최근 생활수준이 향상과 더불어 식생활 패턴의 서구화로의 변모에 따라 육류의 소비가 크게 증가하면서 동맥경화증, 심근경색증, 협심증, 뇌경색 및 뇌혈전증과 같은 퇴행성 심혈관계 질환이 크게 증가하고 있다 (사망통계치, 국립통계청, 2006). 따라서 이러한 심혈관계 질환를 치료할 수 있는 합성의약품의 개발되고 있으나 이들 대부분 심각한 부작용을 초래하여 건강에 악영향을 끼치므로 현재 천연 유래의 보다 안전하고 효과가 있는 식물화학물질(phytochemicals)의 개발이 활발히 이루어지고 있다 (Ames et al., Science 236: 271-280, 1990; Hasler CM., Food Technol 52: 63-70, 1998).
해조류는 식이성 섬유소인 복합다당류를 다량 함유하고 있을뿐 아니라 여러 비타민과 무기질이 비교적 풍부하고 그 독특한 맛과 향기가 우수한 알칼리성 기호식품으로서 가치가 높다(Sung JH et al., In: Foods and health. Hyungseol Press Co., Seoul pp. 190, 2002; Lahaye M, J Sci Food Agric 54: 587-594, 1991). 특히 해조류는 소화율이 낮아서 열량원으로서의 가치는 없지만 섬유성 식품으로 위에 포만감과 통변을 조절하는 효과(Lee JG et al., J Korean Fish Soc 35: 601-607, 2002; Oh HK & Lim HS, J Korean Soc Food Sci Nutr 36: 720-726, 2007) 뿐만 아니라 항암(Cho KJ et al., J Kor Fish Soc 23: 345-352, 1990), 항당뇨(Lee HS et al., Korean J Nutr 29: 296-306, 1996; Lee KS et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 27: 960-967, 1998), 항고지혈증(Kim HS & Kim GA, J Korean Soc Food Sci Nutr 27:718-723, 1998; Joo DS et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 32: 1364-1369, 2003), 항산화(Ruberto G et al., J Appl Phycol 13: 403-407, 2001; Cho SH et al., J Med Food 10: 479-485, 2007) 및 항노화(Kang HS et al., Arch Pharm Res 27: 1226-1232, 2004) 등 여러 생리적 효능을 지니고 있어 최근에는 기능성 다이어트 웰빙식품으로 크게 각광을 받고 있다.
한편, 해조류에는 주된 다당류 성분뿐 아니라 미량의 비당류 생리활성성분을 함유하고 있으며(Sheu JH et al., J Nat Prod 62: 224-227, 1999; Yan X et al., Biosci Biotechnol Biochem 63: 605-607, 1999; Chen CY et al., Mar Biotechnol 4: 189-192, 2002), 그들의 조성과 함량 그리고 생리적 효능은 해조류 종류에 따라 다르며(Lahaye M., J Sci Food Agric 54: 587-594, 1991; Kim YY et al., J Korean Fish Soc 33: 393-398, 2000), 특히 해조류 중 갈조류추출물은 항당뇨 (Lee HS et al., Korean J Nutr 29: 286-295, 1996), 항산화(Ahn CB et al., Food Res Int 37: 253-258, 2004), 및 혈중 지질 개선효과(Park JC et al., J Korean Soc Food Sci Nutr 25: 958-962, 1996; Kim HS & Kim GA, J Korean Soc Food Sci Nutr 27:718-723, 1998)가 높은 것으로 보고되고 있다. 따라서 갈조류로부터 기능성 신소재 개발과 더불어 그를 이용한 기능성 식품 및 화장품의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
국내에서 생산되는 갈조류에는 미역 및 다시마를 비롯하여 곰피, 대황, 감태 및 톳 등이 있으며, 이 중 식용으로 널리 이용되고 있는 것은 미역 및 다시마뿐이며, 그 외 갈조류는 안전성의 문제와 생산량이 적거나 채취가 어려워 거의 이용되지 못하고 있는 실정이다 (Sheu JH et al., J Nat Prod 62:224-227, 1999; Tang HF et al., J Asian Nat Prod Res 4: 95-101, 2002; Bu HJ et al., Kor J Pharmacogn 37: 92-96, 2006). 그리고 미역 및 다시마는 현재 과잉 생산되어 전부 산업적으로 활용되지 못하고 일부는 폐기되고 있는 실정이며, 반면, 우수한 생리활성을 갖는 갈조류는 인공양식의 어려움 때문에 거의 대량 생산되지 못하고 있는 실이다. 따라서 미역 및 다시마의 산업적 활용도를 높일 수 있는 생물공학기술을 이용한 새로운 기능성성분의 개발과 더불어 국내 자생하고 있는 다른 갈조류의 발굴이 필요한 실 정이다.
