KR101761392B1 - 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물에 관한 것이다.
본 발명의 다당 분획물은 정상 마우스 및 면역억제 마우스 모두에서 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나 경쟁력 있는 면역 증강용 식품용 조성물 및 면역 증강용 의약품 제조에 효과적이다.

Description

면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법{Polysaccharide fraction isolated from Aster scaber Thunb. with immune-enhancing activity and method for producing the same}
본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물에 관한 것이다.
산나물의 대표격인 취나물은 국화과(Compositae)에 속하는 풀로 국내에 약 60여종이 자생하고 있으며, 이중 약 20 여종이 식용 가능한 것으로 알려져 있다. 국내에서 식용으로 이용되는 취나물의 종류로는 참취(Aster scaber), 개미취(Aster tataricus), 각시취(Saussurea pulchella), 곰취(Ligularia fischeri), 미역취(Solidago virga-aurea), 수리취(Synurus deltoides) 등이 있으나 주로 참취와 곰취 등이 독특한 향기로 가장 많이 이용되고 있다.
그 중 참취(Aster scaber Thunb.)는 우리나라에서 수확량이 가장 많은 다년생 초본식물로 백운초, 백산국, 동풍, 암취 및 나물취 등의 별명이 있으며, 또한 동풍채(東風菜)라 불리는 한방에서는 이뇨, 방광염, 두통, 해독, 진통 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 무기질, 비타민 C, β-carotene 등이 다량 함유되어 있어 항암 활성, 항산화력 등이 높은 것으로 보고되고 있다.
현재까지 알려진 참취의 생리활성 연구에는 참취 추출물을 포함하는 항고지혈, 항산화 및 항바이러스 활성을 갖는 추출물 및 그로부터 분리된 화합물에 관한 특허(한국등록특허 제831,645호)가 있으나, 그 용도가 항고지혈제, 항산화제 및 항바이러스제 등이고 면역 증강 효과나 본 발명자들이 연구한 당 조성을 가지는 다당체가 알려진 적은 없다.
본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법에 관하여 연구하던 중 본 발명의 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물은 특정 당 조성을 가지는 다당체를 포함하고 있으며, 면역기능을 증진하는 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 참취에 펙틴 가수분해 효소를 처리하는 상기 참취 유래 다당 분획물 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 참취에 펙틴 가수분해 효소를 처리하는 상기 참취 유래 다당 분획물 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물을 제공한다.
상기 분자량은 10 kDa 이상인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 10 내지 400 kDa 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 50 내지 400 kDa 일 수 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 중성 다당은 람노오스, 퓨코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성되는 것을 특징으로 한다. 더 상세하게는 상기 중성 다당은 상기 참취 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 람노오스는 5 내지 40 mole%, 퓨코오스는 0.5 내지 5 mole%, 아라비노스는 10 내지 20 mole%, 자일로스는 0.5 내지 5 mole%, 만노오스는 0.5 내지 7 mole%, 갈락토오스는 15 내지 45 mole%, 글루코오스는 1 내지 55 mole% 인 다당으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 다당 분획물은 참취에 펙틴 가수분해 효소를 처리하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다. 상기 제조방법은 상기 참취 효소 가수분해물에서 분자량 10 kDa 이상의 분획물을 회수하는 단계를 추가로 포함 할 수 있다. 상기 효소 처리된 참취 다당 분획물의 제조방법은 아래에 자세히 설명하였다.
본 발명의 상기 다당 분획물은 면역 증진 효능이 뛰어나다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 실시예들에 잘 나타나 있다.
본 발명에서는 참취 유래 다당의 처리 효소에 따른 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 상기 결과에서 펙틴 가수분해 효소를 이용하여 효소 처리하였을 때 참취 유래 다당소재 추출물의 면역증진 활성을 증진시키는 데 가장 효과적인 것으로 판단되었다(실시예 <1-2>, 도 4a 및 도 4b 참조). 따라서 이후의 효소처리는 펙틴 가수분해 효소를 이용하였다.
또한, 본 발명의 열수추출 조다당 추출물(ASW0), 그리고 효소 처리한 분획물(ASEz1)을 mouse peritoneal macrophage 세포에 처리하여 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다(실시예 <4-4>, 도 7a 및 도 7b 참조).
IL-6, IL-12는 대식세포에 의해 유도되는 대표적인 cytokine 으로 세균 감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며, 염증 병소에서 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 ß2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993).
또한 정상 마우스를 대상으로 면역 세포 증식능이 있는지 여부를 실험한 결과, T lymphocyte 증식능은 ASW0, ASE50 100 mg/kg 투여 군과 ASE10 100, 200 mg/kg 투여 군을 제외한 모든 다당시료 투여 군이 Control군에 비해 전부 유의성 있게 높았으며, B lymphocyte 증식능은 ASE10 100 mg/kg 투여 군을 제외한 모든 군에서 Control군에 비해 유의성 있게 높은 수치를 보였다(실시예 5 및 표 6 참조).
비장(spleen)은 혈액에서 유래되는 항원에 대한 주된 보호 면역 반응 부위로 B 및 T 림프구의 성숙과 항원의 자극에 의한 림프구의 분화가 이루어지는 주요 림프 기관으로 비장 내 림프구의 증식은 면역 시스템에서 매우 중요한 의미를 갖는다.
이로서 본 발명의 다당 분획물은 면역 기능 증진 활성이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 상기 다당 분획물은 면역력이 저하된 상태에서 면역 증진 효능이 뛰어나다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 하기 실시예들에 잘 나타나 있다.
Cychlophosphamide(Cy)로 면역을 억제한 마우스를 대상으로 비장세포(T 세포 및 B 세포)의 증식능, 백혈구 수 및 NK세포 활성 촉진능을 측정해보았다.
비장세포 증식능에 있어서, Cy 투여군은 비장세포의 증식능을 현저히 감소시켰으나, 효소처리 분획물(ASEz1)군은 Cy투여로 억제된 T와 B lymphocyte 증식능이 Cy투여 군에 비해 현저하게 증가되었다. 따라서, 비장세포(T 세포 및 B 세포)의 증식능에서 효소처리 분획물(ASEz1)군이 우수한 것을 확인할 수 있다(실시예 <6-3> 및 표 9 참조).
백혈구 수 측정에 있어서, WBC수 증가율을 비교해보면 모든 참취 유래 다당시료 투여군의 WBC수 증가율이 Cy군과 비교하여 50%이상의 증가율을 보였고, 그 중 ASW0, ASE300, ASE50 세 가지 다당시료 투여군의 증가율은 Cy 투여 군에 비해 100%이상의 증가율을 보였다(실시예 <6-2> 및 표 8 참조).
NK세포 활성 촉진능에 있어서, Cy투여는 NK cell의 활성을 정상 군에 비해 유의적으로 감소시켰으며, ASW0, ASEz1, ASE300, ASE50, ASE10 5개 다당 투여군의 NK cell activity도 Cy 투여 군에 비해 모두 유의성 있게 증가되었다. 따라서, NK세포 활성 촉진능에서 효소처리 분획물(ASEz1)군이 우수한 것을 확인할 수 있다(실시예 <6-4> 및 표 10 참조).
