KR101949885B1 - 면역 증강 활성 및 항암 활성이 있는 적양배추 유래 다당체 및 이의 제조방법 - Google Patents

면역 증강 활성 및 항암 활성이 있는 적양배추 유래 다당체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 증강 활성 및 항암 활성이 있는 적양배추 유래 다당체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 적양배추 유래 다당체는 면역 증강 효과가 우수할 뿐만 아니라 암 세포의 전이를 억제하는 효능이 우수하며, 자연살해세포를 활성화하여 종양 세포를 살해하는 능력이 매우 우수한 바, 면역 증강용 또는 암 개선용 식품 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역 증강 활성 및 항암 활성이 있는 적양배추 유래 다당체 및 이의 제조방법{Polysaccharide obtained from red cabbage with immune-enhancing activity, anti-tumor activity and method for producing the same}
본 발명은 면역 증강 활성 및 항암 활성이 있는 적양배추 유래 다당체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 약물을 이용하여 암세포를 직접적으로 공격하는 방법이 아닌, 체내의 면역계를 활성화하여 암을 치료하는 면역치료요법이 대두되고 있다. 이러한 치료요법은 정상세포에 독성을 유발하는 부작용이 없어 향후 주목되는 항암요법 중 하나로 평가되고 있다.
십자화과(Brassicaceae family) 식물은 전세계적으로 340 속, 3,350종이 존재한다고 알려져 있으며, 대표적으로는 적양배추, 무, 양배추, 배추, 케일, 유채 등이 속해있다. 이들은 4개의 꽃잎이 십자 형태를 이루는 것이 특징이며, 대부분이 초본이고 떡잎이 없는 것이 특징이다.
이 중 적양배추(Brassica oleracea L. var . capitata f. rubra)는 흰색 양배추보다 과당, 포도당, 라이신, 비타민 C 및 셀레늄이 풍부하다고 보고되고 있다. 특히 적양배추의 붉은색을 내는 성분인 안토시아닌은 항산화 효능뿐만 아니라 항암, 항염증 및 세포손상을 막아주는 효능이 있다. 또한 항노화, 콜레스테롤 저하활성, 항균작용, 심장 및 간 보호, 당뇨유발 쥐의 기능회복작용, 눈의 황변성 감소 등의 효과가 있다고 보고되고 있다. 그러나 이러한 물질들이 적양배추의 모든 약리활성을 나타낸다고 설명할 수는 없다.
최근, 천연물 유래 다당, 특히 펙틴은 물에 잘 용해되고 다양한 약리활성을 보이고 있다고 알려져 있다. 특히 cytokine 생산자극, macrophage 활성화 및 NK cell 자극활성 등과 같은 여러 생리활성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있으나 그 연구 결과가 아직 미미한 실정이다.
상기 천연물 유래 다당체와 관련하여, 한국등록특허 제1561648호에서는 감귤류 가공부산물 유래의 면역활성 다당체에 관하여 개시하고 있고, 한국등록특허 제1696076호에서는 면역활성이 증진된 가시파래 유래 다당류에 관하여 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2015-0132946호에서는 톳의 조다당체를 유효성분으로 하는 면역 증강용 식품 및 의약조성물에 관하여 개시하고 있으나, 아직까지 적양배추 유래의 다당체에 관한 발명은 연구되지 않았다.
한편, 본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법에 관하여 연구하던 중 적양배추를 저급알코올로 추출하고 남은 잔사로부터 분리정제된 다당체는 특정 당 조성을 가지는 다당체를 포함하고 있으며, 면역 기능을 증진하는 효능 및 항암 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-1561648 B KR 10-1696076 B KR 10-2015-0132946 A
본 발명의 목적은 적양배추를 저급알코올로 추출하고 남은 잔사로부터 분리정제된 것으로, 우수한 면역 증강 활성 및 항암 활성을 나타내는 적양배추 유래 다당체를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 적양배추 유래 다당체의 용도를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 적양배추 유래 다당체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득하는 단계; (2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 열수추출물을 C1 내지 C4의 저급알코올로 침전시켜 침전물을 얻는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 중성 다당(neutral sugar) 30 내지 50중량%, 우론산(uronic acid) 45 내지 65 중량%, 단백질 0.1 내지 5 중량%, Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.1 내지 5 중량%, 및 페놀화합물 0.1 내지 3 중량%을 포함하며, 중량평균분자량(Mw)이 30 내지 40 kDa인 것을 특징으로 하는, 적양배추 유래 다당체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 중성 다당은 람노오스, 퓨코오스, 아라비노오스, 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 중성 다당은 상기 적양배추 유래 다당체 100 중량부에 대하여 람노오스는 3 내지 10 중량부, 퓨코오스는 0.1 내지 5 중량부, 아라비노오스는 10 내지 30 중량부, 자일로오스는 1 내지 5 중량부, 만노오스는 1 내지 5 중량부, 갈락토오스는 5 내지 25 중량부 및 글루코오스는 1 내지 30 중량부인 다당으로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 다당체는 아라비노-β-3,6-갈락탄(arabino-β-3,6-galactan)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 중량평균분자량(Mw)이 30 내지 40 kDa일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명은 또한, (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득하는 단계; 및 (2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계;를 포함하는 적양배추 유래 