해조류는 다량의 소금을 함유하고 있을 뿐 아니라 난소화성 다당류를 함유하고 있어 소화성 및 용해성이 낮은 반면, 점성이 높고, 특유의 비린내 때문에 해조류추출물을 그대로 또는 건강식품 소재로 사용하는 데 제한을 받고 있다. 또한, 해조류 열수 또는 에탄올추출물 제조시 추출 수율이 낮고 고온 추출에 따른 열에 불안정한 생리활성물질 등이 소실될 가능성이 있으며, 유기용매에 사용에 따른 독성 및 안전성이 문제시되고 있다. 따라서 최근 해조류추출물의 용해성, 소화성을 증가시키고 점성을 감소시킬 수 있는 압출성형(Harper JM. Food extruders and their application. In: Extrusion cooking. Mercier C, Kinko P, Harper JM. (eds.), AACC St. Paul MN, USA pp. 1-18, 1989; Linko P. Extrusion cooking in bioconversion. In: Extrusion cooking. mercier C, Linko P, Harper JM, eds. American Association of Cereal Chemists, Inc., St. Paul. p 235-245, 1989) 및 효소처리(Heo et al., Algae 18: 341-347, 2003; Jeon & Heo, Food Indus Nutr., 10: 31-41, 2005)를 이용한 생물전환기술에 의한 저분자화된 고활성의 해조류추출물 및 기능성물질의 제조 및 그를 이용한 식품첨가제 혹은 건강기능식품 신소재 개발이 활발히 이루어지고 있으나 아직까지 여러 식품 및 화장품 산업에 실용화되지 못하고 있는 실정이다.
대황(大荒; Eisenia bicyclis)은 갈조식물 다시마목(Laminariales) 미역과(Alariaceae)의 다년생 식물로 우리나라 울릉도에 분포한다. 주로 연안 수심 10 m 내외에서 서식하고 있으며, 줄기는 원기둥 모양이고 뿌리는 수지상이며 윤생하고 원주상 내지 편원이며 길이는 1-2 m에 달하며 지름은 2-3 cm 이고, 중앙부가 좀 굵다.
대황은 그 성분들이 확인되고 있으나, 그 효능이 명확하게 알려져 있지 않으며, 일부 알려져 있는 효능에 대한 동물실험을 통한 검증이나 이를 이용한 건강기능식품 개발에 관한 연구는 거의 없으며, 특허등록을 받은 것도 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 갈조류 대황에 대해 꾸준히 연구를 거듭한 결과, 고지방-콜레스테롤 식이 래트의 지질대사개선효과 뿐만 아니라 당뇨쥐의 혈당 강하효과가 강화된 대황효소추출물을 제조하는 본 발명에 이르게 되었다. 또한 이를 이용한 대황정제환을 제조하여 건강보조식품으로서 일반 공중이 쉽게 이용할 수 있도록 하였다.
이하 본 발명이 구체적인 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 해조류 대황으로부터 대황분말을 제조하는 단계; 상기 제조된 대황분말을 압출성형하는 단계; 비스코자임 효소액을 가하여 가수분해하는 단계; 열수추출, 여과, 농축 및 건조하여 대황 효소추출물을 제조하는 실시예 1과 상기 대황효소추출물에 대황분말, 다시마분말 및 부형제를 혼합하여 자동환제조기로 대황정제환을 제조하는 실시예 2, 그리고 고지방 및 콜레스테롤 유발 래트와 스트렙토조톡신(streptozotocin) 유발 당뇨마우스를 이용한 동물실험에서 그들의 지질대사 및 혈당 개선효과를 측정하는 실험예 1 내지 3으로 구성되어 있다.
실시예
1 :
대황효소추출물의
제조
대황분말의
제조
본 실험에 사용한 갈조류의 일종인 대황(Eisenia bicyclis)은 2007년 2월 경북 울릉도 근해에서 직접 채취한 것으로서 채취 후 곧바로 수돗물로 이물질과 염분을 제거한 후 끓는 물에서 5분간 데치기하였다. 상기 데치기한 대황을 탈수하고 동결건조한 다음 분쇄하여 10-20 메쉬 크기의 대황분말을 제조하였다.
다른 해조류와의 비교실험을 위하여 미역(Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria japonica) 및 곰피(Ecklonia stolonifera)를 부산 자갈치 시장에서 구입한 후 상기와 동일한 방법으로 미역, 다시마 및 곰피분말을 제조하였다.
압출성형(
extrusion
)
대황분말에 물을 20%(원료 중량당) 가하여 반죽한 것을 쌍축형압출성형기(밀링산업, 서울, 한국)에 넣고 압출성형하였다. 이때 압출성형기의 스크루 직경은 29.0 mm, 직경과 길이의 비(L/D 비율)는 20:1이며, 배럴온도는 80℃, 스크루 회전속도 250 rpm, 원료 사입량 140 g/min, 사출구 직경 3.0 mm로 고정하였다.
상기 압출성형물을 50℃의 열풍건조기에서 12시간 건조한 후 10-20 메쉬 크기로 조분쇄하여 압출성형분쇄물을 수득하였다.
상기 압축성형을 통하여 해조류 추출물의 용해성, 소화성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 생리활성이 배가된 저분자화된 해조류추출물을 얻을 수 있을 것으로 기대되었다.
효소를 이용한 가수분해
상기 압출성형분쇄물 100 g에 물 5 L를 넣고 현탁시킨 후 여기에 비스코자임 엘(viscozyme L; Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) 10 mL를 가하여 교반하면서 50± 2℃ 발효기에서 12시간 가수분해처리하였다.
열수
추출
가수분해 후 다시 물 3 L를 가하여 50-60℃에서 3시간 2회 반복 가열추출한 후 여과 및 농축하고 다시 최종 동결건조하여 대황 효소추출물(52 g)을 제조하였 다.
실험방법에 따른 효과를 비교실험하기 위하여 대황분말(100 g)에 증류수(5 L)를 가하여 80-90℃에서 2시간 가열추출한 후 여과 및 감압농축하여 대황 물추출물(55.3 g)을 제조하였으며, 위와 유사하게 대황분말(100 g)에 80% 에탄올수용액(5 L)를 가하여 70-80℃에서 2시간 가열추출한 후 여과 및 감압농축하여 대황 에탄올추출물(47.5 g)을 제조하였다.
