KR101774566B1 - 면역기능 증진 활성이 우수한 효소처리 보리잎 유래 다당 분획물 및 이의 용도 - Google Patents

면역기능 증진 활성이 우수한 효소처리 보리잎 유래 다당 분획물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 보리잎 유래 다당 분획물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조되고, 중성 다당(neutral sugar)은 65 내지 85 중량비이고, 우론산(uronic acid)은 5 내지 30 중량비인 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물에 관한 것으로, 상기 다당 분획물은 우수한 면역 증진활성 및 암 전이 억제 활성을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 보리잎 다당분획물은 선천면역계 및 적응면역계 증강 효과가 우수할 뿐만 아니라 암 전이 억제 활성 또한 매우 우수한 효과가 있어 경쟁력 있는 면역 증강용 식품용 조성물, 면역 증강용 의약품 제조 및 암 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

면역기능 증진 활성이 우수한 효소처리 보리잎 유래 다당 분획물 및 이의 용도{Polysaccharide fraction isolated from enzyme treated barley grass with immune-enhancing activity and uses thereof}
본 발명은 면역기능 증진 활성이 있는 보리잎 유래 다당 분획물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조되고, 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 65 내지 85 중량% 및 우론산(uronic acid) 5 내지 30 중량% 인 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물에 관한 것으로, 상기 다당 분획물은 우수한 면역 증진활성 및 암 전이 억제 활성을 특징으로 한다.
보리잎에는 단백질과 18종의 아미노산 및 8종의 필수아미노산을 함유하고 있으며, 이중 90% 이상이 쉽게 소화 흡수되는 폴리펩타이드(polypeptide)로 존재한다. 또한 보리잎에는 다량의 클로로필은 염증을 중화시키고 해독력을 높여 유해물, 유독물을 효과적으로 해체하며(Keiichi, 2000), 오렌지의 7배되는 비타민 C와 우유의 55배 이상, 시금치의 18배나 되는 칼륨, 우유의 11배나 되는 칼슘이 들어있어 생리활성 조절능력이 있는 기능성 식품을 섭취하고자 하는 요구 증가에 부합되는 천연건강식품으로 미국, 일본에서 활발히 연구 진행되고 있다. 이와 같은 보리잎이 가지는 여러 효능에 대해서는 공지된 바 있으며, 그 예로 보리잎의 추출물이SOD(superoxide dimutase)를 높은 수준으로 포함하고 있다고 보고하였고(Hagiwara 1978), In vitro 상에서 항염성, 항류마티스염 활성과 궤양상해 치료효과, 항산화, 항알러지, 항암, 항궤양, 항바이러스 등의 기능이 보리잎의 추출물에서 나타난다고 보고하였다(Kubota et al. 1983). 보리잎의 기능성 물질은 플라보노이드계 화합물중 C-글리코실플라본과 C-글리코실이소플라본인 비텍신(vitexin), 이소비텍신(isovitexin), 비텍신-2-0-람노사이드(vitexin-2-O-rhamnoside)인데, 오사와 등은 보리의 어린잎으로부터 2"(3")-O-글리코실이소비텍신[2"(3")-O-glycosylisovitexin]이라는 항산화 물질을 분리하였음을 보고한 바 있으며(Toshihiko Osawa et al., J.Agric. Food Chem. 1992, 40, 1135-1138), 카주미 키타 등은 보리잎 유래의 이소플라보노이드류인 2"-O-글리코실이소비텍신[2"-O-glycosylisovitexin]의 항산화 활성을 개시한 바 있다(Kazumi Kitta et al., J. Agric.Food Chem. 1992, 40, 1843-1845).
면역은 나와 남을 구별하는 것이며, 면역력은 인체가 내-외부의 적으로부터 스스로를 지켜내기 위한 자위력이다. 세균, 바이러스 등의 외부의 적과 인체 내의 죽은 세포나 유전자복제로 탄생한 새로운 세포 중 비정상적인 세포인 내부의 적이 없어져야만 건강을 유지할 수 있는데 이러한 역할을 담당하는 것이 바로 '면역시스템'이다. 따라서 면역기능이 저하되면 질병에 쉽게 걸리는 것은 당연한 것이다. 그리고 노화와 더불어 면역기능도 함께 저하되는 것이 일반적이다.
면역 기능에 장애가 발생하는 문제점을 극복하기 위하여, 다양한 면역 기능 강화 치료제가 개발 및 사용되고 있다. 그러나 별도의 치료제를 장기간 복용할 경우, 개개인마다 면역력의 차이가 달라서 그 부작용의 문제점이 크다는 단점이 있다. 특히, 면역 질환은 치료보다 예방이 중요한데, 현재 시판되고 있는 치료제를 예방을 위하여 복용하기 어려운 것이 현실이다. 따라서 부작용 없는 천연 재료 치료제가 필요하다. 지금까지 밝혀진 천연물 유래의 면역계 활성화에 관여하는 물질들은 표고버섯(Lentinus edode)에서 분리한lentinan과 구름버섯(Coliolus versicolar)에서 분리한 PSK(polysaccharide K) 등이 있다.
대식세포는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지 cytokine을 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로서, 항원제시와 림프구의 비 특이적 면역작용에 관계하며, 종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다. 또한 TLR (tolllike receptor)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 대식세포를 활성화하여 T세포와 B 세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성화, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 및 TNF-α와 같은 cytokine을 생산한다고 알려져 있다.
자연살해세포(NK cell)는 다양한 기전을 통해 암 세포나 바이러스에 감염된 세포를 직접적으로 공격하여 사멸시키는 기능을 가지며, 전체 림프구에서 5~10% 비율로 소량 존재하지만 정상 세포에서 돌연변이와 같은 이상이 감지되었을 때 가장 처음으로 방어하여 이를 제거하는 강력한 기능을 갖는다. 또한 다른 면역 세포의 기능 조절에도 매우 중요한 역할을 담당하여 선천면역 세포이면서도 획득면역 세포를 자극하여 더 강력한 방어 작용을 한다.
본 발명자들은 면역기능을 증진시킬 수 있는 새로운 방법에 관하여 연구하던 중 본 발명의 면역기능 증진 활성이 있는 보리잎 유래 다당 분획물은 특정 당 조성을 가지는 다당체를 포함하고 있으며, 면역기능을 증진하는 효능이 매우 뛰어난 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조되고, 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 65 내지 85 중량% 및 우론산(uronic acid) 5 내지 30 중량% 인 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 보리잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리하는 상기 보리잎 유래 다당 분획물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조되고, 중성 다당(neutral sugar)은 65 내지 85 중량비이고, 우론산(uronic acid)은 5 내지 30 중량비인 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 보리잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리하는 상기 보리잎 유래 다당 분획물의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조되고, 중성 다당(neutral sugar)은 65 내지 85 중량비이고, 우론산(uronic acid)은 5 내지 30 중량비인 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물을 제공한다.
본 발명에서 전체 다당 분획물은 중성 다당 및 우론산으로 이루어져 있으며, KDO 유사물질(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 및/또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하고, 상기 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사물질은 DHA (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO 로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 중성 다당은 아라비노오스, 자일로스 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 중성 다당은 람노오스, 푸코오스, 만노오스 및 갈락토오스를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물은 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물은 (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리한다. 상기 보리잎은 건조되지 않은 보리잎이나 건조된 보리잎일 수 있으나, 분쇄된 것 또는 분말화된 것을 사용할 수 있다.
펙틴 가수분해 효소는 보리잎 분말 중량 대비 1 내지 4% 만큼 첨가하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1 내지 3% 이고, 가장 바람직하게는 1.5 내지 2.5% 일 수 있다. 효소를 처리하는 상기 보리잎은 증류수로 5배 내지 20배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 가수분해 효소 처리는 1일 내지 4일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2일 내지 3일 일 수 있다.
효소 처리 후, 잔존 펙틴 가수분해 효소를 90 내지 110℃에서 10 내지 60분 동안 가열하여 효소를 불활성화하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당을 제거할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성, 침전시킴으로서 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
상기 단계 이후에, (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 단계를 추가로 포함한다.
발명의 일실시예에서는 효소 처리 보리잎 반응액을 100℃에서 15분간 가열처리하여 잔존 pectinase를 불활성화 시키면서 유효성분을 추출하였다.
상기 (a) 및 (b) 단계를 거쳐 수득한 보리잎 추출물은 가수분해 효소 처리하는 과정을 거치기 때문에 보리잎을 그대로 열수추출한 추출물과 비교해 중성다당의 비율이 현저하게 높다. 즉, 상기 방법에 따라 추출된 보리잎 추출물은 다당 분획물을 다량 포함하고 있다.
구체적으로, 본 발명의 상기 보리잎 유리 다당 분획물은 중성 다당(neutral sugar) 65 내지 85 중량비 및 우론산(uronic acid) 5 내지 30 중량비를 포함하고 있다.