다당체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제조방법은 (3) 상기 열수추출물을 C1 내지 C4의 저급알코올로 침전시키는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 적양배추 유래 다당체는 면역 증강 효과가 우수할 뿐만 아니라 암 세포의 전이를 억제하는 효능이 우수하며, 자연살해세포를 활성화하여 종양 세포를 살해하는 능력이 매우 우수한 바, 면역 증강용 또는 암 개선용 식품 조성물, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 적양배추 유래 다당체의 제조방법을 간략하게 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 적양배추 유래 다당체의 HPLC 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 적양배추 유래 다당체에 대하여 single radical gel diffusion을 진행한 결과를 나타낸 것이고, 도 3의 (B)는 본 발명에 따른 다당체와 β-glucosyl Yariv reagent 사이의 반응성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 적양배추 유래 다당체의 세포독성을 나타내는 그래프로서, 도 4의 (A)는 종양세포주인 B16BL6 melanoma에 대한 세포독성을, 도 4의 (B)는 대식세포에 대한 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 적양배추 유래 다당체의 mouse 복강유래 대식세포에 대한 cytokine 생산활성능을 나타낸 그래프로서, 상기 도 5의 (A)는 IL-6, (B)는 IL-12 및 (C)는 TNF-α의 생산활성능을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 적양배추 유래 다당체인 RCP의 정맥투여를 통한 NK cell의 taget cell에 대한 세포용해 활성(cytolytic activity)을 나타내는 그래프이다.
도 7은 B16BL6 종양세포를 접종한 실험동물 모델에서 RCP의 항전이 활성을 확인한 결과를 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득하는 단계; (2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 열수추출물을 C1 내지 C4의 저급알코올로 침전시켜 침전물을 얻는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 중성 다당(neutral sugar) 30 내지 50중량%, 우론산(uronic acid) 45 내지 65 중량%, 단백질 0.1 내지 5 중량%, Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.1 내지 5 중량%, 및 페놀화합물 0.1 내지 3 중량%을 포함하며, 중량평균분자량(Mw)이 30 내지 40 kDa인 것을 특징으로 하는, 적양배추 유래 다당체를 제공한다. 상기 적양배추 유래 다당체는 페놀화합물을 0.1 내지 3 중량% 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 적양배추 유래 다당체는 상기 적양배추를 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하고 남은 잔사로부터 분리정제된 것이다. 이 때 사용되는 물과 C1 내지 C4의 알코올의 혼합 비율은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 전체 다당체는 중성 다당(neutral sugar), 우론산, 단백질 및 Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사 물질로 이루어져 있으며, 페놀 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 전체 다당체는 중성 다당(neutral sugar) 중성 다당(neutral sugar) 30 내지 65 중량%, 우론산(uronic acid) 30 내지 65 중량%, 단백질 0.1 내지 5 중량% 및 Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사 물질 0.1 내지 5 중량%을 포함하는 것을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, 상기 다당체는 중성 다당(neutral sugar) 30 내지 50 중량%, 우론산(uronic acid) 45 내지 65 중량%, 단백질 0.1 내지 5 중량%, Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사 물질 0.1 내지 5 중량% 및 페놀화합물 0.1 내지 3 중량%로 이루어진 것일 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 다당체는 중성 다당(neutral sugar) 40.0 중량%, 우론산(uronic acid) 58.0 중량%, 단백질 0.5 중량%, Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사 물질 1.2 중량% 및 페놀화합물 0.3 중량%로 이루어진 것일 수 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 중성 다당은 람노오스, 퓨코오스, 아라비노오스, 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스로 이루어진 것을 특징으로 한다.
특히, 상기 중성 다당은 상기 적양배추 유래 다당체 100 중량부에 대하여 람노오스는 3 내지 10 중량부, 퓨코오스는 0.1 내지 5 중량부, 아라비노오스는 10 내지 30 중량부, 자일로오스는 1 내지 5 중량부, 만노오스는 1 내지 5 중량부, 갈락토오스는 5 내지 25 중량부 및 글루코오스는 1 내지 30 중량부인 다당을 포함하는 것을 특징으로 한다.
더 바람직하게는 상기 중성 다당은 상기 적양배추 유래 다당체 100 중량부에 대하여 람노오스는 7.7±0.3 중량부, 퓨코오스는 0.9 중량부, 아라비노오스는 27.5±1.0 중량부, 자일로오스는 2.4 중량부, 만노오스는 2.1±0.1 중량부, 갈락토오스는 17.2±1.2 중량부 및 글루코오스 2.3±0.1 중량부인 다당으로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 적양배추 유래 다당체는 아라비노-β-3,6-갈락탄(arabino-β-3,6-galactan)을 다량 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 적양배추 유래 다당체는 중량평균분자량(Mw)이 30 내지 40 kDa(main peak)일 수 있다.