Cyclophosphamide는 악성 종양의 치료 및 장기이식 후 나타나는 거부반응의 억제제로 사용되고 있는 대표적인 약물로 알려져 있다. 그러나 Cyclophosphamide의 비선택적인 독성으로 인해 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 독성을 나타내어 백혈구 수 감소, 혈소판 감소, 빈혈 등과 같은 부작용을 나타내고 있다. 따라서 최근에는 이와같은 부작용이나 면역독성을 최소화 할 수 있는 물질을 발굴하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.
자연살해세포(NK cell)는 다양한 기전을 통해 암 세포나 바이러스에 감염된 세포를 직접적으로 공격하여 사멸시키는 기능을 가지며, 전체 림프구에서 5~10% 비율로 소량 존재하지만 정상 세포에서 돌연변이와 같은 이상이 감지되었을 때 가장 처음으로 방어하여 이를 제거하는 강력한 기능을 갖는다. 또한 다른 면역 세포의 기능 조절에도 매우 중요한 역할을 담당하여 선천면역 세포이면서도 획득면역 세포를 자극하여 더 강력한 방어 작용을 한다. 정상인의 경우, 유전 및 환경적 요인으자연 살해 세포에 의해 1차적으로 제거된다.
따라서 본 발명의 다당 분획물은 면역력이 저하된 상태에서 면역 증진 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
본 발명의 참취 유래 다당 분획물은 면역 기능 증진 활성이 매우 뛰어나기 때문에, 본 발명의 다당 분획물을 이용하여 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 참취 유래 다당 분획물은 면역력이 저하된 상태에서 면역 증진 효능이 매우 뛰어나기 때문에, 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 이용하여 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “면역 증강”은 생체 내 면역시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 참취 유래 다당 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 참취 유래 다당 분획물과 면역기능 증진의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 참취 유래 다당 분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다. 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 참취 유래 다당 분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다. 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기, 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 면역력 저하로 인한 질환은 면역 기능이 떨어져서 정상인 보다 더 쉽게 걸리게 되는 질환 또는 면역 기능 저하로 인해 치료가 어려운 질환을 의미하는 것이다. 상기 알러지 질환은 아토피, 천식 및 알러지성 비염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 다당 분획물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 참취 유래 다당 분획물은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로 부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 다당 분획물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 다당 분획물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 다당 분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 다당 분획물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한 본 발명은 참취에 펙틴 가수분해 효소를 처리하여 본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 제조하는 제조 방법을 제공한다. 상기 제조방법은 상기 참취 펙틴 가수분해물에서 분자량 10 kDa 이상의 분획물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 다당 분획물을 제조하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 참취 유래 다당 분획물을 제조하기 위해서 참취 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리한다.
본 발명자는 참취 분말에서 면역 활성 물질을 수득하는데 가장 적합한 효소를 찾기 위해, 여러 가지 당 분해효소로 열수추출한 참취 조다당 분획물에 다양한 효소들을 처리하여 cytokine 생산량을 측정한 결과, 펙틴 가수분해 효소가 가장 적합한 것을 발견하였다(실시예 <1-2>, 표 1, 도 4a 및 도 4b 참조).
펙틴 가수분해 효소는 참취 분말 중량 대비 0.01 내지 1% 만큼 첨가하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 0.01 내지 0.5% 이고, 가장 바람직하게는 0.05 내지 0.1% 일 수 있다. 효소를 처리하는 상기 참취 분말은 증류수로 5배 내지 15배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 가수분해 효소 처리는 10분 내지 30시간 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1시간 내지 24시간 일 수 있다. 처리 pH는 3.0 내지 5.0이 바람직하다. 효소 처리 후, 잔존 펙틴 가수분해 효소를 90 내지 110℃에서 10 내지 60분 동안 가열하여 효소를 불활성화하는 공정을 추가로 포함한다. 상기 가열로 인해 가용성 다당을 제거할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성, 침전시킴으로서 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
상기 제조방법은 상기 참취 효소 가수분해물에서 분자량 10 kDa 이상의 분획물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 분자량 10 내지 400 kDa의 분획물을 회수할 수 있다.
상기 추가 단계는 효소처리 후 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제거하여 얻은 다당 추출물로부터 분자량이 10 내지 400 kDa 인 분획물을 수득하는 단계로서, 수득 방법은 물질을 분자량에 따라 분리하는 공지의 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 제거할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 고분자 물질 수득 방법은 투석막을 이용한 투석 방법에 의해 조다당으로부터 목적 분자량 이하의 물질을 제거하는 방법 일 수 있다.
본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물, 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명의 다당 분획물은 정상 마우스 및 면역억제 마우스 모두에서 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나 경쟁력 있는 면역 증강용 식품용 조성물 및 면역 증강용 의약품 제조에 효과적이다.
도 1은 참취 유래 조다당 ASW0의 제조 방법에 관한 모식도 이다.
도 2는 참취 유래 효소 처리별 조다당 ASEz1~5의 제조 방법에 관한 모식도 이다.
도 3은 효소처리 참취 유래 다당의 분자량에 따른 분획물 제조 방법에 관한 모식도 이다.
도 4a는 효소처리에 따른 참취 유래 다당의 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-6 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEz2:cellulase β-glucanase hemicellulase로 처리한 조다당, ASEz3:α-amylase로 처리한 조다당, ASEz4:protease α-amylase lipase로 처리한 조다당, ASEz5:protease로 처리한 조다당)
도 4b는 효소처리에 따른 참취 유래 다당의 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-12 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEz2:cellulase β-glucanase hemicellulase로 처리한 조다당, ASEz3:α-amylase로 처리한 조다당, ASEz4:protease α-amylase lipase로 처리한 조다당, ASEz5:protease로 처리한 조다당)
도 5는 참취 유래 다당 ASWO와 ASEz1의 mouse peritoneal macrophages에서의 세포독성을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASWO:열수추출 조다당, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당)
도 6은 Pectinase로 처리한 참취 유래 다당의 분자 크기에 따른 mouse peritoneal macrophages에서의 세포독성을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEz300:분자량 300KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당, ASEz50:분자량 300KD<MWCO≤50KD인 pectinase로 처리한 조다당, ASEz10:분자량 300KD<MWCO≤10KD인 pectinase로 처리한 조다당)
도 7a는 참취 유래 다당 ASWO와 ASEz1의 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-6 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASWO:열수추출 조다당, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당)
도 7b는 참취 유래 다당 ASWO와 ASEz1의 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-12 분비 촉진능을 측정한 결과이다.
