈증, 동맥경화증, 지방간 형성 억제 효과 및 간 기능 개선 효과

분석결과식이군	총콜레스테롤(㎎/㎗)	중성지질(㎎/㎗)	GOT(IU/ℓ)	GPT(IU/ℓ)	γGTP(IU/ℓ)	동맥내의지방선측정면적(%)	비정상적인 지방간세포비율
대조군	1143±260	56±38	77±8	65±9	4.2±0.9	35±14	3.2±0.3
로바스타틴 투여군	1210±263	66±17	125±19	73±9	12.4±0.8	5±4	3.4±0.5
네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군	1293±89	79±43	53±23	42±20	7.8±5	12±7	2.7±0.3

표 7에서 보듯이, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군은 대조군과 비교해 볼 때 동맥내피상의 죽상경화반이 대조군에 비해 거의 형성되지 않으며, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 로바스타틴과 비교해서 거의 동등한 약효를 가진다. 따라서 본 발명의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 혈중지질 강하제(고지혈증 예방 및 치료제)와 동맥경화 예방 및 치료제로서 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군은 간 기능의 요소인 GOT가 대조군과 비교해 약 31 % 강하되고, GPT도 약 35 % 강하된다. 간의 지방간 세포의 경우에도 로바스타틴 투여군 및 대조군에서는 간 조직에서 지방간 세포가 심하게 형성되나 본 발명의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군에서는 지방간의 형성이 크게 억제된다.

도 1a, 1b 및 1c는 각각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군 토끼의 동맥 내피 사진이다. 도 1a에서 보듯이, 대조군은 동맥내피 표면에 많은 대식세포-지질 복합체 형성에 의한 죽상경화반이 침착되어 있는데 반하여, 도 1b와 1c에서 보듯이, 로바스타틴과 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군은 동맥내피의 표면에 얇은 층의 죽상경화반이 침착되어 있다. 따라서 본 발명의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 혈중 콜레스테롤이 매우 높은 조건하에서도 동맥경화 예방효과가 강력하다는 것을 알 수 있다.

도 2a, 2b 및 2c는 각 대조군, 로바스타틴 투여군 및 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군 토끼의 간 해부 사진이다. 도 2a 및 2b에서 보듯이, 대조군 토끼의 간에는 중심 정맥 주변부에 지방질이 과도하게 함유된 세포들이 존재하고, 로바스타틴 투여군 토끼의 간에도 중심 정맥과 그 주변의 거의 모든 세포가 지방간 세포를 형성하는데 반하여, 도 2c에서 보듯이, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여군 토끼의 간에는 대부분의 간 세포가 정상적이며 일부 간 세포만이 지방간 세포를 형성하였다. 따라서, 본 발명의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 지방간 형성을 강력히 저해함을 알 수 있다.

실시예 4: 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 혈당 강하 효과

(1) 동물 실험

실험 동물은 생후 3주령의 스프라그-다우리종 수컷 흰쥐 20 마리를 실험실용 식이(Lab. chow pellet)로 사육하고, 체중 280g이 되었을 때 췌장 β세포에만 특이적으로 작용하면서 다른 기관에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보고된 스트렙토조토신(Junod A, et al., Diabetogenic action of streptozotocin : Relationship of dose to metabolic response. J Clin Invest, 48, 2129-2139(1969))을 이용하여 당뇨를 유발하였다. 즉 스트렙토조토신(Sigma chemical Co.)을 pH 4.5의 구연산 완충용액에 최대주사량이 1㎖ 이하가 되도록 녹여 45 ㎎/㎏ 체중의 양으로 근육에 주사하였다. 주사 후 24시간이 지난 때에 꼬리 혈액을 취하여 혈당을 측정한 결과, 350 내지 400 ㎎/㎗ 로 나타나 당뇨가 유발되었음을 확인하였다.

