KR101696076B1 - 면역 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역활성이 증진된 가시파래 유래 다당류 및 그 제조방법에 관한 것으로 가시파래를 주정을 이용하여 색소성분을 제거한 다음 증류수 추출 및 구연산의 단계적 처리를 통하여 면역 활성이 증진된 다당류를 수득하고 상기에서 얻은 가시파래 유래 다당류의 면역 활성 증진 효과를 확인하여 면역증강용 기능성 식품 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 면역 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가시파래에 주정을 사용하여 색소성분을 제거한 다음 증류수로 추출시 구연산을 첨가하여 면역 활성이 증진된 저분자 다당류를 수득하는 가시파래 유래 다당류의 제조방법에 관한 것이다.
해조류는 바다에서 나는 조류를 통틀어 이르는 말로 식물학적으로는 녹조, 갈조, 홍조, 남조의 4식물문으로 크게 분류된다. 이들은 공통엽록소로 클로로필 a를 포함하지만, 고등식물에 함유된 b는 녹조에만 포함되어 있고, 다른 조류에는 존재하지 않는다(영양학사전, 1998.3.15, 아카데미서적). 녹조류에는 파래, 갈조류에는 다시마와 미역이, 홍조류로는 김이 대표적이다(전통 한국음식, 2005.9.5, 광문각). 해조류는 예로부터 식용으로 이용 될 뿐만 아니라 사료, 식품첨가물, 비료 등으로도 이용되어 왔다. 우리나라에 서식하는 500여 종 해조류 중 50여 종이 식용으로 이용되고 있으나(파워푸드 슈퍼푸드, 2010.12.11, 푸른행복), 유럽 등 다른 나라에서는 알긴산, 카라기난, 한천 등의 식품첨가물 원료와 비료, 사료 등으로 사용되며 극히 일부분을 식용으로 이용하고 있다.
가시파래(Enteromorpha prolifera)는 녹조류의 갈파래과의 해조로, 형태는 녹색 또는 연녹색을 띠며 높이 10∼30cm 정도이며, 모양이나 크기가 매우 다양하여 때로 수m에 이르는 것도 있다. 몸 전체가 통모양으로서 약간 납작하며 많은 곁가지를 내고, 곁가지는 다시 작은 가지를 낸다. 가지 끝은 한 줄 세포로 되어 있지 않으며 세포의 길이는 표면에서 볼 때 10∼12㎛이다. 어린 부분에는 세포가 세로로 늘어서고 다 자란 뒤에는 불규칙해진다. 분포지역은 한국 전역을 비롯한 전세계에 분포하며, 서식지는 내만(內灣) 또는 민물의 유입으로 영양이 풍부하고 오염원이 없는 강 어귀 등지이며 주로 바위 위나 죽은 나뭇가지 위 또는 다른 해조에 붙어 자란다. 우리나라의 주 산지는 부산 가덕도 해역을 비롯하여 경남 사천, 전남 장흥, 무안 등지이다. 주로 손이나 채취기를 사용하여 자연군락을 이루고 있는 서식지에서 4~6회 가량 수시로 채취한다. 무기염류와 비타민이 풍부하며 향기와 맛이 독특하며, 익혀먹기보다 생으로 무쳐 밑반찬으로 많이 요리된다. 이외에 잼, 스프, 과자의 첨가물로도 사용된다. 연간 80t 이상을 수출하고 있으나 전량 자연산에 의존한다. 최근 환경오염으로 생산량이 줄어들면서 양식을 시작하였으며 다른 해조류에 비해 양식방법이 쉽고 경제성이 높으며 채취가 용이하여 새로운 양식품종으로 각광받고 있다([네이버 지식백과] 가시파래 [green laver] (두산백과)).
가시파래는 철분, 칼륨, 요오드, 무기염류, 비타민 A, 비타민C가 다량 함유되어 있어 피를 맑게하고 영양소가 골고루 들어 있다. 또한, 인체의 해로운 각종 독성성분의 배출을 돕고, 니코틴을 해독 중화 시키는데 효과가 우수한 것으로 알려져 있으며, 간질환, 숙취해소, 혈류세포를 활성화 시키는데 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 식물성 섬유질이 풍부하여 콜레스테롤 저하 및 대장의 연동운동을 도와 변비에도 탁월한 효과가 있고, 체내 염증을 가라앉히는 성분이 다량 함유되어 있어 관절염, 근육통에 효과가 있는 것으로 보고되었다.