실시예
2 :
대황정제환
제조
실시예 1에서 제조한 대황효소추출물을 쉽게 섭취가 가능하도록 하기 위하여 정제환으로 제조하는 실험을 하였다. 고지혈증 및 혈당에 효과가 있다고 알려져 있는 다시마, 쥐눈이콩, 검은깨, 양파, 및 마늘을 추가로 선택하였으며, 예비 실험을 통하여 가장 좋은 효과를 보인 함량을 결정하였다. 최적의 함량은 대황 효소추출물 15 내지 21 중량%, 대황분말 17 내지 23중량%, 다시마분말 14 내지 21중량% 범위내로 혼합하였을 때였다.
본 정제환 제조 실험에서는 대황분말 20%, 대황 효소추출물분말 18%, 다시마분말 17%, 쥐눈이콩분말 15%, 검은깨분말 12%, 양파분말 6%, 마늘분말 6%, 및 맥아효모 분말 6%를 혼합하였고, 상기 배합비로 혼합한 후 KJ-2 자동제환기(한국특허상품개발원, 부산, 한국)를 사용하여 환약(pill)을 제조한 후 50-55℃에서 열풍건조기로 수분 함량 10% 이하가 되도록 건조하여 대황정제환을 제조하였다.
실험예
1:
대황분말
, 추출물 및
정제환에
의한
래트
체중,
식이섭취량
및
식이효율
변화 측정
본 실험예에서 상기 실시예 1, 2에서 얻은 대황분말, 추출물 및 정제환의 고지방-콜레스테롤 유도 래트의 지질대사 개선 효과를 살펴보기로 하였다.
래트 식이 실험
체중 100± 2 g 내외의 스프라구에-다울레이(Sprague-Dawley)종 수컷 래트를 한국실험동물센터(서울, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, 실험식이 시작 전 일주일간 일반배합사료 (퓨리나, 서울, 한국)로 예비사육 하였다. 분말식이는 P/S(다가불포화지방산/포화지방산) 비율이 0.5가 되게 쇠기름과 대두유를 11:4의 비율로 혼합한 고지방식에 콜레스테롤을 0.5% 첨가한 고지방/콜레스테롤 대조(control)식이를 조제하였다. 이 대조식이에 해조류 분말 또는 추출물 및 대황정제환 제품을 첨가하여 실험식이를 조제하여 1, 2차의 식이실험을 수행하였으며, 각각의 조성물은 표 1에 나타내었다.
혈청 지질 및 혈당 개선 효과 측정을 위한 실험군들의 식이조성
성분 |
대조군 |
알긴산 첨가 비교군 |
해조류 첨가 실험군1 |
대황추출물 실험군2 |
대황정제환 제품 시험군3 |
카제인 |
200 |
200 |
200 |
200 |
200 |
옥수수전분 |
400 |
400 |
400 |
400 |
400 |
수크로스(설탕) |
150 |
150 |
150 |
150 |
150 |
우지(Beef tallow) |
110 |
110 |
110 |
110 |
110 |
콩기름 |
40 |
40 |
40 |
40 |
40 |
미네랄 혼합물(AIN-93) |
35 |
35 |
35 |
35 |
35 |
비타민 혼합물(AIN-93) |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
콜레스테롤 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
셀룰로스 |
50 |
30 |
20 |
45-47 |
38 |
알긴산 |
|
20 |
|
|
|
해조류 분말1 |
|
|
50-100 |
|
|
대황추출물2 |
|
|
|
50 |
|
대황정제환 제품3 |
|
|
|
|
50 |
11차 식이실험에 사용된 해조류 분말 ; 미역분말 8%, 다시마분말 10%, 곰피분말 10%, 대황분말 10%
22차 식이실험에 사용된 대황(Eisenia bicyclis, EB) 물추출물 및 에탄올추출물, 그리고 효소추출물
32차 식이실험에 사용된 대황정제환 제품; 대황분말 20%, 대황효소추출물분말 18%, 다시마분말 17%, 쥐눈이콩분말 15%, 검은깨분말 12%, 양파분말 6%, 마늘분말 6%, 맥아효모분말 6% 함유.
먼저 1차 식이실험은 해조류 분말을 사용한 실험으로 대조식이에 미역분말 8%, 다시마분말 10%, 곰피분말 10%, 및 대황분말 10%되게 첨가한 4종의 해조류 분말 첨가식이를 대조식이와 알긴산 2% 첨가식이(비교군)와 함께 조제하여 래트에게 4주간 섭취시켰다. 4종의 해조류 분말 첨가량은 각 해조분말에 함유된 섬유소가 식이에 약 3%가 되도록 조정한 것이며 모든 식이에 총섬유소 함량을 5%로 조정하기 위하여(AIN 93) 해조류 분말 식이는 셀룰로스 양을 2%로 추가하였고, 대조군에는 5%, 알긴산식에는 3% 추가하였다. 2차 식이실험은 대황을 중심으로 대황분말, 물추출물과 에탄올추출물, 대황 효소추출물 그리고 대황분말에 대황효소추출물, 다시마 분말과 더불어 여러 부형제를 혼합하여 제조한 대황정제환 제품(EB pill)을 식이에 첨가하였으며 이 식이들의 효과를 대조식과 대황분말식과 비교하였다. 이때 대황분말식은 1차식이 때와 동일하게 식이에 분말이 10%, 추출물들은 5%, 그리고 대황정제환 제품은 5%로 첨가하였고 각 시료들에 함유된 섬유소양을 고려하여 첨가되는 셀룰로스 양을 조정하여 식이내 총섬유소가 5% 되게하였다. 식이실험에서 사용한 래트는 각 군당 10마리씩이었고 실험식이는 4주간 시행하였다. 식이실험을 위한 모든 식이는 4℃에서 보관하였으며 매일 일정 시간에 공급하여 자유섭취하게 하고 이때 사육조건은 온도 22± 1℃, 습도 50± 10%로 하였으며, 명암은 12시간(light 6:00~18:00)을 주기로 자동 조절되게 하였다.