본 발명의 적양배추 유래 다당체는 (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득하는 단계; 및(2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 적양배추 유래 다당체의 제조방법을 더욱 상세히 설명한다.
먼저, (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득한다.
상기 C1 내지 C4의 저급알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편, 상기 적양배추를 알코올로 추출하기 전에, 적양배추를 분쇄한 후, 분쇄된 적양배추에 대하여 1 내지 4 배(부피)의 물을 가한 후 0.5 내지 3 시간 동안 정치시키는 단계를 거치면 추출 효율을 더욱 높일 수 있어 바람직하다.
상기 저급알코올은 20 내지 80 부피%, 더욱 바람직하게는 40 내지 70부피%의 알코올 수용액인 것이 바람직하고, 상기 알코올 추출은 상기 적양배추와 물의 혼합물에 대하여 5 내지 20배 부피의 알코올을 첨가한 뒤 1 내지 6 시간 동안 추출하는 것일 수 있다.
상기 저급알코올로 추출하고 남은 잔사는 상기 적양배추에 함유된 알코올 불용성 성분인 것이다.
상기 단계 이후에, (2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계를 수행한다.
상기 열수추출물은 상기 잔사에 5 ~ 50 배 부피, 바람직하게는 10 ~ 30 배 부피, 가장 바람직하게는 20 배 부피의 물을 가한 후 70 ~ 120 ℃에서 1 ~ 6 시간 동안 가열하여 추출한 것일 수 있다.
다음으로, (3) 상기 열수추출물을 C1 내지 C4의 저급알코올로 침전시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
상기 열수추출물은 투석, 컬럼크로마토그래피, 막여과법 등을 이용하여 정제될 수 있으나, 설비 및 공정비용 면에서 보다 간편하고 저렴한 방법으로 C1 내지 C4의 저급알코올을 이용한 침전방법을 이용하여 정제하는 것이 바람직하다.
상기 정제는 열수추출물을 여과하여 불순물을 제거하고, 얻어진 여과액에 30-90 부피%, 더욱 바람직하게는 40-80 부피%의 C1 내지 C4의 저급알코올, 더 바람직하게는 에탄올을 가하여 암세포의 전이억제, 암 치료 효능 및 면역 증강활성을 가진 유용성 물질의 침전을 유도함으로써 정제될 수 있다. 상기 저급알코올의 농도가 상기 범위 미만이면 침전이 일어나지 않아 상기 유용성 물질을 얻기 힘들며, 상기 범위를 초과하는 경우에는 불순물의 함유량이 증가할 수 있고 제조비용이 증가되어 경제적이지 않다. 그리고, 상기 C1 내지 C4의 저급알코올은 상기 여과액에 대하여 2 내지 6 배(부피)로 가하는 것이 바람직하며, 상기 알코올을 가한 후 12 내지 36 시간 동안 정치시켜 당침전을 유도하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 열수추출물의 여과액을 그대로 이용할 수도 있으나, 상기 여과액을 농축한 뒤 침전을 유도하는 것이 침전물의 수율이 높으므로 바람직하다.
상기 침전물은 제조과정에서 사용된 알코올과 물 등의 용매가 다량 함유되어 있으므로 건조하는 과정이 필요하다. 상기 용매는 자연건조로 제거하기 어려우며, 고온 또는 감압 등에 의해서 제거될 수 있으나, 고온으로 가열시 면역 및 항암 활성 다당의 기능기가 가수분해되어 효능이 저하될 수 있으므로, 동결건조시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 침전물을 증류수에 재용해한 후 투석하는 단계를 더 수행하면, 면역 증강활성 및 항암 활성이 더 우수한 다당체가 얻어질 수 있다. 상기 투석은 0.5 내지 4일 동안 수행할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3일 동안 수행하는 것이 바람직하다. 그리고, 상기 투석시 사용되는 투석튜브는 분자량 절단점이 12,000-12,500 Da, 바람직하게는 12,400 Da인 것이 좋다.
상기 단계를 거침으로써, 더욱 항암 및 면역증강 활성이 우수한 다당체가 얻어질 수 있다.
본 발명의 적양배추 유래 다당체는 면역 증강 활성을 갖는다.
또한, 본 발명의 적양배추 유래 다당체는 암 전이 억제 활성이 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 적양배추 유래 다당체는 사이토킨인 IL-6, IL-12, TNF-α를 촉진시키고, 대식세포에 대해 뚜렷한 독성이 없으며, 자연살해세포의 활성을 증가시켜 암세포 살해능을 향상시키며, 종양세포의 전이를 억제하는 효능을 나타내는 바, 상기 다당체는 면역 증강활성 및 암예방 또는 치료 효능이 있다.