도 8a는 Pectinase로 처리한 참취 유래 다당의 분자 크기에 따른 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-6 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEz300:분자량 300KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당, ASEz50:분자량 300KD<MWCO≤50KD인 pectinase로 처리한 조다당, ASEz10:분자량 300KD<MWCO≤10KD인 pectinase로 처리한 조다당)
도 8b는 Pectinase로 처리한 참취 유래 다당의 분자 크기에 따른 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-12 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEz300:분자량 300KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당, ASEz50:분자량 300KD<MWCO≤50KD인 pectinase로 처리한 조다당, ASEz10:분자량 300KD<MWCO≤10KD인 pectinase로 처리한 조다당)
도 9는 효소 다당 분획물 ASEU50의 최적 공정도 이다. (ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당)
도 10은 참취유래 열수 추출물 ASW0(A), 효소처리 다당 추출물 ASEz1(B), 효소처리 다당분획물 ASEU50(C)의 HPLC를 통한 분자량 분포를 비교한 결과이다. (STD:standard)
도 11은 참취 유래 열수 추출물 ASW0, 효소처리 다당 추출물 ASEz1, 효소처리 다당분획물 ASEU50의 mouse peritoneal macrophages에서의 세포독성을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASWO:열수추출 조다당, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당)
도 12a는 참취유래 열수 추출물 ASW0, 효소처리 다당 추출물 ASEz1, 효소처리 다당분획물 ASEU50의 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-6 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASWO:열수추출 조다당, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당)
도 12b는 참취유래 열수 추출물 ASW0, 효소처리 다당 추출물 ASEz1, 효소처리 다당분획물 ASEU50의 mouse peritoneal macrophages에서의 사이토카인 IL-6 분비 촉진능을 측정한 결과이다. (Con:대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군, ASWO:열수추출 조다당, ASEz1:pectinase로 처리한 조다당, ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당)
도 13a는 참취유래 열수 추출물 ASW0, 효소처리 다당분획물 ASEU50의 Raw 264.7 macrophages에서의 세포독성을 측정한 결과이다. (ASWO:열수추출 조다당, ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당, IFN -γ:interferon-γ-양성대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군)
도 13b는 참취유래 열수 추출물 ASW0, 효소처리 다당분획물 ASEU50의 Raw 264.7 macrophages에서의 nitric oxide를 측정한 결과이다. ((ASWO:열수추출 조다당, ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당, IFN -γ:interferon-γ-양성대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군)
도 13c는 참취유래 열수 추출물 ASW0, 효소처리 다당분획물 ASEU50의 Raw 264.7 macrophages에서의 TNF-α를 측정한 결과이다. (ASWO:열수추출 조다당, ASEU50:최적 공정에 의한 분자량 50KD≥MWCO인 pectinase로 처리한 조다당, IFN -γ:interferon-γ-양성대조군, LPS:lipopolysaccharide-양성대조군)
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
조다당 분획물 제조
<1-1> 열수추출에 의한 조다당 분획물(ASW0) 제조
참취(Aster scaber Thunb.)는 2012년 전남 고흥군에서 생산되어 건조된 참취를 구입하여 분말로 만들어 실험에 사용하였다.
시료 분말 100g에 10배의 증류수를 가하여 100℃에서 추출한 후 4℃로 조절된 원심분리기(Mega 17R, Hanil Science Industrial Co. Ltd., Inchun, Korea)로 6,500×g 에서 20분간 원심분리 하였다. 분리한 상등액은 최종농도가 80%가 되도록 에탄올을 첨가하여 4℃에서 하룻밤 방치한 후 침전물을 원심분리기를 이용하여 회수하였다. 침전물을 소량의 증류수에 용해한 다음 투석막(MWCO; 6,000～8,000)을 이용하여 3일간 투석 하였고, 동결건조(Tokoyo Rikakikai Co. Ltd., FD-1000, Tokyo, Japan)하여 열수추출 조다당 분획물(ASW-0) 3.3%를 얻었다(도 1 참조).
<1-2> 열수추출 및 효소처리에 의한 조다당 분획물(ASEz1~5) 제조
시료 분말 100 g에 증류수 10배(w/v)를 가하여 현탁시키고, RAPIDASE C80MAX(Pectinase, from Aspergillus niger ; Ez1), ROHAMENTCL(Cellulase, from Trichoderma reesei ; Ez2), SPEZYME XTRA(α-amylase, from Bacillus licheniformis - Ez3), PANCREATIN(Protease, from pancreas of pig ; Ez4), PROTEX 6L (Endo-Protease, from Bacillus licheniformis ; Ez5) 총 5종류의 가수분해효소를 표 1의 조건으로 각각 처리하였다. 그 후 효소처리 반응을 101℃, 20분간 가열처리한 다음 6,500×g 에서 20분간 원심분리하여 잔사를 제거하고, 분리한 상등액은 최종농도가 80%가 되도록 ethanol을 첨가하여 하룻밤 방치한 후 다당을 침전시켰다. 발생한 침전물을 소량의 증류수에 용해시켜 투석막(MWCO;6000~8000)을 이용하여 저분자 물질을 제거한 후 동결 건조하여 효소처리 조다당 추출물(ASEz1~5)분획물을 얻었다. 이 때 ASEz1, ASEz2, ASEz3, ASEz4, ASEz5 의 수율은 각각 3.8, 3.1, 3.4, 3.0, 2.7%였다(도 2 참조).
참취 유래 다당의 처리 효소에 따른 mouse peritoneal macrophage의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. IL-6의 경우, 특히 pectinase를 처리한 군인 ASEz1은 모든 농도에서 다른 시료에 비해 높은 활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 정도의 차이가 존재하나, IL-12에서도 유사하게 관찰되었다(도 4a 및 도 4b 참조).
이상의 결과에서 펙틴 가수분해 효소를 이용하여 효소 처리하였을 때 참취 유래 다당소재 추출물의 면역증진 활성을 증진시키는 데 가장 효과적인 것으로 판단되어 이후의 효소처리는 펙틴 가수분해 효소를 이용하였다.
효소처리 조건
Trade name Enzyme Orgin conditions 사용량 반응시간 및 특징
RAPIDASE C80MAX pectinase Aspergillus niger pH 3.0~5.0
Tem. 10~55℃		 원료당 0.05~0.1% 45~50℃,1~2hr
10~15℃, 10~24hr
ROHAMENT
CL		 cellulase β-glucanase
hemicellulase		 Trichoderma
reesei 		pH 4.5~5.0
Tem. 50~60℃		 기질대비 0.05~0.2% 2~6hr
SPEZYME
XTRA		 α-amylase Bacillus licheniformis pH 4.5~6.0
Tem. 85~95℃		 전분중량대비
0.03~0.1%		 -
PANCREATIN protease
α-amylase
lipase		 돼지의 췌장 pH 7.0~8.0
Tem. 40~50℃		 0.05~0.2% 2~4hr
PROTEX
6L		 protease (Endo-type) Bacillus licheniformis pH 7.0~9.0
Tem. 55~60℃		 기질대비 0.1~0.3% 실활조건:
90℃, 15분유지
< 실시예 2>
효소 처리 참취 유래 조다당 추출물의 분자량에 따른 분획물 조제
면역 활성이 뛰어난 효소처리 조다당 추출물로 도 3과 같이 고분자 다당 분획물을 분리하였다. 효소처리된 시료액을 Sartocon Slice 200 Cassettes(Sartorius stedium biotech, Gyeonggido, Korea)를 이용하여 각기 다른 MWCO(Molecular weight cut off)를 가지는 Cassettes방식의 UF막을 장착한 UF장치(Semi Pilot scale)를 활용하여 각 분자량별로 분리한 후 동결건조하여 분자량 범위가 따른 조다당 분획물들을 조제하였다. 즉, 효소처리한 시료를 증류수에 일정량 녹인 다음 UF filter를 이용하여 MWCO 300KDa로 4~5번의 여과를 실행하여 여과되지 않은 액을 동결 건조하여 고분자 다당 ASE300 분획물을 얻었다. 여과된 여액을 MWCO 50KDa로 4~5번의 여과를 거쳐 여과되지 않은 액을 동결 건조하여 다당 ASE50 분확물을 얻었으며, 다시 여과된 Membrane MWCO 10KDa로 통과시켜 여과되지 않고 남아있는 여액을 동결 건조하여 다당 ASE10 분획물을 조제하였다(도 3 참조).