래트
체중,
식이섭취량
및
식이효율
측정
식이성 고지혈증이 유발된 실험동물을 대조군(control), 알긴산 투여군, 4 가지 해조류(미역, 다시마, 곰피 및 대황) 분말 투여군으로 나누어 1차 실험을 수행하였으며, 아울러 대황분말을 다시 물추출물, 에탄올추출물, 효소추출물 및 대황정제환 제품 식이군으로 나누어 실시한 2차 실험을 수행한 식이군들을 전부 종합하여 1일 식이섭취량과 체중증가량 및 식이효율을 각각 측정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
고지방-콜레스테롤 식이 래트의 4주 동안 실험군의 식이섭취량과 체중증가량 및 식이효율
그룹1) |
식이섭취량 (g/day) |
체중증가량 (g/day) |
식이효율2) |
대조군(Control) |
23.34±0.433) |
9.17±0.37 |
0.39±0.01 |
알긴산 |
22.80±1.17 |
8.88±0.38 |
0.39±0.01 |
미역분말 |
23.33±0.60 |
9.35±0.45 |
0.39±0.02 |
다시마분말 |
21.48±0.70 |
7.66±0.34 |
0.42±0.07 |
곰피분말 |
23.26±0.27 |
8.50±0.33 |
0.36±0.01 |
대황분말 |
23.30±0.62 |
9.64±0.52 |
0.41±0.02 |
대황 물추출물 |
25.35±0.40 |
9.00±0.45 |
0.35±0.01 |
대황 에탄올추출물 |
23.46±0.66 |
8.89±0.40 |
0.38±0.01 |
대황 효소추출물 |
25.38±0.37 |
9.04±0.37 |
0.36±0.05 |
대황정제환 제품 |
24.62±0.69 |
9.32±0.54 |
0.38±0.01 |
1)대조군, 고지방-콜레스테톨 식이그룹; 알긴산군, 대조군 식이 +2% 알긴산 식이; 미역분말군, 대조군 식이 + 8% 미역 식이; 다시마분말군, 대조군 식이 + 10% 다시마 식이; 곰피분말군, 대조군 식이 + 10% 곰피 식이; 대황분말군, 대조군 식이 + 10% 대황 식이; 대황물추출물군, 대조군 식이 + 5% 대황 물추출물 식이; 대황 에탄올추출물군, 대조군 식이 + 5% 대황 에탄올추출물 식이; 대황 효소추출물군, 대조군 식이 + 5% 대황 효소추출물 식이; 대황정제환 제품군, 대조군 식이 + 20% 대황분말 + 18% 대황효소추출물 +17% 다시마분말 +15% 쥐눈이콩분말 + 12% 검은깨분말 + 6% 양파분말 + 6% 마늘분말 + 6% 맥아효모분말.
2)체중증가량/식이섭취.
3)평균± SD (n=10).
먼저 4가지 해조류분말군 간의 식이섭취량을 비교한 결과 다시마분말 섭취군의 식이섭취량이 가장 낮아서 체중증가량도 제일 낮았으며, 그 외 미역, 곰피, 및 대황분말 식이군들의 식이섭취량은 대조군과 유사하였다. 그리고 식이섭취량이 적은 군들이 체중증가량도 대체로 낮아 식이효율에서 차이는 없었다.
다음, 대황섭취군 간에 비교를 해 볼 때, 대황 물추출물, 효소추출물 및 대황정제환의 식이섭취량이 대황분말군보다 다소 높았으나 체중 증가는 오히려 낮은 경향이어서 식이효율이 대황분말군에 비하여 낮은 경향이었다. 반면, 대황 에탄올추출물군은 대황분말군과 유사한 식이섭취량을 나타내었으나 체중 증가는 오히려 낮은 경향이어서 식이효율은 대황분말군에 비하여 낮은 경향이었다.
실험예
2:
대황분말
,
대황추출물
및
대황정제환의
고지혈증 억제효과 분석
상기 식이 실험군들의 항고지혈증 작용을 측정하기 위해 사육 종료 후 실험동물을 12시간 절식시킨 다음 가벼운 에테르 마취 하에서 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 BD 진공채혈관(Vacutainer blood collection tube; BD, Dickinson Co. UK)에 넣어서 3,100 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 간 조직은 혈액 채취 후 즉시 적출하여 가아제로 피를 제거한 뒤 무게를 측정하였다. 다음, 혈청지질 상태 개선효능을 측정하기 위하여 사육한 래트들의 혈청 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤과 중성지방(triglyceride, TG)은 효소 키트(아산제역, 서울)를 사용하여 정량하였으며, 혈청의 지질과산화 지표인 TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)는 Yagi(Yagi 1976)와 Ohkawa(Ohkawa et al., 1979)등의 방법에 따라 측정한 후 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(1,1,3,3-tetraethoxy- propane)의 검량선으로부터 환산하여 정량하였다. 혈청의 GOT(glutamate oxaloacetate transaminase) 및 GPT(glutamate pyruvate transaminase), 알부민, 및 세라티닌(ceratinine) 함량은 키트 시약(아산제약, 서울)을 사용하여 측정하였다.