상기 (b) 단계 이후에, (c) 상기 (b)단계의 추출물로부터 고분자 다당분획물을 수득하는 단계를 추가적으로 거칠 수 있다.
상기 (c) 단계는 (c1) 가수분해된 보리잎 추출물에서 잔사를 제거하는 단계; 및 (c2) 상기 잔사가 제거된 보리잎 가수분해물에 유기용매를 넣어 침전된 조다당을 수득하는 단계로 이루어질 수 있다.
상기 (c1) 단계에서 효소 처리된 보리잎 가수분해물에서 잔사를 제거하는 방법은 원심분리, filtration 등 공지의 혼합물로부터 고형분을 제거하는 방법에 의할 수 있다. 바람직하게는 원심분리에 의할 수 있다.
(c2) 단계에서는 잔사가 제거된 보리잎 가수분해물에 유기용매를 넣어 침전된 조다당을 수득한다. 상기 유기용매는 C1 내지 C4의 에탄올일 수 있다. 에탄올 침전은 공지의 에탄올 침전법에 의할 수 있으며, 상기 에탄올 침전에 사용되는 에탄올은 물과 혼합하여 70% 내지 95%(v/v)의 농도를 가지는 에탄올이 바람직하다.
상기 (c) 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 보리잎 유래 다당분획물은 중성 다당(neutral sugar) 70 내지 85 중량비, 우론산(uronic acid) 5 내지 23 중량비를 포함하고 있다.
상기 제조방법은 ( c) 단계 이후에 한외여과 또는 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 이용하여 분자량 50 kDa 이상의 고분자 다당분획을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 추가 단계는 효소처리 후 원심분리 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제거하여 얻은 다당 추출물로부터 분자량이 50kDa 이상인 분획물을 수득하는 단계로서, 수득하는 수단은 분자량을 기준으로 정제하는 당업계에 알려진 공정은 모두 가능하며, 바람직하게는 한외여과 또는 겔 여과 크로마토그래피이고, 가장 바람직하게는 겔 여과 크로마토그래피이다. 최종 다당 분획물의 형태는 추출물, 농축물, 분말 등일 수 있다.
상기 (d)단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 보리잎 유래 다당분획물은 중성 다당 77 내지 85 중량비, 우론산 5 내지 15 중량비를 포함하고 있다.
상기 최종 다당 분획물에 50~100%의 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 저분자 물질 및 불순물을 제거하여 다당을 정제하는 단계를 추가로 실시할 수 있다.
상기한 본 발명의 제조방법에 의하면 면역기능 증강 효과가 우수한 다당분획물을 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역기능 증진활성이 있는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물을 제공한다.
면역기능이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기능을 말한다. 면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는 데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나, 손상된 세포들이 방출하는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다. 적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.
본 발명의 다당분획물은 대식세포의 NO, TNF-α 및 IL-6, IL-12의 생성을 촉진시켜 내재면역(Innate immune)을 증진시키는 효능이 있을 뿐만 아니라, 마우스 비장세포의 유사분열을 촉진하고 IFN-γ 유도 활성을 나타내 적응면역(adaptive immune)을 증진시키는 효능도 나타낸다. 또한, 본 발명의 다당분획물은 T 및 B 세포로 구성되어 있는 Peyer’s patch를 자극하여 골수세포의 분화 및 증식을 유도하는 효과를 나타낸다.
이와 같은 본 발명의 효과는 본 발명의 일실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 다당분획물이 선천면역계 면역기능 증가효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 대식세포인 RAW 264.7 세포에 본 발명의 다당분획물을 처리한 후 싸이토카인의 및 NO의 생성능을 평가하였다. 대식세포는 포식 용해소체(Phagolysosome)에서 살균 분자를 생산하여 포식된 미생물을 사멸하는 역할과 함께 감염에 대비한 방어에 있어서 여러 가지 다양한 기능을 수행하며, 이러한 기능의 대부분은 선천면역의 사이토카인들에 의해 매개된다고 알려져 있다. 본 발명의 다당분획물을 상기 대식세포에 처리한 결과, TNF-α, IL-6 및 IL-12의 생성량이 매우 증가하였고, 산화질소(NO)의 생성량 또한 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 다당분획물은 선천면역계 증강 효능이 우수한 것을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 다당분획물이 적응면역계 면역기능 증가효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 본 발명의 다당분획물을 비장세포에 처리하여 비장세포의 유사분열 정도 및 IFN-γ 생성능을 평가하였다. IFN-γ는 NK 세포, CD4+ TH1 세포 및 CD8+ T 세포에 의해 생성되는 사이토카인으로 대식세포 활성화와 함께 선천면역과 세포 내 기생세균에 대한 세포매개 적응면역에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 발명의 다당분획물은 비장세포를 자극하여 유사분열 활성을 증가시키고, IFN-γ 생성을 증가시킴으로써 적응면역계에도 효과적으로 작용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 소장 내 중요한 국소 면역조직 중 하나인 Peyer’s patch를 경유한 조혈세포인 골수세포의 증식활성을 측정한 결과 본 발명의 다당분획물이 높은 활성을 나타내었으며, Peyer’s patch 세포로부터 백혈구의 성장인자로 작용하며, 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)와 단핵구를 생산하도록 자극하는 과립구 단구-군체자극인자(granulocyte 대식세포-colony stimulating factor, GM-CSF) 및 골수의 증식에 관여를 하는 사이토카인으로 전신면역으로 확대가 일어나게 된다고 알려진 IL-6의 발현량 평가에서도 본 발명의 다당분획물 처리에 의해 상기 GM-CSF 및 IL-6의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
한편, 우리 신체의 위장관 (gastrointestinal tract)은 환경으로부터의 여러 가지 항원에 끊임없이 노출되고 장관 내에는 막대한 양의 미생물이 항원으로 작용하게 되는데, 이에 대응하여 장관면역계에서는 면역응답으로 IgA 항체를 생산하게 된다고 알려져 있다. Peyer’s patch (P.P)는 가장 중요한 GALT(gut-associated lymphoid tissue)로써 알려져 있으며, 이러한 림프장치는 전신의 림프절이나 비장과는 독립한 면역 조직계를 형성하고 외분비 장기에 연결된 림프조직과 교류하여 immunoglobulin A (IgA)의 생산을 중심으로 하는 분비형 면역계를 형성하고 있다. 특히 immunoglobulin A (IgA)는 점막에서 면역을 조절하는 면역글로불린 중 하나로 미생물 유래 독소나 외부항원이 점막에 결합하지 못하게 하는 일차적 점막 방어기전 (primary mucosal defense mechanism)의 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 항체를 분비하는 B 림프구는 일반적인 경우에 IgG를 생산하지만, 장관 면역계에서는 특이적으로 IgA를 많이 생산하여 장관내로 분비시키고, 분비된 항체는 세균이나 바이러스를 불활성화 (inactivation)시키는 중요한 역할을 수행한다.
이에, 본 발명의 일실시예에서는 보리잎 유래 다당분획이 경구로 섭취되었을 때에도 인체에 유효한지 여부에 대해서 동물실험을 진행하였고, 마우스의 경구투여를 이용한 장관면역계의 활성 증진여부를 확인하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 보리 유래 다당 분획물을 경구투여한 마우스의 Peyer's patch, 소장 내액 및 분변에서의 IgA 검출량이 늘어났을 뿐만 아니라 IgA 생성을 유도하는 관련 사이토카인들의 농도 또한 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대장 및 맹장 내에서 유용 미생물의 발효에 이용되어 단쇄지방산의 생성을 촉진시키는 효과가 있는 것으로 확인되어, 장 점막의 영양분으로 작용하여 암을 예방하는 기능을 나타낼 수 있을 것으로 판단되었다.
이로서 본 발명의 다당분획물은 선천면역계, 적응면역계 및 장관면역계의 기능 증강 활성이 매우 뛰어난 것을 확인하였다.
한편, 본 발명의 가수분해된 보리잎 유래 다당분획물의 면역기능 증강활성은 보리잎의 단순 열수추출 다당분획물과 비교해 면역기능 증진 활성이 현저히 우수한 것으로 나타났으며, 보리잎으로부터 유효성분을 추출하기 전에 가수분해효소로 전처리하여 면역기능이 증강된 다당 분획물에 관한 발명은 본 발명에서 최초로 공개하는 바이다.
따라서 본 발명은 본 발명의 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 보리잎유래 다당분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 보리잎유래 다당분획물과 면역기능 증강의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 보리잎 유래 다당분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 보리잎 유래 다당분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 본 발명의 보리잎 유래 다당분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알레르기 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 다당분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 다당분획물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역기능 증강용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 '경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 다당분획물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 당단백 분획의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 다당분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 다당분획물을 면역기능 증강제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 치료에 효과가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알레르기 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물은 암 전이 억제 활성이 있는 것을 특징으로 한다.