< 실시예 3>
참취 유래 당분획물의 특성 규명
<3-1> 열수 추출( ASW0 ) 및 효소처리 조다당 추출물( ASEz1 )의 이화학적 성분 특성 및 구성당 분석
이화학적 성분 분석은 시료중의 중성당 함량은 D-gulcose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법으로, 산성당 함량은 D-galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl법으로, TBA-positive material의 함량은 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로 하여 thiobarbituric acid법으로 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 단백질 함량은 BSA를 표준 물질로 하여 Bradford 법을 변형하여 사용하였다. 폴리페놀 화합물 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 것을 이용한 Folin Denis법을 일부 변형시켜 측정하였다.
구성당 분석은 Albersheim 등의 방법(21)을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성당을 alditol acetate와 aldonolactone로 유도체화 하여 GC(Gas Chromatography ACME-6100, Young-Lin Co. Ltd. Anyang, Korea)를 이용하여 분석하였다. 다당 시료를 2 M TFA(trifluroacetic acid) 중에서 121℃, 1.5 hr 반응시켜 가수분해한 후, 1 ㎖의 1 M NH4OH (ammonia solution)에 용해하여 10 ㎎의 NaBH4로 4 hr 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후, methanol을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 alditiol에 1 ㎖의 acetic anhydride를 가하여 121℃에서 30 min 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며 이를 chloroform/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다. 또 산성당의 구성을 분석하기 위하여 전환된 alditol을 증류수에 녹인 뒤, Sep-pak QMA Cartridge(Waters, Milford, MA, USA)에 전개하고 1 M HCl로 aldonic acid를 분리하였다. 분리한 용액에 2 M TFA를 가하여 100℃에서 5 min간 반응시켜 aldonolactone으로 전환시켰다. 그 후 chloroform/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 건조하여 GC 분석 시료로 사용하였으며, GC column은 SP-2380 capillary column(0.25 ㎜×30 m, 0.2 ㎛ film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을, detector는 Flame ionization detector(FID, Young-Lin Co. Ltd.)를 사용하였고, carrier gas로서 N2를 1.5 ㎖/min 으로 흘렸다. Injection 온도 250℃, detector 온도 270℃, Column 온도는 60℃에서 220℃까지 30℃/min, 220℃에서 250℃까지 8℃/ min의 조건하에서 실험하였다(표 2 참조). 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
GC 분석 조건
Apparatus GC ACME­6100 (Young­Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Detector Flame ionization detector(FID) (Young­Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Column SP-2380 capillary column (Supelco, Bellefonte, USA)
Column size 0.25 mm×30 m, 0.2 m film thickness
Oven temp. 60°C (1 min) → 220°C (12 min) → 250°C (15 min) 30°C/min 8°C/min
Injector temp. 250°C
Detector temp. 270°C
Carrier gas N2(1.5mL/min)
그 결과, 참취로 부터 열수 조다당 추출물(ASW0)과 RAPIDASE C80MAX(Pectinase) 효소처리 조다당 추출물(ASEz1)의 주요성분 함량과 구성당 조성 등의 이화학적 특성을 분석한 결과 표 3과 같았다.
구성 당 분석 결과
Chemical property ASW0 ASEz1
Yield (%) 3.3 3.8
Chemical composition (%)
Neutral sugar 45.7 58.4
Uronic acid 51.6 40.1
KDO-liked 0.4 1.2
Protein 2.3 0.3
Componet of neutral sugar (Mole%)
Rhamnose 9.4 10.6
Fucose 1.7 1.5
Arabinose 20.0 15.3
Xylose 0.5 1.3
Mannose 1.3 3.4
Galactose 17.6 20.5
Glucose 49.5 47.4
Componet of uronic acid (Mole%)
GalA+GlcA 51.6 40.1
상기 KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 말하며, GalA는 galacturonic acid, GlcA는 glucuronic acid를 의미한다.
<3-2> 효소처리 조다당 추출물( ASEz1 )의 분자량별 분획물의 이화학적 성분 분석
효소처리 참취 유래 다당 추출물의 기능성 증진을 위해 MWCO가 다른 UF cassette를 순차적으로 적용한 연속식 UF 시스템을 활용하여 분자량에 따른 다당분획물을 조제하였고, 이화학적 성분 분석은 상기 실시예 <3-1>의 방법과 동일하게 진행 하였다. UF cassette의 MWCO 수준을 300K, 50K, 10K 등으로 순차적으로 변화시키면서 다당 분획물들의 화학적 성분 함량을 살펴본 결과는 표 4와 같았다.
ASEz1 분자량별 성분 분석(%)
Yield Neutral sugar Uronic acid Protein KDO
ASEz1 1.6 60.3 38.1 0.4 1.2
ASE300 1.6 60.3 38.1 0.4 1.2
ASE50 1.1 61.8 36.5 0.3 1.4
ASE10 1.0 62.7 35.2 0.1 2.0
상기 ASE300은 분자량 300KD 이상의 다당분획물, ASE50은 분자량 50KD 이상 300KD 이하의 다당분획물, ASE10은 분자량 10KD 이상 50KD 이하인 다당분획물을 의미한다.
<3-3> HPLC 에 의한 분자량 측정
분자량 측정을 하기 위하여 표준물질(STD)과 열수 추출물(ASW0) 및 펙틴 가수분해 효소로 처리된(ASEz1) 각각의 다당 시료 20mg을 0.2 M NaCl 1ml에 녹인 후, 막여과지로 여과하여 HPLC(Jasco Co., Japan) 분석에 사용하였다. 사용된 Column은 GS520(7.5mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan)+GS320(8.0mm×300mmL, Showa Denko Co., Toyko, Japan)을 이동상으로는 0.2 M NaCl를 용매를 사용하였으며, 시료 주입량은 20 ㎕ 유속은 0.4 ml/min로 하였으며, refractive index detector(Jasco Co., Toyko, Japan)로 검출하였다. 정제다당의 분자량은 Pullulan Standard(P-800-2, 400-3, 100-2, 20-2, 10-2 및 5-2: Fluka, Switzerland)를 표준물질로 하여 얻어진 표준곡선과 비교하여 측정하였다.
< 실시예 4>
세포모델에서의 면역활성평가
<4-1> 실험 동물 준비
본 연구에 사용한 실험동물은 생후 5~6주령의 웅성 BALB/c를 3일간 적응을 거친 후 실험에 사용하였다. Mouse는 사육조에 2마리씩 넣어 일정한 온도, 습도로 유지되는 사육장에서 사육하였으며 물과 사료는 자유 급식 형태로 유지하였다.