파래의 면역 활성 증진효과에 대한 기술현황으로 한국산 파래에 증류수를 가하고 교반한 다음 이를 원심분리하여 상등액을 취하는 수용성 성분의 추출방법 또는 상기 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질성분을 침전시킨 후 크로마토그래피법에 의해 렉틴 성분을 수득하여 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역력을 효과적으로 활성화시킬 수 있는 면역 증강용 약제로 효과적을 사용할 수 있는 특허가 개시된 바 있다(대한민국 등록특허 제 10-0617495호).
가시파래에 관한 연구로는 가시파래 수용성 다당의 추출 및 화학적 조성에 관한 것으로 국내에서 양식되는 가시파래의 효율적인 이용을 위한 기초 조사로써 가시파래의 일반성분을 분석하고 수용성 다당을 추출 및 분획하여 화학적 특성을 조사한 연구가 보고된바 있다(최용석, 구재근, 하진환, 윤장택.(2002) 가시파래 수용성 다당의 추출 및 화학적 조성. 한국수산과학회지, 35(5),519-523).
가시파래와 관련된 기술현황을 살펴보면 에탄올을 사용하여 가시파래로부터 항산화 물질을 추출하고 그 추출물을 이용한 식품의 제조방법에 관한 특허(대한민국 등록특허 제 10-0828701호)가 개시된 바 있고, 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어지는 가시파래 추출물과 NO 생성억제 활성, TNF-α 생성억제활성, IL-6 생성억제활성, IL-1β의 생성억제활성, 프로스타글라딘 E2 생성억제활성을 가지는 것을 특징으로 하는 가시파래 추출물을 포함하는 항염증제 조성물에 관한 대한민국 등록특허 제 10-1110061호가 개시된 바 있다. 또, 가시파래의 항당뇨 기능성을 갖는 추출물을 포함하는 기능성 식이식품 및 가시파래의 용도에 관한 것으로 만성질환인 당뇨병의 예방 및 치료에 효과적으로 사용 가능하여 항당뇨 기능성 식품으로 사용 할 수 있음이 개시되어 있고(대한민국 공개특허 제 10-2010-0001635호), 면역증강 활성을 갖는 녹조류 유래 다당류 및 그 제조방법 관한 대한민국 등록특허 제 10-1179101호는 녹조류인 가시파래에 유기용매를 순차적으로 처리하여 가시파래 유래 다당류를 제조하고, 제조된 다당류의 산화질소(NO), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터류킨1β(IL-1β) 및 프로스타글라딘 E2(PGE2)등 면역 관련 사이토카인의 분비 효과를 평가한 결과, 가래파래 유래 다당류가 상기의 면역증진 관련 사이토카인을 분비하는데 결정적으로 작용함을 확인하여 면역력을 효과적으로 활성화시킬 수 있는 면역증강용 조성물로 사용할 수 있음이 개시되어 있다. 그러나 상기문헌 어디에도 면역세포의 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류 추출 시 유기산으로 처리하는 가시파래 유래 다당류의 제조방법에 관하여는 개시된 바가 없다.
따라서 본 발명의 목적은 면역 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 가시파래 유래 다당류를 함유하는 면역 활성 증진용 식품조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 수세한 가시파래를 건조한 다음 분말화한 가시파래에 80% 주정을 첨가하여 색소성분을 제거하고 여과하는 단계; 상기 단계에서 색소성분이 제거된 가시파래에 증류수를 첨가한 다음 구연산을 처리하여 다당류 성분을 추출한 다음 원심분리하여 상등액만 회수하는 단계; 상기 단계에서 회수된 상등액을 감압농축한 다음 농축된 상등액에 주정 70%(v/v)가 되게 첨가한 다음 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 침전물을 수득하는 단계; 상기 단계에서 수득된 침전물에 잔류하는 주정을 제거하는 단계; 상기 단계에서 수득된 다당류를 동결건조한 다음 분말화하여 본 발명 가시파래 유래 다당류를 제조하는 단계로 이루어지고 상기 본 발명 가시파래 유래 다당류의 면역활성 증진효과를 확인한 다음 식품 조성물의 제형을 제공하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 면역 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있고, 나아가 가시파래 유래 다당류를 유효성분으로 함유하는 면역 활성 증진용 기능성 식품조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명 실시예 1에 따른 가시파래 유래 다당류를 제조하는 방법을 나타낸 다이어그램이다.