종양이 타기관으로 전이될 때 보리잎 유래 다당이 갖는 항전이 활성을 평가하기 위해 Colon 26-M3.1 carcinoma 세포주의 폐암전이 모델에서 in vivo 활성을 측정하였는데, 실험 결과 tumor control군에서는 평균 76 여개의 colony가 계수되었고, 이를 기준으로 본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물의 암 전이 억제율을 계산하였을 때, 모든 농도에서 본 발명의 BLE0분획이 우수한 암 전이 억제 활성을 보였다.
한편, NK 세포의 기능을 제거시키는 시약으로 잘 알려진 Anti-asialo GM1을 처리한 마우스를 이용하여 동일실험을 진행한 결과, NK 세포의 기능이 제거된 마우스에서는 평균 277개의 종양이 생성되어 일반 마우스의 종양생성에 비해 약 3.6배 높아진 종양 생성율을 나타내었다. NK 세포기능이 제거된 마우스에 본 발명에 따른 보리잎 유래 다당 분획물인 BLE0을 20 및 200 μg/mouse의 농도로 2회 투여하였을 때, 각각 평균 151개와 59개 (45.4와 78.6% 종양생성 억제율)의 종양이 관찰되었으며, 이는 NK 세포 외에 macrophage 및 T 세포 등의 다른 면역세포에 의한 결과로 사료되었다.
상기한 바와 같은, NK 세포의 기능이 제거된 마우스에서 높아진 종양전이 활성의 결과는, 앞서 제시된 macrophage의 TNF-α 및 IL-12와 같은 다양한 cytokine의 생성과 연관된 macrophage의 활성으로 짐작할 수 있으며, macrophage에 의한 선천면역의 활성화는 BLE0의 투여로 인해 증진될 수 있음을 간접적으로 시사하는 결과로 판단되었다.
따라서, 본 발명은 상기 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 관한 구체적인 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 보리잎 다당분획물은 선천면역계, 적응면역계 및 장관면역계 증강 효과가 우수할 뿐만 아니라 암 전이 억제 활성 또한 매우 우수한 효과가 있다.
도 1은 보리잎 유래 각 분획물의 추출방법을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 보리잎 열수추출 다당 분획물의 분자량 패턴을 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 효소처리 보리잎 다당 분획물의 분자량 패턴을 HPLC를 이용하여 분석한 결과이다.
도 4는 보리잎 유래 각 분획의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 5는 보리잎 유래 각 분획의 대식세포에서 TNF-α분비 촉진능을 평가한 결과이다.
도 6은 보리잎 유래 각 분획의 대식세포에서 nitric oxide(NO) 생성 촉진능을 평가한 결과이다.
도 7은 보리잎 유래 각 분획의 대식세포에서 사이토카인 분비 촉진능을 평가한 결과이다(A: IL-6, B: IL-12).
도 8은 효소처리 보리잎 유래 다당분획물(BLE0) 및 이의 고분자 분획(BLE-I)의 대식세포에서 TNF-α 분비 촉진능을 평가한 결과이다.
도 9는 효소처리 보리잎 유래 다당분획물(BLE0) 및 이의 고분자 분획(BLE-I)의 대식세포에서 nitric oxide(NO) 분비 촉진능을 평가한 결과이다.
도 10은 효소처리 보리잎 유래 다당분획물(BLE0) 및 이의 고분자 분획(BLE-I)의 대식세포에서 사이토카인 분비 촉진능을 평가한 결과이다(A: IL-6, B: IL-12).
도 11은 보리잎 유래 각 분획의 비장세포 유사분열 촉진능(mitogenic activity)을 평가한 결과이다.
도 12는 보리잎 유래 각 분획의 비장세포에서 IFN-γ 분비 촉진능을 평가한 결과이다.
도 13은 보리잎 유래 각 분획이 Peyer’s patch를 통한 골수세포 증식능을 평가한 결과이다.
도 14는 보리잎 유래 각 분획의 Peyer’s patch에 의한 GM-CSF 생성능을 평가한 결과이다.
도 15는 보리잎 유래 각 분획의 Peyer’s patch에 의한 IL-6 생성능을 평가한 결과이다.
도 16A는 보리잎 유래 각 분획을 투여한 마우스에 colon 26-M3.1 세포를 정맥으로 주입한 후 14일이 경과된 시점에서, 종양세포의 콜로니 개수의 변화를 평가한 결과이다.
도 16B는 NK 세포 저해제인 Anti-asialo GM1을 처리한 마우스에 보리잎 유래 각 분획을 투여하였을 때, 종양세포의 콜로니 개수의 변화를 평가한 결과이다.
도 17은 Peyer's patch cell에 의한 IgA 분비능 및 관련 사이토카인 유도능 평가를 위한 동물실험 디자인을 모식도로 표현한 것이다(P.P: Peyer's patch).
도 18은 BLE0를 경구투여한 마우스에서 IgA 생산능 변화를 확인한 결과이다(A: Peyer's patch에 의한 IgA 생성, B: 소장 내액에서의 IgA 농도, C: 분변에서의 IgA 농도).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
보리 다당 분획물 제조
본 실험에 사용된 보리(Barley grass)은 전남 영광에서 생산된 것으로 ㈜새뜸원에서 구입하여 실험에 사용하였다. 하기한 각 보리 추출물 분획의 제조 방법의 모식도를 도 1에 나타내었다.
<1-1> 보리 단순 열수추출 분획물의 제조
분말 보리를 증류수 10배(w/v)에 현탁하여 100℃에서 3시간동안 가열처리하였다. 열수추출액을 4℃, 6,500×g, 15분으로 원심분리 후, 상등액을 동결건조하여 단순 열수추출 분획물(BLX)를 얻었다.
<1-2> 열수추출에 의한 조다당 분획물(BLW-O) 제조
분말 보리를 증류수 10배(w/v)에 현탁하여 100℃에서 3시간동안 가열처리하였다. 열수추출액을 4℃, 6,500×g, 15분으로 원심분리 후, 상등액을 분리하여 상등액의 4배 부피(v/v)의 80% 에탄올을 가하여 4시간동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 이를 다시 65% 에탄올을 가하여 4시간 동안 정치하면서 다당을 침전시켰으며, 이를 3번 반복하여 실험하였다. 침전된 다당에 투석(MWCO 6,000~8,000)을 행하여 열수추출 조다당 분획물(BLW0)을 얻었다.
<1-3> 효소처리 열수 추출분획물(BLEX) 제조
분말 보리를 증류수 10배(w/v) (pH 4) 에 현탁하여, pectinase(Rapidase C80MAX, 비전비이오켐)를 원료당 1%로 첨가한 후, 50℃ incubator에서 3일간 효소 처리한다. 그 후 상기 효소 처리 반응액을 100℃에서 15분간 가열처리하여 잔존 pectinase를 불활성화 시킨다. 이후 불활성화된 추출액을 4℃, 6,500×g, 15분으로 원심분리 후, 상등액을 동결건조하여 효소처리 열수추출 분획물(BLEX)를 얻었다.
<1-4> 효소처리 조다당 분획물(BLE0)의 제조
분말 보리를 증류수 10배(w/v) (pH 4) 에 현탁하여, pectinase(Rapidase C80MAX, 비전비이오켐)를 원료당 1%로 첨가한 후, 50℃ incubator에서 3일간 효소 처리한다. 그 후 상기 효소 처리 반응액을 100℃에서 15분간 가열처리하여 잔존 pectinase를 불활성화 시킨다.
효소 처리를 마친 상기 시료를 4℃, 6,500×g, 15분 원심분리하여 잔사를 제거하고, 여기에 80% 에탄올을 가하여 4시간 동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 침전된 다당을 회수하고, 이를 다시 65% 에탄올을 가하여 4시간 동안 정치하면서 다당을 침전시켰으며, 이를 3번 반복하여 실험하였다. 이후 침전된 다당을 소량의 증류수에 용해시킨 후 투석막(MWCO 3,500)을 이용하여 저분자 물질들을 제거한 뒤, 효소처리 조다당 분획물(BLE0)을 얻었다.
<실시예 2>
보리잎 유래 당분획물의 특성 규명
<2-1> 다당분획(BLEO)의 화학적 특성
이화학적 성분 분석은 시료중의 중성당 함량은 D-gulcose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법으로, 산성당 함량은 D-galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl법으로, TBA-positive material의 함량은 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로 하여 thiobarbituric acid법으로 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 단백질 함량은 BSA를 표준 물질로 하여 Bradford 법을 변형하여 사용하였다. 폴리페놀 화합물 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 것을 이용한 Folin Denis법을 일부 변형시켜 측정하였다.
이러한 다당분획들을 각각 Superdex GL-75 size exclusion column이 장착된 HPLC로 분석한 결과, RapidaseTM가 처리되지 않은 고분자 다당분획인 BLW-0는 도 2에서와 같이 고분자 물질이 주로 혼재한 peak pattern을 나타내었으나, 펙티나제가 처리된 BLE0의 경우에는 peak pattern이 상이한 것을 알 수 있었다.