<4-2> 세포 배양
본 실험에 사용한 mouse peritoneal macrophage 세포는 BALB/c mouse의 복강에 5% thioglycollate 배지(Sigma, St Louis, MO, USA)를 1 ㎖ 주입하고, 72～96 hr내에 유도된 macrophage를 PBS(Phosphate buffered saline, Gibco TM, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 회수하였다. 그 후 RPMI 1640 medium(Gibco TM, Grand Island, NY, USA)으로 2～3회 세척하고 세포 수를 2.5×106 cells/mL로 조정하여 96 well plate(NUNC Co., Roskilde, Denmark)에 배양하였다. 배지는 RPMI 1640에 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum, Gibco TM, Grand Island, NY, USA)와 1%(v/v) penicillin-streptomycin(Gibco TM, Grand Island, NY, USA)을 혼합해 사용하였다. 다양한 농도로 희석된 시료를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
Raw 264.7 cell line(KTCC No. 40071)은 한국 세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 DMEM 배지에 10% FBS, penicillin, streptomycin을 혼합해 사용하였다. 미리 rIFN-γ를 100 ng/mL의 농도로 처리한 후에 다양한 농도로 희석된 시료를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
<4-3> 면역계 관련 세포에 대한 독성 측정
각 세포에 대한 시료의 독성 여부는 MTT assay로 측정하였다. 96 well plate의 상등액을 조심스럽게 제거한 후, MTT 0.5 mg/mL [3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT, Sigma)] 용액을 200 ㎕ 씩 첨가하여 4 hr 동안 배양하여 formazan을 형성시켰다. 그 후, 상등액을 제거하고 DMSO 200 ㎕를 각 well에 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA 판독기(Infinite M200 Pro, TECAN, M, Switzerland)를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 참취 다당 시료 ASW0와 ASEz1를 0.12, 0.37, 1.11, 3.33, 10, 30 ㎍/mL의 농도로 mouse peritoneal macrophage 세포에 처리했을 때, 모두 80% 이상의 생존율을 보여 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
도 6에서 보는 바와 같이, 효소로 처리한 참취 유래 다당(ASEz1)을 분자 크기 별로 분리한 시료를 mouse peritoneal macrophage에 처리하여 독성 여부를 확인한 결과, ASEz1, ASE300, ASE50, ASE10 4가지 다당시료를 1, 10, 50 ㎍/mL의 농도로 세포에 처리했을 때, 유의적이지 않은 수준의 차이로 80% 정도의 생존율을 보여 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
<4-4> Cytokine 생산량 측정
배지로 희석시킨 고분자 분획 물을 농도 별로 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 hr 배양한 후, macrophage에 의해 유도, 분비된 상등액 중 cytokine의 양은 ELISA kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 즉, Anti-cytokine capture antibody를 coating buffer에 희석하여 96 well plate에 100 ㎕/well씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 방치하여 coating하였다. Tween 20(Sigma)을 PBS(Phosphate buffered saline)에 0.05% (v/v)가 되도록 가한 PBS/Tween 용액으로 plate를 3회 세척하였다. Assay diluent(PBS with 10% FBS)를 plate에 200 ㎕/well씩 넣은 후 상온에서 1시간 방치하였다. PBS/Tween로 3회 세척 후, 배양 상등액을 각 well에 100 ㎕씩 넣어준 뒤 2시간 상온에서 방치하였다. PBS/Tween로 5회 세척 후, detection antibody인 biotinylated antibody와 enzyme reagent인 stretavidin-horseradish peroxidase conjugate를 assay diluent(PBS with 10% FBS)에 희석하여 plate에 100 ㎕/well씩 넣은 후 상온에서 1 hr 방치하였다. PBS/Tween로 7회 세척 후, substrate solution(TMB substrate reagent Set, BD Biosciences)을 100 ㎕/well씩 넣은 후 암소에서 30 min 방치하였다. Stop solution인 2 N 황산용액을 well 당 50 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고 96 well plate reader를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에서 보는 바와 같이, 참취 다당 시료 ASW0와 ASEz1를 0.12, 0.37, 1.11, 3.33, 10, 30 ㎍/mL의 농도로 mouse peritoneal macrophage 세포에 처리하여 자극에 의한 mouse peritoneal macrophage의 cytokine 생산을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다(도 7a 및 도 7b 참조).
또한, 도 8a 및 도 8b에서 보는 바와 같이, 효소로 처리한 참취 유래 다당(ASEz1)의 분자량 크기에 따른 mouse peritoneal macrophage의 cytokine 생산 능력을 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다. IL-6의 경우, ASEz1의 활성과 ASE300의 활성의 모든 농도에서 유사하게 나타나 ASEz1 중 MWCO 300이상의 다당이 거의 모든 IL-6 생산에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 그 다음 크기인 ASE50에서도 대조군과 비교했을 때 약간의 활성이 나타났으며, ASE10은 거의 활성이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 정도의 차이가 존재하나, IL-12에서도 유사하게 관찰되었다. ASEz1의 활성과 ASE300의 활성의 모든 농도에서 유사하게 나타나 ASEz1 중 MWCO 300 이상의 크기를 가진 다당이 거의 모든 IL-12 생산에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 다만 IL-12의 경우 ASE50에서도 비교적 많은 활성이 나타나 IL-6에 비해 작은 크기의 다당에서도 활성이 확인되었다(도 8a 및 도 8b 참조).
< 실시예 5>
정상마우스 비장 면역세포 증식 효과
<5-1> 실험 동물 준비
본 연구에 사용된 실험동물은 7~8주령 된 수컷 SPF KM mouse 310마리(첫 번째 단계 70마리, 두 번째 단계 110마리, 세 번째 단계 130마리)를 연변대학 실험동물센터로 부터 분양 받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 5일 정도 실험동물실의 IVC시설에서 순화시킨 후 무작위로 매개 실험 군에 10마리씩 나누었다. 마우스 사양조건은 온도 23±1℃, 습도는 40～60%로 유지하였고, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다.
<5-2> 투여량 선정 및 투여방법
모든 다당 시료는(ASW0, ASEz1) 100 mg/kg, 200 mg/kg의 2개 투여량으로 나누어 위내에 직접 투여하였다. 대조군은 증류수 10 mL/kg을 위내에 직접 투여하였다.
<5-3> 세포 배양 및 세포 증식능 측정
다당 시료들을 28일간 투여한 후 마우스 비장세포 분리는 Mishell의 방법에 의해 시행되었다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 배양액으로 씻은 후 멸균 유리봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시켜 배양액으로 2번 세척하고, 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이것을 tris-buffered ammonium chloride(NH4Cl, pH7.2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 다시 RPMI medium 1640에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정한다. 세포농도 3.0×106 cell/mL로 분산시킨 후 96-well plate에 90 ㎕씩 분주, 배양하여 세포 증식능 측정에 사용하였다. Con A(concanavalin A)와 LPS(Lipopolysaccharides)는 각각 5 μg/mL, 10 μg/mL로 처리하였고, 비장세포 증식능은 배양액 10% FBS-RPMI 1640을 넣은 대조군의 흡광도와 비교하여 표현하였다.
비장세포에는 B 임파구, T 임파구 및 대식세포가 혼재되어 있으며, T 임파구는 성숙 T 임파구만이 존재하는 것으로 알려져 있다. 유사분열물질(Mitogen)로는 B lymphocyte 증식능을 측정하기 위하여 LPS(Lipopolysaccharides)를, T lymphocyte 증식능의 측정을 위하여 Con A(concanavalin A)를 사용하였다. 또한, 양성대조군으로는 미국과 캐나다 등지에서 면역력 증진 및 감기증상 개선용 의약품으로 판매중인 Afexa사의 인삼 유래 다당분획물인 CVT-E002를 주성분으로 하는 COLD-FX를 사용하였다.