도 2는 본 발명 실험예 2에 따른 가시파래 유래 다당류의 NO 생성능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 실험예 3의 구연산(citric acid) 처리시간에 따른 가시파래 유래 황함다당류의 HPSEC 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명 실험예 4의 구연산 처리시간에 따른 가시파래 유래 황함다당류의 면역세포에 대한 mitogenic 활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 실험예 4의 구연산 처리시간에 따른 가시파래 유래 황함다당류의 NO 생성능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 실험예 4에 따른 가시파래 유래 황함다당류 농도별 NO 생성능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 실시예 1에 유기산 저분자화 방법이 추가된 가시파래 유래 다당류 제조방법의 다이어그램이다.
도 2는 본 발명 실험예 2에 따른 가시파래 유래 다당류의 NO 생성능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명 실험예 3의 구연산(citric acid) 처리시간에 따른 가시파래 유래 황함다당류의 HPSEC 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명 실험예 4의 구연산 처리시간에 따른 가시파래 유래 황함다당류의 면역세포에 대한 mitogenic 활성 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 실험예 4의 구연산 처리시간에 따른 가시파래 유래 황함다당류의 NO 생성능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명 실험예 4에 따른 가시파래 유래 황함다당류 농도별 NO 생성능 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 실시예 1에 유기산 저분자화 방법이 추가된 가시파래 유래 다당류 제조방법의 다이어그램이다.
본 발명은 면역 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류 및 그 제조방법을 개시한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며 본 발명의 권리범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
[실시예 1] 본 발명의 공시재료 및 가시파래 유래 다당류 추출
본 발명에서 국내 재배지/지역 수산업 영농법인으로 부터 가시파래를 구매하여 수세한 후 건조한 것을 분쇄하여 공시재료로 사용하였다. [도 1]과 같이 분쇄한 가시파래분말 10 kg에 80% 주정 500 L를 가하여 75℃에서 1 시간동안 반응한 후 색소성분을 제거하고 추출포로 여과하여 주정이 제거된 가시파래를 수득하였다. 교반기에 상기 수득한 가시파래 시료를 넣고 가시파래 시료 중량대비 20배량의 상수를 가하여 65℃에서 4 시간동안 펌프 및 라인을 연결하여 교반 및 순환 추출한 후 데칸터(원심분리기)를 이용하여 300 ~ 350L/hr의 속도로 3시간 원심분리 후 슬러지와 추출액을 분리하였다. 분리된 추출액은 감압농축기를 이용하여 2배가 되도록 농축하였다. 농축한 추출액에 총 알코올의 함량이 70%(v/v)가 되게 주정을 첨가한 후 5분간 호모믹서로 1,300 rpm으로 교반하여 4℃에서 24시간 보관한 후 관형 원심분리기로 15,000 rpm 원심분리하여 상등액은 제거하고 남은 침전된 물질은 주정을 제거한 후 동결건조를 하였다. 상기 동결건조 된 가시파래 유래 다당류를 분쇄하여 분말화하였다. 이와 같이 분말화 한 가시파래 유래 다당류를 조다당류(crude polysaccharide)라 명하였다.
[실시예 2] 본 발명의 이온교환컬럼 크로마토그래피를 이용한 다당류의 정제
본 실시예에서는 가시파래에서 추출한 다당류를 이온화도에 따라 분리하기 위해 이온교환수지(DIAION HP-20)를 컬럼에 충전하여 사용하였다. 상기 실시예 1에서 수득한 crude 다당류 100 mg을 증류수 10 mL에 녹인 후 극초단파(microwave bomb)를 이용하여 전자렌지에 30초 동안 가열시킨 후 3.0 로 필터한 후 컬럼에 주입하여 이동상으로 0 ~ 1.5 M NaCl을 이용하여 유속 1.5 mL/min으로 정제하였다. 정제한 다당류를 Mw 8000의 투석막(dialysis membrane)에 주입하여 일반수에서 2일간, 증류수에서 1일간 투석한 후 감압 하에 동결건조하여 최종 정제된 가시파래 유래 다당류를 수득하였다. 이와 같이 수득한 다당류를 황함다당류라 명하였다.