해조류 종류에 따른 혈청지질 측정
미역, 다시마, 곰피, 및 대황분말을 첨가한 고지방-콜레스테롤 식이를 4주 섭취한 실험군들의 혈청지질 수준은 표 3과 같다.
고지방-콜레스테롤 식이 래트의 혈청지질 수준에 미치는 여러 해조류분말의 효과
그룹* |
전체 콜레스테롤 |
HDL- 콜레스테롤 |
HDL-/전체콜레스테롤(%) |
트리글리세라이드 |
대조군(Control) |
102.4±5.2a |
18.1±1.1c |
17.6c |
91.9±6.2a |
알긴산 |
98.6±10.2ab |
25.6±3.5b |
26.0b |
80.5±15.0ab |
미역분말 |
90.7±12.2ab |
29.0±2.9ab |
31.9b |
94.8±9.5a |
다시마분말 |
76.0±4.5b |
26.7±1.9b |
35.1ab |
61.0± 7.3b |
곰피분말 |
90.1±5.2ab |
27.9±2.7ab |
31.0b |
59.6± 5.7b |
대황분말 |
75.3±7.1b |
32.9±2.9a |
43.7a |
79.0±8.6ab |
*실험조건은 표 2와 같다.
*평균± SD.
*a,b는 측정치간에 통계학적 유의성 (p <0.05)이 있음을 나타냄.
표 3에 나타낸 바와 같이, 4 가지 해조류 분말 투여군에서 총콜레스테롤 수준이 대조군(control)에 비하여 전체적으로 낮았으며 특히 다시마분말 및 대황분말 섭취군에서 유의적으로 낮은 반면, 미역과 곰피분말은 낮은 경향만을 보여 주었다. 그러나 미역, 다시마 등에 많이 함유되어 있는 주된 식이섬유인 알긴산만을 공급하였을 경우에 대조군에 비하여 혈청 총콜레스테롤의 수준은 차이가 별로 없었다.
한편, HDL-콜레스테롤의 수준은 시험 해조류들뿐 아니라 알긴산도 상승시키는 효과를 보여 주었으며 해조류 중에서는 대황분말의 효과가 가장 컸으며, 그 다음으로 미역 > 곰피 > 다시마 순이었다. 다음, 혈청 중성지방(트리글리세라이드) 수준은 미역을 제외하고는 모두 강하효과를 나타내었으며, 특히 다시마분말과 곰피분말의 강하효과가 유의적이었다.
대황추출물
및
대황정제환
제품 섭취에 의한 혈청지질 측정
1차 식이실험에서 대황분말이 혈청 총콜레스테롤 저하효과와 아울러 HDL-콜레스테롤 상승효과가 탁월하여 이를 좀 더 상세히 알아보고자 2차 식이실험에서 대황물추출물과 에탄올추출물, 효소추출물 그리고 대황분말에 효소추출물 및 다시마분말을 혼합하여 제조한 대황정제환 제품이 고지방-콜레스테롤식이 래트의 혈청 지질에 미치는 영향을 조사한 결과는 표 4와 같다.
고지방-콜레스테롤 식이 래트의 혈청지질 수준에 미치는 여러 대황추출물 및 대황정제환의 효과
그룹* |
전체 콜레스테롤 |
HDL- 콜레스테롤 |
HDL-/전체 콜레스테롤(%) |
트리글리세라이드 |
대조군(control) |
102.4±5.2a |
18.1±1.1b |
17.6c |
91.9±6.2ba |
대황분말 |
75.3±7.1b |
32.9±2.9a |
43.7a |
79.0±8.6ab |
대황 물추출물 |
88.1±4.1ab |
30.9±2.9a |
35.1ab |
68.1±6.2bc |
대황 에탄올추출물 |
92.5±12.6ab |
29.2±1.9a |
31.6b |
79.2±5.9ab |
대황 효소추출물 |
80.6±5.6b |
28.9±3.2a |
35.9ab |
67.8±5.2bc |
대황정제환 제품 |
77.9±8.6b |
27.6±2.1a |
35.4ab |
63.3±5.6c |
*실험조건은 표 2와 같다.
*평균± SD.
*a,b는 측정치간에 통계학적 유의성 (p <0.05)이 있음을 나타냄.
대황의 물추출물 및 에탄올추출물은 대황분말과 달리 혈청 콜레스테롤 저하효과가 나타나지 않았으나 대황 효소추출물 및 대황정제환 제품은 유의적으로 혈청 콜레스테롤 수준을 강하시켰다. 또한, HDL-콜레스테롤의 수준은 1차 실험에서와 같이 대조군에 비하여 모든 대황 시료군에서 증가하였다. 즉, 대황물추출물 및 에탄올추출물은 HDL-콜레스테롤의 수준을 67% 정도 상승시켰으며, 대황효소추출물 및 대황정제환 제품도 50% 정도 증가시키는 효과가 있었다. 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율에서도 마찬가지였으나 실험군간의 차이가 더 뚜렷하여, 즉, 대황분말의 효과가 가장 높고, 물추출물, 효소추출물, 및 대황정제환 제품이 거의 같고 대황 에탄올추출물의 효과가 다소 낮았다. 그러나 혈청 중성지방 강하 효과는 대황분말보다 대황 물추출물 및 효소추출물이 다소 우수하였으며, 대황정제환 제품의 효과가 가장 우수하였다. 이와같이 대황분말, 대황효소추출물, 및 다시마분말을 함유한 대황정제환 제품의 중성지방 강하효과가 우수한 것은 앞서 밝혀진 중성지방 강하효과를 지닌 대황효소추출물 및 다시마분말이 첨가된 것이 주원인으로 사료되지만 부재료로 첨가한 쥐눈이콩, 흑깨, 양파 및 마늘 등에 의한 시너지 효과 때문이라고 판단된다.