표 6에서 보는 바와 같이, 마우스의 비장세포를 이용하여 면역세포의 증식능을 측정한 결과, T lymphocyte 증식능은 ASW0, ASE50 100 mg/kg 투여 군과 ASE10 100, 200 mg/kg 투여 군을 제외한 모든 다당시료 투여 군이 Control군에 비해 전부 유의성 있게 높았다(P<0.05 or P<0.01). B lymphocyte 증식능은 ASE10 100 mg/kg 투여 군을 제외한 모든 군에서 Control군에 비해 유의성 있게 높은 수치를 보였다(P<0.05 or P<0.01).
비장세포에서의 면역세포 증식능
Group Dose
(mg/kg)		 Number of animal N Absorbance Increasing rate(%)▲
T cell B cell T cell B cell
Control 0 10 0.291±0.043 0.356±0.042 - -
COLD-FX 100 10 0.362±0.041** 0.438±0.049** 24.4 23.0
COLD-FX 200 10 0.384±0.057** 0.489±0.068** 32.0 37.4
ASE10 100 10 0.299±0.038 0.368±0.060 2.8 3.4
ASE10 200 10 0.322±0.047 0.417±0.062* 10.7 17.1
ASE50 100 10 0.319±0.041 0.436±0.066** 9.6 22.5
ASE50 200 10 0.368±0.054** 0.468±0.075** 26.5 31.5
ASE300 100 10 0.336±0.039* 0.447±0.061** 15.5 25.6
ASE300 200 10 0.382±0.032** 0.496±0.058** 31.3 39.3
ASEz1 100 10 0.329±0.054* 0.412±0.069* 13.1 15.7
ASEz1 200 10 0.364±0.034** 0.442±0.072** 25.1 24.2
ASW0 100 10 0.319±0.046 0.413±0.072* 9.6 16.0
ASW0 200 10 0.354±0.052** 0.432±0.061** 21.7 21.3
*Compared with control group, P<0.05. ▲Increasing rate(%)=(absorbance of polysaccharide group－absorbance of control group)/absorbance of control group×100
<5-4> 장기중량 및 크기 측정
모든 실험동물의 비장과 흉선의 절대 장기 중량과 체중에 대한 상대 장기중량을 측정하였다.
그 결과, 표 7에서 보는 바와 같이, ASW0, ASEz1 다당시료 200 mg/kg투여 군과 COLD-FX, ASE300, ASE50 다당시료 100, 200 mg/kg투여군의 spleen index가 유의성 있는 증가가 관찰되었다(P<0.05)(표 7 참조). Thymus index 증가는 COLD-FX mg/kg투여 군에서만 유의성 있게 증가되었다.
정상마우스의 체중과 장기무게 변화
Group Dose
(mg/kg)		 Number of animal Body weight(g) Spleen
Index(SI)		 Thymus
Index(TI)		 Increased rate(%)▲
SI TI
Control 0 10 34.30±3.46 0.62±0.06 0.33±0.13 - -
COLD-FX 200 10 33.52±3.63 0.79±0.08* 0.44±0.10* 27.4 33.3
COLD-FX 100 10 34.21±2.93 0.76±0.07* 0.41±0.13 22.6 24.2
ASE10 200 10 33.64±3.65 0.70±0.40 0.37±0.15 12.9 12.1
ASE10 100 10 34.06±3.62 0.65±0.20 0.34±0.13 4.8 3.0
ASE50 200 10 33.76±3.67 0.76±0.09* 0.40±0.14 22.6 21.2
ASE50 100 10 34.84±3.52 0.71±0.06* 0.37±0.12 14.5 12.1
ASE300 200 10 34.24±3.32 0.78±0.15* 0.43±0.12 25.8 30.3
ASE300 100 10 35.01±3.69 0.73±0.08* 0.40±0.11 17.7 21.2
ASEz1 200 10 34.25±3.93 0.74±0.10* 0.41±0.10 19.4 24.2
ASEz1 100 10 34.33±3.28 0.70±0.07 0.38±0.09 12.9 15.2
ASW0 200 10 34.03±3.19 0.74±0.20* 0.42±0.12 19.4 27.3
ASW0 100 10 33.53±3.03 0.71±0.16 0.38±0.09 14.5 15.2
< 실시예 6>
면역억제 동물모델에서 면역력 증강 기능 평가
<6-1> 실험 동물 준비
실험동물과 다당시료 투여방법, 투여량은 정상 마우스 면역기능 평가 방법과 같다. Control군은 매일 1회씩 증류수를 경구 투여하였고 면역억제 모델군은 Cychlophosphamide(Cy) 100 mg/kg을 매일 1회씩 3일간 복강 주사하여 면역력을 억제한 후, 증류수를 14일간 경구 투여하였고, 기타 실험군은 Cy 100 mg/kg을 매일 1회씩 3일간 복강주사한 후, 다당시료들을 100 mg/kg과 200 mg/kg 두 가지 투여량으로 매일 1회씩 14일간 경구 투여하였다. 마지막 투여가 끝나고 24 hr 후, 체중 측정, 혈액 수집을 하였다. 마우스를 희생하여 비장과 흉선을 적출한 다음 중량 측정을 했고, 말초혈액 중의 백혈구 수, 비장세포의 증식능, NK세포 활성을 측정하였다. 비장세포 증식능 측정방법은 위에서 제출한 방법과 같다.
<6-2> 백혈구 수 측정
표 8에서 보는 바와 같이, Cyclophosphamide(Cy）100 mg/kg으로 면역억제 마우스 모델을 만들고 다당소재를 14일간 경구투여한 후 혈액중의 WBC를 측정한 결과, Cy 투여군의 WBC수는 정상 군에 비해 현저하게 감소되었고, 본 실험에 사용한 모든 다당 시료 투여는 Cy에 의해 저하된 백혈구수를 현저하게 증가시켰으므로 Cy로 인한 백혈구감소증을 어느 정도 회복시킬 수 있는 것으로 사료 된다. WBC수 증가율을 비교해보면 모든 참취 유래 다당시료 투여군의 WBC수 증가율이 Cy군과 비교하여 50%이상의 증가율을 보였고, 그 중 ASW0, ASE300, ASE50 세 가지 다당시료 투여군의 증가율은 Cy 투여 군에 비해 100%이상의 증가율을 보였다. 또한 ASW0, ASE300, ASE50 세 가지 시료는 WBC수가 동일한 COLD-FX 투여 군에 비해 다소 증가되었으나 통계학적 의미는 없었다.
혈액중의 백혈구 수 측정 결과
Group Dose
(mg/kg)		 Number of
Animal 		Number of WBC
(
Figure 112014071908846-pat00001
)		 Increasing
Rate(%)△
Control 0 10 4.01±1.44 -
Cy 100 10 2.02±0.36▲▲ -
COLD-FX 200 10 4.00±1.39** 98.0
COLD-FX 100 10 3.84±1.44** 90.1
ASE10 200 10 3.48±1.07* 58.4
ASE10 100 10 3.20±1.12 72.3
ASE50 200 10 4.38±1.17** 116.8
ASE50 100 10 3.29±0.92* 62.9
ASE300 200 10 4.75±1.88** 135.1
ASE300 100 10 3.58±1.31* 77.2
ASEz1 200 10 3.92±1.29** 94.1
ASEz1 100 10 3.73±1.17** 84.7
ASW0 200 10 4.38±1.38** 116.8
ASW0 100 10 3.33±0.82* 64.9
▲▲P<0.01 Compared with control group. *P<0.05, **P<0.01 Compared with Cyclophosphamide group. △Increasing rate(%)=(Number of WBC of polysaccharide group－Number of WBC of Cy group)/ Number of WBC of Cy group×100
<6-3> 비장세포 증식능 측정
면역억제 동물모델에서 참취 유래 다당의 비장세포 증식능을 측정하였다. 비장세포 증식능 분석은 실시예 <5-3>에서와 동일한 방법으로 시행하였다. 비장세포를 분리하여 단일세포 혼탁액을 만들어서 24 well plate에 분주하고 매개 well에 Con A 혹은 LPS를 일정한 농도로 첨가하여 72시간 배양한 후, MTT를 첨가하고 4시간 더 배양한 후 96 well plate에 이전하여 광밀도치를 측정하였다.