[실험예 1] 본 발명의 가시파래 유래 다당류의 총 탄수화물 함량 및 일반성분 측정
본 실험예에서는 상기 실시예 1과 2에서 각각 수득한 가시파래 유래 다당류의 총 탄수화물(Total carbohydrate) 및 일반성분 함량을 측정하였다. 여기서 일반성분은 단백질(Protein), 황산염(Sulfate), 우론산(Uronic acid), 단당류(L-Rhamnose, D-Xylose, D-Glucose)을 측정하였다.
총 탄수화물 함량은 수득한 다당류에 페놀을 첨가한 후 황산을 넣어 다당류를 단당류로 분해하고, 분해된 단당류에 페놀이 반응을 하여 색을 띄게 하고, Rhamnose 표준물질의 흡광도를 490nm 에서 측정하여 가시파래 유래 다당류의 총탄수화물 함량을 측정하였다.
단백질 함량 측정은 Bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Lowry method에 의해 Reagent A와 Reagent B 을 암실에서 반응시킨 후, 570nm에서 흡광도를 측정하여 가시파래 유래 다당류의 단백질 함량을 측정하였다.
황산기의 함량은 Gelatine-barium chloride turbidimetric 방법으로 측정하고, Uronic acid의 함량은 H2SO4로 2시간 동안 가수분해시킨 후, 3,5-dimethylphenol을 가하여 Scott et al. (1984)의 방법으로 분석하였다.
단당류는 Trifluoroacetic acid (TFA)에 시료를 녹인 후 121℃에서 2시간 동안 가수분해한 다음 NaOH로 중화한 후, Carbohydrate analysis 컬럼 (Waters, USA)으로 분석하였고, Elution 조건은 Flow rate; 2.0 L/min, Eluent; 90% acetonitrile solution을 사용하였고, 표준용액으로 각각 glucose, fructose, mannose, galactose, xylose용액을 시료용액의 단당류와 비교하여 측정하였다.
실험결과 [표 1]에서와 같이 실시예 1에서 수득된 다당류의 총 탄수화물 함량은 61.6%, 단백질 함량 4.5%, 황산기 함량 23.9%, 우론산 함량 19.4%으로 측정되었다. 반면, 탄수화물을 구성하는 단당류는 주로 L-Rhamnose (64.6%) 였으며, 상당량의 D-Glucose(18.8%) 와 D-Xylose (16.6%)가 첨가되어 있는 것으로 조사되었다. 또한 실시예 2에서 수득된 다당류의 총 탄수화물 함량이 47.2 ~ 48.6%, 단백질 함량이 11.0 ~ 12.1%, 황산기 함량이 25.2 ~ 26.6%, 우론산 함량이 14.8 ~ 15.1%였으며, 탄수화물을 구성하는 단당류는 L-Rhamnose가 58.7 ~ 60.1%, 상당량의 D-Xylose (15.3 ~ 16.1%)와 D-Glucose (24.0 ~ 26.0%)가 함유되어 있는 것으로 측정되었다. 이는 국내특허 제 10-0617495호에 개시된 성분과 전혀 다르다는 사실을 알 수 있다.