이러한 결과를 미루어볼 때 본 연구에서 개발된 대황정제환 제품은 혈청 콜레스테롤과 중성지방을 저하시키고 동맥경화 예방인자인 HDL-콜레스테롤 수치를 상승시키는 효과가 우수함을 확인할 수 있었기에 본 제품을 혈청 지질성분 개선 효능이 있는 건강기능성식품으로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
해조류 분말,
대황추출물
및
대황정제환
제품 섭취에 의한 혈청과산화지질 측정
해조류 종류와 대황의 처리형태와 대황정제환 제품이 고지방/콜레스테롤식이를 섭취한 쥐들의 혈청 과산화지질 수준을 나타낸 결과는 표 5와 같다.
고지방-콜레스테롤 식이 래트의 혈청 TBARS 수준에 미치는 여러 해조류분말, 대황추출물 및 대황정제환의 효과
그룹 |
TBARS ( MDA nmol / mL ) |
대조군(control) |
0.92±0.07a |
알긴산 |
0.80±0.05ab |
미역분말 |
0.89±0.03ab |
다시마분말 |
0.88±0.05ab |
곰피분말 |
0.78±0.05ab |
대황분말 |
0.75±0.05ab |
대황 물추출물 |
0.72±0.06ab |
대황 에탄올추출물 |
0.79±0.05ab |
대황 효소추출물 |
0.70±0.05ab |
대황정제환 제품 |
0.63±0.07b |
*실험조건은 표 2와 같다.
*평균± SD.
*a,b는 측정치간에 통계학적 유의성 (p <0.05)이 있음을 나타냄.
표 5에 나타낸 바와 같이, TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)로 측정한 혈청 과산화지질의 양은 대조군에 비하여 해조류 섭취군에서 낮은 경향을 보였고, 대황 및 대황 추출물 섭취로 더 낮아지는 경향이었으며 대황정제환 제품(EB pill)에서는 유의적인 감소가 있었다. 이로써 해조류의 항산화 작용을 in vivo 에서 확인할 수 있었으며, 특히 대황정제환 제품의 우수한 항산화 효과를 확인함으로써 향후 대황정제환 제품은 항고지혈증 및 항산화성 효능을 지닌 건강기능식품으로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
해조류 분말,
대황추출물
및
대황정제환
제품 섭취에 의한 혈청 병리지표 측정
해조류 종류와 대황의 처리형태와 대황정제환 제품이 고지방/콜레스테롤식이를 섭취한 쥐들의 혈청 병리지표들을 측정한 결과는 표 6과 같다.
고지방-콜레스테롤 식이 래트의 혈청 GOT, GPT, BUN(blood urea nitrogen), 및 알부민 수준에 미치는 여러 해조류분말, 대황추출물 및 대황정제환의 효과
그룹* |
GOT(IU/ℓ) |
GPT(IU/ℓ) |
BUN(mg/㎗) |
알부민(g/㎗) |
대조군(control) |
61.6±1.4a |
16.7±1.8 |
26.3±0.4ab |
3.9±0.1 |
알긴산 |
56.9±1.4ab |
14.2±2.1 |
21.6±0.6d |
3.6±0.4 |
미역분말 |
57.5±1.5ab |
17.0±2.0 |
25.0±0.9bc |
3.9±0.1 |
다시마분말 |
59.9±1.8ab |
17.3±1.8 |
27.3±1.4ab |
3.6±0.1 |
곰피분말 |
55.3±1.6ab |
12.7±1.4 |
28.1±1.1a |
3.6±0.1 |
대황분말 |
52.4±1.7b |
13.6±1.3 |
25.1±0.7b |
3.8±0.1 |
대황 물추출물 |
58.4±2.3ab |
17.7±2.0 |
21.0±0.8d |
3.9±0.1 |
대황 에탄올추출물 |
57.6±2.4ab |
15.7±1.8 |
24.6±0.8bc |
3.8±0.1 |
대황 효소추출물 |
55.1±1.7ab |
13.9±1.5 |
24.9±0.7bc |
3.6±0.1 |
대황정제환 제품 |
54.6±1.6ab |
12.7±1.2 |
24.5±0.8bc |
3.7±0.1 |
*실험조건은 표 2와 같다.
*평균± SD.
*a,b,c는 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음을 나타냄.
표 6에 나타낸 바와 같이, 해조류 시험물질 섭취로 인하여 혈청 GOT, GPT, BUN(blood urea nitrogen) 및 알부민 수준에 차이가 없어 간장조직이나 신장기능에 악영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 오히려 GOT와 BUN의 수준이 대체적으로 감소하여 해당 장기를 보호하는 효과가 있는 것으로 보인다. 이러한 효과는 특히 대황분말에서 뚜렷하고 대황 효소추출물 및 대황정제환(EB pill)도 유사한 결과를 보였기에 대황을 이용한 기능성식품 개발에 문제가 없음을 보여 준다.