그 결과, 표 9에서 보는 바와 같이, Cy 100 mg/kg 투여군은 비장세포의 증식능을 현저히 감소시켰으며, COLD-FX와 ASE10 100mg/kg 투여 군을 제외한 나머지 다당시료 투여 군에서 Cy투여로 억제된 T와 B lymphocyte 증식능이 Cy투여 군에 비해 현저하게 증가되었다(P<0.05 or P<0.01).
비장세포에서의 면역세포 증식능
Group Dose
(mg/kg)		 Number of
Animal		 Absorbance Increasing rate(%)△
T cell B cell T cell B cell
Control 0 10 0.196±0.014 0.216±0.026 - -
Cy 100 10 0.075±0.017▲▲ 0.093±0.017▲▲ - -
COLD-FX 200 10 0.177±0.021** 0.189±0.031** 136.0 103.2
COLD-FX 100 10 0.124±0.042** 0.129±0.038* 65.3 38.7
ASE10 200 10 0.107±0.025* 0.128±0.025* 42.7 37.6
ASE10 100 10 0.086±0.028 0.111±0.030 14.7 19.4
ASE50 200 10 0.172±0.051** 0.190±0.068** 129.3 104.3
ASE50 100 10 0.165±0.043** 0.168±0.080** 120.0 80.6
ASE300 200 10 0.160±0.029** 0.243±0.035** 113.3 161.3
ASE300 100 10 0.140±0.020** 0.149±0.046** 86.7 60.2
ASEz1 200 10 0.145±0.062** 0.170±0.019** 93.3 82.8
ASEz1 100 10 0.138±0.036** 0.153±0.023** 84.0 64.5
ASW0 200 10 0.128±0.010** 0.181±0.034** 70.7 94.6
ASW0 100 10 0.120±0.030** 0.156±0.076** 60.0 67.7
Compared with control group, ▲▲P<0.01. Compared with Cyclophosphamide group, *P<0.05, **P<0.01. △Increasing rate(%)=(absorbance of polysaccharide group－absorbance of Cy group)/ absorbance of Cy group×100
<6-4> NK cell 활성 측정
NK cell의 세포독성은 NK세포가 암세포의 일종인 YAC-1 세포(NK-sensitive cell line)를 공격하여 파괴된 YAC-1 세포로부터 유리된 LDH를 측정하는 방법(modified lactate dehydrogenase(LDH) release assay)을 이용하여 측정하였다. 96-hole well U-bottom culture plate(Corning Glass Works, Corning, USA)에 1×104/100 ㎕가 되도록 YAC-1 세포수를 조정하고 분리된 비장세포와 같이 배양했다. 비장세포 수는 effector-to-target세포 비가 50：1이 되도록 조정하였다. 이후 5% CO2가 포함된 습도 90%, 37℃의 배양기에서 4시간 동안 반응시키고 원심 분리하여 LDH가 유리된 상등액 100 ㎕을 채취하여 flat-bottom microplates (Nunc, RosRilde, Denmark)에 옮겨 LDH release assay를 수행했다. LDH release assay는 ELISA(microtiter plate reader, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하였는데, 시약 (LDH substrate mixture)을 100 ㎕ 첨가하고 빛을 차단한 상태의 실온(15-25℃)에서 30분간 반응시킨 후, stop solution인 1N HCl 50 ㎕로 반응을 중지시켜 492 nm의 흡광도에서 측정하였다. Spontaneous LDH 측정을 위한 well에는 배양액만을 첨가하고 YAC-1 세포로부터 유리된 LDH의 최대치를 알기 위한 maximum LDH well에는 triton X-100 용액을 첨가하여 세포가 완전히 용해되도록(total lysis) 배양하였다. 독성의 백분율(% of cytotoxicity)은 각각의 배양액으로부터 유리된 LDH로 다음과 같은 공식을 이용했다.
NK cell activity(%)=
Figure 112014071908846-pat00002

그 결과, 표 10에서 보는 바와 같이, Cy투여는 NK cell의 활성을 정상 군에 비해 유의적으로 감소시켰으며(P<0.01), ASW0, ASEz1, ASE300, ASE50, ASE10 5개 다당 투여군의 NK cell activity도 Cy 투여 군에 비해 모두 유의성 있게 증가되었다(P<0.05 or P<0.01)(표 10). NK cell활성 증가율을 비교해보면 ASW0, ASEz1, ASE300, ASE50 200 mg/kg 투여군의 증가율이 Cy 투여 군에 비해 모두 50% 이상으로 나타났다(표 10).
면역억제 마우스에서의 NK cell 활성
Group Dose
(mg/kg)		 Number of
Animal		 NK cell activity（%）
(
Figure 112014071908846-pat00003
)		 Increasing rate(%)△
Control 0 10 54.01±11.37 -
Cy 100 10 37.55±6.59▲▲ -
COLD-FX 200 10 51.57±6.85** 37.3
COLD-FX 100 10 45.91±4.84** 22.3
ASE10 200 10 50.59±8.18** 34.7
ASE10 100 10 43.95±6.34* 17.0
ASE50 200 10 65.13±8.01** 73.5
ASE50 100 10 52.21±10.03** 39.0
ASE300 200 10 68.52±14.04** 82.5
ASE300 100 10 51.84±9.46** 38.1
ASEz1 200 10 63.23±6.33** 68.4
ASEz1 100 10 48.12±10.07** 28.2
ASW0 200 10 58.74±5.34** 56.4
ASW0 100 10 47.65±10.15** 26.9
▲▲Compared with control group, P<0.01. **Compared with Cyclophosphamide group, P<0.01. △Increasing rate(%)=(NK cell activity of polysaccharide group－NK cell activity of Cy group)/ NK cell activity of Cy group×100
< 실시예 7>
최종공정에 의한 참취 유래 면역증진 다당소재 제조 및 분석
<7-1> 최종 공정 확립 및 다당 소재 제조
이상의 모든 연구결과를 종합하여 보면, 참취에 펙틴 가수분해 효소를 처리한 50kDa이상의 다당 분획물이 면역증진 활성이 높은 것으로 확인되어, 면역 활성이 높은 참취 유래 다당 분획물(ASEU50)의 최종 제조공정은 도 9와 같이 확립하고, 이에 따라 참취 유래 면역증진 다당 분획물을 제조하였다.
<7-2> 이화학적 성분 특성 및 구성당 분석
앞서 제시한 최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물(ASEU50)의 이화학적 성분 특성, HPLC를 통한 분자량 분포 및 면역증진 활성 등을 열수 추출물(ASW0) 및 효소처리 다당 추출물(ASEz1) 등과 비교하여 살펴보았다.