한편, 본 발명에 따른 다당체는 항암활성 및 면역증강 활성이 우수하여, 암세포의 전이억제, 암 치료 및 면역 증강 효과를 목적으로 하는 약학 조성물, 식품 조성물 또는 건강기능식품의 소재로 이용하는 것이 가능하다.
본 발명은 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "면역 증강"은 생체 내 면역시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 적양배추 유래 다당체 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 적양배추 유래 다당체와 면역증강의 효과 또는 암 예방, 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 적양배추 유래 다당체를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물 중 상기 적양배추 유래 다당체의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 40 중량%이다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 다당체를 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 적양배추 유래 다당체를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다. 상기 항암보조제는 항암제 치료 중에 면역증강 및 회복을 증진시키는 효과를 나타내는 보조제를 의미하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 면역력 저하로 인한 질환은 면역 기능이 떨어져서 정상인보다 더 쉽게 걸리게 되는 질환 또는 면역 기능 저하로 인해 치료가 어려운 질환을 의미하는 것이다.
본 발명은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 좁게는 NK cell의 기능 약화로 인한 암을 의미한다. NK 세포는 초기에 발견되는 암세포를 없애주고, 직접 암세포를 공격하여 괴사 및 자살사를 유도하여 재발 및 전이를 방지해준다. 본 발명의 적양배추 유래 다당체는 NK 세포의 암세포 살해능을 높여준다. 또한, 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 더 좁은 범위로 암 전이 억제용 조성물일 수 있다. 본 발명의 적양배추 유래 다당체는 항전이 활성을 보였다.
또한, 상기 암은 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 면역력 저하로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 본 발명의 다당체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 또는 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 또는 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 또는 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다.
본 발명의 다당체의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 다당체의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 kg 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg, 가장 바람직하게는 1 ㎍ 내지 10 mg일 수 있다. 그러나, 상기 본 발명의 다당체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 다당체를 항암제 및 면역증강제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경료 및 투여 방법에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 적양배추 유래 다당체가 활성화시키는 NK 세포는 바이러스에 감염된 세포나 종양세포 등에 대해서 강력한 면역작용을 나타내는 대표적인 자연면역(innate immunity) 세포로 알려져 있고(Roder JC, Pross HF, JClin Immunol; 2: 249-263, 1982), 혈액암인 급성 림프성 백혈병, 골수성 백혈병의 치료에도 이용된다(FranRomagnet al. F1000 Medicine Reports;03:09, 2011). 실제로 본 발명의 적양배추 유래 다당체를 처리한 NK 세포의 암세포 살해능이 현저하게 증가하는 것을 구체적인 실시예를 통해 확인하였다.
IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993). 또한, IL-6는 T 림프구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있으며(Lotz, M. et al., J.Exp. Med. 167, 1253-1258, 1988), T cell이나 thymocytes에 co-stimulator로 작용을 하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다(Kuby J. In 'Immunology' 2nd ed. 1994, Chap. 15. W.H. Freemn company. USA).
또한, IL-12는 NK cell 및 Th1 세포에 작용하여 INF-의 생산을 유도하게 됨으로써 세포성 면역의 유도에서 선천적인 NK cell 및 T 세포를 항원에 대항케 하는 effector form으로 분화하게 하는 작용이 있으므로 주로 Th1 성향의 세포성 면역계를 활성화시키는 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 대식세포로부터 IL-12의 생산능은 항원에 대항하는 자연 및 획득 면역계의 활성화에 중요한 요소로 작용되는 cytokine으로 간주되고 있다(Dredhe K. et al., Cancer Immunol. Immunother. 2002, 51, 521-531, 2002).
한편, TNF-α는 특정 암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체 반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Kuby J. In 'Immunology' 2nd ed. 1994, Chap. 15. W.H. Freemn company. USA).
이하, 본 발명의 적양배추 유래 다당체에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.
실시예
적양배추 유래 다당체 제조
<1-1> 열수추출물(RCW) 제조
(1) 적양배추 1kg을 거칠게 마쇄하고, 2배 부피인 2L의 물을 가하여 1시간 동안 정치하였다. 이후, 상기 혼합물에 대하여 8배 부피의 70 부피% ethanol (EtOH)을 첨가하여 2시간 동안 균질화 시킨 후, 원심분리기 (6,500 rpm, 20분, 4℃)를 이용하여 침전물을 회수하였다. 이를 10배 부피인 물에 용해시킨 후, 총 부피의 반이 될 때까지 열수추출을 진행하였다. 그 후, 원심분리기 (6,500 rpm, 30min, 4℃)를 이용하여 상등액을 회수하고, 상등액의 반량을 회전감압 농축장치를 이용하여 농축하였으며 이후 동결건조(FreeZone 12 Liter, Labconco, Kansas city, MI, USA)하여 열수추출물(RCW)를 얻었다.