실험예
3:
대황분말
,
대황추출물
및
대황정제환의
혈당 억제효과 분석
해조류 종류에 따른 당뇨 마우스의 혈당, 체중변화 및 사망률 측정
당뇨실험을 위하여 환경에 적응된 ICR 마우스에 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ)을 40 mg/kg bw의 용량으로 5일간 연속 근육에 주사하였다. 혈당 상승이 확인되는 시점, 즉, STZ 첫 번째 주사로부터 1주일 후부터 실험식이를 급여하여 3주간 사육하였다. 실험식이 기간 중의 당뇨 마우스의 혈당 변화는 식이를 급여하기 전 오후, 즉 공복시에 꼬리 혈관에 소량의 혈액을 취하여 혈당계 (Blood glucose monitoring kit, ARKRAY, Inc., Japan)를 이용하여 3~4일 한번씩 측정하였다.
사육기간 중 당뇨 마우스의 식이섭취량은 매일 측정하였으며 체중은 3일에 한번 측정하였다. 위의 모든 실험결과는 분산분산법(analysis of variance)으로 군간의 차이를 조사하였으며, 터키의 테스트방법(Tukey's test)에 의하여 유의성 차이를 p <0.05 수준에서 검증하였다.
4가지 해조류(미역, 다시마, 곰피 및 대황)분말을 10% 수준으로 첨가한 실험식이를 3주간 섭취하는 동안의 당뇨 생쥐들의 혈당과 체중 변화를 조사한 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 UP powder는 미역분말군을, LJ powder는 다시마분말군을, ES powder는 곰피분말군을, EB powder는 대황분말군을 나타내며, 화살표는 당뇨를 유발하기 위한 STZ(40mg/kg BW) 근육주사를 나타낸다. 또한 도면 내의 바(bars)는 표준편자를 나타내며 a, b는 측정치간에 통계학적 유의성(p<0.05)이 있음을 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 당뇨를 유발하기 위하여 연속 5일간 스트렙토조토신(STZ)을 투여하고 나서 3일 후 (첫 투여일로부터는 8일째) 공복시 혈당이 154± 12 mg/100 mL로, 당뇨 유발 전의 54± 3 mg/100 mL에 비하여 현저히 증가하기 시작하였다. 이 후 혈당은 급속히 상승하여 11일부터 15일째 전체 실험동물들의 평균 혈당이 353± 33~453± 30 mg/100 mL 범위였으며, 그리고 18일째는 502± 39mg/100 mL으로 크게 상승하였다. STZ 첫 투여 후 18일 이후에는 혈당계로 측정할 수 있는 한계인 600 mg/100 mL을 넘는 실험동물들이 많아서 정확한 평균 혈당치를 산정할 수 없었다. 당뇨 기간 동안의 혈당 상승은 대조군에 비하여 해조류 분말 섭취 실험군들이 낮았으며, 특히 다시마군이 가장 낮았고, 대황과 미역분말 섭취군도 18일째 혈당은 대조군에 비하여 유의적으로 낮았다. 알긴산 섭취군은 초기에는 대조군에 비하여 혈당 상승이 낮은 경향이었으나 18일째 혈당수준은 대조군과 같았다.
한편, STZ 투여 11일 이후부터 25일까지 6가지 실험군에서 혈당이 600 mg/100 mL을 상위하는 당뇨생쥐들의 수와 이 기간 동안에 죽은 생쥐의 수를 조사한 결과는 표 7과 같다.
STZ 투여 11일 이후부터 25일까지 6가지 실험군에서 혈당이 600 mg/100 mL을 상위하는 당뇨생쥐들의 수와 이 기간 동안에 죽은 생쥐의 수
실험군 |
혈당치가 600 mg/100 mL 이상인 당뇨생쥐의 수 |
식이 3주간 당뇨생쥐 사망수 |
첫 번째 STZ 투여 후 일수 |
11 |
15 |
18 |
22 |
25 |
대조군(control)1) |
2 |
7 |
8 |
8 |
8 |
1/10 |
알긴산 |
0 |
6 |
6 |
7 |
8 |
2/8 |
미역분말 |
2 |
5 |
6 |
9 |
7 |
3/10 |
다시마분말 |
1 |
2 |
4 |
7 |
6 |
1/10 |
곰피분말 |
0 |
4 |
3 |
2 |
3 |
4/10 |
대황분말 |
0 |
3 |
6 |
6 |
6 |
0/10 |
1)6가지 당뇨쥐 그룹은 도 1과 같으며, 식이조건은 표 1과 같다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 대조군에서 7일 이후에 600 mg/100 mL이 넘는 고혈당의 발생이 제일 높았으며, 숫자도 제일 많았다. 알긴산과 미역분말 섭취군이 그 다음 순이었고, 다시마와 대황분말에서 발생이 낮았으며 곰피분말은 초기의 발생은 다시마와 대황분말보다 높았다. 고혈당 발생에 비하여 대조군에서 사망빈도는 낮았고 곰피군의 초기 고혈당이 사망을 유도한 것으로 사망률이 제일 높았으며, 다시마군에서 낮았고, 대황군에서는 동물이 한 마리도 사망하지 않았다.
또한 당뇨 유발 기간 중 체중변화를 살펴 본 결과는 역시 도 1에 나타내었다. 혈당이 154± 12 mg/100 mL로 증가되기 전, 6일 이후부터 모든 실험군에서 체중이 감소하기 시작하여 약 1주일간 지속적으로 감소하였다. 그러나 2주 이후부터는 체중이 유지되거나 약간 증가하는 회복세를 보였다. 알긴산군과 미역분말섭취군은 초기체중이 낮아 식이기간 중 지속적으로 다른 군에 비하여 체중이 낮았으나 체중변화의 추세는 다른 군과 같았고, 실험동물들간의 체중의 차이가 커서 군간의 유의적인 차이는 없었다.