| Component | Sample | |||
| 실시예 1에서 수득한 다당류 | 실시예 2에서 수득한 다당류 | |||
| 1 | 2 | 3 | ||
| Total carbohydrate(%) | 61.6±0.5 | 47.2±2.79 | 48.2±3.39 | 48.6±1.69 |
| Protein(%) | 4.50±0.1 | 12.1±0.42 | 11.8±0.21 | 11.0±0.14 |
| Sulfate(%) | 23.9±1.0 | 26.6±3.15 | 25.2±3.15 | 25.4±1.41 |
| Uronic acid(%) | 19.4±0.2 | 15.1±0.00 | 14.8±0.00 | 15.0±0.05 |
| Monosaccharide content(%) | ||||
| L-Rhamnose | 64.6 | 58.8 | 58.7 | 60.1 |
| D-Xylose | 16.6 | 16.1 | 15.3 | 15.9 |
| D-Glucose | 18.8 | 25.1 | 26.0 | 24.0 |
[실험예 2] 본 발명 가시파래 유래 다당류의 면역활성 증진효과 측정
본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 정제된 가시파래 유래 황함다당류의 면역활성 증진효과 측정은 NO의 생성능으로 측정하였다. 마우스 대식세포는 Raw 264.7 세포를 이용하였다. 황함다당류 10, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도를 Raw 264.7 세포에 분주하고, 24시간동안 배양 후, 배양 상등액 100 uL에 Griess reagent를 첨가하고, 10분간 실온에서 방치한 후 ELISA plate reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 NO의 대사체인 Nitrite의 농도는 Sodium nitrite를 이용하여 얻은 표준곡선으로부터 계산하였다. 대조군으로는 Lipopolysaccharid(LPS)를 사용하였다.
실험결과 [도 2]에서와 같이 10 ~ 200 ㎍/mL의 농도별로 Raw 264.7 세포에 분주한 황함다당류는 2번 시료를 제외하고, 모든 농도에서 <5 ㎍/mL 의 미미한 NO 생성능을 보여주었다. 이와 같은 결과는 상기 실시예 2에 의해 추출된 황함 다당류는 NO 생성능이 그다지 크지 않다는 것으로 확인되었다.
최근 연구에서, 황함다당류의 면역세포에 의한 면역증진 활성은 다당류 분자의 구조와 상당히 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다(강릉원주대학교, 학위논문, Mehdi Tabarsa, 청각유래황함다당류의 구조적인 특성, 면역활성과 구조-활성 연관성). 황함다당류의 면역증진 활성에 영향을 주는 인자로 황산기 함량, 단백질 함량과 황함다당류의 분자량을 주요 인자로 볼 수 있었는데, 이러한 주요 인자 중, 분자량의 감소는 면역세포와 반응하는 황함다당류의 상대적인 몰비를 증가시켜, 매우 효율적으로 면역세포의 활성을 증진시키는데 효과적인 것으로 보여졌다. 따라서, 황함다당류의 분자량을 감소시켜 면역세포의 활성을 증진하고자 황함다당류에 유기산의 한 종류인 구연산 (citric acid)을 처리하여 분자량 감소 및 분자량 감소에 따른 면역증진 활성을 하기 [실험예 3] 및 [실험예 4]를 통하여 나타내었다.
[실험예 3] 본 발명 가시파래 유래 황함다당류의 구연산 처리 및 구연산 처리에 의한 분자량 및 분자크기 측정
본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 수득한 가시파래 유래 황함다당류에 구연산 처리 및 분자량을 측정하였다.
우선, 가시파래 유래 황함다당류의 구연산처리는 가시파래 유래 황함다당류 15 g을 0.1 M citric acid 5 mL에 녹이고 70℃에서 각각 30분, 60분, 120분, 180분씩 가열한 후 1 M NaOH로 중화하였다. 중화 후 투석 및 동결건조하여 분자량을 측정하였다.
분자량 및 분자크기 측정 방법으로 HPSEC-MALLS-RI 시스템을 이용하였다. 상기 구연산이 처리된 황함다당류를 용해시키고, 3.0 ㎛ membrane으로 여과한 후, High performance size exclusion chromatography-Multiangle laser light scattering-refractive index detecting (HPSEC-MALLS-RI) 시스템에 loading 하였다. HPSEC-MALLS-RI 시스템은 세 개의 SEC columns (TSK G5000 PW (7.5 mm×600 mm), TSK G3000 PWxl and TSK G2500 PWxl (7.8 mm×300 mm), TosoBiosep)과 Multiangle laser light scattering 검출기(HELEOS, Wyatt Technology Corp, Santa Barbara, CA, USA) 그리고 Refractive index 검출기 (RI-150, Thermo Electron Corp., Yokohama city, Japan)로 구성되어 있으며 Elution 조건은 다음과 같다: Flow rate; 0.4 mL/min, Eluent; 0.15M Na-Nitrate. 분자량(Mw)과 분자의 크기(Rg)는 MALLS와 RI에서 얻은 데이터로부터 ASTRA 5.3 소프트웨어에 의해 계산되었다.