도 2의 BLW-0에서 크로마토그램상의 용리시간 앞부분(15~22분대)에서 볼 수 있는 고분자 물질은 도 3의 BLE0에서 상당부분 제거된 것을 확인하였으며, 상대적으로 뒷부분(32~33분대)에 해당하는 저분자 물질이 급격히 생성된 것을 알 수 있었으며, 이러한 성분의 변화는 pectin 계열에서 pectinase가 주된 활성인 시판 상업용 효소인 RapidaseTM의 효소작용을 받은 보리잎 유래 고분자 다당분획 중에서 주로 pectin류의 구조적 변화를 예상해 볼 수 있는 결과로 사료되었다.
<2-2> 열수 추출(BLWO) 및 효소처리 다당분획(BLEX, BLE0)의 구성당 분석
구성당 분석은 Albersheim 등의 방법을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성당을 alditol acetate와 aldonolactone로 유도체화 하여 GC(Gas Chromatography ACME-6100, Young-Lin Co. Ltd. Anyang, Korea)를 이용하여 분석하였다. 다당 시료를 2 M TFA(trifluroacetic acid) 중에서 121℃, 1.5 hr 반응시켜 가수분해한 후, 1 ㎖의 1 M NH4OH (ammonia solution)에 용해하여 10 ㎎의 NaBH4로 4 hr 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후, methanol을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 alditiol에 1 ㎖의 acetic anhydride를 가하여 121℃에서 30 min 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며 이를 chloroform/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다. 또 산성당의 구성을 분석하기 위하여 전환된 alditol을 증류수에 녹인 뒤, Sep-pak QMA Cartridge(Waters, Milford, MA, USA)에 전개하고 1 M HCl로 aldonic acid를 분리하였다. 분리한 용액에 2 M TFA를 가하여 100℃에서 5 min간 반응시켜 aldonolactone으로 전환시켰다. 그 후 chloroform/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 건조하여 GC 분석 시료로 사용하였으며, GC column은 SP-2380 capillary column(0.25 ㎜×30 m, 0.2 ㎛ film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을, detector는 Flame ionization detector(FID, Young-Lin Co. Ltd.)를 사용하였고, carrier gas로서 N2를 1.5 ㎖/min 으로 흘렸다. Injection 온도 250℃, detector 온도 270℃, Column 온도는 60℃에서 220℃까지 30℃/min, 220℃에서 250℃까지 8℃/ min의 조건하에서 실험하였다(표 1 참조). 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
Figure 112016108231602-pat00001
그 결과, 보리잎으로 부터 열수추출 다당분획물(BLWO)과 RAPIDASE C80MAX(Pectinase) 효소처리 다당분획물(BLEO)의 주요성분 함량과 구성당 조성 등의 이화학적 특성을 분석한 결과 하기 표 2와 같았다.
Figure 112016108231602-pat00002
* 상기 표에서 KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 의미하며 “GalA+GlcA”는 galaturonic acid 와 glucuronic acid의 합을 의미한다.
* 상기 표에서 당 구성(sugar composition)은 alditol acetates derivative 방법을 이용하여 분석하였다.
* 상기 chemical component의 함량비(%)는 건조 샘플 내의 비율을 나타낸 것이다.
* 상기 mole%는 검출된 총 carbohydrrate의 양으로부터 계산한 것이다.
다당분획들의 일반성분 및 구성당 분석결과, 효소처리되지 않은 고분자 다당분획인 BLW0는 중성당(42.22%)과 산성당(44.64%)이 거의 1:1로 존재하는 산성다당분획으로 나타났으나, 효소처리된 고분자 다당분획인 BLE0는 산성당(19.37)과 함께 단백질(3.66%)의 함량이 급격히 감소된 중성다당분획으로 분석되었다(표 2).
이는 pectinase가 주된 활성인 시판 RapidaseTM의 효소작용을 받아 보리잎 유래 고분자 다당 분획 중에서 주로 homogalacturonan(HG)을 구성하고 있는 polygalacturonan[(α-D-galacturonic acid)n]이 분해되어 투석과정으로 제거되었을 것으로 사료되며, 또한 구성당의 조성에서도 BLE0는 주로 xylose, arabinose 및 galactose(36.09, 16.04 및 10.74%)를 비롯하여 소량의 rhamnose를 포함하고 있어 pectin류의 rhamnogalacturonan I(RG-I)을 구성하고 있는 arabinogalactan 외에도 hemicellulose류로 구분되는 arabinoxylan의 존재 가능성을 강하게 추론해 볼 수 있었다.
<실시예 3>
RAW 264.7 세포를 이용한 선천면역계 증진활성 평가
<3-1> 세포배양
Raw 264.7 cell line(KTCC No. 40071)은 한국 세포주은행(KTCC, Seoul)에서 분양받아 사용하였다. 세포 수를 2.0×105 cells/mL로 조정하여 배양하였으며, 배지는 DMEM 배지에 10% (v/v) FBS와 1% (v/v) penicillin-streptomycin을 혼합해 사용하였다. 이후 다양한 농도로 희석한 시료를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
<3-2> RAW 264.7 세포에 대한 독성 측정
각 세포에 대한 시료의 독성 여부는 MTT assay로 측정하였다. 96 well plate의 상등액을 조심스럽게 제거한 후, MTT 0.5 mg/mL [3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT, Sigma)] 용액을 200 ㎕ 씩 첨가하여 4 hr 동안 배양하여 formazan을 형성시켰다. 그 후, 상등액을 제거하고 DMSO 200 ㎕를 각 well에 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA 판독기(Infinite M200 Pro, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 보리잎 유래 다당분획은 1~100 μg/mL의 농도에서 RAW 264.7 세포에 대한 독성이 없는 것으로 나타났다.
<3-3> Raw 264.7 세포 자극에 의한 cytokine 및 NO 생산량 측정
배지로 희석시킨 고분자 분획 물을 농도 별로 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 hr 배양한 후, 대식세포에 의해 유도, 분비된 상등액 중 cytokine의 양은 ELISA kit(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 즉, Anti-cytokine capture antibody를 coating buffer에 희석하여 96 well plate에 100 ㎕/well씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 방치하여 coating하였다. Tween 20(Sigma)을 PBS(Phosphate buffered saline)에 0.05% (v/v)가 되도록 가한 PBS/Tween 용액으로 plate를 3회 세척하였다. Assay diluent(PBS with 10% FBS)를 plate에 200 ㎕/well씩 넣은 후 상온에서 1시간 방치하였다. PBS/Tween로 3회 세척 후, 배양 상등액을 각 well에 100 ㎕씩 넣어준 뒤 2시간 상온에서 방치하였다. PBS/Tween로 5회 세척 후, detection antibody인 biotinylated antibody와 enzyme reagent인 stretavidin-horseradish peroxidase conjugate를 assay diluent(PBS with 10% FBS)에 희석하여 plate에 100 ㎕/well씩 넣은 후 상온에서 1 hr 방치하였다. PBS/Tween로 7회 세척 후, substrate solution(TMB substrate reagent Set, BD Biosciences)을 100 ㎕/well씩 넣은 후 암소에서 30 min 방치하였다. Stop solution인 2 N 황산용액을 well 당 50 ㎕씩 넣어 반응을 중지시키고 96 well plate reader를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
한편, 활성화된 대식세포(macrophage)가 분비하는 것으로 알려진 nitric oxide(NO)의 생성량 측정은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양을 측정하였다. 동일한 방법으로 배양한 세포 상등액을 취하여 동량의 Griess reagent(Sigma)을 가하여 상온에서 15 min 반응시켰다. NO의 활성 정도는 ELISA 판독기(Infinite M200 Pro, TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 540 ㎚에서 측정하였으며, 이때 표준곡선의 작성은 sodium nitrite를 이용하였다.