<1-2> 조다당(RCP) 제조
상기 상등액 중, 나머지 반량의 상등액은 총 부피의 4배(부피)의 70 부피% ethanol (EtOH)을 첨가하여 24시간동안 정치하였다. 침전물은 투석막 (MW cut-off 14,400) (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 2일간 투석을 행하여 저분자 물질을 제거하였다. 이를 회전감압 농축장치를 이용하여 농축하였으며 이후 동결건조 (FreeZone 12 Liter, Labconco, Kansas city, MI, USA)하여 열수추출 조다당인 RCP를 얻었다(도 1 참조).
실험예
실험예 1. 분획물의 당 성분 분석
<1-1> 일반 성분 분석 및 구성당 분석
구성당 분석은 Albersheim 등의 방법을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성당을 alditol acetate로 유도체화하여 GC를 이용하여 분석하였다. 다당 시료를 2 M TFA (trifluoroacetic acid) 중에서 121℃, 1.5시간 반응시켜 가수분해한 후, 1 mL의 1 M NH4OH 용액에 용해하여 10 mg의 NaBH4로 4시간 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후, methanol을 가하며 건조를 반복함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 이 후 각각의 alditol은 1 mL의 acetic anhydride를 가하여 121℃에서 30분 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며 이를 chloroform/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다. Alditol acetate 유도체의 GC분석 조건은 하기 표 1과 같고, 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak면적, 분자량 및 Flame Ionization detector (FID)에 대한 molecular response factor를 각각 산출하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
GC(Gas chromatography) 분석조건
Apparatus GC ACME-6100
(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Detector Flame ionization detector(FID)
(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Column SP-2380 capillary column
(Supelco, Bellefonte, PA, USA)
Column size 0.25 mm × 30 m, 0.2 ㎛ film thickness
Oven temp. 60 ℃(1 min) → 220 ℃(12 min) → 250 ℃(15 min)
30 ℃/min 8 ℃/min
Injector temp. 240 ℃
Detector temp. 260 ℃
Carrier gas N2 (1.5 mL/min)
Chemical composition(%) RCW RCP
중성 다당(Neutral sugar) 60.0±5.0 40.0±1.6
우론산(Uronic acid) 36.7±0.8 58.9±1.7
단백질 1.4±0.1 0.4±0.5
Kdo 유사 물질 2.3±0.5 1.0±0.5
페놀 화합물 0±0.3 0±0.4
Component sugar(%)
Rhamnose 5.0±0.3 7.7±0.3
Fucose 0.5±0.1 0.9±0.0
Arabinose 14.6±0.0 27.5±1.0
Xylose 1.7±0.0 2.4±0.0
Mannose 1.9±0.1 2.1±0.1
Galactose 8.1±0.2 17.2±1.2
Glucose 28.2±0.7 2.3±0.1
KDO + DHA 2.3±0.5 1.0±0.5
GalA + GlcA 36.7±0.8 58.9±1.7
상기 표 2에서, KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 의미하고, DHA는 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid를 의미한다.
또한, GalA는 갈락투로닉산(galacturonic acid)을 의미하고, GlcA는 글루쿠로닉산(glucuronic acid)을 의미한다.
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 획분의 화학적 특성을 살펴본 결과, RCW는 중성당 60.0% 및 산성당 36.7%로 구성되어 있었으며 단백질 및 KDO는 소량 검출되었다. RCP는 중성당 40.0%, 산성당 58.9% 및 소량의 단백질과 KDO가 검출되었다.
한편, RCW와 RCP를 산가수분해한 후, alditol acetate 유도체로 전환하고 구성당을 분석하였다. RCW는 glucose와 arabinose가 각각 28.2%, 14.6%의 높은 비율로 함유하고 있었으며, RCP는 arabinose와 galactose가 27.5%, 17.2%의 비율로 함유하고 있었다. 또한 RCW와 RCP는 uronic acid가 각각 36.7%, 58.9의 비율로 높게 함유하고 있었다(표 2). 일반적으로 펙틴 유래 다당은 주로 homogalacturonan, rhamnogalacturonan(RG)-I 및 RG-II로 구성되어 있다고 보고되고 있는데, 특히 RG-I의 경우 RG 주쇄에 arabinan, galactan 및 arabinogalactan가 고도로 분지된 구조를 가지고 있다고 알려져 있다. 따라서 RCP의 구성당 분석 결과로 미루어 볼 때, 이들은 galactan, arabinan 혹은 arabinogalactan이 분지된 전형적인 RG으로 존재할 가능성을 시사하였다.
<1-2> 분자량 분포 측정
적양배추 유래 단순 열수추출물 RCW와 조다당 RCP의 순도 확인 및 분자량 측정을 위해 Ashai-Pak GS-520+GS-320+GS-220을 이용하여 HPLC (high performance liquid chromatography)를 행하였다. 분자량 측정시 이용된 표준물질인 pullulan series (P-800, 400, 200, 100, 50, 20, 10 및 5)를 이용하여 각각의 retention time을 구한 후, 각 분자량에 대한 Kav 값을 산출하여 얻은 표준곡선으로부터 환산하여 분자량을 결정하였다.