실험결과, 구연산에 의해 시간별로 처리된 황함다당류의 HPSEC 크로마토그램은 [도 3]에서와 같이 구연산에 의해 처리되지 않은 황함다당류 분자들은 SEC 컬럼으로 부터 25 ~ 53분에 용리가 되었으며, 주로 대부분의 다당류 분자들은 32.5분을 정점으로 하는 peak를 중심으로 용리가 되었고, 45분 경에 매우 작은 peak 에서 적은 양의 분자들이 용리되는 것으로 보였다. 30분간 구연산 처리된 황함다당류는 구연산 처리하지 않은 황함다당류와 분자들의 용리 시간이 유사한 것으로 보여졌고, 주 peak 도 32.5분에서 나타났지만, 40분 경에 작은 shoulder 모양의 peak이 보였는데, 이는 30분간 구연산 처리에 의해 거대한 분자들이 분해되어 용리된 것으로 보였다. 한 시간 동안 구연산 처리된 황함다당류도 주 peak는 구연산을 처리하지 않은 황함다당류와 30분간 처리된 황함다당류와 유사하게 나타났지만, 40분에서 나타나는 peak의 크기가 30분 처리된 황함다당류보다 상당히 면적이 크게 나타나, 분자들의 분해가 보다 더 진행되어 나타난 것으로 사료된다. 반면, 120분과 180분 동안 구연산 처리된 황함다당류는 주요 peak의 상당한 shift 가 일어난 것이 보이며 (peak 35분 경), 40분 이후에 나타나는 두번째 peak의 크기도 상당히 크게 나타난 것으로 보아, 2시간 이상 구연산 처리에 의해서는 상당한 분자들의 breakdown이 일어나는 것으로 보여졌다. 또한, 구연산처리에 의한 황함다당류의 분자량 및 분자크기의 측정결과는 [표 2]와 같다. [표 2]에서 보는 바와 같이 구연산이 처리되지 않은 황함다당류의 주 peak 1,247×103 g/mol이었으며, 45분 경에 나타난 작은 peak의 경우 443×103 g/mol이였다. 30분과 60분간 처리된 황함다당류의 분자량은 각각 주 peak가 502.8×103 g/mol과 429×103 g/mol, 작은 peak의 경우 143.7×103 g/mol과 136×103 g/mol로 측정되었다. 반면, peak의 shift가 일어난 120분, 180분 처리된 황함다당류의 분자량은 더 감소된 398.8×103 g/mol과 353.8×103 g/mol로 측정되었으며 ,작은 peak에서는 99.9×103 g/mol과 29.5×103 g/mol로 측정되었다. 본 실험예에서 유기산인 구연산에 의해 시간별로 처리된 황함당당류에서 상당한 분해가 일어난 것을 알 수 있었다.
| 처리시간(min) | Mw103(g/mol) | Rg(nm) | ||
| 주 Peak(전) | 작은 Peak(후) | 주 Peak(전) | 작은 Peak(후) | |
| 0 | 124727.1 | 443.29.6 | 48.02.5 | 146.35.1 |
| 30 | 502.813.0 | 143.74.1 | 32.75.8 | 136.011.8 |
| 60 | 429.09.3 | 136.317.8 | 30.711.3 | 127.56.3 |
| 120 | 398.811.0 | 99.96.1 | 30.210.1 | 118.624.0 |
| 180 | 353.821.0 | 62.619.0 | 29.511.5 | 101.615.0 |
[실험예 4] 본 발명 가시파래 유래 황함다당류의 구연산 처리에 의한 면역 활성 증진효과 측정
본 실험예에서는 상기 실험예 3에서 시간 별로 구연산 처리된 황함다당류의 면역증진활성을 면역세포에 대한 mitogenic 활성측정 및 NO 생성능 측정으로 확인하였다.