대식세포는 체내 거의 모든 조직에 분포하며 이물질이나 노폐물을 탐식, 제거하는 역할을 하는데, 이 과정에서 여러 가지 cytokine을 분비하여 면역 반응을 조절한다고 알려져 있다. Cytokine은 면역세포에서 생성되는 단백질 중재자로 외부 항원에 대한 여러 면역 세포간의 협력을 중재하므로, 이들의 생성과 분비는 면역반응 조절에 있어 매우 중요하다고 알려져 있다. 대식세포가 분비하는 대표적인 면역반응 유도 cytokine으로는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α 등이 밝혀져 있다(Wang H, Actor JK, Indrigo J, Olsen M, Dasgupta A. 2003. Asian and siberian ginseng as a potential modulator of immune function: An in vitro cytokine study using mouse 대식세포. Clin Chim Acta 327:123-128). 이들 중 IL-6 및 TNF-α는 대식세포에 의해 유도되는 대표적인 사이토카인으로서 세균감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며, 특히 IL-6는 IL-1과 협동적으로 작용하여 T 세포와 B 세포의 분화에 관여하고 항암효과가 있다고 보고되고 있다. 또한 TNF-α은 특정 암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, IL-12는 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응을 유도하는 사이토카인으로써 암세포와 같은 세포성 외래물질에 대한 반응성을 높이는 작용을 한다고 알려져 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포가 분비하는 TNF-α 생성능의 경우, BLE-O는 1 μg/mL의 저농도에서도 1163.1 pg/mL로 우수한 TNF-α 생성능 활성을 보여주었다. 한편 도 6에 나타낸 바와 같이, NO 생성능에서도 BLE0은 10 μg/mL의 저농도에서도 24.7 μM의 생성능을 나타내어 매우 우수한 활성이 있음을 알 수 있었다. 또한 도 7A에 나타낸 바와 같이, 림프구와 단구에서 분비되는 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성능에서도 BLE0은 10 μg/mL의 저농도에서 2447.3 pg/mL로 매우 우수한 생성능을 나타내었다.
또한, 도 7B에 나타낸 바와 같이 대식세포 자극에 의해 생산되는 pleiotropic 사이토카인으로서 선천면역과 적응면역을 서로 연결시켜주는 매우 중요한 면역학적 의의를 가지는 IL-12의 생성능에서도 BLE0은 매우 우수한 생성능을 나타내었다.
상기한 바와 같이, RAW 264.7 murine 대식세포 세포주에 대한 보리잎 유래 다당분획물의 영향을 종합해보면, 보리잎으로부터 유래된 BLE0은 1~100 μg/mL의 농도에서 세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며, 동일농도에서 양성대조군으로 사용된 시판 Cold-FX (CF, 캐나다에서 시판중인 다당주재의 면역증진, 감기예방용 건강식품)에 비해서 월등히 우수한 사이토카인 및 NO 생성능을 나타내었고, 이러한 효과는 단순 열수추출 다당분획물인 BLW-0와 비교해도 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 즉, RapidaseTM가 처리된 보리잎의 고분자 다당획분인 BLE0은 모든 면역기능 지표에서에서 매우 우수한 면역기능 증진활성 결과를 나타내었다.
<실시예 4>
BLE0에서 고분자 다당분획(BLE-I)의 분리 및 이의 면역기능 증진 활성
본 발명자들은 효소처리 보리잎 유래 다당분획물인 BLE0이 우수한 면역기능 증진 활성이 있다는 것을 확인한 후, BLE0을 겔 여과 크로마토그래피 방법에 따라 분리하여 분자량에 따라 보다 세분화된 다당 획분을 수득하였다.
구체적으로, 보리잎 유래 조다당 BLE0 분획물을 50 mM ammonium formate buffer (pH 5.5)로 평형화된 Sephadex G-100 column(2.5×90㎝)에 loading하고 동일 buffer를 이용하여 용출시켰다. 그 결과 유래 조다당 분획물 BLE0은 분자량이 상이한 4개 분획물로 구성된 것을 확인하였는데, 이중 가장 첫 번째로 나온 분획을 BLE-I으로 명명하였다. 동일 실험을 6-7회 반복하여 실험 결과를 검증하였다.
BLE-I의 구성당 분석 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112016108231602-pat00003
이후, 본 발명자들은 상기 실시예 3에서 BLE0의 선천면역계 활성 증진 효과를 평가한 방법과 동일한 방법으로 BLE-I의 면역기능 증진 활성을 평가하기 위해, 우선적으로 BLE-I의 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성을 평가하였고, 도 8에 나타낸 바와 같이 BLE-I은 1000 μg/mL의 농도까지 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다.
RAW 264.7 세포가 분비하는 TNF-α 생성능의 경우, 고분자 정제 다당획분인 BLE-I이 시료대조군인 BLE0과 유사한 정도의 활성을 나타내었고(도 8), NO 생성능에서도 BLE-I이 1 μg/mL의 저농도에서 20.6 μM의 NO 생성능을 나타내었는데, 이는 동일농도의 BLE0 (12.5 μM)에 비해 우수한 활성증가로 나타났으며, 더욱이 시료농도가 증가함에 따라 NO 생성능도 증가하는 경향을 나타내는 것으로 확인되었다(도 9).
또한 도 10A에 나타낸 바와 같이, 림프구와 단구에서 분비되는 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성능에서도 BLE-I은 매우 우수한 활성을 나타내었는데, 1 μg/mL의 저농도에서도 1358.2 pg/mL로 우수한 생성능을 나타냄과 함께 농도가 증가함에 따라 생성능도 우수하게 증가하는 것으로 나타나는 것으로 확인되었다. 이는 BLE0이 1 μg/mL의 농도에서 8.2 pg/mL의 IL-6 생성능을 나타내는 것에 비하여 약 166배로 월등히 우수한 활성으로 확인되었다.
한펴, 도 10B에 나타낸 바와 같이 대식세포 자극에 의해 생산되는 pleiotropic 사이토카인으로서 선천면역과 적응면역을 서로 연결시켜주는 매우 중요한 면역학적 의의를 가지는 IL-12의 생성능에서도 BLE-I은 BLE0에 비해 보다 우수한 활성증가를 나타내었는데, 1,000 μg/mL의 고농도에서 552.0 pg/mL로 동일농도의 BLE0 (142.5 pg/mL)에 비해 약 3.8배 정도 증가된 활성으로 확인되었다.
상기한 바와 같이, BLE0의 고분자 정제 다당획분인 BLE-I은 TNF-α를 제외한 IL-6, IL-12 및 NO 생성능에서 BLE0에 비해 더 우수하게 증가된 활성을 나타내어 면역기능 증진활성이 매우 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
보리잎 유래 다당분획물의 적응면역계 증진활성 측정
<5-1> 비장세포 유사분열 촉진능 평가
Balb/c 마우스로부터 얻은 비장 세포(1×106)를 96-well 플레이트에서 48시간 동안 다양한 농도의 샘플을 처리한 후 배양하였다. 유사분열 활성은 CCK(cell counting kit)어세이를 통해 평가하였으며, 상대적인 유사분열 활성은 NC(negative control)과 비교하여 계산하였다. IFN-γ는 배양 상등액을 이용하여 ELISA법으로 평가하였다.
배지만이 첨가되었을 뿐, 샘플이 처리되지 않은 세포군을 NC(negative control)로 설정하였고, LPS 또는 Cold-FX(CF) 처리군을 PC(positive control)로 설정하였다.
이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 비장세포를 이용한 유사분열 촉진능 평가에서 양성 대조군으로 사용된 시판 Cold-FX(CF)에 비해서도 시료들은 모두 우수한 활성을 나타내었다. 특히, 효소처리 보리잎 유래 고분자 다당분획물인 BLE0는 저농도에서도 가장 우수한 활성을 나타내었는데, 1 μg/mL의 농도에서도 negative control 대비 2.03배의 높은 비장세포의 유사분열 촉진능을 나타내었으며, 100 μg/mL까지는 시료농도가 증가함에 따라 활성도 증가하는 경향(3.49배)을 보여주어 매우 우수한 면역증강 효과를 나타내었다.
<5-2> 비장세포에서의 IFN-γ 생성능 평가
NK 세포, CD4+ TH1 세포 및 CD8+ T 세포에 의해 생성되는 사이토카인으로 주로 TH1 보조 T 세포 아집단의 특징적인 사이토카인인 interferon-γ(IFN-γ)는 대식세포의 활성화와 함께 선천면역과 세포 내 기생세균에 대한 세포매개 적응면역에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
이에 대한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, BLE0은 모든 농도에서 매우 우수한 IFN-γ생성 촉진능을 나타내었다.
상기한 결과로부터 보리잎의 고분자 다당분획물은 비장세포를 자극하여 유사분열 활성을 증가시키고 있음과 함께 IFN-γ의 생성을 증가시킴으로써 선천면역계뿐만 아니라 적응면역계에도 효과적으로 작용될 수 있는 것으로 사료되었다.
<실시예 6>
Peyer’s patch를 경유한 골수세포 증식능 및 GM-CSF, IL-6 유도활성
C3H/H3 마우스의 소장으로부터 유래된 Peyer’s patch 세포(4×105)를 다양한 농도의 BLE0을 처리한 후 96-well 플레이트에서 5일간 배양하였다. 이 후, 배양 상등액 50μl는 C3H/H3 마우스로부터 유래된 골수세포(2.5×104)와 함께 6일간 배양하였다. Payer’s patch를 경유한 골수세포 증식능은 CCK 어세이로 측정하였고 NC와 비교하여 상대적인 활성을 계산하였다. GM-CSF 및 IL-6 생성능은 세포 배양액 상등액을 이용하여 ELISA 법으로 측정하였다.