[계산식 1]
Figure 112017074628762-pat00001
Vt : total volume, Vo : void volume, Ve : ellution volume of sample
표준물질 (pullulan series)을 이용하여 RCW와 RCP의 주 peak 분자량을 확인한 결과(도 2), RCW의 경우 730 kDa, 93 kDa 및 31 kDa 분자량을 가진 peak pattern이 나타나 다양한 물질을 함유하고 있다는 것을 확인하였으며, RCP의 경우 34 kDa의 분자량이 주요 peak pattern을 이루고 있는 다당인 것으로 확인되었다.
<1-3> β­ Glucosyl Yariv reagent를 이용한 arabino -β-3,6- galactan (type-Ⅱ)의 존재 확인 및 정량
Arabino-β-3,6-galactan (type-II)의 존재를 확인하기 위한 β-glucosyl Yariv reagent (Biosupplies, Parkville, Australia)와의 반응성 검토는 single radical 젤 확산법으로 측정하였다. β-Glucosyl Yariv reagent 10 μg/mL를 함유한 0.15 M NaCl agarose 평판을 조제하고 직경 2.5 mm의 well을 만들어 2배수로 희석한 표준물질 gum arabic 및 시료 5 μg을 함유한 용액을 각각의 well에 loading하였다. 이 평판을 습윤 상태에서 상온에서 12시간 이상 반응시키고, 생성된 붉은색 침전환을 관찰하여 arabino-β-3,6-galactan의 존재 유무를 확인하였다. 이때, 시료와 β-glucosyl Yariv reagent와의 반응성은 생성된 침전환의 넓이를 비교, 계산하였다(도 3(A)).
적양배추 유래 열수추출 조다당인 RCP의 경우 galactose 및 arabinose가 높은 비율로 구성하고 있어 arabinogalactan으로 존재할 것으로 예상되어 이를 확인하기 위하여 β-glucosyl Yariv reagent와의 반응성을 확인하였다. β­Glucosyl Yariv reagent [1,3,5-tri-(4-β-glucopyranosyl oxyphenylazo)-2,4,6- trihydroxybenzene]는 다당과 반응하는 유일한 발색 시약이며 arabino-galactan 중에서도 II형의 arabino-β-3.6-galactan과 특이적으로 반응하여 적색 침전을 형성하는 것으로 알려져 있다. 이 시약을 이용하여 적양배추 유래 단순 열수추출물 RCW와 열수추출 조다당 RCP에 대한 single radical gel diffusion을 진행하였다. 그 결과, arabino-β-3,6-galactan의 표준물질인 gum arabic의 경우, 62.5 μg/mL 농도부터 1,000 μg/mL 농도까지 농도 의존적으로 침전환이 커짐을 확인할 수 있었다. 또한, 적양배추 유래 단순 열수추출물 RCW와 열수추출 조다당 RCP에서도 침전환이 관찰되었다. 이를 표준물질의 침전환과 비교한 결과, 전체 구조에 arabino-β-3,6-galactan이 RCW의 경우 2.41%, RCP의 경우 9.69% 포함되어 있음을 확인할 수 있었다(도 3(B)). 따라서 RCW 및 RCP의 구조 내에는 II형 arabinogalactan 구조가 일부 포함되어 있으며, 특히 적양배추로부터 분리한 조다당 RCP는 비교적 RCW보다 arabino-β-3,6-galactan이 더 높은 비율로 함유되어있는 것을 확인하였다.
실험예 2. 정상세포 및 암세포에 대한 세포 독성
종양세포 및 일반세포에 대한 시료의 세포독성 여부를 확인하고자 종양세포주인 B16BL6 melanoma 및 mouse macrophage cell를 각각 2 × 106 cells/mL의 농도로 계수한 후 flat­bottomed 96­well microplate에 100 μL씩 분주하고 여러 농도로 조정된 적양배추 시료를 각 well에 100 μL씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 1일간 배양하였다. 각 시료농도에 따른 세포 독성의 효과는 EZ-cytox (Dogen, Seoul, Korea)를 5배 희석하여 well 당 100 μL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 15∼60분간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2 × 106 cells/mL로 조정된 종양 및 일반세포주에 RCW와 RCP를 1, 10, 100 및 1000 μg/mL까지의 다양한 농도로 가하여 배양한 후 세포의 생존여부를 확인하였다. B16BL6 세포의 경우 두 시료 모두 암세포를 직접적으로 사멸시키는 것을 확인하였다(도 4(A)). 또한, 각 실험 농도에서 mouse 복강 유래 macrophage 세포에서는 뚜렷한 독성을 나타내지 않았으며, RCP의 경우 시료농도 1 μg/mL 이상에서 세포 증식 효과가 관찰되었다(도 4(B)). 이상의 결과로부터 적양배추 유래 단순 열수추출물 RCW와 열수추출 조다당 RCP는 암세포에 대해 직접적인 사멸을 나타냈으며, 일반세포에 대해 증식능이 관찰되었다.