(1) 면역세포에 대한 mitogenic 활성측정
면역세포의 Mitogenic 활성 조사는 마우스 대식세포 (Raw 264.7) 세포를 이용하였다. Raw 264.7 세포를 96well plate에 1×106 cell/well로 분주하고, 24시간동안 37℃, 5% CO2조건의 배양기에서 배양한 후, 실험예 3에서 구연산이 시간별로 처리된 황함다당류를 농도 10 ~ 200 ㎍/mL로 제조하여 첨가하고, 24시간동안 37℃, 5% CO2조건의 배양기에서 배양 후 상등액을 제거한 다음 각각 well에 WST-1(4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) 첨가하고 배양기 한 후, 상등액을 ELISA plate reader를 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 조사하였다.
실험결과, [도 4]에서와 같이 구연산이 처리되지 않은 황함 다당류는 실험이 진행된 농도에서 RAW 264.7 세포의 증식능에 그다지 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. 다만, 가장 고농도(200 ㎍/mL)에서 약 120%의 증식능이 보였다. 하지만, 구연산이 처리된 황함다당류는 처리시간에 상관없이 상당히 높은 RAW 264.7 세포의 증식능을 보였다. 뿐만 아니라, 10 ㎍/mL의 농도에서도 상당히 증가된 RAW 264.7 세포의 증식능이 나타났다. 따라서, 황함다당류를 구연산에 의해 저분자화 하였을 때, 저분자화된 황함다당류는 보다 우수한 RAW 264.7 세포의 증식능을 갖게 된다는 것을 알 수 있었다. 또한, 이 결과는 저분자화된 황함다당류는 RAW 264.7 세포에 세포 독성을 보여주지 않는다는 것을 나타내었다.
(2) NO 생성능 측정
본 실험예의 NO 생성능 측정은 상기 실험예 2의 방법으로 측정하였다. 그 결과 [도 5]에서와 같이 구연산을 처리하지 않은 황함다당류는 거의 모든 농도에서 NO 생성능이 상당히 미약한 것으로 나타났다. 반면, 30분 동안 구연산 처리된 황함다당류는 10 ㎍/mL의 농도에서도 상당한 양의 NO 생성능을 갖는 것으로 보여졌다. 황함다당류의 농도가 증가하면서, NO 생성능도 그에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 하지만, 200 ㎍/mL의 농도에서는 NO 생성능이 다소 감소하는 것으로 보여, 최대 허용량(Maximum dose)은 200 ㎍/mL 미만으로 하는 것이 바람직할 것으로 보여 진다. 60분과 120분 처리된 황함다당류들도 30분 처리된 황함다당류와 매우 유사한 NO 생성능 패턴을 보여주었다. 반면, 180분 처리된 황함다당류는 다른 황함다당류에 비해 비교적 증가된 NO 생성능을 보여주었다. 상기 결과로 부터, 황함다당류의 처리 농도가 상당히 중요한 것으로 나타났다. 200 ㎍/mL을 기점으로 조금 더 낮은 농도에서 실험을 해야 할 필요성이 있는 것으로 보여 본 실험예에서 조금 더 낮은 농도로 RAW 264.7 세포를 처리하였을 때, NO 생성능을 조사한 결과, 구연산 처리된 황함다당류들은 처리시간에 크게 상관없이 상당히 유사한 정도의 NO 생성능을 갖는 것으로 나타났다(도 6). 이는 국내 등록특허 제 10-1179101호에서 개시된 NO 생성능과 큰 차이를 나타내었다.
따라서, 상기 실험예 4 결과에서 알 수 있듯이, 가시파래 유래 다당류는 Crude 상태로 추출하는 것 보다, 유기산인 구연산에 처리에 의한 저분자화 방법이 추가되면, 그에 따른 면역세포의 자극(stimulation)효과는 상당히 증가할 수 있다는 가능성을 보여주어 상기 실시예 1에 유기산 저분자화 방법을 추가하여 [도 7]로 가시파래 유래 다당류 제조방법을 확립하였다.
본 발명의 따른 면역활성 증진 효과를 가지는 가시파래 유래 황함다당류는 통상의 제형을 가질 수 있으며, 예를 들어 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 등으로 제형화 될 수 있다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정 될 수 있다. 이하 면역 활성 증진 효과가 뛰어나면 식품 조성물의 대표적인 적용사례로써 과립과 액상 조성물로 예를들어 설명한다.