대황분말
,
대황추출물
및
대황정제환
섭취에 따른 당뇨 마우스의 혈당, 체중 변화 및 사망률 측정
해조류 분말 식이에서 혈당 강하효과가 가장 좋았던 대황을 중심으로 대황분말(Eisenia bicyclis, EB powder)은 10% 그대로, 물추출물(EB water Ext), 에탄올추출물(EB ethanol Ext), 효소추출물(EB enzyme Ext) 및 대황분말 함유 대황정제환(EB pill)를 식이에 5% 첨가하여 제조한 식이를 섭취시키는 동안의 당뇨 생쥐들의 혈당과 체중 변화를 조사한 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 EB powder는 대황분말군을, EB water Ext는 대황물추출물군을, EB ethanol Ext은 대황에탄올추출물군을, EB enzyme Ext는 대황효소추출물군을, EB pill은 대황정제환을 의미한다. 또한 화살표는 당뇨를 유발하기 위한 STZ(40 mg/kg BW) 근육주사를, 바(Bars)는 표준편차를, a,b,c는 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음을 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 혈당변화 패턴은 도 1과 유사하였으나 18일째 대조군의 혈당이 645± 39mg/100 mL 인데 비하여 대황분말군 494± 29mg/100 mL, 대황 물추출물군 496± 29 mg/100 mL로 고혈당 억제 효과가 뚜렷하였고, 에탄올추출물은 527± 10 mg/100 mL로 혈당 강하효과가 다소 낮았다. 특히 대황 효소추출물(EB enzyme Ext)의 혈당 상승 억제효과는 11일 이후부터 매우 유의적으로 나타났으며, 18일째에는 혈당이 378± 49 mg/100 mL으로 가장 낮았다. 또한, 같은 날짜에 대황정제환 제품(EB pill)의 혈당도 473± 26 mg/100 mL으로 대황효소추출물 다음으로 혈당 상승 억제작용을 보였다.
한편, 당뇨 식이 기간 중에 혈당이 600 mg/100 mL을 넘는 당뇨 생쥐의 수와 죽은 생쥐의 수를 조사한 결과는 표 8과 같다.
STZ 투여 11일 후부터 25일까지 6가지 대황실험군에서 혈당이 600 mg/100 mL을 상위하는 당뇨생쥐들의 수와 이 기간 동안에 죽은 생쥐의 수
|
혈당 600 mg/100 mL 이상인 당뇨쥐 수 |
식이 3주간 당뇨쥐 사망수 |
첫 번째 STZ 투여 후 일수 |
11 |
15 |
18 |
22 |
25 |
대조군(control)1 ) |
2 |
7 |
8 |
8 |
8 |
1/10 |
대황분말 |
0 |
3 |
6 |
6 |
6 |
0/10 |
대황물추출물 |
1 |
4 |
6 |
8 |
7 |
0/10 |
대황에탄올추출물 |
0 |
4 |
7 |
7 |
|
0/9 |
대황효소추출물 |
0 |
1 |
1 |
5 |
|
1/10 |
대황정제환 제품 |
2 |
2 |
3 |
4 |
7 |
1/10 |
1)6가지 당뇨생쥐 그룹은 그림 2와 같으며, 식이조건은 표 1과 같다.
STZ 투여 후 11-18일 기간 중의 혈당이 600 mg/100 mL을 넘는 생쥐의 수는 대황실험군들에서 대조군에 비하여 모두 낮았으며 특히 대황효소추출물군에서 제일 낮았고 대황정제환 제품(EB pill) 순이어서 도 2의 혈당 상승곡선 결과와 일치하였다. 다음, 대황분말, 추출물 및 제품 섭취군들의 당뇨기간의 사망률은 표 8에서 보는 바와 같이 해조류 분말식이군들보다 매우 낮아서 한 마리가 사망하거나 전혀 사망하지 않아 당뇨상태가 개선되었음을 다시 확인할 수 있었다.
한편, 대황 실험군들의 체중 변화는 도 2에서 보는 바와 같이 전반적인 추세는 도 1과 같았으며 당뇨가 진행되면서 대황물추출물군과 에탄올추출물군에서 감소 경향을 보였다. 대황효소추출물군은 다른 군에 비하여 빨리 체중이 회복되어 증가하는 것을 보여 주었으며, 이 또한 당뇨상태가 다른 군에 비하여 더 잘 개선 되었음을 보여주었다. 대황정제환 제품(EB pill)의 체중도 잘 회복되었으며 해조류 분말실험 때와 같이 실험동물들간의 체중의 차이가 커서 군간의 유의적인 차이는 볼 수 없었다.
이러한 결과로 미루어 볼 때 4가지 해조류(미역, 다시마, 곰피, 및 대황) 중 대황분말이 가장 우수한 고지혈증 및 당뇨 억제효능을 나타내었으며, 특히 대황추출물 중 효소추출물이 가장 우수한 고지혈증 및 당뇨 억제효과를 나타내었다. 또한, 대황정제환 제품도 혈청지질 및 당뇨 개선효과가 우수하여 향후 대황함유 정제환제품은 고지혈증 및 당뇨에서 유래되는 심장병 및 당뇨병을 예방할 수 있는 건강기능식품으로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.