실험예 3. 대식세포 활성능
BALB/c (6 weeks, ♀) mouse 복강에 5% thioglycollate medium 1 mL를 주입하여 72시간 동안 유도된 macrophage (2.0 × 106 cells/mL of DMEM) 100 μL를 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. 여기에 다당시료의 최종농도가 8 μg/mL에서 1000 μg/mL가 되도록 5배씩 희석하고 flat­bottomed 96­well microplate에 100 μL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 900 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하여 세포배양액을 회수하고 상등액 중에 유도된 cytokine의 함량을 측정하였다.
대식세포 (macrophage)에 의해 생산된 cytokine은 sandwich ELISA (enzyme­linked immunosorbent assay)에 의해 분석하였다. 각 cytokine의 항체는 coating buffer에 희석하여 flat­bottomed 96­well microplate에 coating한 후 4℃에서 12시간 방치하였다. Coating이 완료된 microplate는 washing buffer (PBS with 0.05% tween 20, PBST)를 이용하여 3회 세척하고, 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하기 위해 assay diluent (PBS with 10% FBS or 2% skim milk) 200 μL를 가한 후 1 시간 동안 방치하였다. Blocking 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 재차 3회 세척하고, 각 well에 2배로 연속 희석한 표준물질 (recombinant mouse cytokine)과 면역세포배양액을 각각 50 μL씩 분주하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 washing buffer로 5회 세척하고 희석된 detection antibody (in assay diluent) 100 μL를 처리하여 실온에서 1시간 방치한 후 재차 7회 세척하였다. Enzyme reagent (avidin­horseradish peroxidase conjugate) 100 μL를 처리하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 substrate solution [tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide] 100 μL씩 처리하여 암실에서 30분간 반응시켰다. 이후, 50 μL의 stop solution (2 N H2SO4)을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
적양배추 시료의 직접적인 자극에 의한 macrophage의 cytokine 생산을 in vitro에서 측정한 결과(도 5), 적양배추 열수추출물 RCW는 cytokine 생산능을 거의 나타내지 않는 반면, 열수추출 조다당 RCP는 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생산이 8 μg/mL의 저농도에서도 높게 나타냈다. 이러한 결과들로 미루어 보아 적양배추 유래 열수추출 조다당 RCP가 단순 열수추출물 RCW보다 생체방어에 작용하는 면역세포를 활성화(조절)하는 기능이 더 우수하다고 판단되었다.
실험예 4. 자연 살해 세포(NK cell)에 의한 종양 세포 살해능
앞선 연구에서 mouse로부터 유도한 macrophage를 이용하여 cytokine 생산능을 측정한 결과 높은 IL-6, IL-12, TNF-α 생산능을 보여준 적양배추 유래 열수추출 조다당 RCP 시료를 BALB/c (6 weeks, female) mouse에 10, 100 및 1000 μg/mouse 농도별로 3일전과 1일전에 정맥주사(i.v.)하였다. 1일 후에 경추탈골법으로 치사시켜 무균 상태에서 비장 (spleen)을 적출하고, stainless steel mesh를 이용, PBS를 가한 후, 비장을 마쇄 (100 mesh) 및 여과 (200 mesh)하여 비장세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 mL을 15∼30초 동안 가하여 혼입된 적혈구를 파괴하고 무혈청 배지 (hydroma-SFM, Gibco)로 2∼3회 세척 후 세포수가 1 × 106 cells/mL가 되도록 조정하고 이를 effector cell로 사용하였다. NK cell에 대한 감수성이 높은 종양세포주인 YAC-1을 target cell로 하여 round-bottomed 96-well microplate에 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 100, 50, 25이 되도록 조정하여 가하였다. 이후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 배양 후 effect cell의 살해 능에 의해 target cell로부터 유리되는 lactate dehydrogenase (LDH)의 발생양을 EZ-LDH (Dogen, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였으며, NK cell의 종양세포 살해시 발생하는 LDH는 다음 식에 의해 계산하였다.
[계산식 2]
NK cell 활성(%)
= [(experimental-effector spontaneous)/(target maximum-target spontaneous)]×100
그 결과 도 6에서 보는 바와 같이 적양배추 유래 열수추출 조다당 RCP를 각 10, 100, 1000 μg/mouse로 정맥 주사하여 얻어진 비장 유래 세포(splenocytes, NK cells)는 target cell인 암세포주 (YAC-1)에 대한 effect cell (splenocytes)의 비율(E/T ratio)이 증가할수록 유의적으로 종양세포에 대해 높은 살해능을 나타내었으며, 특히 살해능은 E/T ratio=100:1에서 가장 우수한 활성이 관찰되었다. 이를 통해 적양배추 유래 열수추출 조다당 RCP는 종양세포에 대한 살해능을 가지는 NK cell의 활성화에 기여함을 확인할 수 있었으며, 따라서 NK cell 활성화에 의한 항암활성을 가질 것이라 결론지었다.