[제형예 1] 본 발명의 가시파래 유래 다당류를 함유하는 과립의 제조
본 발명에서 제조된 가시파래 유래 다당류를 함유하는 과립의 제형예는 [표 3]과 같이 가시파래 유래 다당류로 제조된 혼합품을 일정한 속도로 과립기에 공급되도록 연속식 저울인 감량식 정량공급기(Loss-in weight feeder)를 사용하고 공급된 분말은 자체 진동에 의하여 이동하며, 분말층 상부에 있는 노즐의 압축공기에 의해 일정한 온도의 물이 분사되고 하부 바닥에서는 열풍이 공급되므로 분말은 상호 응집되어 입자의 크기가 커지고 또한 공급된 열풍은 상부에 설치된 공기 필터를거쳐 밖으로 배출되며, 과립화 입자가 출구로 배출되면 40 mesh 과립체에 통과시켜 과립을 제조하였다.
| 원료명 | 함량(중량 %) |
| 가시파래 유래 다당류 | 10 |
| 유당 | 5.0 |
| 결정셀룰로오스 | 25.0 |
| 옥수수전분 | 45.0 |
| 정백당 | 11.5 |
| 만니톨 | 3.5 |
| 합계 | 100 |
[제형예 2] 본 발명의 가시파래 유래 다당류를 함유하는 액상의 제조
본 발명에서 제조된 가시파래 유래 다당류를 함유하는 액상의 제형예는 [표 4]와 같다. [표 4]에서 나타낸 바와 같은 조성비율로 액상형태의 유동식을 제조하였다. [제형예 2]에 사용된 유화제는 솔비탄지방산에스테르와 글리세린지방산에스테를 0.5 ~ 5% 첨가하여 제품의 총 고형분 함량이 20.5%가 되도록 액상형태의 유동식을 제조하였다.
| 원료명 | 함량(중량 %) |
| 가시파래 유래 다당류 | 1.0 |
| 분리대두단백 | 3.5 |
| 카제인나트륨 | 2.83 |
| 덱스트린 | 6.0 |
| 대두식이섬유 | 1.5 |
| MCT유 | 3.65 |
| 첨가물류 | 1.3 |
| 유화제 | 0.5~5.0 |
| 정제수 | 75.22~80.72 |
| 합계 | 100 |
본 발명은 가시파래 유래의 면역 활성 증진효과가 증진된 다당류를 제공하는 효과가 있으며, 가시파래 유래의 다당류를 유효성분으로 함유하는 식품조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 건강기능성식품산업상으로 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (4)
- (a) 가시파래를 건조 후 분말로 제조된 가시파래 분말에 주정을 첨가하여 색소성분을 제거하고 여과하는 단계; (b) 상기 단계에서 얻은 색소성분이 제거된 가시파래에 증류수를 첨가하여 다당류 성분을 추출하고 원심분리하여 상등액만 회수하는 단계; (c) 상기 단계에서 회수된 상등액을 감압농축하고 농축된 상등에 주정 70%(v/v)가 되게 첨가한 다음 원심분리하여 상등액을 제거하고 남은 침전물을 수득하는 단계; (d) 상기 단계에서 수득된 침전물에 잔류하는 주정을 제거한 다음 다당류를 수득하는 단계; (e) 상기 단계에서 수득한 다당류를 동결건조하고 분말화하는 단계로 이루어진 다당류 제조방법에 있어서,
상기 (b)단계에서 구연산을 추가로 처리하는 것이 특징인 면역 활성이 증진된 가시파래 유래 다당류의 제조방법.
- 제 1항의 방법에 따라 제조되어 L-람노스 58~60%, D-크실로스 15~16%, D-글루코스 24~25%를 함유하는 것이 특징인 가시파래 유래 다당류 조성물.
- 제 2항의 가시파래 유래 다당류 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역 활성 증진 기능성 식품 조성물.
- 제 3항의 식품 조성물이 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔 또는 젤리로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것이 특징인 면역 활성 증진 기능성 식품 조성물.
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