배지만이 첨가되었을 뿐, 샘플이 처리되지 않은 세포군을 NC(negative control)로 설정하였고, Cold-FX(CF) 처리군을 PC(positive control)로 설정하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 소장 내 중요한 국소 면역조직 중 하나인 Peyer's patch를 경유한 조혈세포인 골수세포의 증식활성을 측정한 결과에서도, BLE0은 농도 의존적으로 높은 활성을 나타내었으며, 특히 BLE0의 경우 1 μg/mL의 저농도에서 negative control 대비 2.30배의 증식능을 나타내었으며, 상대적으로 고농도인 100 μg/mL에서도 5.34배의 높은 활성을 나타내었다.
Peyer’s patch 세포로부터 백혈구의 성장인자로 작용하며, 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)와 단핵구를 생산하도록 자극하는 과립구 단구-군체자극인자(granulocyte 대식세포-colony stimulating factor, GM-CSF) 및 골수의 증식에 관여를 하는 사이토카인으로 전신면역으로 확대가 일어나게 된다고 알려진 IL-6의 결과는 도 14 및 도 15에 나타내었다. BLE0은 100 μg/mL 까지 농도 의존적으로 GM-CSF 및 IL-6 생성능을 나타내었으며, 특히 BLE0은 100 μg/mL의 시료농도에서 양성대조군인 LPS(34.8 pg/mL)와 같은 34.7 pg/mL을 나타내어 매우 우수한 GM-CSF 생성능을 나타내었으며, 또한 동일농도에서 BLE0은 매우 우수한 IL-6 생성능(90.1 pg/mL)을 보여주었다.
상기한 결과로부터 보리잎의 다당분획물은 T 및 B 세포로 구성되어 있는 Peyer’s patch를 자극하여 골수세포의 분화 및 증식을 유도하는 것으로 판단되어 적응 면역계 활성화 효능이 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 7>
Colon26-M3.1 carcinoma를 이용한 암 전이 억제활성 평가
Macrophage와 같은 탐식세포에 의해 생산된 cytokine인 IL-12는 NK 세포를 활성시키게 되고, NK 세포는 는 다시 macrophage를 활성화시키는 IFN-γ를 생산하여 미생물의 침입, 또는 종양세포에 대한 반응을 증진시키는 것으로 알려져 있다.
상기한 실험결과로 효소 처리한 보리잎으로 분리한 고분자 다당획분인 BLE0은 선천면역계의 주요한 세포인 macrophage와 NK 세포를 효과적으로 자극할 수 있는 것으로 나타났기 때문에, 이들 세포들의 또 다른 특성 중의 하나인 종양 억제활성을 측정하였다.
Balb/C 마우스에 2.5 × 104의 colon26-M3.1 세포를 정맥으로 주입하기 이틀 전에 BLW-0 및 BLE0을 각각 제시된 농도로 정맥투여 하였다. 마우스들은 종양 세포가 주입된지 14일 후에 평가를 위해 희생되었다.
한편, 마우스의 NK 세포를 불활성화 시킨 동물 모델에서는, 암 세포를 주입하기 2일 전에 rabbit anti-asialo GM1 serum을 마우스에 처리하여 NK 세포의 수를 대폭 감소시켰다.
대조군은 오로지 saline만을 투여하였으며, BLE0은 20 및 200 μg을 정맥으로 투여하였다.
이에 대한 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, saline을 투여한 대조군에서는 평균 76개의 colony가 관찰된 반면, BLE0을 20 및 200 μg/mouse의 농도로 2회 투여된 마우스에서는 각각 평균 38개와 25개 (각각 49.8과 67.1%의 종양생성 억제율)로 나타나 우수한 암전이 억제활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 16A)
한편, NK 세포의 기능을 제거시키는 시약으로 잘 알려진 Anti-asialo GM1을 처리한 마우스를 이용하여 동일실험을 진행한 결과, NK 세포의 기능이 제거된 마우스에서는 평균 277개의 종양이 생성되어 일반 마우스의 종양생성에 비해 약 3.6배 높아진 종양 생성율을 나타내었다. NK 세포기능이 제거된 마우스에서 BLE0을 20 및 200 μg/mouse의 농도로 2회 투여되었을 때, 각각 평균 151개와 59개 (45.4와 78.6% 종양생성 억제율)의 종양이 관찰되었으며, 이는 NK 세포 외에 macrophage 및 T 세포 등의 다른 면역세포에 의한 결과로 사료되었다(도 16B).
NK 세포의 기능이 제거된 마우스에서 높아진 종양전이 활성의 결과는, 앞서 제시된 macrophage의 TNF-α 및 IL-12와 같은 다양한 cytokine의 생성과 연관된 macrophage의 활성으로 짐작할 수 있으며, macrophage에 의한 선천면역의 활성화는 BLE0의 투여로 인해 증진될 수 있음을 간접적으로 시사하는 결과로 사료되었다.
<실시예 8>
보리잎 유래 다당 분획물의 장관면역계 증진활성 평가
상기 면역활성 평가 (in vitro)를 통해 효과가 입증된 효소 처리된 청엽 유래 다당분획(BLE0)이 경구로 섭취했을 때에도 인체에 유효한지에 대한 가능성을 타진하고자, C3H/HeN 마우스의 경구투여를 이용한 장관면역계의 활성 증진여부를 확인하고자 하였다.
<8-1> Peyer’patch cell에 의한 sIgA 분비능
7주령의 C3H/HeN 마우스를 6마리씩 총 4 그룹으로 나눈 다음, 보리잎으로부터 분리한 효소처리 다당 (BLE-0)을 농도별로 20일간 총 10회 (1회/2일) 경구투여 하였다(100, 1,000 및 5,000 μg/mouse). 20일간의 경구투여가 종료된 마우스의 Peyer’patch 세포를 회수한 다음, 96 well plate에 3일간 배양하여 경구투여로 인해 활성화된 Peyer’patch 세포가 생산해 내는 sIgA와 함께 sIgA 생산에 중요하게 관여하는 사이토카인(IL-6, GM-CSF, IL-10, TGF-β)을 모두 ELISA법으로 분석하였다. 한편, 경구투여가 종료된 마우스의 소장을 적출하고 소장 내액 (intestinal fluids)과 분변 (feces)을 각각 회수하여 sIgA의 생산능은 ELISA로 분석하였다(도 17).
효소(펙티나제) 처리된 보리잎 유래 조다당획분인 BLE-0를 각각 100, 1,000 및 5,000 μg/mouse의 농도로 총 10회 경구투여한 마우스의 소장으로부터 Peyer's patch 세포 추출 및 분리하고, 배양 중 생산되는 IgA의 함량을 측정한 결과, 농도의존적인 IgA 분비능을 나타내었다 (도 18A). IgA 생성능이 가장 우수했던 5,000 μg/mouse 투여군에서 Peyer's patch에서의 IgA 생성능은 0.73 μg/mL로 negative control (saline 투여군, 0.56 μg/mL)에 비해 약 1.3배 증가된 활성을 확인할 수 있었다.
BLE-0의 복용에 의해 Peyer's patch 내 면역세포가 활성화되면 IgA의 생성능이 증가된 결과로부터 장관 내 또는 분변 중에는 장내로 분비된 IgA가 상당량이 포함되어 있을 것으로 예측되었으므로, BLE-0의 복용 후 장관내액 및 분변 중에 존재하는 잔여 IgA를 측정한 결과, BLE-0의 경구투여로 인해 모두 농도의존적으로 증가된 IgA의 생성능을 나타내었다 (도 18B 및 18C).
특히, IgA 생성능이 가장 우수했던 5,000 μg/mouse 투여군에서 장관 내액 및 분변에서의 IgA 생성능은 각각 18.78 및 16.49 μg/mL로 saline 투여군 (각각 11.92 및 7.24 μg/mL)에 비해서 각각 1.6배 및 2.3배 증가된 활성을 나타났다. 이러한 IgA는 인체에서 생산되는 총 면역글로브 항체의 약 6%를 차지하는 대표적 분비형 항체로써 주로 타액, 눈물 그리고 장점막 (mucosal-associated lymphoid tissues; MALT)에서 주로 분비되며 점막을 통하여 인체로 침입하는 병원균의 제거를 담당하는 생체방어의 최일선을 담당하는 항체로 인간은 1일 평균 약 3 g의 IgA를 생산하는 것으로 보고되어 있는 장관면역에서 중추적인 역할을 하는 항체로 알려져 있다.