당뇨 유발후 1일째에 6시간 동안 공복시킨 후 꼬리정맥에서 채혈하여 고혈당을 확인한 후 난괴법(randomized block design)에 의해 2개 군으로 나누었다. 두 그룹의 쥐들에게 각각 두 가지의 서로 다른 식이, 즉, 기본 식이(AIN-76 반정제 식이)(대조군) 및 기본 식이에 0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘이 함유된 식이를 5주 동안 섭취시켰다.

모든 식이군의 쥐들은 항온(25±2℃)과 항습(50±5%) 그리고 자연조명의 일정한 환경하의 동물실험실에서 상기 실험 식이로 5주 동안 사육되었다. 모든 식이는 자유로 섭취하게하고 물은 매일 공급하여주면서 세균 번식을 피하도록 청결 상태를 유지하였다.

동물 사육이 종료된 다음날 아침 12시간 동안 절식시키고 에테르로 동물들을 마취시킨 다음 복강 투여하고 복부 대정맥(inferior vena cava)으로부터 채혈하였다. 혈액을 4℃에서 3000rpm으로 15분 동안 원심분리시켜 혈청을 분리한 후 -20℃에서 보관하였다. 또한 쥐들의 간, 심장, 신장을 적출하고 생리식염수로 여러번 세척하여 표면의 피를 제거한 후 중량을 측정하고 -20℃에서 보관하였다.

혈액의 당은 혈당측정기(Glucocard Ⅱ GT-1620, Kyto Daiichi Kagaku Co., LTP, model 5616239)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 8과 같다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 투여가 쥐의 혈당농도에 미치는 영향

식이군	포도당 (㎎/㎗)	포도당 감소량(%)
대조군	730 ± 65	0
0.05% 네오헤스페리딘디하이드로칼콘 투여군	550 ± 40	25

표 8에서 보듯이, 0.05% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 쥐의 혈당을 약 25% 강하시킨다.

(2) 인체실험

혈중 콜레스테롤이 230 내지 270㎎/㎗이고 중성 지질이 200 내지 220㎎/㎗인 고지혈증 환자(50대 중반 남자) 두 명에게 각각 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 캅셀제로 하루 6 내지 10 ㎎/㎏의 양으로 3개월 동안 투여하였으며, 2개월 후 혈당이 30 % 강하되었다.

실시예 5: 경질 캅셀제의 제조

다음의 성분들을 혼합하여 통상적인 방법에 의해 경질 젤라틴 캅셀을 제조하였다:

양(㎎/캅셀)

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 200

비타민C 50

락토오스 150

-----------------------------------------

총 400

상기 성분 분말을 잘 혼합하여 총 400 mg의 양이 되도록 경질 젤라틴 캅셀에 충진하였다. 제조된 캅셀을 하루에 1 내지 10개 섭취함으로써 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환 및 고혈당증을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한 상기 조성물들은 비타민 C외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

실시예 6: 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 이용한 식품의 제조

아이스크림 제조시에 0.01 ∼ 10%(w/w)의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 첨가하였다.

실시예 7: 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 이용한 오렌지 쥬스의 제조

오렌지 쥬스 제조시에 0.01 ∼ 0.5%(w/w) 의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 첨가하였다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 포유동물에서 동맥내피표면에 대식세포-지질 복합체의 형성을 억제하고, 콜레스테롤 합성효소인 HMG-CoA 환원효소의 활성을 억제하여 콜레스테롤 합성을 저해하며, ACAT 활성을 억제하여 콜레스테롤의 흡수를 저해하고, 혈청 GOT와 GPT를 강하시키며, 지방간 형성을 억제하고, 혈당을 낮추는 효과를 가지므로, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 포함하는 본 발명의 조성물은 동맥경화증, 고지혈증, 간 질환, 당뇨병의 예방 및 치료용 의약품 및 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

활성 성분으로서 유효량의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 유효량이 0.1 내지 500 ㎎/㎏ 체중/일인 조성물.
활성 성분으로서 유효량의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 고지혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
활성 성분으로서 유효량의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 간 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
활성 성분으로서 유효량의 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 고혈당증 예방 및 치료용 약학 조성물.