실험예 5. B16BL6의 종양 세포에 대한 항전이 활성능
시료의 항전이 활성은 폐 (lung)에 대한 고전이성 종양세포주인 melanoma B16BL6을 이용한 실험동물 종양전이 모델을 이용하였다. 시료에 의한 종양전이 효과를 관찰하기 위해 적양배추 유래 열수추출 조다당 RCP 시료를 각 농도별로 실험 3일전과 1일전에 정맥주사(i.v.)하였다. 이후, B16BL6 lung melanoma (3 × 104 cells/mouse)를 BALB/c mouse에 정맥 주사하였다. 종양접종 14일 뒤 mouse를 치사시키고, 종양세포의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's solution (Sigma)으로 전이된 종양을 고정시킨 후, 전이된 종양의 colony를 계수하였다. 시료에 의한 항종양전이 효과는 종양만을 접종한 대조군과 비교하여 산출하였다.
그 결과(도 7), 생리식염수를 정맥주사(i.v.)한 대조군이 100% 전이된 것으로 하여 RCP의 항전이 활성을 확인한 결과, RCP를 정맥주사(i.v.)한 군에서 농도의존적인 항전이 활성을 나타내었다. 특히, 1000 μg/mouse 정맥주사(i.v.)한 군에서 대조군 대비 약 47%이상의 우수한 항전이 효과가 확인 되었다. 이는 RCP를 정맥주사(i.v.) 할시 종양의 전이를 억제하는데 유효함을 나타내며, 앞선 NK cell 자극 활성실험의 유효 투여량 대비 더 낮은 농도에서도 항전이 활성을 보임을 확인하였다. 이는 RCP에 의한 종양전이 억제효과가 주로 NK cell의 활성화에 의한 활성임을 알 수 있었다. 종합적으로, RCP는 대식세포를 활성화 시키는 것으로 확인되었으며, 활성화된 대식세포가 분비하는 cytokine에 의해 NK cell이 활성화되어 강력한 항전이 효과가 나타내는 것으로 최종 확인되었다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (13)

  1. (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득하는 단계; (2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 열수추출물을 C1 내지 C4의 저급알코올로 침전시켜 침전물을 얻는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조되고,
    중성 다당(neutral sugar) 30 내지 50 중량%, 우론산(uronic acid) 45 내지 65 중량%, 단백질 0.1 내지 5 중량%, Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.1 내지 5 중량%, 및 페놀화합물 0.1 내지 3 중량%을 포함하며, 중량평균분자량(Mw)이 30 내지 40 kDa인 것을 특징으로 하는, 적양배추 유래 다당체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 적양배추 유래 다당체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중성 다당은 람노오스, 퓨코오스, 아라비노오스, 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 적양배추 유래 다당체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중성 다당은 상기 적양배추 유래 다당체 100 중량부에 대하여 람노오스는 3 내지 10 중량부, 퓨코오스는 0.1 내지 5 중량부, 아라비노오스는 10 내지 30 중량부, 자일로오스는 1 내지 5 중량부, 만노오스는 1 내지 5 중량부, 갈락토오스는 5 내지 25 중량부 및 글루코오스는 1 내지 30 중량부인 다당으로 구성되는 것을 특징으로 하는 적양배추 유래 다당체.
  5. 제1항에 있어서,
    아라비노-β-3,6-갈락탄(arabino-β-3,6-galactan)을 포함하는 것을 특징으로 하는 적양배추 유래 다당체.
  6. 삭제
  7. 제1항의 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
  8. 제1항의 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.
  9. 제1항의 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제1항의 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항의 적양배추 유래 다당체를 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
  12. (1) 적양배추를 C1 내지 C4의 저급알코올로 추출하고 남은 잔사를 수득하는 단계;
    (2) 상기 잔사에 물을 가하고 가열하여 열수추출물을 얻는 단계; 및
    (3) 상기 열수추출물을 C1 내지 C4의 저급알코올로 침전시켜 침전물을 얻는 단계;를 포함하는 적양배추 유래 다당체의 제조방법으로,
    상기 적양배추 유래 다당체는 중성 다당(neutral sugar) 30 내지 50중량%, 우론산(uronic acid) 45 내지 65 중량%, 단백질 0.1 내지 5 중량%, Kdo(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 및 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.1 내지 5 중량%, 및 페놀화합물 0.1 내지 3 중량%을 포함하며, 중량평균분자량(Mw)이 30 내지 40 kDa인 것을 특징으로 하는 적양배추 유래 다당체의 제조방법.
  13. 삭제
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