<8-2> Peyer’patch cell에 의한 sIgA 생성 유도-관련 사이토카인의 측정
Peyer's patch 내의 T세포 중 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg 세포)가 외부자극에 의해 반응하게 되면 장관 내 분비형 항체인 IgA의 생산에 중요한 역할을 담당하는 IL-10 및 transforming growth factor-β (TGF-β) 등의 사이토카인의 생산이 촉진되고, 이들이 B 세포를 선택적으로 자극하여 점막 면역과 관련된 IgA 항체의 생성이 증가하게 된다고 알려져 있다. 또한, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)는 macrophage, T 세포, 비만세포 및 NK 세포 등에서 생산되는 백혈구의 성장인자로 작용하며, 줄기세포가 과립구 (neutrophil, eosinophil 및 basophil)와 단핵구 (monocyte 및 macrophage)를 생산하도록 자극하는 사이토카인이다. 특히 GM-CSF는 대식세포의 수를 급격히 늘려 감염반응과 대항할 수 있도록 하는 전신면역/감염반응의 일부로 작용하며, Peyer’patch내에 존재하는 T세포가 macrophage와 함께 작용하여 발생시키는 IL-6는 골수의 증식에 관여를 하는 전신면역으로 확대를 유도하는 사이토카인으로 잘 알려져 있다.
BLE-0를 경구투여한 마우스의 Peyer’patch 세포에서 유도하는 IL-10, TGF-β, GM-CSF 및 IL-6 생성능은 하기 표 4에 나타내었는데, 4종의 사이토카인 모두 농도 의존적인 생성능을 나타내었고, 고농도인 5,000 μg/mL을 투여한 군에서는 saline 대조군과 비교하여 유의적인 활성 (p<0.05)을 나타내었다.
Figure 112016108231602-pat00004
이상과 같이, 효소 처리된 보리잎 유래 고분자 다당획분인 BLE-0의 경구 섭취에 의한 장관면역계의 영향에 대한 결과를 종합해볼 때, BLE-0는 경구투여로 인해 마우스의 장관면역계를 자극함으로써 Peyer’patch 세포의 IgA 및 관련 사이토카인의 생성을 농도의존적인 경향으로 증가시킴을 확인할 수 있었다. 더욱이 BLE-0의 경구투여에 의해 활성화된 Peyer’patch 세포는 IgA의 분비와 관련된 사이토카인인 IL-10과 TGF-β뿐만 아니라, 전신면역계를 활성화시키는 사이토카인으로 알려진 GM-CSF 및 IL-6의 생성을 모두 농도의존적으로 증가시켰다. 또한, BLE-0의 경구 투여는 장관 내 및 분변으로의 IgA 분비를 촉진시킬 수 있음이 추가적으로 확인할 수 있었으며, 이러한 사실은 청엽 유래 다당이 장내의 면역체계를 활성화시켜 IgA 분비를 촉진 시킴으로서 장내로 유입된 각종 항원을 신속하게 제거하는데 기여할 수 있을 것으로 사료되었다.
<실시예 9>
BLE-0의 경구투여에 의해 유도된 맹장 및 분변 중의 단쇄지방산 함량 측정
단쇄지방산 (short chain fatty acids, SCFAs)의 기능성은 이미 많은 연구에서 보고된 바 있는데, 대장 상피세포의 에너지원 이외에 장을 자극해서 연동 운동을 촉진하여 소화 흡수를 도우며, 장내를 산성화하기 때문에 유해균의 증식을 억제하고 감염으로부터 지켜주는 등 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다.
한편 섬유질이 많은 음식이 비만과 대사 질환의 예방에 좋다는 것은 이미 잘 알려져 있으며, 섬유질은 크게 cellulose, lignin과 같은 불용성 식이섬유와 pectin, hemicellulose, galacto-oligosaccharides, 및 fructo-oligosaccharides와 같은 수용성 식이섬유로 나눌 수 있다. 특히 수용성 식이섬유는 장내 미생물에 의해 발효되어 acetate, propionate, butyrate와 같은 단쇄지방산(SCFAs)의 생성을 유도하는데, 이러한 단쇄지방산들은 히스톤의 아세틸화를 조절하여 후생유전학적인 변화와 단쇄지방산의 수용체인 G-protein-coupled receptors인 FFAR3와 FFAR2에 결합하여 glucagon-like peptide 1 (GLP-1)의 분비 조절, 지방합성, 장내 음식물의 배출 시간의 변화 등 다양한 효과를 나타냄으로써 전신적인 에너지 항상성 (energy homeostasis)을 조절한다고 최근 보고된 바 있다. 또한 단쇄지방산은 대장에서 흡수되어 간이 콜레스테롤을 생합성하는 것과 콜레스테롤이 몸에 흡수되는 것을 저해하는 중요한 작용도 한다. 이들은 교감 신경에 있는‘receptor 41 (GPR41)를 활성화하는데, 에너지 과잉시에 GPR41가 교감 신경을 자극해 에너지 소비를 증가시키는 역할을 하게 된다고 알려졌으며, 기아 상태에서는 간으로부터 생성된 ketone body라는 물질이 GPR41를 통해 교감신경을 억제, 에너지 소비를 감소시키게 되므로 SCFAs는 에너지 항상성 (energy homeostasis)에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 단쇄지방산의 중요성이 장관에 매우 중요한 요소로 각광받고 있는 추세이다.
이에, 본 발명자들은 BLE-0를 농도별로 20일간 투여한 마우스의 맹장을 분리하여 추출물을 조제하고 4종의 단쇄지방산 (acetic, propionic, butyric 및 valeric acid)의 변화를 확인하고자 하였다. 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 4종의 단쇄지방산, 즉 acetic acid, propionic acid, butyric acid 및 valeric acid의 함량은 투여농도 100과 1,000 μg/mouse의 농도에서 차이를 나타내지 않았으나 경구투여 농도가 5,000 μg/mouse로 높아짐에 따라 모두 높은 수준으로 높아졌음을 확인할 수 있었다(표 5). 또한, 동일한 효과가 BLE-0를 경구투여한 마우스의 분변에서도 나타나는지 확인하였을 때, 맹장에서 나타난 경구투여 용량별 함량변화와 유사한 결과를 얻을 수 있었다(표 6).
Figure 112016108231602-pat00005
Figure 112016108231602-pat00006
<실시예 10>
보리잎 유래 다당 추출물의 면역억제 동물에서의 면역 증진활성
<실험방법>
1. 실험재료
본 발명에서 사용된 배지는 GIBCO BRL (Grand Island, NY,USA) 제품의 RPMI medium 1640를 사용 하였고, concanavalin (ConA), lipopolysaccharide (LPS), fetal bovine serum (FBS), trypan blue solution (0.4%), PMS(phenazine nethosulfate), Drabkin's Reagent 등의 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였으며 MTS3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2 -(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt는 Promega(Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd. All ) 제품이었고, Cychlophosphamide (CTX)는 중국 강소횡서의약주식유한회사（江蘇恒瑞醫藥股有限公司）제품이었고, YAC-1세포는 중국과학원 상해생명과학원 세포자원센터에서 구입하였다.
2. 시료 및 실험동물
BLE0와 COLD-Fx등 시료들은 한국식품연구원에서 제공하였다. 사용시 전체 시료들을 증류수에 용해하여 마우스에게 경구투여 하였다. 본 연구에 사용된 7~8주령， 체중은 20~24g된 웅성 Clean-level BALB/C 마우스 70마리를 연변대학 실험동물센터로부터 분양 받아 멸균된 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 3일 정도 실험동물실의 IVC시설에서 순화시킨 후 무작위로 10마리씩 7개 군으로 나누어 28일간 각종 시료를 매일 경구투여 하였다. 마우스 사양조건은 온도 22℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암 주기 (Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다.
BLE0를 각각 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg의 4개 그룹으로 나누어 경구투여 하였고, positive control군은 COLD 200 mg/kg, negative control군과 CTX군은 증류수 10 mL/kg을 경구투여 하였고. Negative control군을 제외한 기타 실험군은 약물투여 23일째에 CTX를 40 mg/kg용량으로 연속 2일간 복강내 주사한 다음 3일간 계속 각종 시료들을 투여하였다.
모든 실험동물에 대한 체중과 식이섭취량은 실험 물질 투여 개시 직전에 1회 측정하였고, 투여 개시 이후에는 3일에 1회씩 28일 동안 측정하였다. 실험 종료 후 실험동물에 대해 경추 탈골법으로 희생시킨 후 비장 (무균적으로 적출)과 흉선을 적출하여 중량을 측정하였다.
3. 비장 지수 (spleen index) 와 흉선 지수 (thymus index)선정
무균적으로 비장과 흉선을 적출하여 비장과 흉선의 무게를 측정한 뒤, 실험동물 체중의 차이에 따른 변이를 없애고 이를 표준화하기 위하여 적출 비장과 흉선의 무게와 마우스의 체중을 바탕 으로 아래의 공식에 따라 비장 지수를 구하였다.