이들의 이화학적 성분 특성을 살펴본 결과는 표 11과 같았다. ASW0은 중성당 45.7% 산성당 51.6%, 단백질 2.3%, KDO 0.4%로 구성되어 있었으며, 효소처리 조다당인 ASEz1의 중성당은 58.4%로 ASW0와 비교하였을 때 높은 함량을 나타내었으며, 산성당 함량은 40.1%로 낮은 함량을 나타내었고, KDO 함량은 1.2%로 비교적 높은 함량을 나타내었고, 단백질 함량은 0.3%로 가장 낮았다. 반면, ASEz1을 MWCO 50KDa이상의 분획물(ASEU50)의 구성당과 비교 분석한 결과에서는 ASEz1, ASEU50 모두 7종의 구성당이 주로 검출되었고, galactose, rhamnose 및 특이당인 KDO가 높은 비율로 함유되어 있었으며, 특히 galactose 및 rhamnose의 비율이 ASEz1보다 ASEU50에서 2~3배정도 높은 비율을 나타낸 반면, glucose(Glu)의 비율은 1/10정도로 감소하였다.
구성 당 분석 결과
Chemical property ASW0 ASEz1 ASEU50
Yield (%) 3.3 3.8 2.4
Chemical composition (%)
Neutral sugar 45.7 58.4 62.4
Uronic acid 51.6 40.1 36.0
KDO-liked 0.4 1.2 1.2
Protein 2.3 0.3 0.4
Componet of neutral sugar (Mole%)
Rhamnose 9.4 10.6 37.8
Fucose 1.7 1.5 3.6
Arabinose 20.0 15.3 12.0
Xylose 0.5 1.3 1.3
Mannose 1.3 3.4 1.0
Galactose 17.6 20.5 40.2
Glucose 49.5 47.4 4.1
Componet of uronic acid (Mole%)
GalA+GlcA 51.6 40.1 36.0
상기 KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 말하며, GalA는 galacturonic acid, GlcA는 glucuronic acid를 의미한다.
<7-3> 분자량 분석
최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물의 분자량 분포를 실시예 <3-3>에서와 동일한 방법으로 분석하였다. 참취 유래 효소처리 다당분획물(ASEU50)의 HPLC를 통한 분자량 분포를 열수 추출물(ASW0) 및 효소처리 다당 추출물(ASEz1) 등과 비교하여 살펴보았다(도 10 참조).
그 결과, 단순 열수 추출물(ASW0)의 경우 비교적 넓은 범위의 분자량을 가지는 다당체가 존재한 반면 pectinase 효소처리시(ASEz1)에는 분자량이 10K 이상인 3~4개 정도의 고분자 분획과 2개 이상의 저분자 분획들로 나누어 짐을 알 수 있었으며, 이를 다시 MWCO 50K cassette를 이용하여 UF 처리하였을 경우(ASEU50)에는 10K 이하의 저분자 분획이 제거된 분자량 10K이상의 고분자 다당분획물(ASEU50)을 얻을 수 있는 것으로 나타났다.
<7-4> Mouse peritoneal macrophage 세포에 대한 면역활성 측정
최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물의 mouse peritoneal macrophage 세포에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여 실시예 <4-3>에서와 동일한 방법으로 MTT assay를 실시하였다. 참취 다당 시료 ASW0, ASEz1와 ASEU50을 0.1, 1.0, 10 ㎍/mL의 농도로 mouse peritoneal macrophage 세포에 처리했을 때, 모두 80% 이상의 생존율을 보여 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않았다(도 11 참조).
최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물의 자극에 의한 mouse peritoneal macrophage의 cytokine 생산을 확인하기 위하여 실시예 <4-4>에서와 같이 ELISA 방법으로 측정한 결과, IL-6, IL-12의 분비를 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. IL-6는 모든 농도에서 ASW0와 ASEz1에 비해 ASEU50의 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. IL-12는 1.0, 10 ㎍/mL의 농도에서 ASW0와 ASEz1에 비해 ASEU50의 활성이 유의적으로 높았다(도 12a 및 도12b 참조).
<7-5> Raw 264.7 세포 주에 대한 면역활성 측정
최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물의 Raw 264.7 세포 주에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여 실시예 <4-3>에서와 동일한 방법으로 MTT assay를 실시하였다. Raw 264.7 세포 주에서 ASW0와 ASEU50 을 비교한 결과에서도 마찬가지로 추출물에 의한 세포독성을 나타내지 않았다(도 13a 참조).
최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물의 Raw 264.7 세포 주의 nitric oxide 생산을 확인하기 위하여, Raw 264.7 macrophage를 1×105 cells/mL의 농도로 24 well plate에 배양하고, 다양한 농도로 희석된 시료를 첨가하였다. 24시간 후, 배지 상등액을 회수하고 Griess reagent와 상등액을 1:1로 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 nitrite의 양을 나타내었다.
그 결과, 도 13B에서 보는 바와 같이, nitric oxide의 양을 농도 의존적으로 증가시킨 것을 확인할 수 있었다. 특히 ASE50은 ASW0에 비해 비교적 낮은 농도에서도 유의적인 활성을 보였다(도 13b 참조).
또한 최적 공정에 따라 조제한 참취 유래 효소처리 다당분획물의 자극에 의한 Raw 264.7 세포 주의 cytokine 생산을 확인하기 위하여 실시예 <4-4>에서와 같이 ELISA 방법으로 측정한 결과, cytokine TNF-α의 활성이 농도 의존적으로 나타나는 것을 확인하였으며, ASEU50의 수치를 ASW0와 비교한 결과 단순 열수추출방식에 비해 선택적으로 정제한 고분자 다당분획물이 더 좋은 면역 활성을 나타낸다는 점을 추측할 수 있었다(도 13c 참조).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계 및 상기 가수분해된 참취로부터 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되고, 전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량% 인 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물, 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명의 다당 분획물은 정상 마우스 및 면역억제 마우스 모두에서 면역 기능을 증진시키는 효능이 매우 뛰어나 경쟁력 있는 면역 증강용 식품용 조성물 및 면역 증강용 의약품 제조에 이용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (11)

  1. (a) 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 가수분해된 참취로부터 분자량 10 kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조되고,
    전체 참취 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 50 내지 70 중량%, 우론산(uronic acid)은 30 내지 50 중량%인 것을 특징으로 하는, 면역기능 증진 활성이 있는 참취 유래 다당 분획물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다당 분획물의 중성 다당은 람노오스, 퓨코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 구성되는 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 다당 분획물의 중성 다당은 상기 참취 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 람노오스는 5 내지 40 mole%, 퓨코오스는 0.5 내지 5 mole%, 아라비노스는 10 내지 20 mole%, 자일로스는 0.5 내지 5 mole%, 만노오스는 0.5 내지 7 mole%, 갈락토오스는 15 내지 45 mole%, 글루코오스는 1 내지 55 mole% 인 다당으로 구성되는 것을 특징으로 하는 참취 유래 다당 분획물.
  6. 삭제
  7. 제1항의 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물.
  8. 제1항의 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항의 참취 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력저하로 인한 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
  10. (a) 참취에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 가수분해된 참취로부터 분자량 10 kDa 이상의 다당 분획물을 수득하는 단계를 포함하는, 참취 유래 다당 분획물 제조방법.
  11. 삭제
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