Spleen index= Spleen weight(mg) / Body weight(g) ×10
Thymus index= Thymus weight(mg) / Body weight(g) ×10
4. 비장 세포의 분리
면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장을 이용하였다. 먼저 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 무균 PBS로 비장을 씻은 후 5 mL 일회용 주사기 막대피스톤으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시켜 배양액으로 2번 세척하고, 1,000 rpm/min에서 5분간 원심분리 하였다. 이것을 Tris-buffered ammonium chloride (NH4Cl, pH 7.2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하고 다시 RPMI medium 1640 용액에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 ScepterTM Handheld Automated Cel lCounter (Millipore Corporation, USA)를 이용하여 그 세포수를 측정하였다.. 배양액 10% FBS-RPMI 1640으로 3.0 X 106 cell/mL농도가 되게 분산시킨 후 96-well plate에 90μL 씩 첨가하여 세포 증식능 측정에 이용하였다.
5. 세포 증식 측정법
준비된 96 well plate에 세포를 90μL씩 넣고 각 군당 양성 대조군으로서 Con A (5μg/mL)와 LPS (10μg/mL)를 각각 10μL씩 넣었고 대조군에는 멸균 PBS를 동량 분주한 후, 각 plate를 37℃, 5% CO2 incubator에서 68시간 배양한 다음 MTS/PMS mixed solution을 각 culture plate에 20μL씩 넣은 후, 다시 4시간 동안 incubation시키고, incubation (보라색으로 발색함)이 끝나면, 492nm 파장으로 ELISA (Nanjing Huadong Electronics Information & Technology Co., Lit., CHINA) 분석을 하였다.
6. NK cell 활성 측정
NK cell의 세포독성 능력을 알아보기 위하여 Feng Zhou 등[5-7]의 방법을 이용하여 MTS assay를 실시하였다. 96 well culture plate에 4 X 105 cells/well가 되도록 YAC-1세포수를 조정하고 분리된 비장 세포와 같이 배양했는데, 비장세포수는 effector-to-target세포 비가 20：1이 되도록 세포수를 조정하였다. 이후 5% CO2, 37℃의 incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 MTS/PMS mixed solution을 20μL씩 각 well에 넣고 알루미늄 호일로 차광시킨 뒤 incubator에서 4시간 동안 incubation시켰다. Incubation이 끝나면 492nm 파장으로 ELISA분석을 하였다.
NK cell activity(%)= [1- (ODET ODE)/ODT] ×100%
7. 비장세포부터 분비되는 사이토카인의 측정
비장세포가 5 X 106 cells/well이 되도록 배양액 500 μL에 희석하여 24-well plate에 분주한 후, 각 well에 배양액에 희석된 10 μg/mL의 ConA를 500 μL 첨가하였다. 5% CO2가 포함된 습도 90%, 37 ℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 배양액을 취하여 IL-2, IL-6, IL-10，IFN-γ， TNF-α의 유리를 ELISA kit (Shanghai Bogoo Biotechnology. Co., Ltd, CHINA)를 이용하여 측정하였다. Capture antibody가 부착되어 있는 well에 희석용액을 50 μL 씩 분주한 후, 각 사이토카인 표준액 및 배양액을 50 μL 분주하여 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세척용액으로 4회 (매회 15~30sec) 세척한 후, 매개 well에 chromogenic agent A, B용액을 각각 50μL씩 첨가하여 실온 에서 10~15min 반응시킨 후 각 well에 반응정지 용액을 50μL씩 첨가하고, microplate reader를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 사이토카인 의 농도는 표준액을 사용하여 얻은 표준곡선에 따라 계산하였다.
8. 통계처리
실험결과는 SPSS 17. 0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계처리 하였으며, 실험군당 평균±표준편차 (Mean±로 표시하였고. 실험군간 통계적인 유의성은 ONE WAY-ANOVA를 실시한 다음, Duncan’multiple range test로 사후 검정을 실시하여 p<0.05-p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.
<실험결과>
1. 체중과 장기무게 변화
CTX 투여전까지 각 실험군과 대조군의 체중과 식이섭취량은 시간에 따라 점차적으로 증가하였으나, CTX를 투여한 후 5일간 정상 대조군을 제외한 기타 실험군의 체중과 식이섭취량은 다소 감소되었다(결과 미도시). 정상 대조군에 비하여 최종 희생일에 CTX 대조군에서 유의한 체중 감소가 인정되었고 (p<0.01), COLD-Fx투여군과 BLE0 각 농도별 투여군에서는 최종 희생일에 CTX 대조군에 비교하여 유의한 체중 증가 (p<0.05)가 각각 인정되었다(결과 미도시). CTX투여 후 각 실험군의 식이섭취량은 Control군에 비해 다소 감소되었지만 통계학적 의의는 없었다.
CTX군의 thymus index는 대조군에 비하여 현저히 낮았고 (p<0.05), BLE0 200 mg/kg투여군의 thymus index는 CTX군에 비해 현저히 높았다 (p<0.05). 각 실험군과 대조군의 평균 spleen index는 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(표 7).
CTX투여군의 WBC수는 대조군에 비해 현저하게 감소되었고(p<0.01), COLD-Fx와 BLE0투여군의 WBC 수는 CTX투여군에 비해 전부 유의성 있게 증가되었다 (p<0.05 or p<0.01) (표 7).
Figure 112016108231602-pat00007
2. 비장 면역세포 증식능 증가 효과
비장세포에는 B 임파구, T 임파구 및 대식세포가 존재되어 있으며, T 임파구는 성숙 T 임파구만이 존재하는 것으로 알려져 있다. B lymphocyte 증식능을 측정하기 위하여 LPS를, T lymphocyte 증식능의 측정을 위하여 ConA를 사용하였다.
마우스의 비장세포를 이용하여 면역세포의 증식능을 측정한 결과는 하기 표 9와 같다. CTX 투여군의 T lymphocyte 와 B lymphocyte 증식능은 Control군에 비해 현저히 낮았으며 (p<0.01), COLD-Fx, BLE0 200 mg/kg, 400 mg/kg투여군의 T lymphocyte 증식능은 CTX군에 비해 전부 유의성 있게 높았다(표 8, p<0.05 or p<0.01).
Figure 112016108231602-pat00008
NK cell 활성을 고찰해 보았을 때, CTX투여군의 NK cell 활성은 정상군에 비해 현저하게 감소되었고 (P<0.01), COLD-Fx，BLE0 200 mg/kg, 400 mg/kg 투여군의 NK cell활성은 CTX투여군에 비해 전부 유의성있게 증가되었다 (p<0.05 or p<0.01), (표 9).
Figure 112016108231602-pat00009
3. 비장세포에서의 사이토카인 분비 촉진 효과
BLE0투여가 비장세포의 사이토카인 분비능에 미치는 영향을 하기 표 11 및 표 12에 나타내었다. 정상 대조군에 비하여 CTX 대조군에서는 비장 내 IL-2, IL-6, IL-10, INF-γ, TNF-α함량이 유의하게 감소된 것을 확인 할 수 있고 (p<0.01), COLD-Fx와 BLE0 200 mg/kg, 400 mg/kg투여군에서 비장 내 IL-2, IL-6, IL-10 함량의 유의한 증가(p<0.05 or p<0.01)가 각각 확인되었다(표 10).
Figure 112016108231602-pat00010
COLD-Fx와 BLE0 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg투여군의 TNF-α 함량은 CTX군에 비해 전부 유의성 있게 증가되었으며, COLD-Fx와 BLE0 400 mg/kg 투여군의 INF-γ함량은 CTX군에 비해 전부 유의성 있게 증가되었다(표 11).
Figure 112016108231602-pat00011
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 보리잎 다당분획물은 선천면역계 및 적응면역계 증강 효과가 우수할 뿐만 아니라 암 전이 억제 활성 또한 매우 우수한 효과가 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (15)

  1. (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 방법에 의해 제조되고,
    중성 다당(neutral sugar)은 65 내지 85 중량비이고, 우론산(uronic acid)은 5 내지 30 중량비인 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다당 분획물은 DHA (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 또는 KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  4. 제1항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계의 추출물을 C1 내지 C4의 알코올로 침전시켜 다당분획물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  5. 제4항에 있어서, (d) 상기 (c)단계의 다당 분획물에서 한외여과 또는 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 이용하여 분자량 50kDa이상의 고분자 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다당 분획물의 중성 다당은 아라비노오스, 자일로스 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 중성 다당은 람노오스, 푸코오스, 만노오스 및 갈락토오스를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 보리잎 유래 다당 분획물은 면역 기능 증진활성이 있는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역 기능은 선천 면역, 적응 면역 및 장관 면역 기능으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 다당 분획물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 보리잎 유래 다당 분획물은 암 전이 억제 활성이 있는 것을 특징으로 하는 보리잎 유래 다당 분획물.
  11. 제1항의 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물.
  12. 제1항의 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물.
  13. 제1항의 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제1항의 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
  15. (a) 보리잎에 펙틴 가수분해효소를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 가수분해된 보리잎을 열수추출하는 단계를 포함하는,
    제1항의 보리잎 유래 다당 분획물의 제조방법.
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